UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID Departamento de Biología Molecular Facultad de Ciencias
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1 UNIVERSIDAD AUTONOMA DE MADRID Departamento de Biología Molecular Facultad de Ciencias CURSO DE DOCTORADO 06-07 "NEUROPÉPTIDOS: implicaciones fisiopatológicas" PARTE PRÁCTICA: Dr. Félix Hernández Pérez EFECTO DEL NEUROPEPTIDO ENDOTELINA SOBRE LOS NIVELES DE cAMP INDUCIDOS POR ADENOSINA E ISOPRENALINA EN CORTEZA CEREBRAL DE RATA 2 OBJETIVOS El objetivo de estas prácticas consiste en estudiar en corteza de cerebro de rata, los efectos que sobre los niveles de AMP cíclico tiene la presencia de un neuropéptido. Para ello se analizaran los efectos que tiene la endotelina por sí sola y, en segundo lugar, los efectos que tiene sobre dos activadores de la adenilato ciclasa como son la adenosina y la isoprenalina. Los objetivos experimentales a cubrir consistirán en: 1. dominio de la técnica de “slices”, 2. preparación y manejo de neuropéptidos, uso de antagonistas y agonistas específicos para caracterizar el receptor implicado 3. aprendizaje de una técnica de medida de AMP cíclico diferente al método standard de unión de radioligando a una proteína específica, 4. cálculo de valores de EC50 y, 5. manejo estadístico de los resultados 3 INDICE A. Introducción ..................................... 4 B. Materiales. Preparación de soluciones y tampones .. 7 C. Preparación de "slices" de cerebro de rata ........ 9 D. Incubación con [3H]adenina ........................ 10 E. Parte experimental ................................ 12 E.1. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP ... 13 E.2. Efecto de la enzima adenosina desaminasa sobre la producción de [3H]cAMP inducida por endotelina-1 ........................... 14 E.3. Efecto de adenosina y NECA sobre los niveles de cAMP inducidos por endotelina-1 ..... 15 E.4. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina desaminasa ............................ 16 E.5. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-3 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina deaminasa .................................. 17 E.6. Efecto de concentraciones crecientes de sarafotoxina 6c sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina deaminasa .................................. 18 E.7. Cálculo de la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por NECA ................. 19 E.8. Efecto que sobre la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por NECA tiene la presencia de endotelina-1 .................. 20 E.9. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por Isoprenalina en presencia de adenosina desaminasa ............ ....... 21 E.10. Cálculo de la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por ISO .................. 22 4 E.11. Efecto que sobre la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por ISO tiene la presencia de endotelina-1 .................. 23 F. Extraccion de [3H]cAMP ............................ 24 G. Expresión de los resultados ....................... 26 H. Bibliografia ...................................... 27 I. Apuntes - Notas ................................... 30 5 A. INTRODUCCION Las endotelinas, descubiertas en primer lugar en el sistema cardiovascular (Yanagisawa y col., 1988), son una familia de péptidos (de aproximadamente 2.5 KDa) integrada por 4 isoformas: ET-1, ET-2, ET-3 y VIC (vasoactive intestinal contractor o endotelina ß, presente en intestino de rata). Todas presentan las siguientes características (Fig. 1): (1) dos puentes disulfuro, (2) una zona polar (aminoácidos 6-10) y (3) un extremo carboxilo terminal hidrofóbico (aminoácidos 16-21). Las endotelinas guardan una alta homología con las toxinas peptídicas aisladas a partir del veneno de la serpiente Atractaspis engaddensis (sarafotoxinas 6a, 6b y 6c). Figura 1. ----------------------- Fig.2. -------------------------- Las endotelinas, como otras hormonas y/o neuropéptidos, se generan a partir de un pre-pro-péptido (de aproximadamente 200 aminoácidos). Estos pre-pro-péptidos (diferentes para cada una de las endotelinas) contienen el péptido maduro asi como una región semejante al péptido ("ET-like region"). El pre-pro-péptido se procesa por proteolisis para rendir el propéptido, el cual, gracias a otra proteasa (enzyme converting endothelin - ECE-), genera el péptido activo (Fig. 2). Los diferentes pre-pro-isopéptidos se sintetizan a partir de diferentes genes (el gen humano para la ET-1 se encuentra en el cromosoma 3, mientras que el gen para la ET-3 se encuentra en el cromosoma 20) cuya expresión se encuentra regulada a nivel de tejido. Así, y a modo de ejemplo, la endotelina-1 se sintetiza en las células endoteliales, la endotelina-3 en riñon, ojo y cerebro, mientras que ambas se sintetizan en pulmón. También se han encontrado diferencias entre tejidos adultos y fetales, sugiriendo que la regulación también se puede llevar a cabo durante del desarrollo. Un esquema de la organización génica y los productos de expresión del gen para la ET-1 humana se muestra en la Fig. 2. En la región "5'-upstream" existen secuencias para AP-1/jum y NF-1, factores que pueden regular la expresión de las diferentes endotelinas. Existen dos tipos de receptores bien caracterizados que transducen la señal extracelular de las endotelinas al interior celular. Los receptores de tipo A presentan diferente afinidad por las endotelinas. Así, la endotelina-1 es el mejor ligando, y la endotelina-3 el peor. El orden de potencia es el siguiente ET-1>ET-2>>ET-3. Aunque existen varios antagonistas, el compuesto BQ-123 es el más utilizado. Los receptores de tipo B no discriminan entre las diferentes endotelinas presentando todas ellas la misma potencia. Así el orden sería ET1=ET-2=ET-3. La sarafotoxina 6c discrimina entre ambos receptores, siendo esta un agonista específico de los receptores de tipo B (Williams y col., 1991). Por último, también se han 6 descrito receptores de alta afinidad o superreceptores en el sistema circulatorio. La endotelina1 es un agonista de estos receptores, mientras que la endotelina-3 y la sarafotoxina 6c son antagonistas. Estos receptores pueden ser catalogados como de tipo A puesto que BQ-123 es un antagonista. La expresión de los receptores, al igual que el de las diferentes endotelinas, se encuentra regulada a nivel tisular. Los receptores de endotelina, cuando son activados por su ligando, estan acoplados a una serie de rutas de transducción. La actividad fosfolipasa C se incrementa rápidamente tras la activación de los receptores de endotelina. En células musculares lisas la toxina pertúsica inhibe la generación de inositoles fosfato inducidos por endotelina (Reynolds y col., 1989). Sin embargo, en fibroblastos la toxina pertúsica no inhibe dicha acumulación (Muldoon y col., 1989). Estos datos parecen indicar que la activación de la fosfolipasa C puede ser, dependiendo del tejido, a través de varias proteínas G. La activación de la fosfolipasa C genera dos metabolitos, IP3 y diacilglicerol. El primero, via su receptor intracelular, incrementa los niveles citoplasmáticos de calcio y el segundo activa la proteína quinasa C. La activación de la proteína kinasa C conlleva la fosforilación de ciertas proteínas como la MARCKS (Catalán y col.). Las endotelinas también provocan alteraciones en las concentraciones iónicas citoplasmáticas. Asi, las endotelinas inducen la alcalinización citoplasmática (0.1-0.3 unidades de pH) activando el intercambiador Na+-H+ y, dependiendo del tejido analizado, activan o inhibin la Na+-K+-ATPasa. La variación en los niveles intracelulares de Na+ puede, por otro lado, llevar a una activación del intercambiador Na+-Ca2+ y por tanto un aumento de la concentración de calcio intracelular. Las endotelinas tambien activan la fosfolipasa A2, bien directamente via proteínas Go bien por un aumento intracellular de Ca2+. La activación de esta fosfolipasa libera ácido araquidónico a partir de fosfaticilcolina y fosfatidilinositol. Dicho ácido graso es transformado, dependiendo de la célula diana en prostaglandinas y/o tromboxanos. Así, en pulmón se genera PGI2, mientras que en células mesangiales se genera PGE2 y TxA2. Las endotelinas también activan multiples canales de calcio, bien directamente o via segundos metabolitos. Dicha activación es dependiente del tejido diana. Así se ha descrito que las endotelinas pueden activar VOC y ROC. El efecto final de todas estas rutas suele ser un aumento sotenido en los niveles de Ca2+ intracelular. Las endotelinas también modulan los niveles de nucleótidos cíclicos. Así, las endotelinas incrementan los niveles de cGMP activando el sistema del óxido nítrico (ShragaLevine y col., 1994). Respecto al sistema del cAMP, las endotelinas, dependiendo del tejido, pueden producir un incremento o una disminución en los niveles de cAMP. En el esfinter del iris y la glándula pituitaria anterior, las endotelinas incrementan los niveles de cAMP (el-Mowafy y Abdel-Latif, 1994, Domae y col., 1994). En riñon y miometrio las endotelinas inhiben los niveles de cAMP inducidos por AVP y forskolina (Kohan, 1993; Khac y col., 1994). En las células endoteliales las endotelinas inhiben la adenilato ciclasa via proteínas G (Ladoux y Frelin, 1991; Eguchi y col., 1993). Por último, en slices atriales la endotelina-1 puede inducir una acumulación de cAMP o bien una disminución, dependiendo de la concentración. A largo plazo las endotelinas activan la transcripción de ciertos genes como c-fos. Dicha proteína puede posteriormente unirse formando homodimeros o bien a otros miembros de la familia AP-1 generando heterodímeros que se unen a secuencias consenso que regulan la transcripción. Dicha regulación a nivel genético puede dar cuenta de la efectos promitogénicos de la endotelinas en ciertos tejidos. Además de los efectos promitogénicos de las endotelinas, estas estan implicadas en numerosas respuestas fisiológicas. Un resumen se muestra en la Tabla I. 7 Como otros péptidos descubiertos en primer lugar en el sistema digestivo y/o circulatorio, las endotelinas también se encuentran en el sistema nervioso central. Una administración intraventricular de endotelina-1 afecta a la hemostasis, el sistema cardiovascular y a la temperatura corporal, sugeriendo que los receptores de endotelina cerebrales son funcionales. En el cerebro existe endotelina, tal y como ponen de manifiesto su detección por radioimmunoensayo (Giaid et al., 1989). Dicha endotelina se sintetiza en el cerebro puesto que se han detectado ET-mRNA (MacCumber et al., 1990). También existe la enzima que transforma el propéptido en endotelina activa (Warner et al., 1992). En cerebro de rata se han detectado receptores del tipo B (ETR-B, los tres isopéptidos tienen la misma afinidad). En primer lugar se han detectado dichos receptores en experimentos de unión de radioligando y, en segundo lugar se ha detectado mRNA-ETR-B. El lecho molecular del cerebelo es el area con la mayor densidad de receptores en el cerebro. El objetivo de estas prácticas consiste en estudiar, en cerebro de rata, los efectos que sobre los niveles de cAMP tiene la presencia de endotelina en el medio. Para ello se analizará, en primer lugar, los efectos que tiene la endotelina por sí sola y, en segundo lugar, los efectos que tiene sobre un activador de la adenilato ciclasa como es la adenosina. La técnica para medir la generación de cAMP consistirá en preincubar los slices de corteza cerebral con [3Hadenina (Hernández y col.), para posteriormente separar el [3H]cAMP de otros metabolitos marcados radiactivamente utilizando columnas de Dowex/Alumina (Solomon y col., 1974). 8 B. PREPARACION DE MEDIOS Y MATERIALES 1. Columnas de Dowex (AG 50W-X4) 1.1. Lavar la resina en agua 1.2. Dejar sedimentar 1.3. Decantar el sobrenadante y los finos 1.4. Repetir varias veces 1.5. Resuspender la resina en 50% de agua (V/V) 1.6. Pipetear 2 ml de la resina en las columnas 1.7. Guardar con los extremos de las columnas sumergidos en agua. 1.8. Antes de usar, llevar a cabo el ciclo siguiente 1.8.1. Lavar con 5 ml HCl 1M 1.8.2. Lavar con 10 ml de agua 1.8.3. Lavar con 10 ml de HCl 1M 1.8.4. Lavar con 10 ml de HCl 1M 1.8.5. Lavar con 10 ml de agua 1.8.6. Lavar con 10 ml de agua 2. Columnas de Alumina 2.1. Añadir 0.6 g de Alumina neutra a las columnas 2.2. Guardar a temperatura ambiente en seco. 2.3. Antes de usar lavar con 10 ml de imidazol 0.1 M (3 veces) 3. Preparacion del tampón Krebs-Ringer-Bicarbonate (KRB) El tampón Krebs-Ringer-Bicarbonato (KRB) se debe preparar fresco aproximadamente 30 min antes de iniciar el experimento. Composición (mM): NaCl 118 KCl 4.7 MgSO4 1.2 KH2PO4 1.2 glucose 11.7 NaHCO3 25 CaCl2 1.2 Equilibrar con 95% O2:5% CO2 hasta pH 7.4 a 37°C (aproximadamente 30 min). 9 IMPORTANTE: El tampón KRB se mantendrá a 37°C durante todo el tiempo que dure el experimento, manteniendose el gaseo durante todo el proceso. 4. Preparación de soluciones 4.1. HCl 1 M 4.2. Imidazol 0.1 M 5. Preparación de péptidos y drogas 5.1. Endotelina-1 La solución stock será de 31 µM (agua). Alícuotas de 40 µl. Conservar a -20°C Las diluciones se realizan en agua. 5.2. Adenosina La solución stock será 15 mM (agua) Alícuotas de 40 µl. Conservar a -20°C. Las diluciones se realizaran en agua. 5.3. NECA La solución stock será de 30 mM (DMSO). Alícuotas de 40 µl. Conservar a -20°C. Las diluciones se realizaran en agua 5.4. Sarafotoxina 6c La solución stock será de 31 µM (agua) Alícuotas de 40 µl. Conservar a -20 °C. Las diluciones se realizan en agua. 5.5. BQ-123 La solución stock será de 31 µM (agua) Alícuotas de 40 µl. Conservar a -20 °C. Las diluciones se realizan en agua. 5.6. Adenosina desaminasa Utilizar la ADA comercial (400 U/ml). Preparar en el momento. Añadir a 10 µl de ADA comercial a 590 µl de KRB. 5.7. [8-3H]adenina Stock 1 µCi/µl. Conservar a 2°C. 5.8. ISOPRENALINA Preparar en el momento en agua 10 C. PREPARACION DE "SLICES" DE CEREBRO DE RATA. 1. Decapitar el animal y extraer el cerebro. 2. Haciendo uso de un cortador de tejido hacer prismas de 350x350 µm. 3. Dispersar el tejido cortado en KRB. Para ello introducir el tejido en un vial que contenga 20 ml de KRB y agitar enérgicamente 2-3 veces. 4. Lavar 3 veces con KRB. Transferir los slices a un erlenmeyer, gasear por espacio de 30 segundos y tapar con un tapón de goma. 5. Incubar a 37°C por espacio de 20 minutos 6. Lavar con KRB, resuspender en 20 ml de KRB. 7. Incubar a 37°C por espacio de 20 minutos. 8. Lavar con KRB, resuspender en 20 ml de KRB. 9. Incubar a 37°C por espacio de 20 minutos. 11 D. INCUBACION CON [3H]ADENINA 1. Lavar con KRB los slices y resuspender en 20 ml de tampón. 2. Añadir 40 µl de [3H]adenina (150 Bq/ml). 3. Gasear por espacio de 30 segundos. Tapar con un tapón de goma. 4. Incubar por espacio de 1 hora a 37°C con agitación. 5. Lavar 3 veces con KRB. El producto de estos lavados depositarlo en un bidón especial para recoger la radiactividad. 6. Permitir que los slices sedimenten en un tubo de plástico de 5ml y decantar el sobrenadante. 7. Distribuir alicuotas de 50 µl de slices empaquetados usando un Microdosímetro tipo Oxford en viales con la base plana y capaces de ser cerrados herméticamente. 8. Gasear cada vial con carbógeno. Tapar herméticamente e incubar por espacio de 10 min a 37°C y con agitación. 12 E. PARTE EXPERIMENTAL ------------------ TODOS LOS EXPERIMENTOS SE REALIZARAN POR DUPLICADO CADA ALUMNO REALIZARA UNICAMENTE DOS DE LOS SIGUIENTES APARTADOS (C1 A C11) ----------------- 13 E1. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control Endotelina-1 (-9) Endotelina-1 (-8) Endotelina-1 (-7.5) Endotelina-1 (-7) Endotelina-1 (-6.5) Endotelina-1 (-6) 1. Añadir 10 µl de agonista. Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de agonista (endotelina-1) seran: 0, 1 nM, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM. Para ello las concentraciones de partida del neuropéptido seran: agua, 0.03 µM, 0.3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 4. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 14 E2. Efecto de la enzima adenosina deaminasa sobre la producción de [3H]cAMP inducida por endotelina-1. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control Endotelina-1 Adenosina deaminasa Adenosina deaminasa + Endotelina-1 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa o vehículo (en este caso KRB). Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir 10 µl de agonista. Gasear y volver a tapar los viales. La concentración final de agonista (endotelina-1) sera 0.3 µM. Para ello la concentracion de partida seran 10 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 15 E3. Efecto de adenosina y NECA sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por endotelina-1 Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control Adenosina (-3.5) NECA (-5) Endotelina-1 (-6.5) Adenosina (-3.5) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-5) + Endotelina-1 (-6.5) 1. Añadir 10 µl de agua, NECA (0.3 mM) o adenosina (10 mM) y, simultáneamente, 10 µl de agua o endotelina-1 (0.3 µM). Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de NECA será 10 µM, de adenosina 0.3 mM. Para ello las concentraciones de partida seran 0.3 mM y 10 mM respectivamente. La concentración final de endotelina-1 será 0.3 µM. La concentración de partida será, por tanto, 10 µM. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 4. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 16 E4. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina deaminasa. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control NECA (-5) NECA (-5) + Endotelina-1 (-9) NECA (-5) + Endotelina-1 (-8) NECA (-5) + Endotelina-1 (-7.5) NECA (-5) + Endotelina-1 (-7) NECA (-5) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-5) + Endotelina-1 (-6) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de NECA y 10 µl de endotelina-1 (diferentes concentraciones). Gasear y volver a tapar los viales. La concentración final de NECA será 10 µM. Para ello la concentración de partida será 333 µM. Las concentraciones finales de endotelina-1 seran 0, 1 nM, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM. Las concentraciones de partida seran, agua, 0.03 µM, 0.3 µM, 0.1 µM, 3 µM, 1 µM y 30 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 17 E5. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-3 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina deaminasa. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control NECA (-5) NECA (-5) + Endotelina-3 (-9) NECA (-5) + Endotelina-3 (-8) NECA (-5) + Endotelina-3 (-7.5) NECA (-5) + Endotelina-3 (-7) NECA (-5) + Endotelina-3 (-6.5) NECA (-5) + Endotelina-3 (-6) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de NECA y 10 µl de endotelina-3 (diferentes concentraciones). Gasear y volver a tapar los viales. La concentración final de NECA será 10 µM. Para ello la concentración de partida será 333 µM. Las concentraciones finales de endotelina-3 seran 0, 1 nM, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM. Las concentraciones de partida seran, agua, 0.03 µM, 0.3 µM, 0.1 µM, 3 µM, 1 µM y 30 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 18 E6. Efecto de concentraciones crecientes de sarafotoxina 6c sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por NECA en presencia de adenosina deaminasa. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control NECA (-5) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-11) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-10) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-9.5) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-9) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-8.5) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-8) NECA (-5) + Sarafotoxina 6c (-7) Sarafotoxina 6c (-7) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de NECA y 10 µl de sarafotoxina 6c (diferentes concentraciones). Gasear y volver a tapar los viales. La concentración final de NECA será 10 µM. Para ello la concentración de partida será 333 µM. Las concentraciones finales de agonista (Sarafotoxina 6c) seran: 0, 10 pM, 100 pM, 333 pM, 1 nM, 3 nM , 10 nM y 100 nM. Para ello las concentraciones de partida del neuropéptido seran: agua, 0.3 nM, 3 nM, 10 nM, 30 nM, 100 nM , 300 nM y 3 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 19 E7. Calculo de la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por NECA. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control NECA (-8) NECA (-7) NECA (-6.5) NECA (-6) NECA (-5.5) NECA (-5) NECA (-4.5) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de NECA (diferentes concentraciones) y 10 µl de agua. Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de NECA seran: 0, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM, 3 µM, 10 µM y 33 µM. Para ello las concentraciones de partida seran: agua, 0.3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 33 µM, 100 µM, 333 µM, 1 mM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 20 E8. Efecto que sobre la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por NECA tiene la presencia de endotelina-1. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control Endotelina-1 (-6.5) NECA (-8) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-7) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-6.5) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-6) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-5.5) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-5) + Endotelina-1 (-6.5) NECA (-4.5) + Endotelina-1 (-6.5) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de NECA (diferentes concentraciones) y 10 µl de endotelina-1 (0.3 µM). Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de NECA seran: 0, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM, 3 µM, 10 µM y 33 µM. Para ello las concentraciones de partida seran: agua, 0.3 µM, 1 µM, 3 µM, 10 µM, 33 µM, 100 µM, 333 µM, 1 mM. La concentración final de endotelina-1 será 0.3 µM. La concentración de partida será, por tanto, 10 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 21 E9. Efecto de concentraciones crecientes de endotelina-1 sobre los niveles de [3H]cAMP inducidos por ISO en presencia de adenosina deaminasa. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control ISO (-5) ISO (-5) + Endotelina-1 (-9) ISO (-5) + Endotelina-1 (-8) ISO (-5) + Endotelina-1 (-7.5) ISO (-5) + Endotelina-1 (-7) ISO (-5) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-5) + Endotelina-1 (-6) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de ISO y 10 µl de endotelina-1 (diferentes concentraciones). Gasear y volver a tapar los viales. La concentración final de ISO será 10 µM. Para ello la concentración de partida será 300 µM. Las concentraciones finales de endotelina-1 seran 0, 1 nM, 10 nM, 33 nM, 100 nM, 333 nM y 1000 nM. Las concentraciones de partida seran, agua, 0.03 µM, 0.3 µM, 0.1 µM, 3 µM, 1 µM y 30 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 22 E10. Calculo de la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por NECA. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control ISO (-9) ISO (-8) ISO (-7.5) ISO (-7) ISO (-6.5) ISO (-6) ISO (-5) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de ISO (diferentes concentraciones) y 10 µl de agua. Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de ISO seran: 0, 1nM, 10 nM, 33 nM y 0.1 µM, 0.3 µM, 1 µM y 10 µM. Para ello las concentraciones de partida seran: agua, 0.01 µM, 0.03 µM, 0.1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 0.3 mM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 23 E11. Efecto que sobre la EC50 para la generación de [3H]cAMP inducida por ISO tiene la presencia de endotelina-1. Los experimentos a realizar, por duplicado, seran: Control Endotelina-1 (-6.5) ISO (-9) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-8) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-7.5) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-7) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-6.5) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-6) + Endotelina-1 (-6.5) ISO (-5) + Endotelina-1 (-6.5) 1. Añadir 10 µl de adenosina deaminasa a todos los tubos. Gasear y volver a tapar los viales. La concentracion final de ADA sera 1 U/ml. 2. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 3. Añadir, simultáneamente, 10 µl de ISO (diferentes concentraciones) y 10 µl de endotelina-1 (0.3 µM). Gasear y volver a tapar los viales. Las concentraciones finales de ISO seran: 0, 1nM, 10 nM, 33 nM y 0.1 µM, 0.3 µM, 1 µM y 10 µM. Para ello las concentraciones de partida seran: agua, 0.01 µM, 0.03 µM, 0.1 µM, 3 µM, 10 µM, 30 µM, 0.3 mM. La concentración final de endotelina-1 será 0.3 µM. La concentración de partida será, por tanto, 10 µM. 4. Incubar por espacio de 10 min a 37°C con agitación. 5. Parar las reacciones añadiendo 200 µl de HCl 1M frio. 6. Dejar en hielo por espacio de 20 min. 24 F. EXTRACCION DE [3H]cAMP 1. Añadir 750 µl de agua destilada fria 2. Centrifugar los viales (10 min x 2000 g) 3. Aplicar 0.9 ml del sobrenadante a las columnas Dowex, previamente equilibradas (ver esquema 1). 4. Descartar los eluidos 5. Añadir 1 ml de agua y descartar 6. Colocar la gradilla con las columnas de Dowex sobre la gradilla con las columnas de alumina (ver esquema 2). 7. Añadir 4 ml de agua sobre las columnas de Dowex. 8. Añadir otros 4 ml de agua. 9. Retirar las columnas de Dowex. 10. Lavar las columnas de Alumina con 1 ml de agua. 11. Colocar las columnas de Alumina sobre una gradilla que contenga los viales de centelleo (ver esquema 3). 12. Añadir 4 ml de imidazol 0.1 M. _________________________________________________________ 13. Recoger el eluido en los viales de centelleo (ver esquema 3). 25 14. Añadir 10 ml de líquido de centelleo para muestras acuosas a los viales. 15. Contar en un contador de centelleo. 16. IMPORTANTE: con objeto de calcular la radiactividad total incorporada, tomar 50 µl de 2 tubos, añadir 2 ml de líquido de centelleo y contar. 26 G. RESULTADOS 1. Los resultados se expresaran como cpm/50 µl de "slices" o bien se expresaran como porcentaje de la radiactividad incorporada/50 µl de "slices". 2. Se calcularan los valores de EC50, asi como los porcentajes de activación y/o inhibición respecto a los controles. Se calculará la significancia estadística de los resultados obtenidos. 3. Se expondran los resultados obtenidos por cada alumno y se hará una puesta en común. 27 H. BIBLIOGRAFIA Catalán RE, Gargiulo L, Martínez AM, Calcerrada MC, Liras A. Protein tyrosine phosphatase activity modulation by endothelin-1 in rabbit platelets. FEBS Lett 400, 280-284 (1997) Catalán RE, Aragonés MD, Martínez AM, Fernández I. Involvement of sphingolipids in the endothelin-1 signal transduction mechanism in rat brain. Neurosci. Lett 220, 121-124 (1996). Catalán RE, Martínez AM, Aragonés MD, Martínez A, Díaz G. Endothelin stimulates phosphoinositide hydrolysis and PAF synthesis in brain microvessels. J. Cereb Blood Flow Metab. 16, 1325-1334 (1996) Catalán RE, Martínez AM, Aragonés MD, Hernández F, Díaz G. Endothelin stimulates protein phosphorylation in blood-brain barrier. Biochem. Biophys. Res. 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Preparación de soluciones y columnas. MARTES Experimento 1 MIERCOLES Procesamiento muestras experimento 1. Experimento 2 JUEVES Procesamiento muestras experimento 2. VIERNES Representación gráfica de resultados. Análisis estadístico. Seminario.
