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LABORATORIO Nº5
CINÉTICA ENZIMÁTICA I: EFECTO del pH y de la TEMPERATURA.
1. Aspectos teóricos.
Las enzimas son proteínas que presentan actividad catalítica específica, esto es,
aumentan la velocidad de reacciones específicas. La actividad catalítica de una enzima
es una propiedad que se mide por el aumento de la velocidad de reacción en presencia
de la enzima con relación a la reacción no catalizada en un sistema químico dado.
La velocidad de las reacciones se determina de acuerdo al aumento de la
concentración del producto o la disminución de la concentración del sustrato de la
reacción en el tiempo.
v = - d[S]/dt = + d[P]/dt
Existen diferentes métodos que permiten cuantificar la concentración de reactantes y/o
productos. Entre los métodos analíticos físicos destacan los ópticos, que se basan en la
absorción de radiación electromagnética en la región visible y ultravioleta. Determinando
el coeficiente de extinción de un compuesto se estima la velocidad sobre la base de las
medidas experimentales de absorbancia a un tiempo dado.
Hay diferentes factores que afectan la actividad de las enzimas. Los factores más
importantes son: concentración de enzima, concentración de ligandos (sustratos,
productos, inhibidores y activadores), pH, fuerza iónica y temperatura.
La actividad de las enzimas se ve notablemente afectada por el pH del medio. En
general, son sólo activas en un rango limitado de éste, observándose en la mayoría de los
casos una zona de pH óptimo y una disminución de la actividad a ambos lados del pH
“óptimo”. El efecto del pH en la actividad enzimática se debe fundamentalmente a cambios
en el estado de ionización de los componentes del sistema; esto puede darse en la
enzima libre, en el complejo E-S o en el sustrato. En la zona de pH óptimo predomina la
forma iónica activa, a valores de pH menores y mayores su proporción disminuye,
aumentando la proporción de formas iónicas no activas; a causa de ello la curva de
velocidad versus pH tiene aproximadamente la forma de una campana. El pH no sólo
afecta la actividad de las enzimas, sino que también la estabilidad, lo que contribuye a la
disminución de la actividad generalmente a valores extremos de pH.
Las reacciones enzimáticas están fuertemente afectadas por la temperatura. Hay dos
factores determinantes, el efecto de la temperatura en las constantes de velocidad de la
reacción y el efecto de la temperatura en la estabilidad de la enzima. Como es de
esperar, un aumento de la temperatura aumenta la velocidad de la reacción; sin embargo,
sobre cierta temperatura hay inactivación de la enzima que lleva a una disminución en la
velocidad. La zona de temperatura en la cual se observa mayor actividad se conoce como
“temperatura óptima”, ésta tiene sólo valor operativo, ya que depende de una serie de
factores, como el pH y el tiempo de reacción.
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En este práctico se verá el efecto que produce en la actividad de la enzima
-glucosidasa de almendra dulce los cambios de pH y temperatura. Se determinará la
velocidad de la hidrólisis de un sustrato artificial, el p-nitrofenil--D-glucopiranósido
(pNPG), midiendo la formación de un producto de la reacción, el p-nitrofenolato, que en
un medio alcalino es de color amarillo y presenta un máximo de absorción alrededor de
405 nm.
v 
A
Co
·
t
V
v
fd
fe
A  Co
1
V
 
 fd fe ( UI/m l)
 
t
v
Ecuación 5.1
= Absorbancia
= absorbancia del ensayo control
= pendiente curva de calibrado
= tiempo (minutos)
= volumen de ensayo (ml)
= volumen de enzima (ml)
= factor dilución en el ensayo enzimático (en ensayos discontinuos)
= factor de dilución de la enzima previo al ensayo enzimático.
Una unidad internacional (UI) de enzima se define como la cantidad que cataliza la
formación de 1 mol de producto por minuto en condiciones definidas de ensayo.
2. Objetivos.
Estudiar el efecto del pH y de la temperatura en la velocidad de la hidrólisis del
p-nitrofenil--D-glucopiranósido catalizada por la -glucosidasa de almendras.
Establecer condiciones adecuadas de ensayo.
3. Parte experimental.
3.1 Materiales

espectrofotómetro / celdas

1 cronómetro

1 trípode / rejilla/ mechero

1 termómetro

1 baño termostatizado

1 vaso precipitado de 500 ml

1 vaso precipitado de 250 ml

2 gradillas

20 tubos de ensayo

1 pizeta

1 pipeta graduada de 1 ml

1 pipeta graduada de 2 ml

1 pipeta graduada de 5 ml

plato poroso.
24
3.2
Reactivos






p-nitrofenolato 0,2 mM.
tampón acetato 50 mM, pH 4,0; 5,0 y 6,0.
tampón fosfato 50 mM, pH 7,0.
p-nitrofenil--D-glucopiranósido 2 mM / tampón.
-glucosidasa de almendras (baño agua / hielo).
Na2CO3 1.0 M.
4. Procedimiento.
Obtención del coeficiente de extinción milimolar del p-nitrofenolato (pNF).
De acuerdo a la tabla 5.1:

Prepare una batería de tubos rotulados.

Agregue el volumen indicado de la solución de p-nitrofenol (0,2 mM) a los
tubos 2S  7S.

Complete el volumen a 1,0 ml a cada tubo (1B, 2S  7S) agregando tampón
acetato pH 5,0.

Agregue a cada tubo 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solución.

Mida la absorbancia de los tubos 2S  7S ocupando el blanco (1B) para
calibrar el equipo y anótela en la tabla.

Calcule y anote en la tabla la concentración del pNF en el volumen final de
3,0 ml.
TABLA 5.1
TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7S
pNF
(ml)
-----0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
Tampón
(ml)
1,0
0,9
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
Na2CO3
(ml)
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
2,0
pNF
(mM)
A405nm
De acuerdo a los datos.

Construya el gráfico absorbancia versus [pNF].

Determine la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de
regresión.

Calcule el coeficiente de extinción milimolar.
25
Obtención de la velocidad de la reacción catalizada por la -glucosidasa (Método
discontinuo).

Preincube 0,9 ml del sustrato (pNPG) 2,0 mM al pH dado durante 3 minutos a
la temperatura indicada.

Inicie la reacción mediante la adición de 0,1 ml de la enzima, inmediatamente,
homogenice la solución y colóquela en el baño de agua termostatizado a la
temperatura correspondiente. Al mismo momento inicie el cronómetro.

Detenga la reacción a los 5,0 minutos con 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M.

Cuantifique el p-nitrofenolato, producto de la reacción, por absorbancia a
405 nm.

Calcule la velocidad de la reacción de acuerdo a la ecuación 5.1.
Blanco.

Prepare el blanco (control tiempo 0 o tubo tiempo 0, t0) con todos los
componentes del ensayo mezclados en tal forma que no haya reacción.
o Preincube 0,9 ml del sustrato al pH dado durante 3 minutos a la
temperatura indicada.
o Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando
2,0 ml de Na2CO3
o Agregue 0,1 ml de la enzima.
Control.

Prepare el control incubando a la temperatura definida todos los componentes
del ensayo, menos la enzima, de modo que no haya reacción enzimática.
o Incube 0,9 ml de pNPG durante 8 minutos (3,0 min de preincubación y
5,0 min de ensayo),
o Inmediatamente, detenga la posible reacción no enzimática agregando
2,0 ml de Na2CO3,
o Agregue 0,1 ml de la enzima.
Ocupe el blanco para calibrar el espectrofotómetro y el control para detectar una
reacción no enzimática, reste esta lectura a la del ensayo enzimático correspondiente
(Ecuación 5.1).
26
4.1
Efecto de la temperatura en la velocidad de la reacción enzimática.
Para estudiar el efecto de la temperatura en la actividad de la -glucosidasa, se
trabajará a cuatro temperaturas, a un pH dado (pH 5,0), a concentraciones de sustrato y
de enzima constantes.
De acuerdo a la tabla 5.2:

Prepare una batería de tubos rotulados (1R tº  4R tº) para los ensayos
enzimáticos.

Agregue 0,9 ml de pNPG 2,0 mM

Preincube los tubos a una temperatura indicada por 3,0 minutos.

Inicie la reacción agregando 0,1 ml de la enzima, inmediatamente
homogenice y coloque en baño termorregulado a la temperatura
correspondiente por 5,0 minutos exactos.

Detenga la reacción sacando los tubos del baño, colocándolos en un baño
frío (agua / hielo) y agregando 2,0 ml de Na2CO3 1,0 M, que además disocia
el p-nitrofenol a p-nitrofenolato. Homogenice la solución.

Repita la operación a las restantes temperaturas.
TABLA 5.2
Tubo
Sustrato 2,0 mM (ml)
Enzima (ml)
Temperatura (ºC)
Tiempo incubación (min)
Na2CO3 1,0 M (ml)




1R tº
0,9
0,1
25
5,0
2,0
2R tº
0,9
0,1
40
5,0
2,0
3R tº
0,9
0,1
60
5,0
2,0
4R tº
0,9
0,1
100
5,0
2,0
Prepare los blancos a cada temperatura (1B tº  4B tº).
Prepare los controles a cada temperatura (1C tº  4C tº).
Lea a 405 nm la absorbancia de los ensayos enzimáticos y de sus respectivos
controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
Calcule la velocidad de la reacción de acuerdo a la absorbancia obtenida
utilizando la ecuación 5.1.
27
4.2
Efecto del pH en la velocidad de la reacción enzimática.
Para estudiar el efecto del pH en la actividad de la -glucosidasa, se trabajará a cuatro
valores de pH, a temperatura (40ºC), concentración de sustrato y de enzima constantes.
De acuerdo a la tabla 5.3:

Prepare una batería de tubos rotulados (1R pH  4R pH) para los ensayos
enzimáticos.

Agregue 0,9 ml de pNPG 2,0 mM a un pH indicado.

Preincube los tubos a la 40ºC por 3,0 minutos.

Inicie la reacción agregando 0,1 ml de la enzima, inmediatamente
homogenice y coloque en un baño termorregulado a 40ºC por 5,0 minutos
exactos.

Detenga la reacción sacando los tubos del baño y colocándolos en un baño
frío (agua / hielo) y transforme el p-nitrofenol en p-nitrofenolato con 2,0 ml de
Na2CO3 1,0 M. Homogenice la solución.
TABLA 5.3
Tubo
Sustrato 2,0 mM (ml) pH 4,0
Sustrato 2,0 mM (ml) pH 5,0
Sustrato 2,0 mM (ml) pH 6,0
Sustrato 2,0 mM (ml) pH 7,0
Enzima (ml)
Tiempo incubación (min)
Na2CO3 1,0 M (ml)





5.
1RpH
0,9
------0,1
5,0
2,0
2RpH
--0,9
----0,1
5,0
2,0
3RpH
----0,9
--0,1
5,0
2,0
4RpH
------0,9
0,1
5,0
2,0
Repita la operación a los restantes pH.
Prepare el blanco correspondiente a cada valor de pH (1B pH  4B pH).
Prepare los controles a cada valor de pH (1C pH  4C pH).
Lea a 405 nm la absorbancia de los ensayos enzimáticos y de sus respectivos
controles ocupando el blanco para calibrar el espectrofotómetro.
Calcule la velocidad de las reacciones de acuerdo a los resultados y a la
ecuación 5.1.
BIBLIOGRAFÍA

Jürgen Bergmeyer and Marienne Gral, 1984.
Methods of Enzymatic Analysis, Third Edition, Verlag Chemie.

Apuntes de cátedra.
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