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UNIVERSIDAD DE CARABOBO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DIRECCIÓN DE POSTGRADO DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICAS ESCUELA DE CIENCIAS BIOMÉDICAS Y TECNOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS EFECTO DE LA ATORVASTATINA SOBRE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS, FENOTÍPICOS, SEROLÓGICOS Y CITOMÉTRICOS, DURANTE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL EXPERIMENTAL EN RATAS SPRAGUE DAWLEY Autor: Carlota Oria de Suárez Tutor: Dr. José Corado Valencia, Diciembre de 2008 UNIVERSIDAD DE CARABOBO FACULTAD DE CIENCIAS DE LA SALUD DIRECCIÓN DE POSTGRADO DOCTORADO EN CIENCIAS MÉDICAS ESCUELA DE CIENCIAS BIOMÉDICAS Y TECNOLÓGICAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS FISIOLÓGICAS EFECTO DE LA ATORVASTATINA SOBRE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS, FENOTÍPICOS, SEROLÓGICOS Y CITOMÉTRICOS, DURANTE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL EXPERIMENTAL EN RATAS SPRAGUE DAWLEY Autor: Carlota Oria de Suárez Tutor: Dr. José Corado Trabajo que se presenta ante la Dirección de Estudios Avanzados de Postgrado de la Facultad de Ciencias de la Salud de la Universidad de Carabobo para optar al Título de DOCTOR EN CIENCIAS MÉDICAS Valencia, Diciembre de 2008 Si encuentras un camino sin tropiezos, quizás no te lleve a ninguna parte. Anónim DEDICATORIA A Sergio, la otra mitad de mi vida, a quien me unen los más hermosos y profundos lazos de amor. Ha sabido brindarme su ayuda y su paciencia en todo momento. Admiro y agradezco su tolerancia y comprensión, ante mis explosivas manifestaciones de molestia, cuando las cosas no salen del todo bien. Sus palabras de estímulo siempre están presentes, cada vez que me siento decaída. Sus brazos son el refugio donde se agotan mis penas y renacen mis alegrías. A mis hijos Sergio, Rossana y Rossalex, cada uno de ellos representa la continuación de mi ser y las tres más importantes razones de mi existencia. Les robé parte de mi tiempo a su lado, para dedicarme, a veces días enteros, al laboratorio y largas horas pegada a la computadora. Espero sepan comprender mis ausencias y que el inmenso amor que les tengo pueda compensar, en parte, algunas de ellas. A mi madre y mi hermana, quienes a pesar de no estar físicamente hoy conmigo, viven eternamente en mi corazón. Se que estarían orgullosas de mí en estos momentos, por culminar esta etapa de mi vida, como siempre antes lo estuvieron, cada vez que lograba alcanzar una nueva meta. AGRADECIMIENTO Quiero agradecer en primer lugar a Dios, porque siempre he contado con su presencia en todos los momentos de mi existencia. Por permitirme culminar otra etapa de mi vida profesional. Por haberme dado el intelecto suficiente para alcanzar este nivel académico. Por darme la paciencia para superar todos los obstáculos que encontré en el camino y, por darme las fuerzas suficientes para levantarme y continuar sin desfallecer. Al Dr. José Corado, por sus enseñanzas, sus consejos oportunos, su apoyo incondicional, su amistad y sobretodo, por la paciencia que tuvo conmigo en estos años de arduo trabajo. Creo firmemente que no hubiese conseguido un mejor tutor. A Loida Ponce, pieza fundamental en esta investigación. Fue ella la que me guió en todo lo referente a la parte experimental, desde hacer cortes histológicos, inmunohistoquímica, suspensión de células y manejo de todos los instrumentos de laboratorio. Sin ella, nada de este trabajo hubiese sido posible. Al Dr. José Ramón López Gómez, artífice del Doctorado en Ciencias Médicas, casi un padre para cada uno de nosotros; me transmitió siempre un entusiasmo sin límites, ingrediente espiritual indispensable para concluir esta tesis. A Cira Bracho, por la confianza que siempre mantuvo en mí y por cada una de sus palabras, que estuvieron desbordadas de estímulos. A Mercedes Márquez, cuando parecía que un final sin resultados ni conclusiones me esperaba a la mitad del camino, apareció ella con su amistad cargada de palabras alentadoras y oportunas, brindándome apoyo para continuar. A la Dra Yépez, por su orientación oportuna, la cual siempre estuvo ajustada a cada una de las experiencias vividas en esta investigación. Al Dr. Antonio Eblen, por haberme iniciado en la investigación experimental con ratas. Mis primeros pasos en el estudio de la isquemia cerebral fueron de su mano. A Robert Tovar, por su colaboración en las diferentes etapas de esta investigación A Marianella Zavala, Lisbeth Silva y Francisco Mendoza, por su ayuda profesional en el análisis y procesamiento de algunas de las muestras. A Julie Verzura, por la colaboración que me prestó cada vez que la necesité. A Adriana, Andrés, Idana y María Eugenia, quienes con su entusiasmo y dedicación fueron de ayuda en la ejecución de algunas etapas de este estudio. A Marielena, Robinson y Luis Lara, personal del Departamento de Farmacología, quienes me dieron su sincera colaboración, sin exigir nada a cambio. Finalmente, quiero agradecer a todas aquellas personas cuyo nombre se haya podido escapar de mi mente y, que de una u otra forma colaboraron en alguna de las etapas de este estudio. INDICE GENERAL Dedicatoria.......................................................................................................... vi Agradecimiento.................................................................................................. vii Índice General ................................................................................................... ix Índice de Fotografias......................................................................................... xi Índice de Tablas................................................................................................. xiii Índice de Figuras .............................................................................................. xiv Resumen ............................................................................................................. xvii Abstract.............................................................................................................. xviii Capítulo I: El Problema: Planteamiento del Problema……………………………………....... 1 Capítulo II: Abordaje Epistemológico……………………………………... 7 Capítulo III: Objetivos de la Investigación……………………………….. 8 Capítulo IV: Marco Teórico: IV.1.- Enfermedades Cerebrovasculares ………………………….. 10 IV.2.- Fisiopatología de la Isquemia Cerebral ……………..……… 14 IV.3.- Apoptosis................................................................................ 19 IV.4.- Apoptosis e Isquemia Cerebral................................................ 28 IV.5.- Neuroprotección…………………………………………….. 31 IV.6.- Estatinas…………………………………………………...... 32 Capítulo V: Bases Legales y Éticas ……………………………………….... 38 Capítulo VI: Marco Metodológico VI.1.- Tipo de Investigación……………………………………….. 40 VI.2.- Nivel de Investigación……………………………………..... 40 VI.3.- Obtención y procesamiento de muestras…………………….. 41 VI.4.- Estudio de los cambios morfológicos del tejido cerebral normal e isquémico………….................................... 43 VI.5.- Estudio Inmunohistoquímico de la Expresión de Fas y FasL……………………………………………….. VI.6.- Análisis Densitométrico de la Expresión de Fas y FasL…….. 44 46 VI.7.- Determinación de las concentraciones séricas de IL-1α y TNFα en suero…………………………………… 46 VI.8.- Determinación de Apoptosis por Citometría de Flujo ………. 48 VI.9.- Análisis Estadístico………………………………………….. 50 Capítulo VII: Resultados……………………………………………………… 52 Capítulo VIII: Discusión………………………………………………………. 82 Capítulo IX: Conclusiones…………………………………………………….. 91 Capítulo X: Recomendaciones……………………………………………….. 92 Referencias Bibliográficas……………………………………………………. 94 Anexos………………………………………………………………………….. 112 INDICE DE FOTOGRAFÍAS FOTOGRAFÍA 1A Tejido Cerebral de ratas del Grupo Control correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 100X……….……..…………………. 53 FOTOGRAFÍA 1B Tejido Cerebral de ratas del Grupo Control correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 400X……..…………..………………. 53 FOTOGRAFÍA 2A Tejido Cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 100X………………………….. 53 FOTOGRAFÍA 2B Tejido Cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 400X………………………….. 53 FOTOGRAFÍA 3A Tejido Cerebral isquémico de ratas sin tratamiento. Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 100X ……….………... 55 FOTOGRAFÍA 3B Tejido Cerebral isquémico de ratas tratadas con atorvastatina. Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 100X ………………………...…………………………………………………... 55 FOTOGRAFÍA 4A Tejido Cerebral isquémico de ratas sin tratamiento. Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 400X ……….………... 55 FOTOGRAFÍA 4B Tejido Cerebral isquémico de ratas tratadas con atorvastatina. Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 400X ……….…………………………………………………………………..... 55 FOTOGRAFÍA 5 Control Negativo de la expresión de Fas en tejido cerebral. (400X). Técnica Avidina-Biotina-Peroxidasa…………………………………………………….. 61 FOTOGRAFÍA 6A Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control de ratas Sprague Dawley. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X)……………………………………………………………………………. 62 FOTOGRAFÍA 6B Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X)... 62 FOTOGRAFÍA 7 Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas tratadas con Atorvastatina. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa (400X)……………………………………………………………….. 64 FOTOGRAFÍA 8 Control Negativo de la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley. (400X). Técnica Avidina-Biotina-Peroxidasa………………… 69 FOTOGRAFIA 9A Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley del grupo control. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X)……………………………………………………………………...…….. 70 FOTOGRAFIA 9B Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X)... 70 FOTOGRAFÍA 10 Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X)…………………………………………….. 72 INDICE DE TABLAS TABLA I Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento y tejido cerebral isquémico de ratas tratadas con atorvastatina……………………. 63 TABLA II Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley sin tratamiento y tejido isquémico de ratas tratadas con atorvastatina…. 71 INDICE DE FIGURAS FIGURA 1 Distribución porcentual de células normales e hipóxicas en tejido cerebral del grupo control y en tejido isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1)………………………………………………………………………………….. 56 FIGURA 2 Distribución porcentual de células normales e hipóxicas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley sin tratamiento (Grupo 1) y de ratas sometidas a tratamiento con atorvastatina (Grupo 2)……………………………. 57 FIGURA 3 Frecuencia relativa de expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control y del tejido isquémico de ratas Sprague Dawley………………………... 59 FIGURA 4 Perfil Densitométrico de la Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control y en tejido cerebral isquémico (Grupo 1) de Ratas Sprague Dawley……………………………………………………………………………. 60 FIGURA 5 Perfil densitométrico de expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (Grupo 1) e isquémico de ratas tratadas con atorvastatina (Grupo 2)………………………………………………………….. 65 FIGURA 6 Frecuencia relativa de expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral del grupo control y en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley………………… 67 FIGURA 7 Perfil Densitométrico de la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral del grupo control y en tejido isquémico sin tratamiento (Grupo 1) de ratas Sprague Dawley…………………………………………………………………………… 68 FIGURA 8 Perfil densitométrico del efecto de la atorvastatina sobre la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (Grupo 1) e isquémico de ratas tratadas con atorvastatina (Grupo 2)………………………… 73 FIGURA 9 Concentraciones séricas de TNF-α e IL-1 α en suero de ratas control, ratas con isquemia y de ratas con isquemia tratadas con atorvastatina. Expresados en promedio…………………………………………………………………………. 74 FIGURA 10 Efecto de la atorvastatina sobre los cambios necróticos y apoptóticos precoces en el tejido cerebral de ratas Sprague Dawley. Comparación de los tres grupos de estudio…………………………………..……………………………………. 76 FIGURA 11 Autofluorescencia del tejido cerebral del grupo control………………………. 77 FIGURA 12 Tejido cerebral del Grupo control. Control Negativo (Anexina)……………..…. 77 FIGURA 13 Tejido cerebral del Grupo control. Control Negativo (Ioduro de Propidio)……. 77 FIGURA 14 Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley del Grupo Control…………………………………………… 78 FIGURA 15 Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1)………………………………………………… 79 FIGURA 16 Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina (Grupo 2)……………………. 79 FIGURA 17 Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley del Grupo Control………………………………………………………. 80 FIGURA 18 Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1)………………………………………………… 81 FIGURA 19 Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina (Grupo 2)……………………. 81 EFECTO DE LA ATORVASTATINA SOBRE LOS CAMBIOS MORFOLÓGICOS, FENOTÍPICOS, SEROLÓGICOS Y CITOMÉTRICOS, DURANTE LA APOPTOSIS INDUCIDA POR ISQUEMIA CEREBRAL GLOBAL EXPERIMENTAL EN RATAS SPRAGUE DAWLEY RESUMEN La isquemia cerebral, es una patología, muy frecuente en las emergencias hospitalarias. En su fisiopatología participan eventos que llevan a la necrosis y a la apoptosis. Estudios reportan, la existencia de fármacos con acciones neuroprotectoras, que reducen el daño neuronal asociado a la isquemia, mejorando, la evolución neurológica y calidad de vida del paciente. Entre los medicamentos más estudiados con estas acciones, se encuentran las estatinas. Se ha dicho, que aumentan el flujo sanguíneo cerebral, disminuyen el tamaño del infarto cerebral y reducen la apoptosis en algunos tejidos, no conociéndose con certeza, hasta los momentos, los mecanismos por los cuales ello ocurre. Objetivos: Determinar los efectos de la atorvastatina, en los cambios morfológicos, fenotípicos, serológicos y citométricos, durante la apoptosis inducida, por isquemia cerebral global experimental. Material y métodos: Ratas Sprague Dawley, machos, fueron distribuidas en tres grupos: Control (sin isquemia), Grupo 1 (Isquémico sin tratamiento) y Grupo 2, Isquémico tratado con atorvastatina, 10 mg/Kg/día, v.o., durante dos semanas previas a la inducción de la isquemia. Se indujo la isquemia cerebral global por paro respiratorio con Dtubocurarina (ip), una vez lograda anestesia profunda con tiopental sódico. Se tomaron muestras de sangre para determinar citocinas séricas y se extrajeron los hemisferios cerebrales para estudios morfológicos, inmunohistoquímicos y citométricos. Resultados: El estudio morfológico mostró que, en tejido isquémico de ratas tratadas con atorvastatina, el porcentaje de células con signos de hipoxia fue significativamente menor, que en el tejido isquémico de ratas no tratadas (P=0,023). Fas y FasL se expresaron en tejido control, esta expresión aumentó en tejido isquémico, siendo significativamente mayor que en el tejido de ratas tratadas con atorvastatina (P=0,0003 vs 0,0082 respectivamente). Las concentraciones de IL-1 y TNF-α no mostraron diferencias significativas entre los tres grupos de estudio. El estudio citométrico, aún cuando, mostró que el porcentaje de células apoptóticas y necróticas fue mayor en el tejido isquémico de ratas no tratadas, que en el tejido de las ratas tratadas con atorvastatina, esta diferencia no fue significativa estadísticamente. Conclusiones: La atorvastatina disminuyó las alteraciones morfológicas celulares inducida por la hipoxia, redujo la expresión de Fas y FasL y el porcentaje de células apoptóticas y necróticas en el tejido cerebral isquémico. Esto pudiera explicar parte de su efecto neuroprotector. Estos hallazgos permiten recomendar el uso de la atorvastatina en la prevención de los ataques isquémicos. Palabras Clave: Isquemia cerebral, apoptosis, necrosis, Fas, FasL, citocinas proinflamatorias, anexina V. EFFECTS OF ATORVASTIN ON MORPHOLOGICAL, PHENOTIPIC, SEROLOGIC AND CYTOMETRIC CHANGES DURING APOPTOSIS INDUCED BY EXPERIMENTAL GLOBAL CEREBRAL ISCHEMIA IN SPRAGUE DAWLEY RATS ABSTRACT Cerebral ischemia is a very common disease in emergency rooms. Several events that produce necrosis and apoptosis are involved in its pathophysiology. Recent studies have shown the existence of drugs with neuroprotective actions that reduce the ischemic neuronal damage and improve the neurological evolution and the life quality of patients. Statins are the most studied drugs with neuroprotective effects. It has been told that statins increase cerebral blood flow, decrease the cerebral infarct volume and reduce apoptosis in several tissues. Until now, the mechanisms that produce these effects are not well known. Objetive: To determine the effects of atorvastatin on morphological, phenotypic, serologic and cytometric changes during apoptosis induced by experimental global cerebral ischemia. Material and methods: Male Sprague Dawley rats were distributed in three groups: A Control group (without ischemia), Group 1 (Ischemic without treatment) and the Group 2, Ischemic treated with atorvastatin, (10 mg/Kg/day, po), for two weeks before the induction of the ischemia. Global cerebral ischemia was induced by respiratory arrest with Dtubocurarin (ip) once the deep anaesthesia with sodic thiopental took place. Samples of blood were taken in order to determine seric cytocin, and the cerebral hemispheres were extracted in order to do morphological, inmunohistochemical and cytometric studies. Results: The morphological study showed that the percentage of cells with hypoxic signs was significantly smaller in ischemic tissue of rats treated with atorvastatin, than ischemic tissue of rats without treatment (P=0,023). Fas and FasL were expressed in control tissue. These expressions increased in ischemic tissue and were significantly greater than in the rat tissue treated with atorvastatin (P=0,0003 vs 0,0082 respectively). The IL-1 and TNF-α concentrations did not show significant differences between the three groups in study. The cytometric study showed that the percentage of apoptotic and necrotic cells was greater in the ischemic tissue of rats without treatment than in the tissue of rats treated with atorvastatina. This difference was not significant. Conclusions: Atorvastatin decreased the cell morphological alterations induced by the hypoxia, reduced the Fas and FasL expressions and the percentage of apoptotic and necrotic cells in ischemic cerebral tissue. This fact may explains atorvastatin neuroprotective effects, and it allows to recommend atorvastatin in prevention of ischemic attacks. Keywords: Cerebral ischemia, apoptosis, necrosis, Fas, FasL, proinflammatory citocine, annexin V CAPÍTULO I EL PROBLEMA I.1.- Planteamiento del Problema Las enfermedades cerebrovasculares constituyen una de las principales causas de muerte y de invalidez permanente en el mundo; 80% de ellas, está representado por los ataques isquémicos cerebrales (AIC). La isquemia cerebral, es una de las patologías, que con más frecuencia, afecta a los pacientes que ingresan a las salas de emergencia hospitalaria. Constituye un problema de salud pública grave, dado que las complicaciones médicas que puede originar, restringen la participación activa del individuo afectado, en la vida productiva (1, 2). Un tercio de las personas que padece esta patología muere durante los 6 primeros meses, y dos tercios de los que sobreviven, quedan con algún grado de discapacidad (2). En Venezuela, los ataques isquémicos representan la quinta causa de mortalidad, de acuerdo al último informe emitido por el Ministerio de Salud y Desarrollo Social. En Carabobo, para el año 2005, la mortalidad por esta causa representó 7,97%, siendo el grupo etario más afectado el comprendido entre 45 y 65 años (3). Según las proyecciones que se tienen para el año 2020, la enfermedad arterial coronaria (EAC) y los AIC ocuparán la primera y cuarta posición respectivamente en la lista de las principales causas de discapacidad emitida por la OMS (1). La mayoría de las investigaciones realizadas sobre la fisiopatología de la isquemia cerebral, relacionan su etiología, con las complicaciones tromboembólicas, que ocurren sobre la placa ateroesclerótica o sobre el endotelio expuesto, que favorece la adhesión de plaquetas y leucocitos (4). Sin embargo; los estudios actuales se orientan a comprender, de una manera más amplia, los mecanismos intrínsecos inmunoinflamatorios implicados, que van más allá de la simple comprensión del evento tromboembólico. Es así como, a través de investigaciones biomoleculares, se ha podido determinar con bastante precisión los mecanismos inmunopatogénicos que se suceden en el tejido cerebral isquémico (5). Los AIC ocurren, principalmente, como consecuencia de una reducción del flujo sanguíneo cerebral, lo que ocasiona una disminución del aporte de oxígeno y glucosa al tejido cerebral (2, 6). Estos cambios llevan a la muerte celular de manera inmediata por necrosis, en el centro del infarto, o tardía en la zona de penumbra isquémica, lugar éste, donde juega papel principal la apoptosis (6 - 12). La apoptosis, es un mecanismo de muerte celular, que produce una serie de cambios morfológicos, diferentes a los que ocurren en la necrosis, sin signos de inflamación (13, 14). Estos hallazgos, han podido ser evidenciados en diferentes tipos de tejido, incluyendo el cerebral, durante eventos isquémicos (15). Adicionalmente, en el área de necrosis, se activan procesos inflamatorios. La respuesta inflamatoria que se desencadena tras la isquemia del tejido cerebral, está mediada y modulada por la acción de las citocinas. Las principales citocinas que intervienen en la inflamación inducida por la isquemia cerebral, son la interleuquina1(IL-1), el factor de necrosis tumoral (TNF), y la interleuquina-6 (IL-6) (16, 17). Las citocinas, inducen a su vez, la liberación de quimiocinas, que son de suma importancia para la quimiotaxis de los leucocitos hacia la región isquémica. La más importante de las quimiocinas, es la interleucina- 8 (IL-8); cuya principal función es la de intervenir en el reclutamiento de los neutrófilos (18). Se ha dicho, además, que durante la isquemia cerebral la producción de citocinas inflamatorias y la invasión de linfocitos, macrófagos y microglias, pueden inducir la expresión de Fas (proteína de superficie que actúa como receptor de señales de muerte) en el tejido (19), el cual, al unirse con su ligando FasL, favorece el desarrollo de la apoptosis (20, 21, 22). En los últimos años, se han realizado numerosos estudios, aclarando importantes aspectos fisiopatológicos de la isquemia cerebral, que han permitido avanzar en los estudios de diferentes posibilidades terapéuticas. Es así, como, en los actuales momentos, existen infinidad de trabajos cuyo objetivo principal, es la búsqueda de fármacos capaces de prevenir los ataques isquémicos. Desde el punto de vista médico, es importante señalar que lo ideal, es la profilaxis de los AIC, para evitar o reducir, así, el alto índice de discapacidad. Sin embargo; la mayoría de las veces, los AIC son impredecibles, por lo que, se hace prácticamente imposible ejercer una acción terapéutica profiláctica, salvo en aquellos casos donde el paciente haya presentado, de inicio, un ataque isquémico transitorio o tenga factores predisponentes tales como hipertensión arterial, diabetes mellitus, tabaquismo, etc. (1). Es, a estos últimos grupos de individuos, que están dirigidas las acciones preventivas del médico. Numerosos estudios científicos reportan, la existencia de fármacos con acciones neuroprotectoras, que prolongan la vida de las neuronas durante los procesos isquémicos cerebrales (23) reduciendo, el daño neuronal asociado a la isquemia (9, 24, 25) mejorando así, la evolución neurológica y la calidad de vida del paciente. Actualmente, entre los medicamentos más estudiados con estas acciones, se encuentran las estatinas, las cuales tienen, desde el punto de vista experimental, una acción neuroprotectora, relacionada con sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes (26.), que son totalmente independientes, de su efecto hipolipemiante (23, 27, 28). A estas propiedades se les ha llamado “Efecto Pleiotrópico de las Estatinas” (29, 30, 31). A pesar de que existen controversias relacionadas, con las acciones de algunas estatinas en diversos tejidos, donde se ha reportado que algunas son capaces de inducir apoptosis, como es el caso, de la lovastatina y la simvastatina en las células musculares lisas vasculares (32) y en miocitos cardíacos de humanos (33). Algunos autores han informado que, el tratamiento profiláctico con estatinas, aumenta el flujo sanguíneo cerebral, reduce el tamaño de los infartos cerebrales y mejora la función neurológica en ratones normocolesterolémicos (34). Adicionalmente, se han reportado efectos beneficiosos de algunas estatinas, como la atorvastatina, sobre ciertos eventos que ocurren durante la cascada apoptótica (12). Por otra parte, se ha demostrado, que la atorvastatina, también, es capaz de reducir la apoptosis (35) en placas ateroescleróticas (36), en cardiomiocitos (37) y en el tejido cerebral isquémico (24, 38). Sin embargo, hasta los actuales momentos, no se han identificado con certeza, los mecanismos por los cuales ello ocurre. Por tal motivo, sería de interés conocer, como influye el uso profiláctico de la atorvastatina, en la apoptosis durante la isquemia cerebral. Por lo anteriormente expuesto, se propuso realizar el presente estudio, con el fin de determinar los efectos de la atorvastatina, en los cambios morfológicos, fenotípicos, serológicos y citométricos, durante la apoptosis inducida, por isquemia cerebral global experimental, en ratas Sprague Dawley. CAPÍTULO II ABORDAJE EPISTEMOLÓGICO La presente investigación está enmarcada en un enfoque Empírico-Analítico, fundamentado en el Positivismo Lógico y enmarcado en el paradigma cuantitativo. Está caracterizado por un análisis estructurado y prefijado. Dentro de esta matriz epistémica, la presente investigación tiene como fin último controlar y explicar los fenómenos estudiados, buscando la generalización de los hallazgos, haciendo énfasis en la validez externa y basándose en un análisis estadístico. CAPITULO III OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION III. 1.- OBJETIVO GENERAL: Evaluar el efecto de la atorvastatina sobre los cambios morfológicos, fenotípicos, serológicos y citométricos durante la isquemia cerebral global experimental. III. 2.- OBJETIVOS ESPECÍFICOS: 1) Estudiar los cambios morfológicos que induce la hipoxia en el tejido cerebral de ratas. 2) Determinar el efecto de la atorvastatina en los cambios morfológicos inducidos por la isquemia en el tejido cerebral de ratas. 3) Evaluar la expresión de Fas y FasL en tejido cerebral del grupo control y en tejido cerebral isquémico de ratas. 4) Estudiar el efecto de la atorvastatina en la expresión de Fas y FasL en el tejido cerebral isquémico de ratas. 5) Evaluar cuantitativamente los cambios necróticos y apoptóticos precoces, en el tejido cerebral isquémico de ratas por citometría de flujo. 6) Analizar el efecto de la atorvastatina sobre los cambios necróticos y apoptóticos precoces, en el tejido cerebral isquémico de ratas por citometría de flujo. 7) Determinar las concentraciones séricas de citocinas proinflamatorias (TNFalfa e IL-1) en ratas sin isquemia y sometidas a condiciones de isquemia cerebral global. 8) Evaluar el efecto de la atorvastatina sobre las concentraciones séricas de citocinas proinflamatorias (TNF-alfa e IL-1) en ratas sin isquemia y sometidas a condiciones de isquemia cerebral global CAPÍTULO IV MARCO TEORICO IV.1.- Enfermedades Cerebrovasculares En el año 400 AC, el padre de la medicina, Hipócrates, reconoció y describió el accidente cerebrovascular (ACV), como el "inicio repentino de parálisis”. En aquellos tiempos se le conocía como apoplejía, que significa "ataque violento", en griego. El término apoplejía no indicaba diagnóstico o causa específica. Los médicos sabían muy poco acerca de la causa del ACV y la única terapia establecida era alimentar y cuidar al paciente hasta que, el mismo, siguiera su curso (39, 40). La primera persona en investigar los signos patológicos de la apoplejía fue Johann Jacob Wepfer, quien fue el primero en identificar los signos "posmorten" de la hemorragia cerebral de los pacientes fallecidos de apoplejía. De los estudios de autopsias obtuvo conocimiento sobre las arterias carótidas y vertebrales que suministran sangre al cerebro. Wepfer fue, también, la primera persona en indicar que la apoplejía, además de ser ocasionada por la hemorragia, podría también ser causada por un bloqueo de una de las arterias principales que suministran sangre al cerebro. Así pues, la apoplejía vino a conocerse como enfermedad cerebrovascular (41). La ciencia médica continuó estudiando las causas, los síntomas y el tratamiento de la apoplejía y confirmaría, con el tiempo, las hipótesis de Wepfer, pero hasta muy recientemente los médicos podían ofrecer poco en materia de terapia. En 1928 se dividió a las enfermedades cerebrovasculares en dos categorías, basadas en la causa del problema en los vasos sanguíneos, el accidente cerebrovascular isquémico, cuando hay un bloqueo de un vaso sanguíneo que suministra sangre al cerebro, y el accidente cerebrovascular hemorrágico, cuando ocurre un sangramiento (42). En 1951, Fisher encontró, la relación entre la obstrucción de las arterias carótidas en el cuello y la isquemia vascular cerebral, afirmando que la trombosis en la arteria carótida interna, constituía una causa importante de ACV y que el embolismo cerebral no explicado, podía originarse del material trombótico en la misma arteria. Fisher también describió la patología en los infartos lacunares, que son pequeños infartos, generalmente de alrededor de 5 milímetros de diámetro, que se producen preferentemente en los núcleos grises basales (43). Durante las dos últimas décadas, los investigadores básicos y clínicos, han identificado los principales factores de riesgo de los ACV y han formulado técnicas quirúrgicas y tratamientos farmacológicos, para la prevención de estas condiciones médicas (39). Los ACV, en general, ocurren cuando se interrumpe el flujo sanguíneo, en cualquier área del cerebro, como consecuencia de un proceso patológico en los vasos sanguíneos: oclusión del lumen por un trombo o émbolo, ruptura del vaso, alteración de la permeabilidad de la pared vascular o cambios en la calidad de la sangre (6, 44). El término isquemia, no es sinónimo de hipoxia o hipoxemia, ésta última, se caracteriza por tensión parcial de oxígeno reducida a los tejidos, aún cuando exista una perfusión adecuada. La anoxia es la ausencia de oxígeno, a pesar de una perfusión adecuada. En la isquemia, por su parte, al disminuir el flujo sanguíneo cerebral, se produce una ausencia de oxígeno y de principios inmediatos, lo que se acompaña de un inadecuado lavado de metabolitos (45). Estudios, con animales, han demostrado que, la lesión cerebral se presenta dentro de unos minutos después de ocurrir una isquemia cerebral y, puede hacerse irreversible, dentro de un periodo de sólo una hora. En los seres humanos, el daño cerebral comienza en el momento en que se inicia la isquemia y a menudo continúa, por días, después de ocurrir la misma (6, 40). La incidencia de enfermedad cerebrovascular varía, dependiendo de las poblaciones estudiadas; se presenta más en hombres, en población de raza negra, y aumenta exponencialmente con la edad (46-50). En Latinoamérica se reporta una incidencia para enfermedad cerebrovascular entre 0,89-1,83/1.000 (50, 51, 52, 53). En nuestro país, los ataques isquémicos cerebrales (AIC) representan la cuarta causa de morbimortalidad, según el último informe del Ministerio de Salud y Desarrollo Social (3). Por otro lado, las cifras de prevalencia de enfermedad cerebrovascular reportadas en Latinoamérica, están en un rango de 1,7 a 6,5/1.000 (50, 52, 53). Es importante resaltar que la enfermedad cerebrovascular es la tercera causa de muerte en países desarrollados después de la enfermedad coronaria y el cáncer (54, 55) y se ha estimado que entre 10% y 40% de los pacientes mueren antes de recibir atención médica (50). La curva de mortalidad secundaria a enfermedad cerebrovascular ha mostrado una tendencia a disminuir en los últimos años. La caída en la tasa de mortalidad llega hasta 7% en los países desarrollados, comportamiento que no se ha observado en países Latinoamericanos en desarrollo (54). La disminución en las curvas de mortalidad en los últimos años en los países desarrollados, puede explicarse por los avances en el cuidado y tratamiento inmediato, de las personas con enfermedad cerebrovascular y por la intervención de medidas de prevención y control sobre los factores de riesgo (54). Hoy en día, las enfermedades cerebrovasculares son una de las primeras causas de discapacidad y mortalidad en el mundo. El ataque isquémico representa aproximadamente 80% de los casos. Los estudios que se han realizado en los últimos años, han tratado de identificar los mecanismos de daño celular producidos por la isquemia, demostrándose que, durante ella, se desencadenan una serie de cambios bioquímicos y fisiológicos que causan daño a la célula y llevan a la muerte celular. (56). El consumo de O2 cerebral normal es, en promedio, de 3,5 ml/100 gr de tejido cerebral/minuto, principalmente destinado a elaborar ATP, para lo cual son utilizados aproximadamente 31 M de glucosa/100 gr de tejido/min. Normalmente, estos requerimientos son cubiertos por el flujo sanguíneo cerebral medio (FSC) cuyo valor es aproximadamente 50 a 60 ml/100 gr de tejido/min (57, 58), lo que en un cerebro adulto de 1700 gr de peso equivale a 500 – 700 al/min y representa 15 a 20% del volumen minuto cardíaco (59). IV.2.- Fisiopatología de la Isquemia Cerebral Lo primero que ocurre en un AIC es la reducción del FSC, cuando éste desciende, a menos de 20 ml/100gr/min, se produce un cierto grado de isquemia, que puede provocar un déficit neurológico reversible si ocurre la reperfusión, en menos de 20 minutos. Pero, si el flujo desciende a menos de 10 ml/100 gr/min, ocurre una necrosis y por lo tanto un déficit neurológico, que será irreversible (60). El área cerebral que funciona con un aporte de flujo entre 10 y 20 ml/100 gr/min se denomina Penumbra Isquémica y es potencialmente recuperable si se reestablece la presión de perfusión (6, 61-64). El concepto de penumbra, ha tenido gran impacto clínico, debido a que se trata de una zona potencialmente viable, en la que la integridad de la membrana celular se preserva y puede ser rescatada de la necrosis. Lógicamente, el periodo durante el cual la penumbra persiste, representa una ventana potencial de oportunidad terapéutica, que depende fundamentalmente de la severidad de la isquemia, del FSC proveniente de colaterales, de la vulnerabilidad selectiva del tejido neuronal afectado y de factores sistémicos, tales como la glucemia, la presión arterial sistémica y la temperatura corporal. (65, 66). Al ocurrir la isquemia, en cuestión de segundos, se produce depleción del metabolismo aeróbico, cesando la fosforilación oxidativa y por lo tanto, la única vía de producción de ATP será la Glicólisis Anaerobia, sin embargo esta vía no es adecuada para la función cerebral normal. (57). Al ocurrir la hipoxia y la consecuente desviación del metabolismo a la vía anaerobia, se producirá una gran cantidad de ácido láctico y de CO2, lo que produce una acidosis (67). Como consecuencia de la depleción de ATP, va a ocurrir una alteración de la bomba sodio-potasio, con la consiguiente despolarización de la membrana neuronal, que lleva a una salida de potasio al exterior de la célula y la entrada de iones sodio y calcio. El aumento del sodio intracelular atrae agua y cloro, aumentando la despolarización celular (6, 64, 68), favoreciendo la formación de un edema citotóxico, que afecta a las neuronas y especialmente a las células de la glia (57). El calcio juega un papel importante en la regulación de muchas vías enzimáticas, de las cuales 4 tienen gran importancia en el intento de explicar los efectos citotóxicos mediados por el calcio, ellas son: fosfolipasas, proteasas, proteinquinasas y fosfatasas activadas por el calcio. Sin embargo, su incremento intracelular durante la isquemia produce daño mitocondrial y desacopla la fosforilación oxidativa con la consiguiente depleción de ATP, impidiendo a su vez la recuperación mitocondrial (57). Además de lo anterior, el aumento del calcio intracelular condiciona la expresión de varios genes de respuesta inmediata (6, 64). La producción de inositol trifosfato (IP3) induce la liberación de Ca++ de los depósitos intracelulares. La sobrecarga de Ca++ intracelular combinado al exceso de Diacilglicerol (DAG) activa enzimas como la proteinquinasa C (PKC), capaz de aumentar la sensibilidad celular, tanto al glutamato, como a otros estímulos excitatorios. La continua liberación intracelular de Ca++ dispara la liberación de glutamato y por ello se extiende la cascada tóxica a otras células (63, 64). La activación de la fosfolipasa A2 como consecuencia del aumento del calcio intracelular provoca la descomposición de los fosfolípidos de la membrana y la liberación de ácidos grasos de la célula. La pérdida de fosfolípidos altera la permeabilidad de la membrana al calcio, con lo cual el deterioro es aún mayor. Los ácidos grasos libres desacoplan la fosforilación oxidativa; altas concentraciones de ácidos grasos promueven también la liberación de Glutamato e impiden su recaptación, además de inhibir la ATPasa Na+ /K+ e inducir la formación de edema tisular (64). Las fosfolipasas activadas por el calcio actúan sobre los fosfolípidos que forman parte de la membrana celular transformándolos en ácido araquidónico, este ácido, por efecto de las monooxigenasas (lipooxigenasa y ciclooxigenasa), es el precursor de varios compuestos activos como son: las prostaglandinas (PG), los leucotrienos (LT) y tromboxanos (TX). Además, se producen radicales libres como, Hidroxilo (OH-), Peróxido de Hidrógeno (H2 O2) y Superóxido (O2-), subproductos metabólicos que, finalmente, desembocan en la muerte neuronal (57, 64). Estos radicales libres, producen daño a los ácidos nucleicos por ruptura de las cadenas y modificación de las bases. Además del daño neuronal, los radicales libres también pueden afectar el tejido vascular, produciendo daño al endotelio, ruptura de la barrera hematoencefálica y edema vasogénico. También se ha demostrado, que estos compuestos, estimulan la liberación de glutamato (6). En la evolución de una isquemia cerebral, la muerte neuronal puede ocurrir de manera inmediata, por necrosis, en el centro del infarto o, tardía, en la zona de penumbra isquémica, en la cual participarían los procesos de apoptosis (56, 69, 70). La apoptosis es un mecanismo de eliminación de células en el cual se produce una serie de cambios morfológicos diferentes a los que ocurren en la necrosis. Durante la misma, los fragmentos celulares que se forman, son rápidamente fagocitados por neutrófilos, macrófagos y células dendríticas, los cuales no se activan durante el proceso y, por lo tanto, no producen fenómenos inflamatorios en los tejidos vecinos. Por el contrario, en la necrosis, la célula sufre una agresión generalmente súbita y experimenta cambios morfológicos importantes, produciéndose finalmente, una respuesta inflamatoria (13). La inflamación, tras la isquemia cerebral aguda, es un hecho conocido desde hace varias décadas, aunque se desconocían sus implicaciones fisiopatológicas (7, 71). El conocimiento de algunos de los mecanismos básicos de la inflamación, como la liberación de citocinas y quimiocinas, o la migración y posterior adhesión de los leucocitos al endotelio vascular (16), ha permitido llevar a cabo en estos últimos años, diferentes estudios, a través de los cuales se ha podido evaluar, la repercusión de estos mecanismos en la fisiopatología de la isquemia cerebral aguda (71). La respuesta inflamatoria que se desencadena, tras la isquemia del tejido cerebral, está mediada y modulada por la acción de las citocinas. La isquemia aguda provoca una alteración del intercambio iónico a través de la membrana neuronal por el fallo energético de la bomba NA+/K+, ocasionando aumento de calcio intracelular, con liberación de ácidos grasos libres y leucotrienos. Estas sustancias parecen ser las responsables de inducir la expresión de las citocinas en las neuronas y en las células gliales. Las principales citocinas que intervienen en la inflamación inducida por la isquemia cerebral son: la interleucina-1(IL-1), el factor de necrosis tumoral (TNF), y la interleucina-6 (IL-6) (16, 17). Las citocinas, inducen la liberación de quimiocinas, que son de suma importancia para la quimiotaxis de los leucocitos hacia la región isquémica. La quimiocina más importante es la interleucina- 8 (IL-8); cuya principal función es la de intervenir en el reclutamiento de los neutrófilos, y su liberación es inducida por la IL-1 y el TNF. En pacientes con infarto cerebral se ha observado un aumento de sus niveles plasmáticos durante las primeras 24 horas (18). El daño isquémico cerebral se exacerba por la infiltración leucocitaria y la formación de edema vasogénico (72, 73). IV.3.- Apoptosis Poco después del descubrimiento de las células, la muerte celular comenzó a considerarse como un fenómeno fisiológico importante durante del desarrollo del organismo. Las primeras observaciones de muerte celular fisiológica fueron desarrolladas, en la metamorfosis de anfibios, por Vogt, en 1842. Posteriormente, se realizaron las mismas descripciones en otros tejidos en desarrollo, tanto de invertebrados como de vertebrados (74). El concepto de muerte celular programada fue dado por Lockshin y Williams, en 1964 (75), al describir la muerte de células que ocurría como evento programado durante el desarrollo del organismo. En 1972, Kerr, Wyllie y Currie, publicaron un artículo pionero, describiendo una forma de muerte celular, a la que denominaron apoptosis, y establecieron las diferencias entre este tipo de muerte y la necrosis, haciendo la primera descripción morfológica, de los cambios que ocurren en la célula apoptótica asociados con la muerte celular. Según estos autores, la muerte por apoptosis respondía a un programa de muerte intracelular, que podía ser activado o inhibido por una variedad de estímulos tanto fisiológicos como patológicos (76). La apoptosis es un proceso fisiológico, en la mayoría de los casos, controlado genéticamente, en el que determinadas células dirigen su propia muerte en beneficio del organismo. El término apoptosis deriva del griego apo (fuera de) y ptosis (cayendo). (76, 77). En la década de los 80, se describe la participación de la apoptosis en procesos patológicos y fisiológicos (78). Para 1982, se publicaron los estudios genéticos en el nemátodo caenorhabditis elegans, en los que se describieron, los genes encargados del control y la ejecución de la apoptosis en dicho organismo y gracias a la homología, que existe entre este gusano con los organismos superiores, los estudios de apoptosis han sido tomados como referencia para otros organismos (79). Durante los años 90, la apoptosis, se convirtió en uno de los principales tópicos de estudio dentro de la biología. En la actualidad, se ha demostrado que las alteraciones en la apoptosis, son un mecanismo fundamental para el desarrollo del cáncer (78) y ha sido implicada en la etiología y evolución de muchas enfermedades, en las que la apoptosis, puede participar de dos maneras: ya sea por aumento de la supervivencia celular, en aquellos casos donde existe una inhibición de la apoptosis, tal es el caso del cáncer, como se mencionó anteriormente, enfermedades autoinmunes, enfermedades inflamatorias, etc; o en enfermedades en las que ocurre un incremento de la muerte celular apoptótica, como se observa en el SIDA, enfermedades hematológicas y neurodegenerativas, como el Alzheimer (80) y la esclerosis múltiple (81), y enfermedades por daño tisular entre las que se incluye a los accidentes cerebrovasculares (82). Todas las células del organismo están programadas para destruirse por apoptosis, ya sea porque hubiesen completado sus funciones, porque hayan sufrido un daño en su material genético o porque les falten las señales que las mantengan en plena actividad funcional. La muerte celular programada es un proceso esencial durante el desarrollo del sistema nervioso, permitiendo la selección de poblaciones neuronales adecuadas y el refinamiento de las conexiones (67). Es desencadenada por señales celulares controladas genéticamente. Estas señales pueden originarse en la célula misma o proceder de la interacción con otras células. La apoptosis contribuye a dar la forma a los órganos durante la morfogénesis y elimina células inmunológicamente autorreactivas, células infectadas y las genéticamente dañadas, cuya existencia es potencialmente dañina para el hospedador (77). En el cerebro, contribuye a la muerte neuronal durante el desarrollo (83). Las células que sufren apoptosis, experimentan cambios muy distintos a las que sufren necrosis. En la apoptosis, destacan las alteraciones morfológicas del núcleo frente a las del citoplasma, a la inversa de lo que ocurre en la necrosis, en general, y los organelos permanecen inalterados, incluso hasta la fase en que aparecen los cuerpos apoptóticos (77, 84, 85, 86). La necrosis, por su parte, es una forma de muerte celular que resulta de un proceso pasivo, accidental y que es consecuencia de la destrucción progresiva de la estructura celular, con alteración irreversible y definitiva de la función normal, siempre de manera patológica, y nunca regulada. Este daño, es desencadenado por diversos factores como la isquemia, temperaturas extremas y traumatismos mecánicos y también por diversas enfermedades, agentes infecciosos, carencia de oxígeno, etc. (85). Las células que mueren por necrosis, se edematizan, como consecuencia de un desequilibrio hídrico e iónico, quedando alterada toda su estructura, y produciéndose la ruptura de la membrana celular. El resultado de esta ruptura es la liberación de enzimas intracelulares nocivas, que destruyen las células circundantes. En el proceso necrótico se observan pocas alteraciones del núcleo. Por otro lado, los macrófagos circulantes y otros glóbulos blancos convergen en las células necróticas, e ingieren los restos celulares derivados de dicha ruptura celular, de tal manera que se produce una respuesta inflamatoria. Esta participación de los glóbulos blancos generalmente lesiona también el tejido vecino sano (85). Entre los cambios morfológicos que se observan en la apoptosis se pueden mencionar: a) Ausencia de edema celular, b) Retracción del citoplasma de las células, y disminución del volumen celular, apartándose de sus vecinas. c) La superficie celular adquiere un aspecto vesiculado, pero no se rompe la membrana, de modo que no se dispersan los productos tóxicos. d) Condensación de la cromatina formando acúmulos cerca de la membrana nuclear; los cromosomas y el genoma se dividen en trozos regulares; el ADN se fragmenta en segmentos que son múltiplos aproximadamente de 1856 pb, debido a una hendidura especial que existe entre los nucleosomas. En este momento, las células apoptóticas son ingeridas por células cercanas sin que se produzca respuesta inflamatoria e) Las células no ingeridas sufren una desintegración del núcleo y la célula se divide en numerosos cuerpos apoptóticos, que contienen una o varias piezas nucleares y mantienen la integridad de la membrana plasmática, y cuyos organelos se mantienen intactos (67, 85). A diferencia de la apoptosis, en la necrosis no existen marcadores de superficie o bioquímicos que puedan ser identificados (67) y sólo puede distinguirse por la ausencia de parámetros apoptóticos (activación de caspasas, liberación de citocromo c y fragmentación oligonucleosomal del ADN) y de marcadores de cinética diferencial tales como exposición de la fosfatidilserina y permeabilización de la membrana celular (85). Tanto la necrosis como la apoptosis, pueden combinarse en situaciones de muerte celular masiva, cuando la cantidad de células a eliminar excede la capacidad de fagocitosis por células vecinas, lo que determina que los restos de células apoptóticas se acumulen y sean degradadas por un proceso denominado necrosis secundaria (67). La apoptosis puede ser dividida en tres fases: a) La primera fase es la de iniciación, en la cual la célula recibe el estimulo que la conduce a la muerte. Puede ser desencadenada por diferentes señales intra o extracelulares. Las primeras son, en muchos casos, originadas por estrés biológico, el cual provoca la liberación de citocromo C de la mitocondria (vía intrínseca), mientras que algunas de las señales extracelulares, desencadenan el proceso apoptótico, al unirse a su ligando, presente en la membrana plasmática de la célula blanco (vía extrínseca). La vía extrínseca puede ejemplificarse, con la señal proapoptótica que se desencadena por la unión de Fas con su ligando FasL (CD95L). El Fas (CD95/Apo-1) es miembro de la superfamilia del receptor de Factor de Necrosis Tumoral (TNF) y su activación lleva a la formación de un complejo de señales inductoras de muerte asociadas a la membrana (87). FasL (CD95L) es un trímero que al unirse con Fas (CD95 o APO-1) induce la trimerización de éste. La vía intrínseca o mitocondrial se activa por estrés, y otras señales que provocan la translocación a la mitocondria de miembros proapoptóticos. Lo anterior provoca la liberación de citocromo C al citosol, lo cual se acompaña de pérdida del potencial de membrana mitocondrial y desestabilización de la membrana externa de la mitocondria. En el citosol, el citocromo C se une a Apaf-1 en presencia de ATP y forma el complejo conocido como apoptosoma, que activa a la pro-caspasa 9, la cual puede activar a las caspasas 3, 6 y 7. Estas son las principales responsables de los cambios morfológicos y bioquímicos que ocurren en la célula apoptótica ya que entre sus sustratos se encuentran proteínas del citoesqueleto, de la membrana nuclear y las encargadas de la reparación del DNA entre otras. (88). En otras palabras se degradan los ácidos nucleicos y hay más cambios en la membrana celular. Los cuerpos apoptóticos son fagocitados por macrófagos impidiendo la salida del contenido celular al exterior y evitando inflamación. En esta fase se activan las endonucleasas que se encargan de fragmentar el DNA; además se producen cambios marcados en el citoesqueleto, y se condensa la cromatina (88). b) La segunda o fase de ejecución, se dan la mayor parte de los cambios morfológicos y bioquímicos característicos de la apoptosis. La célula que ha recibido una señal apoptótica, pierde contacto con las células vecinas y el citoplasma se contrae provocando una disminución en el tamaño celular. Los organelos citoplasmáticos permanecen intactos, sin embargo, en la mitocondria se dan cambios como la reducción del potencial transmembrana, el desacoplamiento de la cadena de transporte de electrones para la síntesis de ATP y el incremento en la generación de especies reactivas del oxígeno. En etapas posteriores, la cromatina se condensa y se fragmenta. Finalmente, la célula genera un número variable de vesículas de diferentes tamaños (cuerpos apoptóticos) rodeados de membrana plasmática íntegra, que contienen parte de la cromatina y de los organelos celulares (88). c) Por último, en la fase de eliminación, los restos celulares son degradados por los macrófagos y células adyacentes. (13, 88). Para el estudio de la apoptosis se han desarrollado numerosas técnicas. Entre ellas, las más importantes son: 1) La microscopía óptica y electrónica son las dos técnicas más clásicas, para la búsqueda de los cambios morfológicos de las células apoptóticas. Permite una detección temprana de la apoptosis, pero son poco útiles a la hora de cuantificar la magnitud del fenómeno. (78, 82). 2) Estudio de la fragmentación del ADN en geles de agarosa, que permite observar el patrón en escalera del ADN degradado y cuantificar la proporción de células apoptóticas (78, 82). 3) Detección de degradación de ADN en células individuales por medio del marcaje del ADN. Método muy utilizado, llamado técnica del TUNEL (transferase-mediated dUTP nick end-labeling), que se puede utilizar tanto para la detección por citometría de flujo, como por microscopía. Esta técnica permite determinar, tanto en forma temprana como tardía, la fragmentación de ADN en células individuales y conocer la proporción de células que está muriendo por apoptosis en un determinado momento; sin embargo, tiene el problema de que las células pueden ser removidas por fagocitosis antes de que se presente la degradación del ADN y por otra parte, no permite distinguir las células que mueren por apoptosis, de aquellas células que durante la necrosis también presentan degradación del ADN, por lo que siempre se sugiere que se complemente este estudio con otra técnica. (78). 4) Detección de la activación de caspasas. La activación de la caspasa 3 se utiliza como marcador temprano de apoptosis. Presenta la ventaja de que es un evento que tiene alta correlación con la inducción de la apoptosis, por lo que no existe la incertidumbre presente en otros marcadores en los que su presencia o ausencia no son determinantes en el proceso de muerte celular programada (78). 5) Evaluación de la simetría de la membrana celular. Un evento temprano que se presenta en la apoptosis es la pérdida de la simetría de la membrana citoplasmática. Se sabe que durante la apoptosis la integridad de la membrana se mantiene, lo que significa que la característica de semipermeabilidad está presente, sin embargo, se presentan cambios en su simetría. En este sentido, uno de los eventos tempranos en apoptosis es la exposición de fosfatidilserina hacia el exterior de la membrana celular. Para detectar la presencia de fosfatidilserina en el exterior de la membrana se utiliza la anexina V, la cual es una molécula que no es capaz de difundir a través de la membrana intacta y que tiene una alta afinidad por la fosfatidilserina, por lo que las células que se encuentren marcadas con anexina V, serán aquellas que se encuentran en apoptosis. La detección de anexina V, por citometría de flujo, se puede acompañar de una tinción con ioduro de propidio, lo que nos permitirá saber si la integridad de la membrana se ha perdido. Esto permite conocer si la célula se encuentra en una etapa temprana de muerte celular, o si se encuentra en una etapa tardía, en la cual ya se encuentra presente la necrosis secundaria (78, 89). IV.4.- Apoptosis e Isquemia Cerebral La isquemia cerebral focal ocasiona una necrosis, en el centro del infarto y la activación de vías de señales complejas, para la muerte y supervivencia celular, en el área de la penumbra. Recientes estudios han demostrado la activación de las vías intrínseca y extrínseca de la muerte celular mediada por caspasas, así como también, la activación de la vía de señalización independiente de caspasa, durante la isquemia (12). Se ha demostrado un aumento de la expresión de Fas y FasL después de una isquemia cerebral focal, así como también, un aumento de la expresión de caspasa 1, 3, 8 y 9 y clivaje de la caspasa 8, en el área de la penumbra (12). En el año 1999, Martin-Villalba y Cols (90) observaron modelos de muerte neuronal, inducida por isquemia, en cerebros de ratas, tanto in vivo como in vitro, y constataron que en las áreas isquémicas con muerte celular por apoptosis, se expresaban FasL (CD95L) y TNF (TRAIL). Por otra parte, también demostraron que al añadir proteínas recombinantes de Fas y TNF a neuronas in vitro, se les inducía apoptosis. Se ha dicho, que la producción de citoquinas inflamatorias e invasión de linfocitos, macrófagos y microglias, durante la isquemia cerebral, pueden inducir la expresión de mediadores de apoptosis, tales como la molécula Fas (19). Una publicación realizada por Padosch y Cols en 2003 (22), respalda los resultados obtenidos por los investigadores anteriormente citados, al destacar el posible rol que tiene el sistema Fas/FasL en el daño luego de una isquemia cerebral global total. Como resultado obtuvieron que la expresión de ambas proteínas fue alta en los tejidos estudiados, con diferencias sólo en el tiempo que se mantuvieron expresadas. La activación de la vía intrínseca (mitocondrial) de la apoptosis, después de una isquemia focal es disparada por la translocación de Bax y la competencia con Bcl-2 y otros miembros de la familia Bcl-2 en la membrana mitocondrial, la cual es seguida por la liberación de citocromo C en el citosol (12, 13). La liberación de citocromo C en el citoplasma de las células se ha observado, tanto en isquemia cerebral reversible, como en la permanente y podría disparar la muerte celular por apoptosis, proceso que probablemente contribuya a la expansión de la lesión isquémica (91). Estudios previos han demostrado que la sobreexpresión de Bcl-2 reduce el tamaño del infarto; Bcl-2 protege contra la muerte apoptótica y necrótica inducida por varias lesiones cerebrales (92). El citocromo C se une a Apaf-1 y dATP reclutando y clivando a la procaspasa 9 en el apoptosoma. Tanto la caspasa 8 como la caspasa 9 activan a la caspasa 3, entre otras caspasas, la cual a su vez cliva a varios substratos. La caspasa 3 es la principal proteasa efectora de muerte celular en el sistema nervioso del adulto y el neonato (93). La inhibición de la caspasa 3, reduce el tamaño del infarto (12). Teniendo en cuenta la fisiopatología de la isquemia cerebral se pueden plantear tres posibles estrategias terapéuticas orientadas a minimizar las consecuencias del accidente cerebrovascular isquémico: 1) incrementar las reservas energéticas de las células (tratamiento profiláctico exclusivamente) (25), 2) minimizar el daño restableciendo la perfusión lo antes posible (terapias trombolíticas) (70), y 3) neuroprotección propiamente dicha. (25). IV.5.- Neuroprotección La neuroprotección, en tèrminos generales, es una estrategia de tratamiento cuyo objetivo fundamental es reducir la vulnerabilidad intrínseca del tejido cerebral a la isquemia (15, 66, 94). En los últimos años, se ha progresado de forma importante, en el conocimiento de sustancias que actúan en diferentes puntos de la cascada, que conllevan a la muerte por necrosis o por apoptosis y que interfieren con estos procesos, prolongando la vida de la neurona (70, 95, 96). Muchas de estas sustancias han demostrado una considerable eficacia, en diversos modelos animales de isquemia cerebral, especialmente reduciendo el tamaño del infarto. Estos compuestos parecen promisorios como neuroprotectores y son el objeto de estudio en animales de experimentación y ensayos clínicos en el humano (6). Se han definido varios niveles de neuroprotección, aquella que se produce cuando se utiliza un fármaco que incrementa la resistencia de la neurona al daño isquémico, hipóxico, excitotóxico o metabólico, se denomina Neuroprotección Primaria. La Neuroprotección Secundaria se refiere a la intervención farmacológica que interfiere con los procesos patogénicos que se desencadenan después de que se ha instaurado la lesión isquémica, hipóxica, excitotóxica o metabólica. Estos procesos más tardíos son responsables de la muerte neuronal de forma necrótica o apoptótica y finalmente cuando lo que se busca es potenciar la capacidad de recuperación del tejido nervioso previamente lesionado, se habla de Neuroprotección Terciaria (25). En los actuales momentos existen infinidad de trabajos cuyo objetivo principal es la búsqueda de fármacos capaces de prevenir los ataques isquémicos (97, 98). Entre los medicamentos que más han sido estudiados se encuentran las estatinas, las cuales tienen, desde el punto de vista experimental, un efecto neuroprotector, relacionado con sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes (23, 27, 99). Estas acciones descritas para las estatinas son totalmente independientes de su acción hipolipemiante. IV.6.- Estatinas Las estatinas son un grupo de fármacos, análogos del ácido mevalónico, que producen una potente inhibición competitiva y reversible de la Hidroxi-MetilGlutaril-Coenzima A (HMG-CoA) reductasa, enzima que limita la síntesis endógena del colesterol. Reducen así, la síntesis celular de colesterol y los niveles circulantes de lipoproteínas de baja densidad (LDL). Las células responden a esta reducción, aumentando la expresión, en el hígado, de los genes que codifican la HMG-CoAreductasa, por lo que la síntesis de colesterol disminuye, aumentando la captación hepática de LDL y de lipoproteínas de muy baja densidad (VLDL). Por otra parte, las estatinas también reducen la degradación de dichos receptores, por lo que hay una disminución de los niveles plasmáticos de ambas lipoproteínas. (24, 59, 100). Las estatinas al bloquear la colesterogénesis en el hígado, conducen a un aumento de la expresión del gen que codifica para receptores de LDL. Como reacción al contenido reducido de colesterol libre dentro de los hepatocitos, las proteínas de unión del elemento regulador de esteroles, unidas a membrana, se desdoblan por medio de una proteasa y se traslocan hacia el núcleo. A continuación el elemento con capacidad de respuesta a esterol del gen que codifica para receptores de LDL se une a los factores de transcripción, lo cual aumenta ésta última e incrementa finalmente la síntesis de dichos receptores. También se reduce la desintegración de receptores de LDL. El mayor número de receptores de LDL sobre la superficie de hepatocitos da por resultado aumento de la eliminación de LDL desde la sangre, lo que disminuye las concentraciones de colesterol de lipoproteínas de baja densidad. Algunos estudios sugieren que las estatinas, también pueden reducir las concentraciones de LDL, al aumentar la eliminación de precursores de LDL, como las VLDL y las lipoproteínas de densidad intermedia (IDL) y al disminuir la producción hepática de VLDL (59, 101). Estudios en ratas, han revelado que las estatinas tienen un efecto neuroprotector (102) y son capaces, de reducir el tamaño del infarto cerebral, después de una oclusión temporal de la arteria cerebral media (24, 38). Este mecanismo neuroprotector no es dependiente de la reducción de colesterol sino del aumento de la actividad de la sintetasa de óxido nítrico endotelial (23, 24, 34, 103). Algunas investigaciones han demostrado que estos fármacos aumentan el flujo sanguíneo cerebral (34), reducen el riesgo de ataques isquémicos en sujetos con altos niveles de colesterol (24, 26, 104, 105) con una reducción de riesgo relativo del 21% (106) y, mejoran la función neurológica de los ratones normocolesterolémicos (34). Chaturvedi y cols, en 2008 (107) demostraron que la atorvastatina, reducía el riesgo de ataques isquémicos transitorios y, de cualquier otro evento arterial coronario, en pacientes ancianos. Iguales hallazgos, fueron reportados por Amarenco y cols en 2006 (108), para otros grupos etarios. Otros estudios han reportado que las estatinas, no sólo reducen el riesgo de ocurrencia, de los ataques isquémicos, en pacientes con alto riesgo (109, 110), sino también el riesgo de recurrencia de dichos ataques (111, 112). Investigaciones con doppler transcraneal han demostrado que las estatinas son capaces de mejorar la hemodinámica cerebral (113). Las estatinas pueden reducir la respuesta inflamatoria en el cerebro y, sus propiedades antioxidantes pueden conferir neuroprotección adicional (102). La lovastatina inhibe la activación de la óxido nítrico sintetasa inducible y de citocinas, Factor de Necrosis Tumoral e Interleucina-1, en macrófagos, microglias y astrocitos de ratas. La reducción de la respuesta inflamatoria, puede ser importante en la isquemia cerebral, donde la sintetasa del óxido nítrico inducible y las citocinas inflamatorias tales como la IL-1 aumentan el daño tisular (24). Los estudios con estatinas, como medicamento neuroprotector, han tenido resultados variables y en algunos casos, contradictorios y dependientes del tipo de estatina utilizada y del tejido estudiado. Por ejemplo, Knapp y cols en 2000, (32) estudiaron el efecto de la simvastatina y de la lovastatina en la apoptosis de células musculares lisas vasculares y demostraron que ambas estatinas, a dosis farmacológicas, sensibilizan fuertemente a dichas células, a la apoptosis inducida por citocinas; por el contrario, la atorvastatina redujo la apoptosis en las placas ateroescleróticas. Este efecto también fue demostrado por Atalar y cols en 2002 (36). Además de sus efectos hipolipemiantes, se ha demostrado que las estatinas poseen efectos pleiotrópicos, relacionados principalmente, con la inhibición de la síntesis de isoprenoides intermedios, en la vía de la biosíntesis del colesterol, los cuales son necesarios para la proliferación celular y otras importantes funciones celulares (114, 115, 116). Por consiguiente, los beneficios cardiovasculares estarían probablemente relacionados con estos efectos pleiotrópicos, particularmente, aquellos que inducen una estabilización de la placa ateromatosa (114, 117, 118). De hecho, varios estudios clínicos, han demostrado la habilidad de las estatinas, para reducir la incidencia de enfermedad coronaria, probablemente, más por incremento de la estabilidad de la placa, que por reducción de la oclusión estenótica (119), este efecto puede envolver, además de la reducción de colesterol, una actividad directa de estas drogas en la pared arterial (120, 121, 122). Algunos autores han demostrado que las estatinas disminuyen la migración y proliferación de células musculares lisas, (24) y pueden mejorar la función endotelial, independientemente de cualquier reducción de niveles de LDL colesterol (123). Las estatinas lipofílicas en general, entre las cuales se encuentra incluida la atorvastatina, inhiben la proliferación celular aparentemente por varios mecanismos, los cuales incluyen: inhibición del ciclo celular, reducción de la actividad de la ciclooxigenasa 2 y mejoría de la angiogénesis. Dentro de todos estos mecanismos, está la capacidad para inhibir la prenilación de la Proteína G a través de una reducción de la farnesilación y de la geranilgeranilación (124, 125). Las estatinas lipofílicas, reducen significativamente la liberación de prostaglandina E2, desde la microglia, ya sea, bajo condiciones basales o después de estimulación con interleucina 1beta (126). Recientes estudios han reportado que las estatinas tienen propiedades inmunomoduladoras, las cuales pueden tener efectos clínicos beneficiosos. Así, disminuyen la migración de leucocitos, en el sistema nervioso central, inhiben la expresión de los antígenos de histocompatibilidad clase II y coestimulan señales requeridas para la activación de células T proinflamatorias. Además, disminuyen la expresión de mediadores inflamatorios incluyendo óxido nítrico y Factor de Necrosis Tumoral α (127). Cabe considerar, por otra parte, que las estatinas también inhiben la expresión de factor tisular en el macrófago, bloquean la quimiotaxis de los monocitos y las interacciones entre las células endoteliales y los neutrófilos. Otras reducen la expresión de CD11b en los monocitos e inhibe la adhesión de monocitos al endotelio dependiente de CD11b. (24). Si bien es cierto, que hasta hace pocos años, la reducción de la incidencia de ataques isquémicos con el uso de estatinas sólo había sido evidente en prevención secundaria (24), recientemente algunos estudios han demostrado que pueden ser útiles en prevención primaria (118, 128-131). La reciente aparición de los resultados del estudio SPARCL (Stroke Prevention by Aggressive Reduction in Cholesterol Levels), junto con la publicación de las guías de la American Heart Association y de la Sociedad Española de Neurología, que otorgan a las estatinas un papel principal en la prevención del ictus, abren nuevas perspectivas para el uso de las estatinas en la patología vasculocerebral (106). CAPÍTULO V BASES LEGALES Y ÉTICAS Grandes avances en conocimientos biológicos y médicos, sobre todo en lo relativo a tratamiento y prevención de enfermedades, ha requerido en muchas oportunidades la experimentación en animales (132). La mayoría de los modelos de infarto cerebral se han desarrollado en ratas, y son ellas las más comúnmente usadas en el estudio de agentes terapéuticos, esto es debido a que estos animales muestran una aceptable analogía con los grandes mamíferos en cuanto a la anatomía cerebral y vascular y a la fisiología. Es de tener en cuenta, sin embargo, que en la aplicación clínica puede haber discrepancias en cuanto a los resultados obtenidos en animales y en humanos (133). De acuerdo a las normas internacionales para la investigación biomédica con animales del Consejo de Organizaciones Internacionales de Ciencias Médicas, el empleo de vertebrados en investigaciones médicas y para otros fines biomédicos, incluidos la producción y el ensayo de sustancias terapéuticas, profilácticas o de diagnóstico, etc, debe ceñirse a una serie de disposiciones nacionales o internacionales (134). Entre los principios básicos que deben tomarse en cuenta a la hora de utilizar animales de experimentación y que guardan relación con el presente trabajo, se encuentran (132, 135): 1) Los experimentos con animales sólo deberán realizarse después de considerar debidamente su interés para la salud humana o animal y la ampliación de los conocimientos biológicos. 2) Los animales seleccionados para un experimento deben ser de la especie y calidad apropiadas y su número debe constituir el mínimo necesario para obtener resultados científicamente válidos. 3) Los investigadores y el resto del personal deben tratar en todo momento a los animales como seres sensibles y han de considerar imperativos éticos, cuidarlos y emplearlos debidamente, evitando o minimizando su incomodidad, el sufrimiento físico o el dolor. 4) Los procedimientos que causen a los animales, dolor o sufrimiento físico que no sea momentáneo o mínimo deberán realizarse después de administrar sedantes, analgésicos o anestesia según prácticas aceptadas en la medicina veterinaria. 5) Al final de un experimento o, cuando proceda durante el mismo, se debe dar muerte a los animales que, de lo contrario, padecerán dolores, sufrimiento o incapacidades graves o crónicos imposibles de aliviar. 6) Los animales empleados para fines biomédicos se deben mantener en las mejores condiciones posibles. CAPÍTULO VI MARCO METODOLÓGICO VI.1.- Tipo de Investigación La presente investigación es de tipo experimental, debido que se administró un medicamento hipolipemiante con propiedades pleiotrópicas, a ratas de laboratorio, para analizar, posteriormente, las consecuencias de su administración, sobre los cambios tisulares inducidos por la isquemia cerebral, todo dentro de una situación controlada por el autor. VI.2.- Nivel de Investigación Es una investigación de nivel descriptivo, ya que se estudió la isquemia cerebral, utilizando criterios sistemáticos y poniendo de manifiesto su estructura o comportamiento, ante el uso de un medicamento con conocidas propiedades neuroprotectoras. Es de nivel exploratorio, ya que se obtuvo una visión general, aproximativa del tema en estudio, con el objeto de clarificar algunos aspectos de su fisiopatología, que ayuden a futuras investigaciones. Es de nivel explicativo, ya que se estudió un fenómeno que, aunque bastante conocido, aún quedan muchas interrogantes que deben ser investigadas, tratando de buscar explicación del por qué y cómo se produce. VI.3.- Obtención y Procesamiento de muestras Se realizó un estudio experimental en ratas Sprague Dawley, machos, con un peso promedio de 320 ± 20 gramos; las cuales fueron sometidas a las mismas condiciones de ambiente y de alimentación, ritmo de luz:oscuridad 12:12 horas, comida y agua ad libitum. Las ratas fueron distribuidas en tres grupos: Un Grupo Control (n=5) y dos Grupos Experimentales (Grupo 1 y Grupo 2) (n=5 c/u). Las ratas que conformaron el Grupo Control no fueron sometidas a isquemia cerebral y solo recibieron agua y alimento durante dos semanas. A los animales de los Grupos Experimentales (1 y 2) se les indujo isquemia cerebral global. Las ratas del Grupo 1 sólo recibieron agua y alimento, las ratas del Grupo 2 recibieron, además de agua y alimento, una dosis de Atorvastatina durante dos semanas. Los procedimientos experimentales se realizaron de acuerdo a lo indicado por el National Institute of Health y la U.S. Public Health Office (135) sobre el uso de animales de experimentación y fueron avalados por la Dirección de Investigación y Producción Intelectual de la Facultad de Ciencias de la Salud de la UC. Se administró Atorvastatina al grupo experimental 2, a una dosis de 10 mg.kg-1.día-1, por vía oral, durante 2 semanas, según Laufs y cols (116). Las tabletas de Atorvastatina eran pulverizadas y luego diluidas en agua, y administradas a través de una cánula orofaríngea especial para ratas. Las ratas del grupo control, una vez cumplidas las dos semanas de cautiverio, se anestesiaron con Tiopental Sódico (60 mg.kg-1), por vía intraperitoneal (I.P.), y una vez verificado el grado de anestesia profunda, por la ausencia de reflejos de retiro, se les realizó una trepanación fronto-parieto-occipital amplia y se les extrajo el hemisferio cerebral izquierdo, para obtener las muestras de tejido cerebral utilizado para los estudios morfológicos e inmunohistoquímicos. A las ratas de los grupos experimentales, previa anestesia profunda con Tiopental Sódico (60 mg.kg-1) por vía intraperitoneal (i.p.), se procedió a inducirles isquemia cerebral global por hipoxia, por paro respiratorio, al administrar Dtubocurarina (0,2 mg.kg-1, i.p.) siguiendo metodología reportada con anterioridad (136). Se vigiló, cuidadosamente, el momento en que ocurrió el paro respiratorio y a los 10 minutos, se les abrió el cráneo y se extrajo rápidamente el hemisferio cerebral izquierdo, el cual posteriormente fue cortado para obtener las muestras de tejido cerebral utilizados para los estudios morfológicos e inmunohistoquímicos. Para cuantificar y obtener un patrón de concentraciones séricas normales de TNF- e IL-1 en ratas, se tomaron muestras de sangre a las ratas del Grupo Control, para ello se les extrajo 3cc de sangre de las cavidades cardiacas por punción transtorácica inmediatamente después de inducir la anestesia y previo a la trepanación del cráneo. A las ratas de los Grupo 1 y 2, luego de la anestesia, se les extrajo, rápidamente, una muestra de 1,5 ml de sangre por punción de la vena de la cola, (cada rata representó su propio control); inmediatamente después se les sometió a isquemia cerebral global por el procedimiento ya descrito y una vez lograda la isquemia, se procedió a extraer 3cc de sangre de las cavidades cardiacas por punción transtorácica para determinar los niveles de TNF- e IL-1, posterior a la isquemia. VI.4.- Estudio de los cambios morfológicos del tejido cerebral normal e isquémico Una vez extraídos los hemisferios cerebrales, se lavaron en una solución de Buffer Fosfato Salino (PBS) y luego fijados en formol 10%. Posteriormente, se hicieron cortes sagitales de los hemisferios y se sometieron a un proceso de parafinación. Se hicieron cortes de tejido de 5 m de espesor, con un microtomo, y se procedió a teñirlos con Hematoxilina-Eosina (Laboratorio Sigma-Aldrich, EEUU), con las técnicas habituales, para su análisis histológico a través de un microscopio. Las láminas fueron observadas al microscopio óptico con aumentos sucesivos 40X, 100X y 400X, para ubicar y observar las características celulares. Se hizo énfasis en corteza cerebral e hipocampo (Asta de Amón), lugares donde se encuentran las neuronas más vulnerables a la hipoxia (134). En todos los casos, se analizaron 3 campos consecutivos, por el autor y dos investigadores colaboradores, en forma independiente. Se realizó el recuento de células normales e hipóxicas, se tomaron fotografías representativas de las características tisulares y celulares de los tres grupos de estudio. VI.5.- Estudio Inmunohistoquímico de la Expresión de Fas y FasL Las muestras de tejido obtenidas para inmunohistoquímica se procesaron de manera similar a lo descrito anteriormente, con la diferencia de que los cortes de tejido se colocaron en láminas portaobjetos tratadas con poli-L-lisina. Para la inmunohistoquímica se utilizó la técnica de Inmuno-Peroxidasa por el método indirecto. Las muestras fueron hidratadas con solución amortiguadora de fosfato (PBS) y secuencialmente incubadas, en cámara húmeda a temperatura ambiente, en diferentes etapas, con: 1) Anticuerpo Monoclonal Primario, anti CD95 (R&D Systems® EEUU), a una dilución 1/1000, durante 40 minutos, para la determinación de Fas; y Anticuerpo Monoclonal Primario antiCD95L (Abcam, Inglaterra), a una dilución 1/100, durante 90 minutos, para la determinación de FasL; 2) Anticuerpo Secundario biotinado, antiinmunoglobulina de rata (BRAR) generado en conejo (Vector Labs® EEUU), a una dilución 1/30, por 30 minutos y, 3) Sistema revelador enzimático con solución Cromógeno “Novared” (Vector Labs® EEUU) por 4 minutos. Los cortes fueron lavados con agua corriente y contrastados con Hematoxilina de Meyer (Chemical Webster, EEUU), por 5 minutos. Entre cada incubación se realizó un lavado con PBS durante 5 minutos. Las láminas fueron sometidas, luego, a deshidratación por pasos sucesivos de 3 minutos con alcohol 70%, alcohol 100%, y a dos pasos sucesivos en xilol 100%. Finalmente, se utilizó medio de montaje Entellan permanente hidrofóbico (Merck®). Se realizaron controles negativos en cada experimento en los que no se añadió el anticuerpo primario y, en su lugar, se colocó PBS. Las láminas fueron procesadas el mismo día, por los tres investigadores mencionados, de manera coordinada, independiente y simultánea, para detener la reacción enzimática al mismo tiempo. Posteriormente, las láminas se observaron al microscopio óptico. Se consideró como positiva la expresión de CD95 y CD95L, cuando las membranas celulares y el tejido tomaron una coloración pardo rojiza. Se consideró expresión negativa cuando el corte tomó una coloración violeta. Se hizo recuento de las células positivas y negativas, evaluando cuatro campos de cada corte histológico en un total de cinco láminas por grupo de estudio. VI.6.- Análisis Densitométrico de la Expresión de Fas y FasL Con el fin de hacer más objetivos los resultados observados, en el recuento celular realizado en la inmunohistoquímica, se realizó densitometría a los cortes histológicos positivos y negativos de expresión de ambas moléculas. Para ello, los cortes fueron fotografiados con una cámara digital (Sony®) con una resolución de 4,8 Megapixels. Las imágenes se procesaron digitalmente. La lectura densitométrica fue realizada con el programa Imagetool 3.0. Para ello, las imágenes coloreadas fueron previamente convertidas a una escala de grises, y luego se realizó inversión de dicha escala, de tal manera que las áreas pardo rojizas de mayor intensidad mostraran una mayor densidad óptica, expresada en unidades densitométricas. Estos datos se trasladaron a un programa estadístico (Statistica 6.0) para establecer la base de datos, realizar cálculos y analizar los resultados. VI.7.- Determinación de las concentraciones séricas de IL-1α y TNFα en suero Las muestras de sangre obtenidas fueron colocadas en tubos de ensayo sin anticoagulante, los cuales se dejaron reposar en forma vertical, por un lapso mínimo de 10 minutos y máximo de una hora para la esperar la retracción del coágulo. Posteriormente, las muestras se centrifugaron a 2500 rpm, durante 15 minutos. Luego se separó el suero con una Pipeta Pasteur, suavemente, y se dejó almacenado a -70ºC, en tubos Eppendorf rotulados con la identificación de la muestra, para su posterior análisis con la técnica de ELISA. Para la determinación de IL-1α y TNFα se utilizaron Kits de ELISA (Endogen® del Laboratorio Pierce Biotechnology, Inc, EEUU) (137, 138). Previa calibración de la técnica y una vez clasificadas y diluidas las muestras de suero, de acuerdo a las indicaciones del fabricante, se enumeraron los pozos problema: dos para los “Blancos”, 12 para las diluciones estándar, 12 para suero de ratas sin isquemia (control), 12 para suero de ratas con isquemia sin tratamiento y 12 para suero de ratas isquémicas tratadas con Atorvastatina. Previa preparación de todos los reactivos, se añadió 100 µl de solución estándar o de las muestras a cada pozo, cubriéndolo posteriormente con bandas adhesivas, para su incubación por una hora a temperatura ambiente. Luego de transcurridos 60 minutos, se procedió a lavar los pozos, en 3 oportunidades, con la solución buffer. Posteriormente, se añadió 100 µl del anticuerpo biotinado conjugado a cada pozo, se cubrieron con bandas adhesivas, incubándose por dos horas a temperatura ambiente. Al transcurrir este tiempo, se lavó nuevamente en 3 oportunidades con solución de lavado, agregándosele a cada pozo posteriormente 100 µl de Streptavidina-HRP, incubándose por 30 minutos a temperatura ambiente. Se realizó un nuevo lavado en 3 ocasiones y se colocó en cada pozo 100 µl del cromógeno TMB premezclado, se cubrieron los pozos y se dejó en oscuridad por 30 minutos a temperatura ambiente. Luego se agregó 100 µl de solución STOP-Ácido Sulfúrico 2N a cada pozo, para posteriormente proceder a la lectura en el espectrofotómetro a 450 nm. Para ello, se realizaron, inicialmente, las curvas de calibración de cada uno de los reactivos. Las concentraciones estándar fueron reflejadas en el eje de las Y, y las concentraciones correspondientes de IL-1-α (pg/ml) y de TNFα (pg/ml) en el eje de las X. Las concentraciones de IL-1α y de TNFα en cada muestra, se calcularon interpolando en la curva estándar, desde el valor de absorbancia en el eje Y, hasta la concentración de IL-1α y TNF α en el eje X. VI.8.- Determinación de Apoptosis por Citometría de Flujo VI.8.a.- Obtención de la Suspensión celular Para este experimento se utilizaron tres grupos de ratas, que fueron sometidas a las mismas condiciones experimentales de las ratas mencionadas en los párrafos anteriores, y se siguió igual protocolo para la obtención del tejido cerebral, tanto en el grupo control (sano), como en los grupos experimentales. Una vez extraído el cerebro y lavado con PBS frío, se colocó en una solución de RPMI con 0,3% de albúmina de suero bovino fetal (Solución A) y se procedió a trocearlo finamente sobre una rejilla metálica para luego llevarlo a centrifugación a 500 g durante 3 minutos a 4º C. El sobrenadante fue eliminado y el botón celular fue sometido a un proceso de tripsinización, para ello, se incubó con tripsina al 0,025% diluida en 5 ml de Solución A, agitando constantemente a 37º C durante 15 minutos, tiempo en el cual la tripsinización fue detenida añadiendo Suero Bovino Fetal frío, hasta una concentración final de 10%. La mezcla fue pasada a un tubo de plástico y llevada a centrifugación a 500 g durante 5 minutos a 4º C para eliminar el sobrenadante. Luego de dos pasos sucesivos de resuspensión de los botones celulares y asentamiento por 4 minutos y una filtración, seguidos de dos procesos de lavado de células y centrifugación a 500 g durante 5 minutos, se obtuvo la suspensión celular definitiva al resuspender el precipitado de células, en 1 ml de RPMI suplementado. Posteriormente, se realizó el recuento y ajuste de la suspensión celular a 2 x 105 cel/mL utilizando la cámara de Neubauer (139). VI.8.b.- Medición de viabilidad celular con Anexina V-FITC y Ioduro de Propidio(IP) Se incubó, en tubos eppendorf separados, 2 x 105 células con anexina V-FITC (25 g/mL) (Dako Cytomation®. EEUU), y 2 x 105 células con ioduro de propidio (250 g/mL) (Dako Cytomation®. EEUU), durante 10 minutos, en hielo y en oscuridad. Posteriormente las células fueron cuantificadas por un citómetro de flujo FACSCalibur, marca Becton Dickinson® (EEUU), equipado con un laser de argón simple (488 nm). La detección de fluorescencia se hizo con dos filtros, el primero de 530 nm para Anexina-V y el segundo de 639 nm para ioduro de propidio (IP); diseñado específicamente para detectar cambios celulares de menos del 1% (140). Previo al análisis de cada muestra, el citométro fue calibrado eléctrica y mecánicamente. El análisis cuantitativo de la viabilidad celular de 2 x 105 células fue realizado en 20 segundos. El valor promedio de los cambios celulares, fue obtenido por un análisis computarizado y, expresado en histogramas, donde el eje de las Y representa el número de células y, el eje de las X la intensidad de fluorescencia. Se consideraron como células normales, aquellas con expresión negativa tanto de Anexina V, como de IP (Anexina V -/ IP-), células apoptóticas, las que expresaban Anexina V, pero no IP (Anexina V+/IP -), y células necróticas las que expresaban IP. Se determinó la fluorescencia basal o autofluorescencia al pasar por el citómetro, la suspensión celular sin anexina ni ioduro de propidio. VI.9.- Análisis Estadístico El contaje de células en todos los casos fue expresado en frecuencia relativa (%). El análisis estadístico se hizo a través de la comparación de dichos porcentajes (Prueba Z), con el programa estadístico STATISTICA versión 6.0. Los valores densitométricos de la expresión de Fas y FasL fueron presentados como media aritmética ± error estándar (EE). Se determinó el tipo de distribución de los datos mediante el test de Kolmogorov Smirnov, como la misma no era gaussiana, se procedió al análisis de los datos utilizando el test de Friedman. Se consideraron significativas las diferencias cuando P < 0,05. Para el análisis de los niveles de citocinas en el suero (pg/ml), se calculó la media aritmética +/- el error estándar (X ± EE). Se aplicó a todos los resultados la prueba de Kolmogorov-Smirnov para verificar la forma de distribución de los datos; como los mismos presentaban una distribución normal (Gaussiana) se utilizaron métodos de análisis paramétricos (T-Student). Se consideraron estadísticamente significativos los valores de P menores de 0,05 (P < 0,05). Los resultados obtenidos de la citometría de flujo fueron expresados como porcentaje ± Error estándar. Se realizó la comparación de los grupos utilizando el test Z. Se consideró significativo estadísticamente cuando P<0,05. CAPÍTULO VII RESULTADOS VII.1.- ESTUDIO MORFOLÓGICO DEL TEJIDO CEREBRAL DE RATAS SPRAGUE DAWLEY VII.1.1.- Estudio Morfológico del tejido cerebral control e isquémico Las características histológicas del tejido cerebral de las ratas no sometidas a isquemia (Grupo Control), se muestran en la fotografía 1A con aumento de 100X, mientras que la foto 1B corresponde al mismo tejido con mayor aumento 400X). Los cortes corresponden al Asta de Amón. Se puede observar que la gran mayoría de las neuronas presenta un aspecto normal, conservando el núcleo voluminoso y vesiculoso, con nucléolo prominente. Los pocos cambios de hipoxia neuronal aguda observados (25% de neuronas) son de manera salpicada y están dados por microvacuolización, acidofilia y condensación citoplasmática predominantemente, con muy pocas neuronas con picnosis nuclear. FOTOGRAFÍAS 1A Y 1B Tejido Cerebral de ratas del Grupo Control correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumentos 100X y 400X (100X) (400X) A B Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFÍAS 2A Y 2B Tejido Cerebral Isquémico de ratas correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina. Aumento 100X y 400X (100X) (400X) A Fuente: Datos obtenidos por el autor B Las fotografías 2A y 2B corresponden a las características del tejido cerebral isquémico, con aumento de 100X y 400X respectivamente. Se puede observar, la presencia de signos de hipoxia neuronal aguda franca en 90% del componente neuronal, predominantemente en el Asta de Amón, lugar donde se observó la mayor extensión y número de células afectadas, con presencia de condensación nuclear y acidofilía citoplasmática, picnosis nuclear y/o cariolisis. VII.1.2.- Estudio Morfológico del tejido cerebral isquémico tratado con atorvastatina En las fotografías 3A y 3B se observan comparativamente los cortes histológicos con aumento de 100X, del tejido cerebral isquémico sin tratamiento (3A) y el cerebro Isquémico de las ratas tratadas con atorvastatina (3B), se evidencia que en el tejido de las ratas que recibieron tratamiento, sólo 25% de neuronas presentaba cambios de hipoxia aguda, principalmente en el asta de Amón, con presencia de acidofilia y condensación citoplasmática y muy pocas neuronas con picnosis nuclear. El 75% de las células presentó aspecto normal. Estos hallazgos son más evidentes al comparar los cortes de ambos tejidos a mayor aumento (400X), tal y como se observa en las fotografías 4A y 4B. FOTOGRAFÍAS 3A y 3B Tejido Cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (3A) y de ratas tratadas con atorvastatina (3B). Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina (100X) (100X) A B Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFÍAS 4A y 4B Tejido Cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (4A) y de ratas tratadas con atorvastatina (4B). Área correspondiente al Asta de Amón. Tinción Hematoxilina-Eosina (100X) (400X) A Fuente: Datos obtenidos por el autor B En la Figura 1 se observa, que en el grupo control, el porcentaje de células con signos de hipoxia fue de 25%, mientras que en el grupo 1 (isquemia sin tratamiento), se pudo evidenciar que 90% de las células presentan cambios hipóxicos. Esta diferencia fue significativa (P=0,023). FIGURA 1 Distribución porcentual de células normales e hipóxicas en tejido cerebral del Grupo Control y del tejido isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1) Cerebro Control vs Cerebro Isquémico (P=0,023) Fuente: Datos obtenidos por el autor La comparación de los cambios morfológicos entre el tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento y el tejido cerebral isquémico de ratas que recibieron tratamiento con atorvastatina está representada en la Figura 2. Se observa, que el porcentaje de células con signos de hipoxia en el tejido cerebral de ratas tratadas con atorvastatina, fue significativamente menor (25%) que en el tejido cerebral isquémico de ratas no tratadas (90%). FIGURA 2 Distribución porcentual de células normales e hipóxicas en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (Grupo 1) y de ratas sometidas a tratamiento con atorvastatina (Grupo 2) Células Normales Células Hipóxicas 90 100 90 75 PORCENTAJES 80 70 60 50 40 25 30 20 10 10 0 Cerebro Isquémico de Ratas No tratadas Cerebro Isquémico de Ratas Tratadas con atorvastatina Cerebro Isquémico vs Cerebro Isquémico con atorvastatina (P=0,023) Fuente: Datos obtenidos por el autor VII.2.- EXPRESIÓN DE FAS (CD95) EN TEJIDO CEREBRAL DE RATAS SPRAGUE DAWLEY VII.2.1.- Expresión de Fas en tejido cerebral control e isquémico En la Figura 3 se representa la expresión de Fas en tejido cerebral del grupo control y del grupo isquémico. Se observa que Fas se expresa en ambos grupos de estudio. En el tejido cerebral control esta expresión es de 38% del total de células cerebrales y, en tejido isquémico, 63% del total de las células expresaron este marcador. En el perfil densitométrico (Figura 4) se muestra que los valores densitométricos del tejido cerebral en el grupo control, fueron significativamente menores que los observados en el tejido isquémico (P=0,000001). FIGURA 3 Frecuencia relativa de expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control y del tejido isquémico de ratas Sprague Dawley Cerebro Control vs Cerebro Isquémico (P=0,0003) Fuente: Datos obtenidos por el autor FIGURA 4 Perfil Densitométrico de la Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control y en tejido cerebral Isquémico (Grupo 1) de ratas Sprague Dawley 140 VALORES DENSITOMETRICOS 130 120 110 100 90 80 70 60 GRUPO CONTROL 50 GRUPO 1 (Isquemia sin Tto) PROFUNDIDAD DEL CORTE Cerebro Control vs Cerebro isquémico (P=0,000001). Fuente: Datos obtenidos por el autor En la Fotografía 5 se representa la imagen de un control negativo de expresión de Fas, en la que se observa la típica coloración violeta de las células que no expresan dicho marcador. En la fotografía 6A, se muestra la expresión basal de Fas en tejido cerebral del grupo control y en la fotografía 6B se observa el aumento de dicha expresión en tejido isquémico. FOTOGRAFÍA 5 Control Negativo de la expresión de Fas en tejido cerebral. (400X). Técnica Avidina-Biotina-Peroxidasa Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFÍAS 6A Y 6B Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral del grupo control (A), y en tejido cerebral isquémico (B) de ratas Sprague Dawley. Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X) (400X) (400X) A B Fuente: Datos obtenidos por el autor NOTA: Las flechas negras señalan las células positivas a la expresión de Fas y las flechas rojas, las células negativas VII.2.2.- Efecto de la atorvastatina sobre la expresión de Fas en tejido cerebral isquémico de ratas En la Tabla I se observa la expresión celular de Fas en el tejido cerebral isquémico de ratas, tratadas y no tratadas con atorvastatina. El cerebro de ratas que recibió atorvastatina, mostró una expresión de Fas significativamente menor que la observada en el cerebro isquémico de ratas sin tratamiento (p = 0,0007). (Fotografía 7). TABLA I Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento y tejido cerebral isquémico de ratas tratadas con atorvastatina Porcentaje de Células Positivas Negativas 63 37 40 60 Cerebro Isquémico de ratas sin atorvastatina Cerebro Isquémico de ratas con atorvastatina Cerebro Isquémico no tratado vs Cerebro Isquémico con atorvastatina (P=0,0007) Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFÍA 7 Expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas tratadas con Atorvastatina (Grupo 2). Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa (400X) Fuente: Datos obtenidos por el autor NOTA: Las flechas negras señalan las células positivas a la expresión de Fas y las flechas rojas, las células negativas. El perfil densitométrico dorso-ventral en los Grupos 1 y 2 mostró valores significativamente mayores para el grupo que no recibió tratamiento que para el grupo tratado con atorvastatina (p = 0,000001) (Figura 5). FIGURA 5 Perfil densitométrico de expresión de Fas (CD95) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (Grupo 1) e isquémico de ratas tratadas con atorvastatina (Grupo 2) 105 100 VALORES DENSITOMETRICOS 95 90 85 80 75 70 65 GRUPO 1 Is que m ia s in Tto) 60 GRUPO 2 (Is que m ia con Atorv) PROFUNDIDAD DEL CORTE Grupo 1 vs Grupo 2 (P=0,000001) Fuente: Datos obtenidos por el autor VII.3.- EXPRESIÓN DE FASL (CD95L) EN TEJIDO CEREBRAL DE RATAS SPRAGUE DAWLEY VII.3.1.- Expresión de FasL en tejido cerebral del grupo control y del grupo isquémico En la figura 6 se observa la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral control e isquémico, en porcentaje de células positivas y negativas. Se muestra que FasL se expresa en el tejido cerebral del grupo control en 47% de células y en tejido isquémico, 64% de las células expresaron FasL (P=0,0082). Estos resultados coinciden con los observados al realizar el perfil densitométrico (Figura 7) donde se muestra que los valores densitométricos del tejido cerebral control, fueron significativamente menores que los observados en el tejido isquémico (P=0,000001). FIGURA 6 Frecuencia relativa de expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral del grupo control y en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley Cerebro Control vs Cerebro Isquémico (P=0,0082) Fuente: Datos obtenidos por el autor FIGURA 7 Perfil Densitométrico de la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral del grupo control y en tejido isquémico sin tratamiento (Grupo 1) de ratas Sprague Dawley 145 VALORES DENSITOMETRICOS 140 135 130 125 120 115 110 GRUPO CONTROL 105 GRUPO 1 (Isquemia sin Tto) PROFUNDIDAD DEL CORTE Cerebro Control vs Cerebro Isquémico sin tratamiento (P=0,000001) Fuente: Datos obtenidos por el autor En la Fotografía 8 se representa la imagen de un control negativo de expresión de FasL, se observa la típica coloración violeta de las células que no expresan dicho marcador. En la Fotografía 9A se muestra la expresión basal de FasL en tejido cerebral control y en la fotografía 9B se observa el aumento de dicha expresión en tejido isquémico. FOTOGRAFÍA 8 Control Negativo de la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley. (400X). Técnica Avidina-Biotina-Peroxidasa Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFIAS 9A Y 9B Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral del grupo control (A), y en tejido cerebral isquémico (B). Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X) (400X) (400X) A B Fuente: Datos obtenidos por el autor NOTA: Las flechas negras señalan las células positivas a la expresión de FasL y las flechas rojas, las células negativas. VII.3.2.- Efecto de la atorvastatina sobre la expresión de FasL en tejido cerebral isquémico de ratas En la Tabla II se puede observar la expresión celular de FasL en el tejido cerebral isquémico de ratas tratadas y no tratadas con atorvastatina. En el cerebro de ratas tratadas con atorvastatina, 45% de las células presentaron expresión de FasL, la cual fue significativamente menor que la observada en el cerebro isquémico sin tratamiento (64%) (P=0,0076) (Fotografía 10). TABLA II Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley sin tratamiento y tejido isquémico de ratas tratadas con atorvastatina Porcentaje de Células Positivas Negativas 64 36 45 55 Cerebro Isquémico de ratas no tratadas Cerebro Isquémico de ratas con atorvastatina Cerebro Isquémico no tratado vs Cerebro Isquémico con atorvastatina (P=0,0076) Fuente: Datos obtenidos por el autor FOTOGRAFÍA 10 Expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina (Grupo 2). Técnica Inmunohistoquímica de Avidina Biotina Peroxidasa. (400X) Fuente: Datos obtenidos por el autor NOTA: Las flechas negras señalan las células positivas a la expresión de FasL y las flechas rojas, las células negativas. La comparación del perfil densitométrico entre el grupo isquémico no tratado (Grupo 1) y el grupo isquémico tratado con atorvastatina (Grupo 2), muestra una disminución significativa de la expresión de FasL en el tejido cerebral isquémico tratado con atorvastatina (P=0,000001). FIGURA 8 Perfil densitométrico del efecto de la atorvastatina sobre la expresión de FasL (CD95L) en tejido cerebral isquémico de ratas sin tratamiento (Grupo 1) e isquémico de ratas tratadas con atorvastatina (Grupo 2) 210 VALORES DENSITOMETRICOS 190 170 150 130 110 GRUPO 2 (Isquemia con Atorv) GRUPO 1 (Isquemia sin Tto) 90 PROFUNDIDAD DEL CORTE Grupo 1 vs Grupo 2 (P=0,000001) Fuente: Datos obtenidos por el autor VII.4.- CONCENTRACIONES SÉRICAS DE TNF- E IL-1 EN SUERO DE RATAS En la Figura 9 se puede observar los valores promedio de TNF-α y de IL-1α en las ratas del grupo control y de las ratas tratadas y no tratadas con atorvastatina. Los valores de TNF-α en el grupo de ratas con isquemia sin tratamiento (Grupo 1) fueron de 4,43 ± 0,25 pg/ml, y en el grupo isquémico que recibió tratamiento con Atorvastatina fueron 4,35 ± 0,19 pg/ml (Grupo 2), por lo que no hubo diferencias significativas entre ambos grupos (P= 0,72). En cuanto a los valores de IL-1α en el grupo con isquemia sin tratamiento (30,33 ± 6,79 pg/ml), fueron ligeramente mayores que los observados en el grupo con isquemia que recibió tratamiento con Atorvastatina (24,5 ± 9,09 pg/ml), pero esta diferencia no fue significativa (P=0,71) (Figura 9). FIGURA 9 Concentraciones séricas de TNF-α e IL-1 α en suero de ratas control, ratas con isquemia y de ratas con isquemia tratadas con atorvastatina. Expresados en promedio Fuente: Datos obtenidos por el autor VII.5.- EFECTO DE LA ATORVASTATINA SOBRE LOS CAMBIOS NECRÓTICOS Y APOPTÓTICOS PRECOCES EN TEJIDO CEREBRAL ISQUÉMICO En la figura 10 se muestra el efecto de la atorvastatina sobre los cambios apoptóticos y necróticos en tejido cerebral isquémico. Se observa que, en condiciones de isquemia cerebral, aumenta tanto el número de células apoptóticas (6,1 ± 5,6% vs 23,3 ± 3,4%) como necróticas (5,1 ± 4,1 vs 58,2 ± 3,5%), siendo esta diferencia estadísticamente significativa. En ratas previamente tratadas con atorvastatina, disminuye el porcentaje de células apoptóticas (9,7 ± 3,8% vs 23,3 ± 3,4%, p<0,05) y el de células necróticas (11,9 ± 6,7% vs 58,2 ± 3,5%, p<0,001), respecto del cerebro isquémico de ratas no tratadas con atorvastatina, esta diferencia resultó significativa. FIGURA 10 Efecto de la atorvastatina sobre los cambios necróticos y apoptóticos precoces en el tejido cerebral de ratas Sprague Dawley. Comparación de los tres grupos de estudio Fuente: Datos obtenidos por el autor En las figuras 11, 12 y 13, se pueden observar citogramas de autofluorescencia o fluorescencia basal del tejido cerebral sano. FIGURA 11. Autofluorescencia del tejido cerebral del Grupo Control FIGURA 12. Tejido Cerebral del Grupo Control. Control Negativo (Anexina) FIGURA 13. Tejido Cerebral del Grupo Control. Control Negativo (Ioduro de Propidio) Las figuras 14 - 16 muestran los citogramas representativos de células apoptóticas en los tres grupos de estudio. Se observa que hay un mayor porcentaje de células marcadas con anexina V (Células apoptóticas) en el tejido isquémico que en el tejido control y en tejido isquémico de ratas tratadas con atorvastatina. FIGURA 14. Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley del Grupo Control FIGURA 15. Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1) FIGURA 16. Distribución porcentual de células apoptóticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina (Grupo 2) En las figuras 17 - 19, se observan los citogramas representativos de células necróticas. Se evidencia que hay un menor porcentaje de células marcadas con ioduro de propidio (Células necróticas), en el grupo de ratas tratadas con atorvastatina y en cerebro control, que en el tejido isquémico de ratas sin tratamiento. FIGURA 17. Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral de ratas Sprague Dawley del Grupo Control FIGURA 18. Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley (Grupo 1) FIGURA 19. Distribución porcentual de células necróticas en tejido cerebral isquémico de ratas Sprague Dawley tratadas con atorvastatina (Grupo 2) CAPÍTULO VIII DISCUSIÓN Los ataques isquémicos cerebrales (AIC) constituyen un conjunto de alteraciones focales o difusas de la función neurológica, de origen eminentemente vascular, como consecuencia de una reducción del flujo sanguíneo cerebral (2). Entre la aparición de la isquemia y la muerte neuronal, se desarrolla una cascada de reacciones bioquímicas, en las células nerviosas, que parece ser responsable del daño celular y de las alteraciones morfológicas neuronales, que acompañan al proceso hipóxico y que son evidenciadas por estudios histológicos (25, 56, 141). Dentro de las alteraciones que sufre la estructura de la neurona en el tejido cerebral isquémico, se mencionan: contracción celular, condensación nuclear y eosinofilía de los cuerpos neuronales (56), hallazgos, que coinciden con las alteraciones neuronales hipóxicas, observadas en 90% de las neuronas, de cerebros de ratas sometidas a isquemia cerebral (grupo 2) de nuestro estudio. Algunos autores han podido demostrar la presencia de daño y muerte de neuronas del hipocampo, con isquemia de 5 minutos de duración, ocasionadas por oclusión bilateral de las carótidas comunes (142). En otros estudios (28, 56, 143), se describen lesiones apoptóticas, desde los 12 minutos de instalada la hipoxia. Los hallazgos en el presente estudio, en cuanto a la duración de la isquemia, se encuentran dentro del rango de tiempo planteado en los estudios mencionados, pudiendo evidenciarse, además, que desde el punto de vista histológico, existen alteraciones celulares, tales como, retracción nuclear, reducción del volumen celular, eosinofilía y ausencia de edema, muy similares a las descritas por Ortiz y cols en 2004 (56). En los últimos años se han llevado a cabo muchas investigaciones, en la búsqueda de medicamentos con propiedades neuroprotectoras, que sean capaces de reducir el daño en la isquemia. Las estatinas han demostrado experimentalmente que son capaces de inducir neuroprotección preventiva relacionada con sus propiedades antiinflamatorias y antioxidantes (23, 28, 144). En este estudio se demuestra que el uso profiláctico de atorvastatina, previo a la isquemia, reduce significativamente el daño morfológico de las neuronas de las áreas vulnerables del cerebro, lo cual se corresponde con los efectos neuroprotectores descritos (145). La demostración de este efecto, pudiera sugerir, que la aplicación de una terapéutica combinada, que incluya el uso de estatinas, en el tratamiento de pacientes que sufran ataque isquémico cerebral, sería de gran beneficio (143, 146). Además de las alteraciones morfológicas descritas, se encontraron cambios fenotípicos en el tejido cerebral. Los resultados muestran, una expresión basal de Fas en el tejido cerebral del grupo control. En este sentido, existe controversia entre diferentes grupos de trabajo, así, Medana y cols (147) y Sung y cols (148) reportan expresión de esta molécula en tejido cerebral normal; igualmente, Grosjean y cols (149), concluyen que Fas y FasL, son expresados en tejidos, independientemente, de que exista o no inflamación. En contraste, Chulhee y cols (19) y Kim y cols (150), indican, que la expresión de Fas, depende de la inducción precoz de TNF-α· e interferón , por lo que se expresan, solamente, en tejido cerebral lesionado. En nuestro estudio observamos además, que la expresión de Fas fue significativamente más elevada en el tejido cerebral sometido a isquemia que en tejido cerebral control. Esto coincide con los datos aportados por Ferrer y Planas (12). Uno de los mecanismos que podría estar implicado en el aumento de la expresión de Fas, en tejido cerebral isquémico, sería, el de la participación conjunta de células (linfocitos, macrófagos o microglias) y citocinas (IL-1, IFN- y TNF-α), capaces de inducir la expresión de esta molécula durante los procesos de isquemia (19). Reportes previos muestran que, un déficit de la expresión de Fas, se asocia con lesiones isquémicas menos prominentes en cerebro de ratones (90). Estos hallazgos, sugieren que una menor expresión de la molécula de Fas, disminuye la apoptosis, con lo cual se preservaría el tejido cerebral, y que el daño tisular observado en el cerebro isquémico, se debe, al menos en parte, a la apoptosis mediada por Fas. El uso de atorvastatina redujo, significativamente, la expresión de Fas, tanto en células, como en parénquima cerebral. Estos resultados, junto a aquellos donde la atorvastatina, administrada a ratones, durante dos semanas, protege del daño ocasionado por el ataque isquémico (151), sugieren, que la atorvastatina disminuye, en forma significativa, la apoptosis durante la isquemia cerebral. Por otro lado, la atorvastatina reduce el número de células apoptóticas y el daño tisular en isquemia retiniana experimental (152), así como, la actividad de la caspasa 3, con disminución de la apoptosis neuronal (153). Estudios en otros tejidos como miocitos cardíacos y células musculares lisas vasculares (32, 36, 154) muestran, también, que la atorvastatina disminuye la apoptosis, lo que está en concordancia con el efecto observado, en el presente estudio en el tejido cerebral. Las observaciones de esta investigación, sugieren fuertemente la utilidad de la atorvastatina en la reducción de la expresión de Fas asociado a la apoptosis de los ataques isquémicos. Respecto del efecto de la Atorvastatina, sobre la expresión de FasL, molécula clave en la apoptosis, en tejido cerebral isquémico de ratas, los resultados obtenidos, permitieron evidenciar la existencia de una expresión basal de FasL, en el tejido cerebral normal. No se conoce, con exactitud, la significación biológica de esta expresión basal, sin embargo, reportes previos, coincidentes con el presente estudio, realizados en astrocitos fetales y adultos humanos, sugieren, el posible papel de esta molécula, en la modulación de la respuesta fisiológica o patológica del sistema nervioso central (135). Por otra parte, la expresión de FasL, aumentó en el tejido cerebral sometido a isquemia, hallazgo que confirma estudios previos de Liu y cols (155), que mostraron que la expresión de esta molécula, aumenta en tejido cerebral de ratas 6 y 12 horas después del evento isquémico (90). Estos resultados, sugieren una relación directa, entre el daño tisular post-isquémico y la expresión de FasL, muy probablemente, debido al papel protagónico que tiene esta molécula, durante la apoptosis (67, 156). Un modelo de traumatismo craneoencefálico severo (157) muestra, que existe una relación estrecha, entre los complejos inductores de señales de muerte celular y el complejo Fas – FasL durante la apoptosis observada en estos casos. Es posible que, durante la isquemia cerebral inducida experimentalmente, ese complejo Fas – FasL juegue, también, un papel fundamental en la muerte celular (116). La atorvastatina redujo, de manera significativa la expresión de FasL, en el cerebro sometido a isquemia. Por lo que, una menor expresión de dicha molécula, podría conllevar a una disminución de la apoptosis en el tejido. Es posible, que el efecto neuroprotector, de este fármaco, dependa, al menos particularmente, de su potencial antiapoptótico, durante la isquemia cerebral. Por otro lado, el efecto de la atorvastatina, parece ser amplio y universal, ya que reportes previos, muestran que es capaz de disminuir la expresión de FasL, en experimentos in vivo e in vitro, realizados con linfocitos T humanos, donde el medicamento, redujo la citotoxicidad mediada por ellos (158); Aunado a los hallazgos morfológicos y fenotípicos mencionados, se sabe, que en la isquemia cerebral, se presenta un proceso inflamatorio, que implica no sólo las neuronas, sino también las glías y las células endoteliales. Durante este proceso, ocurre la liberación, de una serie de mediadores químicos, entre los cuales se encuentran citocinas proinflamatorias, principalmente IL-1, TNF e IL-6 (159). La IL-1 y el TNF son mediadores claves en la respuesta inflamatoria; son inducidos, inmediatamente, después de una lesión cerebral y sus niveles elevados, han sido implicados en la neurodegeneración, que acompaña a la isquemia cerebral (159, 160, 161). Los valores normales de IL-1 oscilan en 40±5 pg/ml (160), mientras que el TNF normal es de 3,1± 6 pg/ml (162). En nuestro estudio, los niveles de IL-1 y de TNF, tanto en la etapa pre como post-isquémica, se encontraron en rangos normales. A pesar, de que los valores de ambas citocinas, se observaron, ligeramente más elevados, en el grupo con isquemia, no hubo diferencia significativa, cuando se compararon las medias de las concentraciones séricas en los grupos experimentales. Aún cuando hay investigaciones, que refieren aumentos discretos de TNF, luego de 5 minutos de una situación de estrés, la mayoría de los estudios previos, informan elevaciones más importantes de IL-1 y de TNF, luego de 3 horas de isquemia (159, 160), lo que hace sugerir, que posiblemente la duración de la isquemia en nuestro estudio, no permitió detectar, elevaciones sustanciales en las concentraciones séricas de estas citocinas. Hasta el momento, no se han descrito fármacos, dirigidos al bloqueo de citocinas, para mejorar el daño por isquemia, sin embargo, existen revisiones en las cuales se plantea esta posibilidad, como un futuro probable dentro del campo de la neuroprotecciòn. En la etapa inicial de la presente investigación, se planteó evaluar, las variaciones en las concentraciones séricas de estas citocinas, en la isquemia cerebral, con el uso profiláctico de atorvastatina, sin embargo no se encontró variaciones significativas de las mismas. Lo anteriormente expuesto, queda en evidencia al considerar; que el tiempo de isquemia cerebral ideal, para la cuantificación serológica de citocinas, reportado en la literatura revisada, es a partir de una hora de iniciada la isquemia. No obstante; creemos que, este es un aspecto de suma importancia, que debe quedar abierto al interés de otras investigaciones. Finalmente, en recientes estudios, se ha demostrado, que en etapas tempranas de la apoptosis (73), se produce la externalización de la fosfatidilserina (FS) en la membrana celular, en ausencia de daño nuclear (163), permitiendo de esta manera, su unión con la anexina-V (164). Esta unión puede ser detectada por citometría de flujo (165) utilizando Anexina V conjugada con un fluorocromo (FITC). La pérdida de simetría de la membrana plasmática, por la exposición de la FS, precede a la pérdida de su integridad (166, 167) al aumento de su permeabilidad y a la condensación nuclear (168, 169). En este estudio, se utilizó Anexina-V y Ioduro de Propidio (IP) como indicadores de apoptosis y de necrosis respectivamente, y se demostró, mediante el uso de Anexina-V, la existencia de cambios apoptóticos precoces, en células cerebrales sometidas a isquemia, como lo demuestra, el importante aumento del porcentaje de células marcada con anexina V en estas condiciones, hallazgos estos, que permitieron corroborar, las modificaciones morfológicas, evidenciadas al microscopio de luz. Adicionalmente, esta investigación demostró que, en el tejido cerebral, tratado previamente con atorvastatina, hubo disminución, del número de células apoptóticas y necróticas, con respecto a sus equivalentes, encontradas en el tejido isquémico. Basados en los resultados obtenidos en el presente estudio, se puede concluir, que el uso de atorvastatina, en forma profiláctica, es capaz de proteger a las células cerebrales, de la progresión de la apoptosis en situaciones de isquemia. Esto sugiere que muchos pacientes serían beneficiados con el uso de una terapéutica combinada que incluya el uso de estatinas en el tratamiento de los ataques isquémicos (170, 171, 172, 173). Estos resultados permiten pensar en el potencial beneficio clínico-terapéutico de la utilización de la Atorvastatina en patologías donde la muerte celular es el evento biológico fundamental, como la isquemia cerebral. CAPÍTULO IX CONCLUSIONES La isquemia induce cambios morfológicos en las células del tejido cerebral, los cuales, disminuyen en forma significativa con el uso profiláctico de atorvastatina. El tejido cerebral expresa, normalmente, Fas y FasL. Esta expresión aumenta al ocurrir un proceso isquémico y disminuye significativamente con el uso de atorvastatina. Los niveles de citocinas séricas (IL-1α y TNFα) no se modifican durante una isquemia de corta duración, por lo que es posible que no pudiera evidenciarse ningún efecto de la atorvastatina sobre ellos. La isquemia induce cambios necróticos y apoptóticos tempranos en el tejido cerebral. La atorvastatina fue capaz de disminuir la aparición de apoptosis precoz y de la necrosis durante la isquemia cerebral. El uso de atorvastatina en la profilaxis de los ataques isquémicos cerebrales, puede resultar beneficioso, en la disminución de la lesión cerebral y sus secuelas, en pacientes portadores de factores de riesgo cardiovascular. CAPÍTULO X RECOMENDACIONES Los hallazgos obtenidos en la presente investigación, demuestran que la atorvastatina, efectivamente, tiene un papel neuroprotector importante en la inhibición de ciertos procesos apoptóticos y necróticos, que ocurren durante la isquemia cerebral. Sin embargo; a pesar de que los mecanismos de esta acción neuroprotectora, aún no están bien precisados, estos parecieran estar relacionados con sus propiedades pleiotrópicas. Ante estas observaciones, nos parece pertinente recomendar, en primer lugar, continuar con esta línea de investigación, para seguir profundizando y conocer más en detalle, la acción que poseen algunos fármacos, sobre los eventos fisiopatológicos que caracterizan la cascada apoptótica. Lo cual sería de suma importancia para el desarrollo futuro de una terapéutica neuroprotectora en la isquemia cerebral. En segundo lugar, tomando en cuenta los resultados de la presente investigación y algunos reportes previos, que sugieren efectos similares, consideramos que se deben realizar estudios controlados en humanos, que permitan demostrar, en el área clínica, los hallazgos experimentales realizados en animales y la efectividad de este medicamento en la profilaxis primaria y secundaria, así como, en el tratamiento de la isquemia cerebral, en la búsqueda de la reducción de las secuelas neurológicas que esta enfermedad suele dejar. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS 1. Arocha I. 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