TRANSCRIPCION DEL ADN - Universidad de Chile

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS AGRONOMICAS
CICLO BASICO
BIOQUÍMICA
BIOSÍNTESIS
DE LAS
MOLECULAS
DE LA VIDA
ALEJANDRO RIQUELME
2001
2
SINTESIS O DUPLICACIÓN DEL ADN
Molécula de la vida.
El ADN es la molécula de la herencia en todos los organismos
vivos (procariontes y eucariontes). Sin embargo, en el caso de los
virus, el material genético puede ser ADN o ARN.
Todos los ADN están formados por dos muy largas cadenas
helicoidales de bases nitrogenadas, que son:
A : adenina
G : guanina
T : timina
C : citosina
Purinas
Pirimidinas
Estas bases se encuentran enrolladas a lo largo de un eje común.
Las dos hebras de la doble hélice están dispuestas en direcciones
opuestas, es decir, mientras una tiene dirección 5´  3´ la otra
tiene dirección 3´  5´.
Ejemplo de una molécula de ADN:
5´ ACTCGGAATGC 3´
3´ TGAGCCTTACG 5´
Las dos cadenas permanecen juntas por enlaces de hidrógeno
entre los pares de bases:
- Adenina siempre se aparea con Timina (unidas por dos
enlaces de hidrógeno)
- Guanina está siempre apareada con Citosina (unidas por
tres enlaces de hidrógeno).
De esto se desprende que una de las hebras de la molécula de
ADN es la complementaria de la otra.
Toda la información genética o de la herencia es codificada por
una secuencia precisa de bases a lo largo de la hebra de ADN.
3
La mayoría de las moléculas de ADN tienen la característica de ser
circulares.
Además el eje de la doble hélice de un ADN circular puede girar en
sí mismo, formándose una superhélice. Esta estructura recibe el
nombre de ADN sobreenrrollado, que es una forma más compacta
que una molécula relajada (sin giro sobre su propio eje).
ADN relajado
ADN sobrenrollado
Durante el proceso de duplicación de la molécula de ADN, lo
primero que debe ocurrir es el desenrollamiento
del ADN
sobrenrollado y luego las dos hebras del ADN son separadas para
que se pueda sintetizar una nueva molécula de ADN. Cada hebra
padre actúa como patrón para la formación de la nueva hebra
complementaria.
Experimento para probar que el ADN es el material genético.
Meselson y Stahl, en 1958, comprobaron que la duplicación del
ADN es semi-conservativa, esto quiere decir, que cada molécula
hija recibe una de las hebras del ADN padre.
Los investigadores crecieron bacterias en un medio que contenía
N-15 (nitrógeno 15; un isótopo de nitrógeno) y luego las bacterias
fueron transferidas a un medio con N-14 (nitrógeno 14; el isótopo
normal de nitrógeno), después ellos analizaron el ADN extraído en
cada generación obtenida (es decir, extrajeron el ADN después de
los ciclo reproductivo). Los resultados indicaron que el ADN de las
bacterias crecidas con N-15 estaban marcadas con N-15. En la
generación siguiente, después de ser transferidas al medio que
contenía N-14, ellos obtuvieron un ADN híbrido, marcado tanto
4
con N-14 como con N-15. Y en la
siguiente generación
encontraron una mezcla de dos tipos de ADN; una molécula de
ADN marcada con N-14 y la otra molécula correspondió a un ADN
híbrido (mezcla de N-14 y N-15)
Si tenemos que
N-15 = 
y
N-14 = ▌
Generaciones
0
1





▌
▌
▌
▌
▌
doble hebra de ADN
marcada con N-15
2
+
▌
▌
▌
▌
▌
2 ADN marcado con
N-14 y N-15
▌
▌▌
▌▌
▌
▌
▌▌
▌▌
▌
▌ + ▌▌ + ▌▌ + ▌
▌
▌▌
▌▌
▌
▌
▌▌
▌▌
▌
2 ADN marcados con N-14 y N-15
2 ADN con N-14
Figura 1. Esquema del experimento de Meselson y Stahl
demostrando que la duplicación es semi-conservativa.
Requerimientos para la duplicación del ADN.
En todos los organismos los requerimientos generales para la
síntesis de ADN son los mismos:
- una hebra de ADN como molde, en otras palabras una
sección de ADN que será copiado.
- la enzima encargada de copiar el ADN, llamada ADN
polimerasa.
5
El proceso de síntesis puede ser resumido como sigue:
Mg+2
d (NMP)n + d NTP
d (NMP)n+1 + PPi
ADN polimerasa
donde d NTP es el deoxirribonucleósido trifosfato y d (NMP)n se
refiere a un polímero de n deoxirribonucleotidos. El pirofosfato (PPi)
generado por la reacción anterior es hidrolizado a fosfato inorgánico
conduciendo la reacción hacia la derecha ( PPi
2Pi) .
Enzimas que participan en la duplicación.
En procariontes.La duplicación es un proceso complejo en la que participan
muchas proteínas. En
bacterias, como E.coli, existen 3
polimerasas (Tabla I) y una ADN ligasa.
- ADN polimerasa I.
Es una de las enzimas que es capaz de catalizar la síntesis
de ADN.
Posee una sola cadena polipetídica de 109 kDa.
Contiene un átomo de zinc como cofactor.
Esta enzima sintetiza en la dirección 5´-->3´ ( ver fig. 2).
Todas las ADN polimerasas poseen una actividad exonucleasa;
esto corresponde a la actividad de hidrolizar el ADN de hebra
simple, removiendo deoxirribonucleotidos terminales desde el
extremo 3´ (actividad exonucleasa 3´ 5´) o desde el extremo 5´
(actividad exonucleasa 5´ 3´).
6
- ADN polimerasa II
Esta enzima sintetiza ADN en forma similar a la ADN polimerasa I,
pero no tiene actividad exonucleasa 5´ 3´.
-ADN polimerasa III
La enzima esta compuesta por lo menos por 10 subunidades.
Todas las subunidades son requeridas para que la enzima exprese
su actividad total. Esta enzima es la responsable de la síntesis de
ADN en E.coli.
Tabla I.
ADN polimerasas de E. coli.
Base
sintetizada Dirección
por
a) polimer.
segundo b) exonucl.
Polimerasa
Mr (kDa)
Moléculas
por célula
I
109
400
16-20
a) 5’ 3’
b) 3’ 5’
y 5’ 3’
II
120
17-100
2-5
a) 5’ 3’
b) 3’ 5’
III
180
10
250-1000
a) 5’ 3’
b) 3’ 5’
y 5’ 3’
7
Origen de duplicación.
La síntesis del cromosoma de E.coli siempre comienza en el mismo
punto, llamado sitio ori C, una región de 245 pares de bases.
oriC
Enzimas que participan en la síntesis de ADN en Eucariontes.
Por otro lado, existen cinco polimerasas en eucariontes son
conocidas como alfa , beta , gamma , delta y épsilon. Todos
ellas tienen mecanismos de acción similares a las enzimas en
procariontes (E.coli).
- Las ADN polimerasas alfa y delta son las encargadas de
la duplicación del ADN cromosomal.
- La ADN polimerasa beta consistente de una sola cadena
polipeptídica es la responsable de la reparación del ADN.
- La ADN polimerasa gamma se encuentra en mitocondrias
y es responsable de la duplicación del ADN mitocondrial.
- La ADN polimerasa épsilon, enzima recientemente
descubierta y su actividad es similar a la polimerasa delta.
Proceso General de Síntesis de ADN (Fig. 2).
Las hebras de ADN son antiparalelas y la cadena del ADN que va
en dirección 3´  5´ es copiada directamente por la enzima ADN
polimerasa III. La hebra hija sintetizada (5´ 3´) es llamada
HEBRA PRINCIPAL o ADELANTADA.
La otra hebra del ADN padre que tiene la dirección opuesta, 5´ 3´,
no puede ser copiada directamente, debido que no es sustrato para
la enzima y solamente puede ser sintetizada hasta que una parte
8
del ADN se ha desdoblado. La hebra hija resultante se llama
HEBRA RETRASADA y es sintetizada en forma discontinua.
Esta síntesis discontinua resulta de la formación de cortas
secciones de ADN de aproximadamente 1000 a 2000 nucleótidos
que reciben el nombre de FRAGMENTOS DE OKASAKI. Estas
secciones son unidas por la acción de la enzima ADN ligasa
produciendo una hebra de ADN continua, que algunas veces se
conoce como ADN+.
ADN girasa (reduce los giros)
Proteinas SSB (cubren ADN de
una hebra)
Helicasas
(desdobla ADN)
Primosoma (hace el “primer”)
Holopolimerasa III
(agrega dNTPs)
Primer
Topoisomerasa
(relaja tensión)
Hebra
Adelantada
El primer es
removido y
llenado el
espacio
Hebra
Retrasada
Pol I
Ligasa
Figura 2. Proceso de síntesis de ADN.
Previo a la síntesis.
Previo al proceso de síntesis del ADN propiamente tal, el ADN
padre de doble hebra debe desenrollarse, para lo cual se requiere
la acción de la proteína REP o HELICASA que necesita energía
9
proveniente del ATP. Además en este proceso de desenrollamiento
participa la enzima ADN girasa, que actúa dando giros negativos
al ADN padre cuando este se encuentra sobre enrollado.
Etapa inicial de la síntesis.
Para comenzar la síntesis de ADN se requiere la presencia de
doble hebra
como patrón-cebador. La segunda hebra
corresponde a una hebra de
ARN, llamada “PRIMER” o
PARTIDOR y es sintetizada por una enzima llamada PRIMASA. La
forma activa de esta enzima requiere una serie de proteínas. Entre
estas proteínas se encuentra la PROTEINA N o dnaB, que
selecciona el sitio en que la primasa actuará. El complejo formado
entre la primasa y las proteínas auxiliares recibe el nombre de
PRIMOSOMA.
Regla para la Síntesis.
La regla principal para la actividad de la ADN polimerasa es que
cataliza la formación de un enlace fosfodiester solamente si la base
entrante es complementaria al nucleótido de la hebra padre. En
otras palabras las ADN polimerasas son enzimas dirigidas por la
hebra patrón o padre.
Como mencionamos anteriormente las ADN polimerasas I. II y III
poseen la actividad exonucleasa que permite aumentar la fidelidad
de la duplicación o replicación del ADN, removiendo los nucleótidos
que fueron puestos erradamente.
Proceso de Síntesis en procariontes
Una vez desenrollado la doble hebra de ADN, la enzima primasa
coloca el ARN partidor y de ahí comienza la síntesis de la hebra
hija por la acción de la enzima ADN polimerasa III. Recordemos
que esta enzima es la responsable de la duplicación, mientras que
la ADN polimerasa I actúa como enzima auxiliar sacando la hebra
de ARN partidor y luego sintetizando el trozo faltante, además ella
también participa en la reparación del ADN.
10
Durante el proceso de duplicación del ADN circular (E.coli) se
produce una estructura característica, formada por dos horquillas (o
frentes) de duplicación.
Dirección de
la replicación
La velocidad de síntesis en E.coli , es de 800 bases por segundo.
Otras proteínas del proceso de síntesis.
A continuación describiremos otras proteínas que participan en el
proceso de duplicación del ADN:
- HELICASA: son enzimas requeridas para desdoblar y abrir
la molécula de ADN padre debido que esto no ocurre
espontáneamente. Las helicasas requieren ATP como
cofactor.
Dos diferentes helicasas han sido descritas, una de ellas se
mueve en dirección 3´ 5´ del ADN padre y recibe el
nombre de REP o HELICASA II o COPOL III ( subunidad
beta de la ADN polimerasa III) y las otras se mueve en
dirección 5´ 3´, llamadas HELICASA I y III.
- PROTEINAS QUE SE UNEN A HEBRA SIMPLE (SSB):
Las hebras simples de ADN generadas por las helicasas
son mantenidas separadas por la unión de las proteínas
SSB a la hebra de ADN. (ver figura 3 y Tabla II)
- ADN LIGASA es una enzima que cataliza la formación de
enlaces fosfodiester entre polinucleótidos preformados. La
ADN ligasa esta involucrada en la síntesis de ADN
11
discontinua, uniendo los fragmentos de OKASAKI una vez
que se ha reemplazado el partidor de RNA. Ellas también
están involucradas en los mecanismos de reparación del
ADN dañado. Existe un solo tipo de ADN ligasa en
procariontes y dos en eucariontes; ambas funcionan en el
núcleo.
Tabla II. Principales proteínas de la duplicación de E.coli.
Proteínas
Proteína N o dnaB
Funciones
Primasa
Capacita a la primasa para comenzar la
duplicación
Sintetiza el ARN partidor.
Helicasas
Desdobla la doble hélice.
Proteínas SSB
Estabiliza regiones de hebra simple.
ADN girasa
Introduce giros a la superhélice.
ADN polimerasa III
Sintetiza el ADN.
ADN polimerasa I
ADN topoisomerasa I
Saca la hebra partidora y completa los
espacios.
Corta una hebra de ADN.
ADN topoisomerasa II
Corta ambas hebras de ADN.
ADN ligasa
Une los extremos de los polinucleotidos
preformados.
12
Duplicación del ADN en Eucariontes.
El mecanismo de síntesis del ADN en eucariontes es
probablemente similar al proceso en procariontes.
La velocidad de las polimerasas en eucariontes es mucho menor
que en procariontes. Para compensar esto, las células eucarioticas
contienen más de 20.000 moléculas de enzimas. Además, las
células eucarioticas tienen un gran número de horquillas de
duplicación y fragmentos de Okasaki mas pequeños de 40 - 300
bases. De esta forma la velocidad de duplicación del ADN es
mayor en eucariontes.
La ADN polimerasa delta es la encargada de sintetizar la hebra
principal o adelantada y la polimerasa alfa la hebra retrasada. El
ADN en eucariontes esta unido con histonas, por lo tanto la
duplicación involucra dos pasos extras;
- Primero el ADN se debe disociar de las histonas para
comenzar la duplicación.
- La síntesis de histonas tiene lugar al mismo tiempo que la
síntesis de ADN y las histonas se deben unir al nuevo
ADN.
Algunos virus poseen otra forma de sintetizar ADN, debido que
tienen una enzima llamada TRANSCRIPTASA REVERSA capaz de
usar como hebra molde la molécula de ARN.
13
5’ 3’
3’
Procariontes
3’
3’ 5’
Hebra
adelantada
3’ 5’
Hebra
retrasada
Figura 3. Esquema que muestra el loop que se forma en la hebra
retrasada para que la ADN polimerasa III
tenga la misma
posibilidad de actuar en ambas hebras.
5'
Primasa
Pol 
3'
5'
Helicasa
PCNA
Pol 
14
Figura 4. Síntesis de ADN en eucariontes.
Mutaciones
Las mutaciones son causadas por cambios en la secuencia de
bases de ADN. Los principales tipos son sustitución, supresión
e inserción. La sustitución de un par de bases por otra es la más
común mutación. Una transición es el reemplazo de una purina
por otra purina ( lo mismo ocurre con las pirimidinas).
Una
transversión es el reemplazo de una purina por una pirimidina o
viceversa.
Muchos potenciales cancerígenos pueden ser detectados por su
acción mutagénica en bacterías.
Gen Salvaje
5'- CGACTGT-3'
3'- GCTGACA-5'
Transición ( cambio del par A-T por G-C)
5'- CGGCTGT-3'
3'- GCCGACA-5'
Transversión (cambio del par A-T por T-A)
5'- CGTCTGT-3'
3'- GCAGACA-5'
Inserción (colocar un par extra ej: G-C)
5'- CGAGCTGT-3'
3'- GCTCGACA-5'
Supresión (suprimir el par A-T)
5'- CGCTGT-3'
3'- GCGACA-5'
15
TRANSCRIPCIÓN DE ADN Ó SINTESIS DE ARN
El flujo de la información genética en las células normalmente es:
ADN  ARN  Proteína
La síntesis de ARN usando un ADN
patrón es llamada
transcripción, mientras que la síntesis de proteína a partir de un
ARN patrón es llamado traducción.
Clases de ARN.
Existen tres clases de ARN:
- ARN mensajero (mARN)
- ARN de transferencia (tARN)
- ARN ribosomal (rARN)
En general, todos estos ARN son de hebra simple, pero el ARN de
transferencia y ARN ribosomal contienen extensas regiones de
doble hélice (la cadena de nucleótidos se dobla formando una
horquilla o loop).
Los ARN más pequeños son los tARNs, que contienen alrededor de
75 nucleótidos, mientras que el más grande esta entre los mARN,
que pueden tener más de 5.000 nucleótidos.
Enzima de la síntesis
Todos los ARN celulares son sintetizados por la ARN polimerasa
de acuerdo a las instrucciones dadas por un ADN-patrón (o molde),
empleando ribonucleósido-5’-trifosfatos como sustrato. La
dirección de la síntesis de ARN es 5’3’, similar a la síntesis de
ADN.
16
La actividad de la ARN polimerasa es diferente a la actividad de la
ADN polimerasa porque no necesita una secuencia partidora o
“primer” y no posee una actividad nucleasa. Otra diferencia es que
el ADN patrón es totalmente conservado después de la síntesis de
ARN.
La secuencia de ADN transcrito por la ARN polimerasa en ARN es
llamado UNIDAD DE TRANSCRIPCIÓN y el producto de la
síntesis (ARN) es el TRANSCRIPTO PRIMARIO.
La ARN polimerasa de E. coli (procariontes) esta formada por subunidades 2‘ y un peso molecular cercano al medio millón de
dalton (450 kDa).
El corazón de la enzima consiste de 2‘ (enzima núcleo).
La sub-unidad sigma (  ) aumenta la velocidad y especificidad de
la transcripción, debido que ayuda a la ARN polimerasa a
reconocer la señal de inicio en el ADN-patrón. La sub-unidad
sigma estaría reconociendo una región particular del ADN, que se
encuentra a 35 bases antes del sitio de inicio de la transcripción.
Esta región del ADN recibe el nombre de región PROMOTORA y
además de esta región, en E. coli existe otra región promotora a 10
bases antes del inicio de la transcripción y está región del ADN
esta relacionada con el lugar donde se une la enzima núcleo.
Región Promotora (E.coli)
-35
-10
+1
(ADN) ------- TTGACA ------- TATAAT ---------------------------Inicio de la
transcripción
El signo negativo indica que las bases se encuentran antes
del sitio de inicio de la transcripción
17
Proceso de síntesis
La unión de la ARN polimerasa a estas regiones promotoras
permiten un desenrollamiento local de 17 pares de bases de la
molécula de ADN - patrón (llamada burbuja de transcripción). La
síntesis de ARN siempre comienzan con GTP ó ATP, es decir, con
una base purina. La sub-unidad sigma se disocia desde la
holoenzima cuando se han trascrito 12 bases. Esta subunidad una
vez suelta puede unirse a otra enzima núcleo, permitiendo el inicio
de una nueva síntesis.
ARN polimerasa
+ 1 punto de inicio
-35
-10
3’
ADN
5’
5’
3’
Enzima núcleo
Subunidad
Sigma
(a)
+1 punto de inicio
-35
-10
5'
ppp

3'
(b)
18
ARN en
crecimiento
5'
p
p
p
ppp  NTP
-35
-10
Subunidad sigma
disociada
(c)
Figura 5. Inicio y elongación de la cadena de ARN (transcripción).
(a) Unión de la holoenzima a la región promotora (complejo
cerrado)
(b) Separación de la doble hebra (complejo abierto)
(c) Elongación en dirección 5'  3' , a los 12 nucleótidos transcritos
la subunidad sigma se disocia.
Las regiones promotoras afectan la frecuencia de inicio de la
transcripción. Lo anterior es reflejado en los siguientes ejemplos:
en cada célula de E. coli contiene solamente 12 moléculas de
“represor lac” y su gen es transcrito una vez cada 30 minutos.
Por otro lado, el gen de ARN ribosomal es transcrito una vez por
segundo aproximadamente.
19
Terminación de la Transcripción.
La terminación de la transcripción es tan controlado como su
iniciación. El ADN-patrón contiene señales de detención para la
transcripción. Existen dos mecanismos de terminación en E. coli:
uno es dependiente de una proteína auxiliar llamada factor rho y
otro independiente de este factor.
Terminación independiente del factor rho. Esto es distinguido
por la presencia de una secuencia rica GC en el ADN seguido por
cinco o seis adeninas. EL ARN transcriptos lógicamente también
posee esta región rica en GC, región que es capaz de formar un
“loop” o estructura de horquilla como resultado de interacción entre
bases complementarias. Además seguido de esta región rica en
GC, en el extremo 3’ del ARN aparece una secuencia rica en
uracilo. Se ha observado que la unión Uracilo con Adenina de la
hebra de ADN molde es menos estable y así el ARN es capaz de
disociarse ( ver fig. 6 ). Por consiguiente el duplex ADN-ARN se
suelta y se libera el ARN sintetizado.
C
U
C
U
C
G -- C
A -- U
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
C -- G
G
3'
5' U - A - A - U - C - C - C - A - C - A - G
OH
---
C
A-U-U-U-U-
Figura 6. Estructura secundaria del ARN sintetizado (señal de
termino).
20
Terminación dependiente del factor rho. También requiere la
presencia de la estructura de horquilla (región rica en GC). Sin
embargo, la secuencia rica en U está ausente. El factor rho, es una
proteína compuesta por seis sub-unidades idénticas de 46 KDa y
tiene una alta afinidad por ARN de hebra simple. Cuando se une al
ARN, el factor rho hidroliza ATP y la energía liberada es capaz de
mover este complejo proteico (factor rho) a lo largo del ARN que se
esta sintetizando en dirección de la burbuja de transcripción.
Cuando llega a dicha burbuja, el factor rho disocia el híbrido ADNARN por un mecanismo desconocido, liberando el ARN al
citoplasma (ver fig. 7).
ARN polimerasa
Factor rho
ADP + Pi
5'
ATP + H2O
Figura 7. Terminación dependiente de rho
La transcripción puede ser bloqueada por inhibidores específicos,
llamados comúnmente antibióticos. Por ejemplo, el antibiótico
rifampicina inhibe la iniciación de la síntesis de ARN, mientras
que la actinomicina D bloquea la elongación del ARN.
21
Transcripción en eucariotes
La maquinaria transcripcional de eucariontes es lejos más complejo
que en procariontes. Una importante consideración es que en
eucariontes superiores solamente una pequeña proporción del
genoma es expresada a ARN (cerca de 10% como máximo). Una
considerable proporción del genoma de eucariontes existe
permanentemente como cromatina (ADN cromosomal) altamente
condensada y es transcripcionalmente inerte. Adicionalmente,
hay proteínas accesorias específicas llamadas FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN
y son requeridos para una transcripción
eficiente de todos los genes de eucariontes.
Diferente al factor bacterial sigma (), los factores de transcripción
no se unen a la polimerasa directamente. Ellos forman complejos
con la cromatina (ADN cromosomal) antes del inicio de la
transcripción y actúa como un regulador positivo de la transcripción.
Enzimas de la trancripción en eucariontes.
El núcleo de eucariontes contiene tres tipos de ARN polimerasas:
- ARN polimerasa I (localizada en el nucléolo) transcribe los genes
de ARN ribosomal. El transcrito primario producido corresponde a
un pre-rARN que posteriormente sufre algunas modificaciones para
transformarse en una rARN maduro.
-ARN polimerasa II (se encuentra en el nucleoplasma) transcribe
los genes que codifican para proteína y el transcrito primario
corresponde a un ARN nuclear heterogéneo (hnARN), que son los
precursores del ARN mensajeros citoplasmático.
-ARN polimerasa III (nucleoplasmática) transcribe el rARN 5S
(ARN ribosomico) y los tARNs (ARN de transferencia).
22
La reacción catalizada por todas las polimerasas en eucariontes es
bioquímicamente la misma que la reacción de las enzimas de E.
coli (procariontes).
Todas las polimerasas eucarionticas son grandes moléculas con
masas que exceden los 500 kDa.
Ellas contienen dos subunidades con masas superiores a 100 kDa, cada una de las
cuales es una polimerasa específica y además poseen 12 subunidades menores, algunas de las cuales son comunes a los tres
tipos de polimerasas. La precisa función de cada sub-unidad es
aún desconocida.
Región promotora para la actividad de ARN polimerasa I
Para el caso particular de la ARN polimerasa I que sintetiza el ARN
ribosomal. En el gen (ADN) para el rARN presenta una región
promotora de 150 pares de bases, ubicada en la posición -142 y
+6.
Sin embargo, existen copias imperfectas del largo total del
promotor en posiciones -1200 y -2300 pares desde el sitio de inicio
de la transcripción y entre estas regiones hay múltiples copias de
60 ó 81 pares de bases de la región promotora ( ver Fig. 8).
Las copias 60/81 estimulan la transcripción del verdadero promotor
y puede estar involucrado en la unión de un factor presente en
cantidades limitadas. Las copias totales de los promotores pero
imperfectos son capaces de iniciar la síntesis de ARN, pero este
efecto termina antes de alcanzar la verdadera región promotora.
Punto de inicio
gen
28S rARN
-4000
Promotor
espaciador
repeticiones
de 60/81 bp
-2000
Promotor
del gen
+1
Gen
18S rARN
23
Figura 8. Región promotora del gen de rARN, con una región
promotora verdadera ( ) y con copias imperfectas de ella ( . ).
Región promotora para la ARN polimerasa II.
Los genes transcritos por la polimarasa II producen los ARN
mensajeros.
Estos incluyen los genes que codifican a las
proteínas que son expresadas constitutivamente (que siempre
son expresadas) en todos los tejidos y aquellos genes que
solamente son expresados en un tejido particular de un organismo
multicelular o que esta regulado por la presencia o ausencia de un
sustrato particular, hormona o estímulo ambiental.
Los promotores para la ARN polimerasa II están localizados en el
lado 5’ del sitio de inicio de la transcripción.
-80
-25
inicio
--CAAT----------GGGCCCGGG------GGGCCGGG---------TATA--------
Estas secuencias tienen la función de unir los factores de
transcripción específicos en vez de dirigir los puntos de contacto
con la ARN polimerasa II, como ocurre en procariontes. Varios
promotores que están relativamente cercanos al punto de inicio de
la transcripción, son necesarios pero normalmente insuficientes
para que se realice una eficiente expresión de los genes por la
enzima ARN polimerasa II.
Además existen otros tipos de secuencias en el ADN molde
llamadas “ ENHANCER” que no tienen actividad promotora por si
mismas, pero que pueden estimular la transcripción y pueden
actuar sobre considerables distancias de varios kilobases del sitio
de inicio de la transcripción. Una característica de los “enhancer” es
24
que realizan su acción independiente de la orientación que ellos
tengan (Fig. 9)
-8,000
Enhancer
+1
Promotor
Sitio de inicio
Figura 9. Esquema de la posición del “Enhancer” con respecto al
promotor.
El transcrito primario de la ARN polimerasa II, son conocidas
colectivamente como ARNs nucleares heterogéneos. Ellas pueden
llegar a ser grandes moléculas (sobre 10 kilobases) debido que
contiene aún los intrones (secuencia que no son traducidas a
proteína) en la secuencia de ARN, pero ellas no estarán presente
en el ARN maduro.
SINTESIS DE ARN MENSAJEROS
La síntesis de un mARN en eucariontes (ver fig. 10):
- (1) Comienza la transcripción de un ADN cuando una ARN
polimerasa se encuentra a 20 o 30 nucleótidos después de la
secuencia TATA.
- (2) Cuando el transcrito (ó ARN) ha alcanzado 30 nucleótidos de
largo, en su extremo 5’ es colocado una guanosina unido a un
grupo trifosfato que además es metilado.
- (3) La ARN polimerasa se nueve a lo largo del ADN
transcribiendo tanto exones como intrones. Hasta que se
transcribe la secuencia AAUAAA, después de cerca de 20
nucléotidos de esta secuencia, el transcrito es cortado; la
reacción
probablemente
involucra
una
pequeña
ribonucleoproteína nuclear
(snRNP) que
contiene una
molécula de ARN ( “U1 ARN”) rico en uracilo.
25
- (4) Una enzima adiciona una secuencia de 150 a 200 adeninas
en el extremo 3’ de la hebra de ARN naciente.
- (5) El transcrito es procesado y son cortados los intrones,
probablemente con la ayuda de otras snRNPs; y nuevamente
U1 ARN se une a una secuencia complementaria (que incluye
GU) en el comienzo del intron, también en este proceso
participan otras 6 moléculas de ARN (denominadas U2,U3,...U7)
- (6) Los intrones son doblados y cortados
- (7) Los exones son unidos para formar finalmente el ARN
mensajero maduro
La mayoría de los genes en eucariontes superiores son
discontínuos. Las secuencias que se codificaran en estos genes
(exones) son separadas por secuencias que no son traducidas
(intrones), que son removidos en la conversión del transcripto
primario a mARN maduro.
(1)
ARN Polimerasa II
ADN
TATA
(2)
TATA
+CH3
Transcrito primario
G -P-P-P
Enzima
26
(3)
CH3
AAUAA
A
G -P-P-P
A
snRNP
U1 ARN
Enzima Poli (A)
(4)
CH3
!
G - P -P -P
AAUAAA
AAAA...
(5)
snRNP
U1 ARN
CH3
!
G - P -P -P
GU
GU
AAAA...
27
GU
(7)
AAAA...
GU
!
G - P -P -P
GU
CH3
GU
(6)
CH3
!
G - P -P -P
AAAA...
Figura 10. Transcripción de un mARN en Eucariontes (las
explicaciones se encuentran en el texto).
ARN Polimerasa III
Los genes transcritos por la ARN polimerasa III ( rARN 5S, tARN
y varios ARNs nucleares y citoplasmáticos pequeños) usualmente
contiene menos de 300 nucléotidos. Genes de rARN 5S no
contienen intrones mientras que muchos genes de tARN poseen
pequeños intrones.
Región Promotora para la acción ARN polimerasa III.
28
El control de transcripción mejor estudiada es del gen rARN 5S,
que inesperadamente tiene una secuencia promotora dentro de su
secuencia transcrita.
Se ha determinado que la región interna
promotora esta entre las posiciones + 50 y + 84, que mostró ser
esencial para la transcripción de los genes rARN 5S (fig. 11). En
la regulación de las síntesis de rARN 5S existen factores llamados :
TFIIIA, TFIIIC, que son requeridos para una transcripción eficiente.
Gen 5S rARN
Región
Promotora
5'
3'
5S rARN
-80
-40
0
+40
+80
+100
Figura 11. Localización de la región promotora del gen 5S rARN de
X. laevis.
Modificaciones Post Transcripcionales
Muchos ARNs son modificados químicamente (Ej. metilados) y
escindidos o cortados después de la transcripción. Los mARNs son
modificados por acoplamiento de una larga cadena de poli-A a su
extremo 3’. Los rARNs se generan a partir de una larga cadena
precursora que finalmente es escindida para rendir los ARNs
maduros.
29
CÓDIGO GENÉTICO
La secuencia de bases de un gen es colineal con la secuencia
aminoacídica de su producto polipeptídico. El código genético es
la relación entre la secuencia de bases en el ADN (o su ARN
transcrito) y la secuencia de aminoácidos en una proteína.
Los aminoácidos son codificados por un grupo de tres bases
(llamadas codones) comenzando de un punto determinado (ver
fig. 12).
Se pueden definir cuatro características generales del código
genético:
1) El código no requiere de puntuación ni señal alguna para indicar
el final de un triplete y el comienzo del siguiente, es decir el
código genético no tiene “comas”. Únicamente requiere de una
molécula de mARN que este ubicada correctamente para su
lectura (5´3´) además de contar con el codón de inicio, AUG
(en procariontes codifica la incorporación de N-formilmetionina y
en eucariontes metionina).
2) 61 de 64 codones especifican algún aminoácido en particular.
De esta forma, para la mayoría de los aminoácidos hay más de
un triplete
(o codón).
En otras palabras, el código es
DEGENERADO. Codones que especifican el mismo aminoácido
son llamados sinónimos. La mayoría de los sinónimos difieren
solamente en la última base del triplete. Esto presenta una
ventaja, debido a que la mayoría de las mutaciones conducen a
la formación de tripletes sinónimos no provocando un cambio en
la secuencia peptídica.
3) La tercera base de los tripletes es menos especifica que las dos
primeras. La degeneración implica solamente la tercera base en
30
la mayoría de los casos (excepto para Arginina, Leucina y
Serina).
4) 3 de los 64 tripletes no codifican para aminoácido alguno y estos
son UAG, UAA y UGA llamados originalmente codones “sin
sentido” que constituyen las señales de termino de la síntesis de
la cadena polipeptídica.
SEGUNDA LETRA
U
C
A
G
UUU
UUC
Phe UCU
Phe UCC
Ser
Ser
UAU
UAC
Tyr UGU
Tyr UGC
Cys
Cys
UUA
UUG
CUU
CUC
Leu
Leu
Leu
Leu
UCA
UCG
CCU
CCC
Ser
Ser
Pro
Pro
UAA
UAG
CAU
CAC
Stop
Stop
His
His
UGA
UGG
CGU
CGC
Stop
Trp
Arg
Arg
CUA
CUG
AUU
AUC
Leu
Leu
Ile
Ile
CCA
CCG
ACU
ACC
Pro
Pro
Thr
Thr
CAA
CAG
AAU
AAC
Gln
Gln
Asn
Asn
CGA
CGG
AGU
AGC
Arg
Arg
Ser
Ser
AUA
AUG
GUU
GUC
Ile
Met
Val
Val
ACA
ACG
GCU
GCC
Thr
Thr
Ala
Ala
AAA
AAG
GAU
GAC
Lys
Lys
Asp
Asp
AGA
AGG
GGU
GGC
Arg
Arg
Gly
Gly
GUA
GUG
Val GCA
Val GCG
Glu GGA
Glu GGG
Gly
Gly
PRIMERA LETRA
U
C
A
G
Figura 12. Código genético.
Ala GAA
Ala GAG
31
SÍNTESIS DE PROTEÍNAS
La síntesis de proteínas tienen lugar en la superficie de los
ribosomas. Dicha síntesis requiere que los aminoácidos sean
“activados” en el citoplasma por la acción de aminoacil- tARNsintetasas, que catalizan la formación de ésteres de aminoácidos
de tARN homólogos (unión de un aminoácido con su tRNA
respectivo) y en forma conjunta en el proceso de activación se
hidroliza ATP produciendo AMP y pirofosfato.
Las aminoaciltARN-sintetasas son altamente específicas tanto para el
aminoácido como para su correspondiente tARN.
Aminoacido + ATP
Aminoacil- AMP + tARN
Aminoacido + ATP + tARN
aminoacil – AMP + PPi
aminoacil-tARN + AMP
aminoacil –tARN + AMP + PPi
El aminoácido se une al extremo 3’ del tARN que posee la
secuencia CCA, mientras que el anticodón esta a 80 Å de
distancia en el otro extremo (ver fig. 13).
32
3’
A
C
5’ C
Loop DHU
Sitio de unión
al aminoácido
Loop TC
anticodón
Figura 13. Estructura de hoja de trébol característica de un tARN
El ARN mensajero reconoce el anticodón de un tARN en vez de
reconocer el aminoácido. Un codón en mARN se aparea con el
anticodón en el tARN. Algunos tARNs reconocen más de un codón
porque la tercera base que se aparea de un codón es menos
especifica que las otras dos ( ver código genético).
Los Ribosomas.
La síntesis de proteína tiene lugar en los ribosomas, que están
formados por una subunidad mayor y una menor, cada una de las
cuales están compuestas de dos tercios de ARNs y un tercio de
proteínas. En E. coli, por ejemplo, el ribosoma 70 S ( 2.500
kdal) está formado por una sub-unidad de 30 S y una de 50 S. En
33
cambio en eucariontes el ribosoma es de 80 S, formado por uno de
40 S y uno de 60 S.
- El coeficiente de sedimentación de macromoléculas biológicas
son expresadas en unidades Svedberg (abreviada como S).
1 S = 10-13 seg.
Hay tres fases en la síntesis de proteína: inicio, elongación y
termino.
CADENA NASCIENTE
INICIO
INICIO
5'
3'
STOP
40 S
ELONGACION
TERMINO
40 S
60 S
60S
40 S
60 S
Figura 14. Ciclo de la síntesis de proteína.
Inicio.
En procariontes el ARN mensajero, la formilmetionina- tARN y la
sub-unidad ribosomal 30 S, forman el complejo iniciación de la
síntesis (en cambio para eucariontes este complejo está formado
por mARN, metionina-tARN y la sub-unidad 40 S, ver fig. 14).
34
La señal de inicio en el mARN es AUG y esta precedida por una
secuencia rica en purina que puede aparearse con el rARN 16 S
de la sub-unidad 30 S del ribosoma. La subunidad mayor ribosomal
de 50 S se une a este complejo para formar un complejo de
iniciación de 70 S, (ver fig. 15) que esta listo para la siguiente
fase (elongación). En el proceso de iniciación están participando
una serie de factores proteícos que son descritos en la Tabla IV.
mARN
fMet.tARNMet
30S
IF-1 IF-3
IF-1 IF-3
IF-2 GTP
IF-2·GTP·fMet-tARN Met
GDP +Pi
IF1
IF2
50 S
30 S
Complejo de inicio 70 S
Figura 15. Fase de inicio de la síntesis de proteína en baterias
(procariontes). 30S y 50 S son la subunidad menor y mayor del
ribosoma respectivamente. IF, son factores proteicos de inicio.
35
Elongación.
El ciclo de elongación consiste en (ver fig. 16) :
1) La unión de aminoacil-tARN (reconocimiento del codón).
2) Formación del enlace peptídico.
3) Transposición.
También durante la elongación se requiere la presencia de factores
proteicos que son descritos en la Tabla V.
La dirección de lectura del mARN es de 5´ 3´y el crecimiento de
la cadena polipeptidica es hecho desde el extremo amino al
extremo carboxilo.
Sitio E
f- Met
Sitio A
Sitio P
f-Met
Ingreso del
aminoaciltARN al sitio A
GTP
AUG- CGA- GCU------------3’
Arg
GDP
+
Pi
----------------AUG.CGA
-
Inicio de un
nuevo ciclo
f- Met
|
Arg
|
Formación del
enlace peptídico
catalizado por la
peptidil transferasa
Sitio A
vació
f- Met
|
Arg
|
Translocación
GDP
+
Pi
GTP
36
-AUG-CGA-GCU-----GCU
----------------- AUG-CGA-
Figura 16. Fase de elongación de la cadena peptídica: unión del
aminoacil-tARN, formación del enlace peptídico y translocación.
Termino.
La síntesis de proteína es terminada por factores de liberación,
que reconocen los codones de terminación UAA, UGA y UAG
provocando la hidrólisis entre el polipeptido y el tARN (Tabla VI).
La energía requerida tanto en la formación del complejo de
iniciación son 70 S como en la unión del aminoacil- tARN al
ribosoma, y en la transposición son obtenidos de la hidrólisis del
GTP ( ver Tabla VII ).
Varios pasos en la síntesis de proteína son específicamente
inhibida por toxinas y antibióticos. Por ejemplo, puromicina inhibe
la síntesis de la cadena peptídica por su interacción con el peptidil
- tARN en la ribosoma, formando peptidil- puromicina que libera el
complejo ribosomal ( ver Tabla VIII).
Por otro lado, los polirribosomas, también denominados
polisomas, consisten en moléculas de mARN a las que están
adheridos muchos ribosomas, cada uno de los cuales, leen el
mARN independientemente y construyen una cadena polipeptídica.
En las células eucarióticas, la síntesis proteíca puede tener lugares
en ribosomas libres, o bién, en los ribosomas unidos al retículo
endoplasmático.
37
También existe síntesis proteíca en las mitocondrias y en los
cloroplastos, los cuales poseen
mARNs, tARNs específicos,
aminoacil- tARN-sintetasas y ribosomas.
Anexo 1.
TABLA IV. FACTORES DE INICIACIÓN DE PROCARIONTES Y
EUCARIONTES
FACTOR
BACTERIAL
FACTOR
EUCARIONTES
FUNCIÓN
IF- 1
IF- 2
elF - 1
elF - 2
Los roles no están claros
Une Met- tARN (o fMet - tARN ) a los
ribosomas en el complejo con GTP.
IF- 3
elF -3
Impide la reasociación de las sub-unidades
ribosomales.
elF -4A
elF -4B
elF -4E
elF -4F
Un grupo de factores liberados responsables de la unión al extremo bloqueado
del mARN y desdoblar alguna estructura
secundaria para capacitar a los ribosomas
en el reconocimiento del codón de inicio.
elF -5
Libera elF-2 y elF-3 del ribosoma y
permite la unión de la sub-unidad 60 S
elF -6
Involucrada en la disociación del ribosoma
en sus sub-unidades.
GEF
(Factor de intercambio de la guanina:
recicla elF-2 mediado por intercambio de
GDP por ATP en un proceso análogo que
para reciclar EF.Ts)
38
TABLA V.
FACTORES DE ELONGACIÓN
FACTOR
BACTERIAL
FACTOR
EUCARIOTICO
ED-Tu
(43 kDa)
EF - 1
(53 kDa )
EF - Ts
( 30 kDa)
EF - 1
(50/38 kDa)
EF - G
EF -2
FUNCIÓN
Unir aminoacil- tARN al sitio A del
ribosoma como por ejemplo, complejo
(EF-1 GTP, aminoacil-tARN).
Reciclar EF -Tu o EF - 1 respectivamente
Involucrado en los pasos de translocación
de los ciclos de elongación.
--------------------------------------------------------------------------------------------------------
TABLA VI. FACTORES DE TERMINACIÓN (O LIBERACIÓN)
BACTERIA ( E. coli )
RF -1
( Para UAA o UAG)
RF-2
( Para UAA o UGA )
RF-3
(estimula RF-1 y RF-2)
EUCARIOTES
eRF ( con los tres
codones de termino)
39
TABLA VII. REQUERIMIENTOS ENERGETICOS PARA LA TRADUCCION:
LA ORGANIZACION REQUIERE EL INGRESO DE ENERGIA LIBRE DESDE
LA HIDROLISIS DEL ATP O GTP
PROCARIONTES
EUCARIONTES
Aminoacilación
del tARN
ATP  AMP + PPi
ATP AMP + PPi
(e.i. 2 enlaces de alta energía por aminoácido)
Iniciación
GTP GDO + Pi,
asociado con IF-2
GTP GDP + Pi,
asociado con elF-2
ATP ADP + Pi,
asociado con el extremo
de guanina y el
desdoblamiento del
mARN. (no esta claro
cuantos ATPs son
usados)
Elongación
Terminación
GTP GDP + Pi,
asociado con EF-Tu
GTP GDP + Pi,
asociado con EF-1
GTP GDP + Pi,
asociado con EF-G
GTP GDP + Pi
asociado con EF-2
Probablemente no
requiere energía
GTP GDP + Pi
40
TABLA VIII.
INHIBIDORES DE TRADUCCIÓN
INHIBIDOR
SELECTIVIDAD
ACCIÓN
-------------------------------------------------------------------------------------------------------Cloramfenicol
Procariontes
Elongación: inhile peptidil
transferasa.
Cicloheximida
Eucariontes
Elongación: mecanismo
incierto.
Eritromicina
Procariontes
Elongación: inhibe
transpeptidación
Ácido Fusidico
Ambos
Elongación: bloquea la
liberación del complejo
EF-G o EF-2 GDP.
Kanamicina
Ambos
Elongación:causa error en la
lectura.
Neomicina
Ambos
Iniciación y elongación:
causa error de lectura del
mARN.
Puromicina
prematura
Ambos
Elongación:
causa
terminación.
Sparsamicina
Ambos
Elongación: inhibe peptidiltransferasa.
Spectinomicina
Procariontes
Elongación: inhibe transpeptidación.
Treptomicina
Procariontes
Elongación: se une a la subunidad 30 S e interfiere con
41
la interacción codón-anticodón causando error de lectudel mARN.
Tetramicina
Procariontes
Elongación: bloquea la unión
de aa- tARN al sitio A.
Anexo 2.
EJERCICIOS
1.- Escribir la secuencia complementaria en dirección 5’ 3’
a) 5’- GATCAA- 3’
b) 3’- ACTGGCCTAA -5’
c) 5’- ACCTAGGGTA -5’
d) 3’- CCTGGATTAAG -5’
2.- Compare la ADN polimerasa I y la ARN polimerasa de E.coli
en cuanto a:
a) estructura de subunidades.
b) precursores activados
c) dirección de elongación de la cadena
d) actividad exonucleasae) conservación del
ADN molde
f) necesidad de una hebra particular.
d) energética de la reacción de elongación
3.- Escribir las secuencias de los mARN sintetizados de los
siguientes ADNs
a) 3’- ATTGCCATGCTA-5’
b) 5’- AGCTACTTAACG-3’
c) 3’-GGACCTACGTT.5’
Además indique cuales son los codones sin sentido presentes.
42
4.- Cuantos aminoácidos pueden ser codificados de las siguiente
secuencia de mARN.
a) Asumiendo que comienza la lectura en el extremo 5’
inmediatamente.
b) Comenzando en forma normal establecida por el código
genético.
4. 14. 24. 3-
5’- UUGCCUAUGGAUUGGAUG-3´
3’-AUGUAGGUAAAGGUAGGCC-5’
3’- AGCGCCAGUGACCAUGUA-5’
5.- Que secuencia es formado por la adición de un poli (UUAC) a
un sistema de síntesis de proteínas.
6.- El ARN transcrito de una región del ADN del fago G4
conteniendo la siguiente secuencia ( este tipo de ADN tiene una
traducción superpuesta)
5’ - TCCTCATTT - 3’
Esta región codifica para diferentes proteínas. cuales son sus
secuencias.