REALTOTAL ARN SPIN “PLANTAS Y HONGOS”

DANAGENE PLANT RNA PURIFICATION KIT
REF.0802.1 100 EXTRACCIONES
REF.0802.2 500 EXTRACCIONES
1.INTRODUCCION
1.1 Descripción del producto
Este kit permite la obtencion de ARN total libre de ADN a partir de diferentes tejidos y células de plantas y
muestras de hongos utilizando para ello columnas con una membrana de sílica.
El procedimiento incluye una pulverización de la muestra con Ni líquido, seguido de una incubación en la solución de
lísis que inactiva inmediatamente las RNasas y crea las condiciones de unión apropiadas para la absorción del ARN en
la membrana de sílica.Junto con la solución de lisis se añade una solución de PVP (polivinilpirrolidona) que actua
uniendo contaminantes como polisacáridos y polifenoles que pueden interferir o degradar el ARN.
Las sales, metabolitos y componentes celulares son eliminados por 2 pasos de lavado. Finalmente, el ARN es eluido
con agua libre de nucleasas.
DANAGENE PLANT RNA PURIFICATION KIT contiene 2 diferentes soluciones de lisis, una basada en guanidin
tiocianato, Tampón de Lisis 1,la más recomendada debido a su fuerte propiedad desnaturalizante y otra en guanidin
HCl, Tampón de Lisis 2 ya que en algunas plantas y mohos la presencia de determinados metabolitos conduce a una
solidificación del lisado, no siendo posible su procesamiento, en tales casos se utiliza la solución de lisis con guanidin
HCl (Tampón de Lisis 2)
1.2 Componentes del Kit
Componenetes
Tampón de Lisis 1
Tampón de Lisis 2
Solución de PVP
Tampón de Lacado RW
Tampón de Lavado(concentrado)*
Agua libre de Nucleasas
Columnas de unión ARN
Columnas de filtración
Tubos de recolección
Cantidad
25 ml
25 ml
5 ml
40 ml
25 ml
15 ml
100 unidades
100 unidades
200 unidades
Almacenamiento
T.A
T.A
T.A
T.A
T.A
T.A
T.A
T.A
* Para su preparación de la solución de trabajo y almacenamiento ver la sección 2.1
1.3 Almacenamiento y estabilidad
Todos los componentes son estables durante 6 meses desde la fecha de la compra siendo almacenados como se indica.
2. PROTOCOLO
2.1 Consideraciones preeliminares
 Añadir 100 ml de alcohol 100 % al Tampón de lavado concentrado, marcar la fecha .

Debido a la omnipresencia de RNasas es absolutamente esencial que todo el material inicial sea congelado en Ni
Líquido y conservado a –70ºC. Añadir las soluciones de lisis lo antes posible, una vez añadida la solución de lisis,
el lisado puede ser conservado a –70ºC durante meses.

El uso de -mercaptoetanol en la lisis es altamente recomendado para tejidos vegetales, particularmente en
aquellos que se sabe que tienen un alto contenido en RNAsas. También se recomienda para aquellos usuarios que
quieren aislar RNA para aplicaciones muy sensibles o enriquecimiento de microRNA. Alternativamente, la
Solución de Lisis RNA puede ser utilizada tal y como es suministrada.

ATENCION La Solución de Lisis 1 contiene guanidine tiociannato. La solución de Lisis 2 contiene guanidine
HCL. Protegerse con guantes y gafas. En caso de contacto lavarse con agua abundantemente.
2.2 Protocolo para 100 mg de tejido de plantas o hongos
Es necesario pulverizar los tejidos con Ni líquido debido a la omnipresencia de RNasas y para conseguir una lisis
óptima de los tejidos, sino fuera posible, los tejidos blandos (hojas jovenes, flores, etc) puede ser homogenizadas
directamente en la solución de lisis con un homogenizador eléctrico. Añadir la solución de lisis lo antes posible para
inactivar las RNasas.
1.
Añadir 400 l de Tampón de Lisis 1 + 40 l Solución de PVP + 4.0 l de -mercaptoetanol al tejido
pulverizado con Ni líquido. Homogenizar con homogenizador eléctrico manual.
2.
Centrifugar 2 minutos a máxima velocidad. Pasar el sobrenadante a una columna de filtración.
3.
Reducir la viscosidad y limpiar el lisado por filtración a través de una columna de filtración. Colocar la
columna de filtración en un tubo de recolección, aplicar el lisado y centrifugar 1 minuto a 8.000 x g.
Transferir el filtrado a un nuevo tubo de centrifuga. No agitar el pellet de desechos celulares que se puede
observar en el fondo del tubo de recolección después de la centrifugación. Este paso también elimina gran
parte del ADN genómico contaminante, no siendo total para aquellas aplicaciones que requieren una
eliminación total, para ello realizar un tratamiento con DNasa I en la columna o una vez eluido el
ARN.
4.
Añadir 400 l de Etanol 70 % al filtrado resultante del paso 3 y mezclar por vortex o pipeteo. Después de
añadirse el etanol se puede observar un precipitado que no afectará al proceso, asegurarse de cargar todo el
precipitado en la columna. Si después del paso 2 y 3 el volumen del lisado es menor de 400 l, añadir 1
volumen igual de etanol 70%.
5.
Coger una columna de unión ARN más su tubo de recolección y añadir el lisado. Centrifugar a 8.000 x g
(10.000 rpm)durante 60 segundos. Colocar la columna en un nuevo tubo de recolección. La capacidad
máxima de la columna es de 750 l. Repetir el proceso si mayores volúmenes son utilizados
6.
Añadir 400 l de Tampón de Lavado RW y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
7.
Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1 minuto.
8.
2º Lavado: Añadir 500 l de Tampón de Lavado y centrifugar a máxima velocidad(11.000 x g) durante 1
minuto.
9.
Centrifugar durante 3 minutos adicionales para eliminar todo el etanol residual. Eliminar el tubo de
recogida.
10. Colocar la columna en un microtubo nuevo de 1.5 ml ( no suministrado con el kit) para eluir el ARN total.
11. Eluir el ARN en 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y centrifugar a
máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
12. Eluir el ARN con otros 30-50 l de Agua libre de Nucleasas (suministrada).Incubar 2 minutos y
centrifugar a máxima velocidad (11.000 x g) durante 1 minuto.
3. GUIA DE PROBLEMAS Y SOLUCIONES
Dada la gran variedad de muestras que se pueden tratar para extraer ARN con este kit se hace difícil poder generalizar
los posibles problemas y soluciones. Es por ello, que recomendamos que no duden en ponerse en contacto con el
servicio técnico de DANAGEN-BIOTED para cualquier consulta adicional respecto a los protocolos de trabajo o
problemas que puedan surgir durante el trabajo. [email protected]