Capitulo 3 Stryer : Investigación en proteínas y proteomas
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1 Capitulo 3 Stryer: Investigación en proteínas y proteomas Las proteínas cumplen roles cruciales en catálisis, transducción de señales y como soportes estructurales. El primer paso es la purificación de la proteína. Las proteínas se pueden separar en base a su solubilidad, su tamaño, carga y capacidad de unión. Una vez purificada se puede secuenciar o identificar mediante la medición y comparación de su masa con una base de datos. La espectroscopia de masas efectúa esta medición. El contexto fisiológico de una proteína puede entenderse mediante sondas (anticuerpos monoclonales) identificación y cuantificación de proteína. La espectroscopia NMR y la cristalografía X son utilizadas para determinar la estructura tridimensional de las proteínas. 3.1 La purificación, el primer paso ¿Cómo aislar una proteína de una mezcla compleja de proteínas? El bioquímico necesita un ensayo para identificar alguna propiedad específica de la proteína. Este normalmente mide la actividad enzimática, capacidad química de la enzima de inducir la reacción. La cuestión asociada con la purificación es maximizar la actividad específica... En un enzima puro la actividad específica será constante. Elegido el ensayo y escogida la fuente de proteína, se debe fraccionar la célula y sus componentes. En primer paso se forma un homogenado por ruptura de membrana celular, fraccionándose la célula por centrifugación y dando lugar a un precipitado de material pesado en el fondo del tubo. El sobrenadante se centrifuga luego sucesivamente en una técnica denominada centrifugación diferencial. Se purifica la proteína en base a la solubilidad, tamaño, carga y afinidad especifica de unión. Precipitación Salina La mayoría de las proteínas son menos solubles a concentraciones elevadas de sal, este efecto es llamado precipitación salina. Las concentraciones de sal en las que se precipita una proteína varían de una proteína a otra. Además es útil para concentrar disoluciones diluidas de proteínas. Para eliminar la sal, se puede utilizar la diálisis. Diálisis Las proteínas se pueden separar de moléculas pequeñas mediante la diálisis a través de una membrana semipermeable, por ej. membrana porosa de celulosa. Las moléculas grandes se retienen en la bolsa, mientras que las moléculas más pequeñas y los iones atraviesan los poros. Cromatografía de filtración en gel o de exclusión molecular Se basa en discriminar por tamaño. La muestra se coloca en lo alto de una columna rellena de bolitas porosas compuestas por un polímero insoluble, pero altamente hidratado, como son el dextrano o la agarosa (carbohidratos) o la poliacrilamida. Sephadex, Sepharosa y Biogel son preparaciones comerciales. Las moléculas pequeñas ingresan dentro de los poros de las bolitas. Así, las moléculas grandes fluyen más rápidamente a través de esta columna y aparecen antes porque tienen accesible un volumen de líquido más pequeño. Las pequeñas siguen un camino más largo y serán las últimas en salir. Cromatografía de intercambio iónico Se separan en base a su carga neta. Si una proteína tiene una carga neta positiva a pH 7 se unirá a una columna que contenga carboxilatos, si tiene carga negativa no se unirá. Luego de unida, puede eluirse alimentando la [] de cloruro sódico u otra sal en el buffer de elución porque los iones sodios compiten con las proteínas unidas. Si estas proteínas tienen una baja densidad de carga positiva neta eluirán primero, si tienen alta densidad tardarán más. La columna de CM-celulosa tiene carga (-) y la DEAE-celulosa carga (+). Cromatografía de afinidad Se basa en la alta afinidad de algunas proteínas por grupos químicos específicos. Por Ej.: una mezcla proteica se eluye a través de una columna que contiene secuencias especificas de DNA unidas a una matriz; las proteínas con mayor afinidad por la secuencia se unirán y quedarán retenidas. Luego el factor de trascripción se libera lavando con una disolución que contiene alta concentración de sal. En general, se puede utilizar en el aislamiento una proteína q reconoce a determinado grupo X por: la unión covalente de X o un derivado a la columna; la adición de un mezcla de proteínas a esta columna, que se lava luego con buffer para eliminar proteínas no unidas; ó por la elución de la proteína deseada 2 añadiendo una concentración elevada de una forma soluble de X o cambio de las condiciones para alterar la afinidad de la unión. Esta técnica es más efectiva cuando la afinidad proteína molécula es muy especifica. Ej. 2: una serie de residuos de His se pueden añadir al extremo amino o carboxilo Terminal de una proteína expresada. La proteína etiquetada se pasa a través de una columna de bolitas que contienen unido de forma equivalente Ni2+ u otros iones metálicos que se unen a la proteína deseada mientras que las otras proteínas atraviesan la columna. Posteriormente se pueden eluir las proteínas de la columna añadiendo imidazol u otros compuestos químicos que se unen a los iones metálicos y desplazan a la proteína. Cromatografía liquida de alta presión El relleno de la columna esta mucho más finamente dividido, con lo que hay más centros de interacción y por lo tanto mayor poder de resolución. Se debe aplicar presión para obtener velocidades de flujo adecuadas. El resultado neto es una elevada resolución y una separación rápida. Electroforesis Constituye un método mediante el cuál se visualiza la eficacia de la purificación a través de las proteínas que se presentan en cada paso. En gel Una molécula con carga eléctrica neta se desplazará en un campo eléctrico. La velocidad de migración de una proteína en un campo eléctrico depende de la fuerza de ese campo, la carga neta de la proteína y del coeficiente de fricción. El coeficiente de fricción depende tanto de la masa como de la forma de la molécula que migra como de la viscosidad del medio. Las separaciones electroforéticas se llevan a cabo sobre geles (o sobre papel) porque actúan como tamices moleculares que potencia la separación. Las moléculas pequeñas pasan fácilmente mientras que las grandes permanecen casi inmóviles. Las proteínas se pueden separar de acuerdo a su masa molecular, utilizando electroforesis de poliacrilamida pero en condiciones desnaturalizantes. La mezcla de proteínas se disuelve en SDS dodecil sulfato sódico, un detergente aniónico que rompe casi todas las interacciones no covalentes en las proteínas nativas. El mercaptoetanol (2-tioetanol) o ditiotreitol reduce puentes disulfuro. Los aniones SDS se unen a la cadena principal, a razón de un anión SDS por cada dos residuos de aminoácido. Este complejo tiene una gran carga negativa que es proporcional a la masa de la proteína. Estos complejos se someten a electroforesis. Las proteínas se pueden visualizar tiñéndolas con plata o Azul de Coomasie. El desplazamiento en estas condiciones de la mayor parte de los polipéptidos es linealmente proporcional al logaritmo de su masa. La SDS-PAGE es rápida sensible y capaz de un alto grado de resolución Isoelectroenfoque Separación electroforética en base a sus contenidos relativos de AA básicos o ácidos. El PI es el pH al cual la carga neta de la proteína es 0; su movilidad electroforética también es 0. Cada proteína se desplaza hasta que alcanza una posición en el gel en la que el pH es igual al PI de la proteína. El gradiente de pH en el gel se obtiene sometiendo a electroforesis precia una mezcla de polianfolitos (polímeros pequeños con múltiple carga) con diferentes valores de PI. Electroforesis bidimensional Es la combinación del isoelectroenfoque y la SDS-PAGE obteniendo una separación de resolución muy elevada. Una muestra se somete a isoelectroenfoque. Este gel de calle única se coloca horizontalmente en la parte superior de un gel de SDS-poliacrilamida. A continuación se somete de nuevo a electroforesis obteniéndose una distribución bidimensional de las manchas; horizontalmente se han separado de acuerdo a su PI y verticalmente de acuerdo a su masa molecular. Las tablas de purificación permiten analizar los resultados: proteína total; actividad total; actividad especifica; Rendimiento (actividad después de cada paso de purificación) y grado de purificación. Un alto grado de purificación y bajo rendimiento proporciona poca proteína con la que experimentar. Un alto rendimiento con una baja purificación deja muchos contaminantes y complica la interpretación de los experimentos. Ultracentrifugación Permite determinar parámetros tales como la masa y la densidad, conocer algo sobre la forma de la molécula e investigar las interacciones entre moléculas. Las partículas se desplazan por la fuerza centrifuga. Para valorar la velocidad se calcula el coeficiente de sedimentación s= m (1-vp)/f. Siendo (1- 3 vp) la fuerza de flotación. El coeficiente se expresa en Svedberg y cuanto menor sea más lentamente se moverá la molécula. La velocidad de sedimentación depende en parte de la masa de la partícula. Mayor masa sedimenta más rápido. La forma influye en el coeficiente de fricción, ya que cuanto mas compacta sea la partícula mayor la velocidad de sedimentación. Un partícula densa sedimenta más rápido que una de menor densidad, porque la fuerza de flotación contraria es menos para las partículas menos densas. La velocidad de sedimentación también depende de la densidad de la disolución, las partículas se hunden cuando vp<1 y flotan cuando vp>1, no se desplazan cuando vp=1. La centrifugación en gradiente se usa para separar proteínas con diferentes coeficientes de sedimentación. Se forma un gradiente de densidad en un tubo. El papel del gradiente es evitar el flujo de convección. La mezcla de la proteína se coloca en peq volumen en la parte superior del gradiente de densidad. Las proteínas se separan de acuerdo a su coeficiente de sedimentación. La masa de una proteína se puede determinar por equilibrio de sedimentación: una muestra se centrifuga a vel bajas para que se equilibre por difusión. Es una técnica muy precisa y se puede aplicar en cond no desnaturalizantes manteniendo estruct cuaternarias; a diferencia de SDS-Page que nos da una estimación del PM. 3.2 Las secuencias se determinan por Edman La composición de AA se realiza mediante hidrólisis ácida, calor + HCl 6 M. Estos AA luego se pueden separar por cromatografía de intercambio iónico. La identidad de los AA se averigua por el Vol. de elución y cuantificado por ninhidrina (color azul excepto con Pro que da amarillo). La concentración de un AA es proporcional a la absorbancia. Se puede usar un colorante más especifico como la fluoroescamina. La determinación del aminoácido N-terminal se logra por la degradación de Edman, que separa secuencialmente del extremo amino Terminal un residuo tras otro. El fenilisotiocianato reacciona con el grupo amino Terminal no cargado del péptido para formar un derivado del feniltiocarbamato. Posteriormente bajo condiciones ácidas suaves, se libera un derivado cíclico del AA Terminal lo que deja un péptido intacto acortado en un AA. El compuesto cíclico es un aminoácido feniltiohidantoína (PTHAA) que se puede identificar por cromatografía. El método de Edman presenta una eficiencia baja en péptidos muy extensos. Por lo que es conveniente fragmentar la proteína selectivamente.: bromuro de cianógeno; tripsina; quimotripsina, etc. Los péptidos obtenidos por ruptura enzimática se separan cromatograficamente. La secuencia de cada péptido se determina por Edman. Si la muestra inicial de proteína consta de varias cadenas se necesitan por ej. Una electroforesis SDS-gel en cond reductoras, para una proteína consistente en 2 o más cadenas unidas no covalentemente se utilizan ag desnaturalizantes como urea o hidrocloruro de guanidina. Los p disulfuro se separan por mercaptoetanol o ditiotreitol; y para evitar que los residuos de cisterna se recombinen se alquilan con yodoacetato. Para determinar las posiciones de los puentes disulfuro originales se utiliza electroforesis en diagonal para aislar las secuencias peptídicas que contienen estos enlaces. Se fragmenta la proteína en péptidos bajo cond en que los p disulfuro se mantengan intactos. La mezcla de péptidos se coloca en una hoja de papel y se somete a electroforesis de una sola calle. La hoja resultante se expone a vapores de ácido perfórmico, que rompen los p disulfuro y los convierte en residuos de ácido cisteico. Los péptidos unidos por disulfuro se vuelven independientes y más ácidos debido al grupo -SO3-. Esta mezcla se somete a electroforesis en dirección perpendicular a la anterior /pero en la mismas cond). Los péptidos q no intervienen en disulfuros tendrán igual movilidad que en la primera por lo que se ubican en la diagonal. Por el contrario, los péptidos recién formados q contienen el ácido cisteico migrarán diferente, fuera de la diagonal. Estos péptidos se pueden aislar y secuenciar, para determinar la localización del puente disulfuro. Secuencias de Aminoácidos · La secuencia puede indicar si pertenece a una familia de proteínas. Por ejemplo la tripsina y la quimiotripsina son similares y pertenecen a la familia se serinproteasas. · La comparación de secuencias de la misma proteína en diferentes especies proporciona datos sobre las vías evolutivas. Por ej. Las albúminas séricas del ser humano y el simio africano. 4 · Las secuencias puede presentar repeticiones internas que brindan información sobre la historia de una proteína específica. Por ej. La calmodulina contiene cuatro módulos de unión generados por duplicación génica · Muchas proteínas contienen secuencias que sirven como señales para indicar su destino o controlar su maduración. Por ej. Un señal de 20 AA hidrofóbicos cerca del amino terminal dirigen la proteína a una membrana. · La secuencia provee datos para la síntesis de anticuerpos específicos contra la proteína de interés. · Las secuencias son útiles para fabricar sondas de DNA específicas para los genes que codifican a las correspondientes proteínas Tecnología del DNA recombinante Para péptidos mayores a 1000 la degradación de Edman resulta inadecuada. Por ello se utiliza la técnica del DNA recombinante: el clonado y secuenciación de hebras largas de DNA y la secuencia de nucleótidos revela directamente la secuencia de aminoácidos codificada por el gen. Sin embargo esta técnica revela la secuencia de la proteína naciente, pero no de la proteína funcional, resultante de las modificaciones postraduccionales. 3.3 Inmunología como técnica de investigación Anticuerpos monoclonales Estos métodos aprovechan la alta especificidad de anticuerpos por sus proteínas-diana. Los anticuerpos marcados proporcionan medios para etiquetar una proteína, y aislarla, cuantificarla o visualizarla. Un anticuerpo es una proteína sintetizada en respuesta a la presencia de una sustancia, el antígeno. Las moléculas pequeñas pueden producir anticuerpos si están asociadas a un transportador macromolecular. Un anticuerpo reconoce un grupo específico o agrupación de aminoácidos en la molécula diana que se denomina determinante antigénico o epítopo. Los anticuerpos en los animales se encuentran en el suero de la sangre. El obstáculo de la técnica es que la mayor parte de los antígenos tienen varios epítopos. Los anticuerpos policlonales son mezclas heterogéneas de anticuerpos, cada uno específico para uno de los diversos epítopes del antígeno. Se resuelve esta barrera con anticuerpos monoclonales, anticuerpos con todos los sitios de unión al antígeno iguales. Estos se sintetizan por medio de la fusión de una célula productora de anticuerpo de corta vida con una célula inmortal de mieloma. Detección y cuantificación mediante ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima Los anticuerpos pueden utilizarse para cuantificar proteína u otro antígeno. La técnica de ensayo de inmunoabsorción asociada a enzima utiliza una enzima que reacciona con un sustrato incoloro y produce un producto coloreado. La enzima se une covalentemente a un anticuerpo específico que reconoce a un antígeno diana. Si el antígeno está presente, el complejo anticuerpo-enzima se unirá a él, y el componente enzimático del complejo enzima-anticuerpo catalizará la reacción que generará el producto coloreado, la presencia del mismo indica la presencia de antígeno. Existen dos tipos de ELISA. El ELISA indirecto se utiliza para detectar la presencia de anticuerpo, se utiliza en la detección de HIV. Se coloca en un pocillo proteínas del núcleo vírico, se agregan los anticuerpos del paciente. Se agregan anticuerpos-Enzima que se unan a los anticuerpos. Se agrega el sustrato: la reacción enzimática indica la presencia de anticuerpos para el retrovirus. El ELISA sándwich permite la detección del antígeno y no del anticuerpo. Se adsorbe en un pocillo un anticuerpo contra una enzima en particular, se agrega la sangre u orina q se estima contiene el antígeno. Se añade un segundo anticuerpo (asociado a una enzima) al antígeno. La reacción qca cuantifica la cantidad de antígeno. Transferencia Western Esta técnica de inmunoensayo permite detectar pequeñas cantidades de proteína. Se somete la muestra a electroforesis en un gel de SDS-poliacrilamida. Las proteínas separadas en gel se transfieren a la superficie de una lámina de polímero para hacerlas más accesibles a la reacción. Se añade a la lámina de anticuerpo que sea específico para la proteína de interés y éste reacciona con su antígeno. El complejo antígeno-anticuerpo puede ser detectado por otro anticuerpo específico para el primero. Si este está marcado radiactivamente puede realizarse una autorradiografía. La fluorescencia posibilita la visualización Los marcadores fluorescentes permiten examinar las proteínas en su entorno biológico. También aportan datos acerca de la función que cumple la proteína. 5 3.4 Síntesis de péptidos en fase sólida Estos péptidos son útiles porque: # Pueden servir como antígenos para estimular la formación de anticuerpos específicos. Estos anticuerpos se pueden utilizar para aislar la proteína intacta, o localizarla en la célula. # Se pueden usar para aislar receptores de hormonas y moléculas señal, también en columnas cromatográficas # Pueden utilizarse en fármacos # Permiten definir las reglas que gobiernan la estructura tridimensional. ¿Cómo se realiza? El grupo amino de un aminoácido se une al carboxilo de otro, para esto es necesario bloquear algunos grupos y activar otros. El grupo α-amino del 1er AA del péptido se bloquea con Pertbutiloxicarbonilo (t-Boc), dando t-Boc-aminoácido. El grupo carboxilo de este mismo aminoácido se activa con el reactivo diciclohexilcarbodiimida (DCC). El amino libre del siguiente aminoácido ataca el carboxilo activado, originando un enlace peptídico y liberando diciclohexilurea. El grupo carboxilo del dipéptido resultante se activa con DCC y reacciona con el grupo amino libre del aminoácido que va a ser el tercer residuo del péptido. Este proceso se repite hasta completar el péptido. La exposición del péptido a ácido diluido libera el grupo t-boc protector del 1er aminoácido. La unión de la cadena peptídico creciente a una matriz insoluble incrementa aun más la eficiencia. La ventaja de este método es que como la cadena esta unido a la fase sólida no se necesita purificar intermediarios y al efectuarse siempre en el mismo recipiente se evita pérdida de producto. En el caso de utilizar la fase sólida, el carboxilo del 1er AA se une a esta, luego se procede como lo explicado. Al final de la síntesis, se libera el péptido con ácido fluorhidrico, que rompe el anclaje éster carboxílico sin alterar los enlaces peptidicos. 3.5 Espectrometría de masas Permite determinar masas proteicas con una precisión de una unidad de masa. Analiza formas ionizadas de moléculas en fase gaseosa. Es aplicable a gases o líquidos volátiles que liberan iones en fase gaseosa. Las medidas se realizan determinando con que facilidad se acelera un ion al aplicarle un campo eléctrico. Dado que los péptidos y proteínas no son volátiles se debe generar una concentración lo suficientemente alta en la fase gaseosa de proteína ionizada, pero intacta. Para esto se ha desarrollado dos métodos: espectrometría de deserción-ionización en matriz inducida (MALDI) e ionización por electrospray (ESI). En MALDI, la proteína o péptido se coprecipita con un compuesto orgánico que absorbe la luz de una longitud de onda apropiada (la matriz). El destello de una luz sobre la preparación expulsa las moléculas de la superficie. Estas moléc capturan e- cuando salen de la matriz y por lo tanto la dejan como iones negativos. En ESI, las disoluciones que contienen a la proteína o el péptido fluyen a través de una fina punta metálica mantenida a un potencial eléctrico distinto de cero. Se liberan pequeñas gotículas cargadas que contienen tanto proteína como disolvente. El disolvente se evapora, concentrando la carga. La repulsión de las moléculas cargadas se incrementa, y los iones moleculares individuales vuelan libres. Después de haber generado los iones en fase gaseosa, se pueden utilizar varias aproximaciones para determinar su masa. En el análisis de tiempo de vuelo (TOF), los iones se aceleran en un campo eléctrico hacia un detector, los iones más pequeños viajan más rápido y llegan primero al detector. La masa de una proteína normalmente no es suficiente para identificarla entre un conjunto de proteínas. Sin embargo, la masa de la proteína junto con la masa de fragmentos proteicos producidos por un método de ruptura específico, provee una identificación única. 3.6 Determinación de la estructura tridimensional Cristalografía de rayos X Fue la primera técnica en desarrollarse. Revela posiciones tridimensionales exactas de la mayor parte de los átomos de una molécula de proteína. La radiación de rayos X proporciona la mejor resolución porque la long de onda de los rayos es aprox. iguala la long del enlace covalente. Para llevar a cabo una cristalografía se necesita un cristal de proteína, una fuente de rayos X y un detector. La adición lenta de sulfato amónico u otra sal, a una disolución concentrada de proteína favorece la formación de cristales muy ordenados. Debe ensayarse varias veces para lograr un cristal idóneo. Los rayos producidos por la fuente, atraviesan en parte el cristal sin cambios y el resto se dispersa. Estos rayos dispersados o difractados se registran en una película fotográfica o bien por medio de un detector electrónico de estado sólido. El cristal se sitúa con una orientación precisa respecto al haz de rayos y a la 6 película. Se hace girar para que el haz incida en todas direcciones. Esto produce una fotografía de rayos X que consiste en una serie de manchas llamadas reflexiones. Las intensidades y posiciones de cada mancha son los datos experimentales, que permitirán la reconstrucción de una imagen de la proteína a partir de las intensidades observadas. La imagen se forma aplicando la transformada de Fourier. La resolución del análisis de rayos X viene determinada por el número de intensidades dispersas usadas en la síntesis de Fourier. Espectroscopia de Resonancia Magnética Nuclear Revela la estructura atómica de macromoléculas en disolución (concentradas). Se basa en el hecho de que algunos núcleos atómicos son intrínsecamente magnéticos (poseen spin). La rotación de un protón genera un momento magnético, cuando se aplica un campo magnético externo, este momento puede adoptar una de dos orientaciones. Aplicando un pulso de radiación electromagnética se puede cambiar el spin de una posición de baja a alta energía, obteniendo una resonancia. El espectro se obtiene manteniendo el campo constante y variando la frecuencia de la radiación electromagnética. El flujo de e- alrededor de un núcleo magnético genera un pequeño campo magnético local que se opone al campo aplicado. Los núcleos absorben a frecuencias de resonancia características, que se conoce como desplazamiento químico. Con esta información se pueden deducir los cambios de un grupo químico determinado en diferentes condiciones, tales como el cambio conformacional de una proteína de estructura desordenada a una hélice alfa en respuesta a un cambio de pH. Otra variante es el espectro bidimensional obtenido por espectroscopia de intensificación nuclear Overhauser (NOESY), que muestra gráficamente pares de protones que están muy cercanos, incluso aunque no estén juntos en la estructura primaria. La base de esta técnica es el efecto nuclear Overhauser, una interacción entre núcleos que es proporcional al inverso de la sexta potencia de su distancia. Se induce una magnetización transitoria en una muestra por aplicación de un pulso de radiofrecuencia, posibilitando alterar la rotación de un núcleo y examinar el efecto producido en la rotación de otro núcleo vecino. El efecto proporciona un medio para detectar la localización relativa de un átomo respecto a otro en la estructura tridimensional de la proteína. La diagonal de un espectro de NOESY corresponde al espectro unidimensional. Los picos fuera de la diagonal proporcionan una información nueva crucial: identifican pares de protones que están separados menos de 5 Å.