Plantilla ejemplo - Universidad Pública de Navarra

Influencia de diferentes antibióticos aminoglicósidos sobre la
regeneración de hojas de albaricoquero
C. Petri, N. Alburquerque y L. Burgos
Departamento de Mejora y Patología Vegetal, CEBAS-CSIC. Apdo. 4195, 30.080
Murcia
Palabras clave: estreptomicina, geneticina, kanamicina, paromomicina, Prunus
armeniaca, yemas adventicias
Resumen
Se estudia el efecto de diferentes antibióticos de tipo aminoglicósido sobre la
regeneración adventicia en hojas de albaricoquero (Prunus armeniaca).Se han
evaluado los antibióticos kanamicina, estreptomicina, geneticina y paromomicina a
concentraciones comprendidas entre 0 y 50 µM. Mientras que la kanamicina tuvo
un efecto estimulador, con respecto al control, a bajas concentraciones, la
paromomicina y la estreptomicina produjeron una disminución progresiva de la
regeneración al aumentar la concentración de antibiótico. La geneticina, por otro
lado, fue letal a todas las dosis estudiadas. La kanamicina cuando se aplicó a bajas
concentraciones tuvo un efecto adicional incrementando la velocidad de aparición
de las yemas. El estudio ha permitido conocer las concentraciones mínimas de
antibióticos que inhiben la regeneración con el fin de utilizar estas en futuros
experimentos de transformación para seleccionar brotes transformados.
INTRODUCCIÓN
Se ha desarrollado en nuestro Departamento un método de regeneración
adventicia a partir de hojas de albaricoquero (Prunus armeniaca L), habiéndose
estudiado diferentes factores que afectan la regeneración de nuevos brotes a partir de
hojas obtenidas de plantas cultivadas in vitro (Pérez-Tornero et al., 2000; Burgos y
Alburquerque, 2003).
Entre estos factores se ha evaluado el efecto de diferentes antibióticos
aminoglicósidos sobre la regeneración de hojas de albaricoquero que son ampliamente
utilizados en protocolos de transformación como agentes de selección ya que el gen
marcador de la neomicina fosfotransferasa (nptII) confiere resistencia a estos
antibióticos.
El objetivo de este trabajo ha sido comparar el efecto de diferentes antibióticos
sobre la regeneración para seleccionar el que pudiera ser más adecuado como agente
selectivo en los experimentos de transformación.
MATERIAL Y MÉTODOS
Se utilizaron brotes del cv. Helena cultivados in vitro. ‘Helena’ es una selección
del programa de mejora de albaricoquero del ARS (USDA) amablemente cedida in vitro
por el Dr. Craig Ledbetter.
Mantenimiento de los brotes in vitro
Los brotes se mantuvieron y multiplicaron en las condiciones descritas
previamente (Pérez-Tornero y Burgos, 2001). Brevemente, los brotes se subcultivaron
cada 21 días en medio de multiplicación a 22 + 1ºC con un fotoperiodo de 16 h y una
intensidad luminosa de 55 µmol m-2 s-1. El medio de multiplicación consiste en los
macronutrientes de Q&L y micronutrientes, vitaminas y componentes orgánicos de
DKW, 3% sacarosa y 0.7% agar (HispanLab, Cat. nº 1812). El pH se ajustó a 5.7 antes
de esterilizar el medio en un autoclave a 121ºC durante 20 minutos.
Protocolo de regeneración
Para regenerar yemas adventicias a partir de hojas de albaricoquero se ha
descrito previamente un protocolo (Burgos y Alburquerque, 2003) que es el que se ha
utilizado. Brevemente, se utilizó el mismo medio de cultivo que durante la
multiplicación pero con diferentes reguladores del crecimiento (TDZ 9.0 µM y NAA
4.0 µM), la adición de tiosulfato (STS) 60µM y como agente gelificante “Pure Agar”
(Hispanlab, Cat. nº 1806.00) al 0.7%.
1. Descripción de tratamientos. Se comprobó el efecto de los antibióticos kanamicina,
estreptomicina, geneticina y paromomicina a concentraciones comprendidas entre 0 y
50 µM sobre la regeneración.
Efecto de la kanamicina sobre el momento de aparición de yemas. Asimismo, se evaluó
el efecto de 8.6 µM kanamicina sobre el momento de aparición de las yemas y la
consistencia de los resultados de experimentos independientes, y se comparó con otros
tratamientos que también estimulan la regeneración como los inhibidores del etileno.
2. Análisis estadístico. Se calculó la media y el error estándar para cada dato cuando se
compararon los distintos antibióticos. Asimismo, se realizó un análisis de varianza para
comparar el efecto de los tratamientos, realizando una transformación angular para los
datos porcentuales previa al análisis de varianza. Cuando se obtuvo una F significativa,
las medias se separaron por el test de Tukey.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Los cuatro antibióticos estudiados han tenido un efecto muy diferente sobre la
regeneración en hojas de albaricoquero (Fig. 1). Mientras que la kanamicina tuvo un
efecto estimulador, con respecto al control, a bajas concentraciones, la paromomicina y
la estreptomicina produjeron una disminución progresiva de la regeneración al aumentar
la concentración de antibiótico. La geneticina, por otro lado, fue letal a todas las dosis
estudiadas, incluso a dosis muy bajas (0.75 µM).
Las concentraciones inhibitorias de los otros tres antibióticos también variaron
ampliamente, siendo (en µM) de 20 en el caso de la paromomicina, 40 para la
estreptomicina y para la kanamicina, que aun a concentraciones de 25 y 35 permitió la
aparición de algunas yemas.
El caso de la kanamicina merece un estudio detallado por el incremento inducido
en la regeneración a la concentración de 8.6 µM pero también por inducir una aparición
más rápida de las yemas adventicias. La figura 2 muestra las frecuencias acumuladas de
yemas aparecidas desde la 3ª a la 8ª semana desde el inicio de los experimentos. Se
puede observar que en los tratamientos en los que se incluyó kanamicina a bajas
concentraciones, la mayoría de las yemas (más del 75%) habían aparecido 4 semanas
después de comenzar el experimento, mientras que en el resto de tratamientos, al igual
que en el control (condiciones de cultivo estándar como se describen en Pérez-Tornero
et al., 2000) niveles similares se alcanzan, al menos, una semana más tarde.
Otros factores que estimularon la regeneración, como son los inhibidores o
competidores del etileno (aminovinilglicina y tiosulfato de plata, respectivamente)
cuando se utilizaron en ausencia de kanamicina no producen el mismo efecto de
adelanto de la aparición de yemas adventicias (Fig. 2).
Como conclusión, de los antibióticos ensayados solo la geneticina tiene un
efecto excesivamente letal para ser utilizado como agente de selección. La kanamicina
presenta una serie de ventajas a bajas concentraciones que podrían ser una dificultad a la
hora de utilizarlo como agente de selección en experimentos de transformación.
Estudios adicionales después de transformar las hojas son necesarios para poder
determinar el antibiótico más adecuado.
Agradecimientos
Esta investigación ha sido financiada por el proyecto CICYT AGL2002-01556.
Referencias
Burgos, L. and Alburquerque, N. 2003. Low kanamycin concentration and ethylene
inhibitors improve adventitious regeneration from apricot leaves. Plant Cell Rep.
21:1167-1174.
Pérez-Tornero, O. and Burgos, L. 2000. Different media requirements for
micropropagation of apricot cultivars. Plant Cell Tiss. Org. Cult. 63: 133-141
Pérez-Tornero, O., Egea, J., Vanoostende, A. and Burgos, L. 2000. Assessment of
factors affecting adventitious shoot regeneration from in vitro cultured leaves of
apricot. Plant Sci. 158:61-70.
Tabla 1. Porcentajes de regeneración obtenidos de diferentes experimentos
independientes con kanamicina (Km) y tiosulfato (STS).
Tratamiento
Control1
Km (8.6µM)
STS (60µM)
Km + STS
1
1
34,3a
77,1b
57,1ab
60,0b
Experimentos independientes2
2
3
4
5
21,4a
26,5a
74,3b
80,0b
27,3a
17,6a
77,1b
82,8b
35,7a
51,4ab
77,1b
51,4a
17,1a
37,5b
77,1c
65,7c
6
7
28,6a
30,1a
48,6b
57,1b
46,4a
42,5a
57,1a
54,3a
Condiciones de regeneración en el control según Pérez-Tornero et al. (2000).
En cada columna, letras diferentes a continuación de las medias indican diferencias
significativas a P=0,05.
2
60
50
Kanamicina
Paromomicina
40
30
Regeneración (%)
20
10
0
50
Estreptomicina
Geneticina
40
30
20
10
0
0
10
20
30
40
0
10
20
30
40
50
Concentración de antibióticos (M)
Fig. 1. Efecto de diferentes antibióticos sobre la regeneración en albaricoquero. Las barras
verticales indican el error estándar.
Frecuencias acumuladas (%)
100
80
60
40
20
0
Control
STS
Km
STS + Km
Tratamientos
Fig. 2. Frecuencias acumuladas de aparición de yemas adventicias (semanas 3 a 8)
obtenidas con kanamicina (Km) y tiosulfato (STS).