Guia de proteínas

CÁTEDRA: BIOQUÍMICA
Carreras: Farmacia
Profesorado en Química
Licenciatura en Química
Lic. en C. y T. de los Alimentos
PÉPTIDOS Y PROTEÍNAS
1) Escriba en fórmulas el pentapéptido Phe-His-Met-Leu-Asp. Sometido el mismo a una
electroforesis, ¿hacia qué electrodo migrará a pH = 7 y a pH = 2?
2) ¿Cuál es la carga neta del tetrapéptido DCRK a: 1) pH = 5; 2) pH = 14. ¿Cuál será el pI
de este tetrapéptido?
3) ¿A cuál de los siguientes pHs se separará mejor por electroforesis una mezcla de los
aminoácidos Pro, Asp y Lys a: a) pH = 2; b) pH = 7; c) pH = 12?
4) Escriba la fórmula del pentapéptido Pro-Glu-Asp-Trp-Ser. Calcule su pI. Indique hacia
qué electrodo migrará cuando se lo someta a electroforesis a pH= 7 y a pH= 2.
5) La angiotensina II es un octapéptido que cumple funciones biológicas importantes,
participando en la regulación de la presión sanguínea y de la formación y secreción de
aldosterona. Dada la secuencia aminoacídica de la angiotensina II: Asp-Arg-Val-Tyr-IleHis-Pro-Phe, escriba en fórmulas el octapéptido. Calcule su punto isoeléctrico.
6) Al realizar la síntesis de un tripéptido un estudiante descubre que la mezcla de
reacción contiene dos tripéptidos. Tripéptido A: Glu-Ala-Lys; Tripéptido B: Glu-Ala-Ala.
Decide entonces separarlos mediante electroforesis en papel. a) Calcule los pI para cada
péptido. b) A partir de los resultados anteriores ¿qué pH debería usar para recuperar el
péptido A en el cátodo?
7) Se resolvieron electroforéticamente cuatro dipéptidos de una mezcla y se determinó
experimentalmente el pI de cada uno de ellos. Por otro mecanismo se obtuvo la
composición de cada dipéptido.
Composición de dipéptidos obtenidos: Asp-Glu; Ala-Ala; Ala-Lys; Ala-Glu.
pI obtenidos: 10,11- 6,3- 3,25 y 2,98.
¿Podría correlacionar cada pI determinado con cada dipéptido?
8) Una proteína que contiene Fe fue tratada con bromuro de cianógeno. Se produjeron
tres polipéptidos de PM 250000, 116000 y 50000, respectivamente, cuyos grupos amino
terminales fueron Phe, Tyr y Leu. El tratamiento con tripsina de estos péptidos produjo
dos polipéptidos más, cuyos grupos terminales fueron Ala y Thr.
Indique el peso molecular de la proteína y el número de moles de residuos de Met por
mol de proteína. Si dicha proteína se encontrara fosforilada en el grupo amino terminal,
indique cuál sería dicho aminoácido.
9) ¿Cuántos aminoácidos están contenidos en una proteína de PM = 32.000, sabiendo
que el peso molecular promedio de un aminoácido en la cadena polipeptídica es de 110?
¿De dónde proviene este valor de masa molecular 110 Da?
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10) Un antibiótico polipeptídico de Bacilus brevis forma complejos con iones metálicos,
inhibiendo el transporte iónico a través de las membranas, y en consecuencia mata a
ciertas especies bacterianas. En el análisis de la estructura se encuentra que:
a) La hidrólisis ácida completa del péptido seguida del análisis de aminoácidos dio
cantidades equimoleculares de Leu, Pro, Orn, Val y Phe.
b) La medida del PM dio 1100 aproximadamente.
c) No se hidrolizó con carboxipeptidasa.
d) El tratamiento del péptido con fluorodinitrobenceno seguido de hidrólisis completa y
cromatografía no generó ningún derivado dinitrofenilado en N-alfa.
e) La hidrólisis parcial del péptido seguida de separación cromatográfica y secuenciación
generó los siguientes péptidos:
Leu-Phe
Phe-Pro
Val-Orn-Leu
Orn-Leu
Phe-Pro-Val
Val-Orn
Pro-Val-Orn
Deduzca la secuencia del péptido.
11) Determine la secuencia de un tetrapéptido con las siguientes características:
a) Contiene un aminoácido que interrumpe la estructura secundaria de alfa-hélices.
b) Al tratar el tetrapéptido con el reactivo de Sanger se obtiene un derivado dinitrofenilado
ópticamente inactivo.
c) Al tratarlo brevemente con carboxipeptidasa libera el más básico de los aminoácidos.
d) El péptido no contiene azufre, pero posee el grupo imidazol.
e) Puede romperse en dos péptidos; ambos dipéptidos migran hacia el cátodo en una
electroforesis a pH = 7.
12) Ud. aisló de un homogenado de cerebro un péptido con actividad de encefalina
(opioide). Éstos se unen a receptores localizados en el cerebro (a los que se unen drogas
derivadas del opio, morfina) disminuyendo el dolor. Al analizarlo encuentra que:
a) La hidrólisis completa en HCl 6 M a 110ºC seguida del análisis de aminoácidos indica
la presencia de Gly, Leu, Phe y Tyr en una relación 2:1:1:1.
b) El tratamiento del péptido con 2,4-dinitrofluorobenceno seguido de hidrólisis completa y
cromatografía indicó la existencia de Tyr-DNP. No se encontró Tyr libre.
c) La hidrólisis con quimotripsina seguida de cromatografía indicó la presencia de Leu y
Tyr libres y un tripéptido cuya composición en aminoácidos indicó la presencia de Gly y
Phe en una relación 2:1.
Determine la secuencia de esta encefalina.
13) La angiotensina II es un péptido biológicamente activo, que en animales tiene un
efecto hipertensivo estimulando la liberación de aldosterona de glándulas adrenales. Un
estudio realizado con angiotensina II de caballo brindó los siguientes resultados:
a) El tratamiento de la angiotensina II purificada con tripsina rindió un dipéptido
(conteniendo Arg y Asp) y un hexapéptido.
b) El hexapéptido del paso anterior se purificó y se trató con quimotripsina, obteniéndose
un dipéptido (conteniendo Tyr y Val) y un tetrapéptido.
c) Luego de purificar este tetrapéptido se trató con papaína, obteniéndose dos péptidos
diferentes, uno conteniendo His e Ile y el otro Phe y Pro.
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d) En todos los casos los productos guardaban una relación molar 1:1.
En base a estos datos escriba con el código de tres letras y en fórmulas la angiotensina II
de caballo y calcule su punto isoeléctrico.
14) Deduzca la secuencia de aminoácidos de un péptido a partir de la siguiente
información:
a) La composición es Met, Tyr, Ser, Phe, Gly, Lys y Ala.
b) Tratado con el reactivo de Sanger da como único derivado el di-DNP-lisina, en los
carbonos alfa y epsilon de la misma.
c) Tratado con BrCN da un dipéptido que contiene Lys y Met, y un segundo péptido que
tiene el resto de los aminoácidos.
d) Tratado con carboxipeptidasa A, libera rápidamente Gly.
e) El tratamiento con quimotripsina libera tres péptidos: uno que contiene Tyr, Lys y Met,
el segundo contiene Ala y Gly, y el tercero Ser y Phe.
15) Un péptido contiene cantidades equimoleculares de Met, Phe, Asp, Ser, Thr. Cuando
se trata con BrCN da un péptido y un aminoácido libre: Met. Si se trata con quimotripsina
da dos fragmentos siendo uno más ácido que el otro; el fragmento ácido contiene Met. Al
tratar el péptido con carboxipeptidasa A, libera rápidamente Ser y a continuación Thr.
Deduzca la secuencia del péptido.
16) Un péptido de doce aminoácidos es sometido a tres tratamientos por separado:
a) Corte por tripsina, produciéndose los péptidos Val-Ala-Phe-Leu-Lys, Met-Trp-Pro-Arg y
Val-Met-Gly.
b) Corte con carboxipeptidasa, observándose liberación inicial de Gly.
c) Corte con una proteasa capaz de cortar sólo hacia el N-terminal de las alaninas,
generando en este caso un pentapéptido y un heptapéptido. ¿Cuál es la secuencia
aminoacídica del péptido original?
17) Ud. aisla del cerebro un péptido que posee la propiedad de unirse a receptores del
opio. Su intención es encontrar la estructura primaria del péptido aislado. Para ello
recurre a métodos utilizados en la química de péptidos y encuentra que:
a) Luego de la hidrólisis ácida del péptido, la composición en aminoácidos es: Arg (1),
Phe (2), Gly (2), Met (1), Tyr (1).
b) El tratamiento del péptido con quimotripsina generó un aminoácido libre (Phe), y dos
péptidos cuya composición en aminoácidos resultó: 1) Gly (2), Tyr (1) y 2) Arg (1), Phe
(1), Met (1).
c) El tratamiento del péptido con bromuro de cianógeno, seguido de separación
cromatográfica de los productos, indica la presencia de dos péptidos cuya composición
en aminoácidos es: 1) Arg (1), Phe (1), Met (1) y 2) Gly (2), Phe (1), Tyr (1).
Cuando ambos péptidos fueron tratados con cloruro de dansilo, solamente se encontró
Phe-dansilada. Deduzca la secuencia del péptido.
18) Un péptido ha sido estudiado para predecir su estructura secundaria realizándose una
serie de estudios. Se obtuvo la estructura primaria que se detalla a continuación: Met-IlePro-Pro-His-Trp-Phe-Ala-Leu-Phe-Glu-Ser-Glu. Se observó que la rotación óptica de la
muestra era notoriamente diferente a la suma de las rotaciones ópticas aportadas por los
aminoácidos que componían el péptido (era menos levorrotatoria). A partir de estos
resultados ¿podría Ud. indicar la presencia de algún tipo de estructura secundaria?
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Explique brevemente dicha estructura secundaria. Indique qué aminoácidos formarían
parte de ella.
19) Indique a qué pH el polipéptido P (o parte de él) que se detalla adoptaría una forma
helicoidal. Fundamente su respuesta. ¿En qué lugares podrían aparecer puntos de
curvaturas al pH indicado?
P: Glu-Glu-Asp-Ala-Glu-Leu-Asp-Pro-Ser-Pro-Pro-Glu-Glu-Asp-Asp-Asp.
20) La estabilidad de una hélice alfa está determinada no sólo por la formación de
enlaces hidrógeno entre las uniones peptídicas, sino también por la naturaleza de sus
cadenas laterales aminoacídicas. Prediga cuáles de los siguientes poliaminoácidos
formarán hélices alfa y cuáles no, en solución y a temperatura ambiente. Fundamente su
respuesta.
a) poliglicina pH 7
b) poliisoleucina pH 7
c) poliglutámico pH 1,5
d) poliglutámico pH 7
e) polialanina pH 7
f) polilisina pH 7
g) polilisina pH 12
21) Su instructor de bioquímica le ha proporcionado alícuotas de tres proteínas
desconocidas A, B y C, informándole además que una es predominantemente α-hélice, la
otra β-plegada y la tercera triple hélice de colágeno. Ud. determinó la composición en
aminoácidos pero no cuenta con equipo cristalográfico de Rayos X. Considerando los
datos descriptos en la tabla asigne la estructura secundaria predominante en cada una
justificando su elección.
% molar de aa.
Polares
No polares
Prolina
Hidroxiprolina
Glicina
Prot. A
20,7
25,4
0,3
44,6
Prot. B
60,4
24
7,5
8,1
Prot. C
27,1
18,3
12,2
9,4
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22) En la hemoglobina se observa una interacción de tipo iónico entre los residuos Asp 94
e His 146 de su cadena β. ¿Cómo se verá afectada dicha interacción si:
a) se incrementa el pH de 6 a 11;
b) se baja el pH de 6 a 3.
23) La albúmina de bovino contiene 0,58 % en peso de triptofano cuyo PM es 204. a)
Calcule el PM mínimo de la albúmina. b) Considerando que el PM de la albúmina es
70000, calcule cuántos residuos de triptofano tiene por molécula.
24) Una molécula de ferritina tiene un 0,25 % de Fe por peso de la proteína. Calcule su
peso molecular mínimo. Peso atómico de Fe: 56
25) El análisis de una enzima pura da en el análisis de sus aminoácidos que contiene
58,1 g de valina (PM 117) en 10 mg de proteína. Calcule el peso molecular mínimo de la
proteína.
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26) La mioglobina está constituida por un polipéptido de 153 aminoácidos. El coeficiente
de absorción molar a 580 nm es 15000 cm-1 M-1. a) ¿Cuál es la absorbancia de una
solución de mioglobina 0,7 mg/ml? b) Si dicha solución contiene 0,04 mM Fe ¿Cuál es la
molaridad de la solución de mioglobina?
RESPUESTAS
1) a pH 7 al ánodo, a pH 2 al cátodo
2) positiva, negativa, 9
3) pH 7
4) pI 3, pH 2 cátodo, pH 7 ánodo
5) pI 7,9
6) pI 6,96 y 3,295
pH menor a 6,96 y mayor a 3,3
7) Ala-Lys 10,11
Ala-Ala 6,3
Ala-Glu 3,25
Asp-Glu 2,98
8) 416.000, 2 moles de Met, Tyr
9) 291 aa
10) Phe-Pro-Val-Orn-Leu-Phe-Pro-Val-Orn-Leu- (cíclico)
11) Gly-His-Pro- Arg
12) Tyr-Gly-Gly-Phe-Leu
13) Asp-Arg-Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe, pI = 7,9
14) Lys-Met-Tyr-Ser-Phe-Ala-Gly
15) Met-Asp-Phe-Thr-Ser
16) Met-Trp-Pro-Arg-Val-Ala-Phe-LeuLys-Val-Met-Gly
17) Phe-Arg-Met-Phe-Gly-Gly-Tyr
18) presencia de α-hélice (dextrógira)
19) pH menor a 4. En las Pro
20)a) PoliGly: Poca posibilidad de formar alfa hélice. Tiene más flexibilidad
conformacional que otros residuos aminoácidos.
b) PoliILeu: Ninguna estructura ordenada. La Ileu se ramifica en C beta.
c) PoliGlu (pH 1,5): Hélice alfa. No hay cargas ni ramificaciones en C beta.
d) PoliGlu (pH 7,0): Ninguna estructura ordenada. A ese pH las cargas negativas se
repelen entre sí más fuertemente que los puentes hidrógeno de la estructura.
e) PoliAla: Hélice alfa.
f) PoliLys (pH 7,0): Ninguna estructura ordenada. A ese pH las cargas positivas se
repelen entre sí más fuertemente que los puentes hidrógeno de la estructura.
g) PoliLys (pH 12,0): Hélice alfa. No hay cargas ni ramificaciones en C beta.
21) A lámina β, B α-hélice y C colágeno
22) Si cambia el pH, la interacción se modifica según se protonen o desprotonen los dos
aa involucrados, es decir desaparece la interacción iónica.
23) a) 35172 b) 2 residuos
24) 22400
25) 20138
26) 0,615, 0,04 mM
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FORMACIÓN DE ENLACE PEPTÍDICO
Péptido serilgliciltirosilalanilleucina o Ser-Gly-Tyr-Ala-Leu
CÁLCULO DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DEL ÁCIDO GLUTÁMICO
Carga neta
+1
0
-1
-2
pI= pK1 + pKR = 3,22
2
CÁLCULO DEL PUNTO ISOELÉCTRICO DE LA HISTIDINA
Carga neta
+2
+1
0
-1
pI= pKR + pK2 = 7,59
2
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SITIOS DE CORTE DE PROTEASAS Y REACTIVOS QUÍMICOS
PROTEASAS
Tripsina
Quimotripsina
V8
Papaína
Aminopeptidasa
Carboxipeptidasa
Pepsina
Termolisina
REACTIVOS QUÍMICOS
Bromuro de cianógeno
Anhídrido maleico (maleilización)
Etilenoimina
ENLACES PEPTÍDICOS ESCINDIDOS
por el carboxilo de Lys o Arg
por el carboxilo de Phe, Trp o Tyr
por el carboxilo de Asp, Glu
por el carboxilo de Arg, Gly, Glu, His, Tyr, Lys
por el carboxilo del aa amino terminal
por el amino del aa carboxilo terminal
por el amino de Phe, Trp, Tyr,Leu, Met, Glu, Asp
por el amino de Leu, Ile o Val
.
por el carboxilo de Met
bloquea el corte de tripsina sobre Lys
produce la aminoetilación de la Cys, permitiendo
el ataque de la tripsina por el carboxilo de CysSH
REACCIONES DEL GRUPO AMINO TERMINAL
•Ninhidrina: α-amino libre a 570 nm, excepto Pro a 440 nm
•Fluorescamina (producto fluorescente).
•1-Fluoro-2,4 dinitrobenceno (FDNB, reactivo de Sanger)
•Cloruro de dansilo (específico alfa-amino)
•Reactivo de Edman (Fenilisotiocianato) (específico alfa-amino)
•o-ftalaldehído (producto fluorescente). Alta sensibilidad
•Cianato (específico alfa-amino)
REACCIONES DEL GRUPO CARBOXILO TERMINAL
•Hidrazina (H2NNH2)
EFECTO DEL PH SOBRE LA ROTACIÓN ÓPTICA EN POLIAMINOÁCIDOS
SINTÉTICOS
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ESTRUCTURAS SECUNDARIAS
Hélice alfa
Hoja beta plegada
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Nota: las estructuras corresponden a los estados de ionización a pH fisológico (cercano a 7.0), salvo en el
caso de la His, que se muestra en el estado de ionización a valores de pH de 6.0 o menos, al solo efecto de
mostrar el N que se protona.
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