Guia TP Melanoforos

Biología Celular 2014
Trabajo Práctico Nº 2:
Movimiento de melanosomas en melanóforos de escamas de pez
Los peces, anfibios, reptiles y algunos invertebrados tienen, a diferencia de los mamíferos, la capacidad de alterar
rápidamente su coloración mediante la regulación fisiológica del movimiento intracelular de pigmento en la epidermis. Esta
capacidad tiene un amplio rango de efectos visuales como por ejemplo el cambio de color asociado a interacciones
sociales en los camaleones o el cambio más sutil de la coloración que se registra en los peces y anfibios. Estos eventos
han intrigado por más de 80 años a los científicos.
Las células que poseen el pigmento de la piel se denominan cromatóforos siendo los más comunes los que contienen
melanina y se los denomina melanóforos. En los mamíferos se denominan melanocitos. En los vertebrados no mamíferos
la melanina puede ser de color marrón o negra. Este pigmento se trata de un derivado oxidado de la tirosina y está
contenida en vesículas provenientes del Aparato de Golgi denominadas melanosomas.
Los melanóforos son células de aspecto estrellado debido a la disposición intracelular de los melanosomas que se
disponen en forma de rayos desde el núcleo y hacia la periferia celular. La regulación de la movilización intracelular de
melanosomas en peces está regulada por inervación directa a través de fibras adrenérgicas (catecolaminas) o por la vía
endócrina a través de dos hormonas: Hormona Estimulante de Melanina (MSH) y Hormona Concentradora de Melanina
(MCH). También tienen un rol en esta regulación el cortisol liberado por la glándula adrenal. Ante cambios en el entorno,
como por ejemplo cambios en la coloración del fondo se producen distintos eventos: 1) Si el fondo es oscuro se producirá
dispersión de melanosomas y el animal presentará una coloración oscura; 2) Si el fondo es claro: se producirá agregación
del pigmento y el animal presentará una coloración clara. La inervación directa permite que en los peces el cambio de
coloración pueda ocurrir en apenas segundos. En estos individuos, el estado basal de los melanóforos presenta la
melanina dispersa.
En la movilización del pigmento intervienen las proteínas accesorias motoras que, utilizando ATP, provocan el
desplazamiento de los melanosomas. Estas proteínas tienen un extremo motor que unen al citoesqueleto (microtúbulos y
actina) y por el extremo “ligante” pueden unirse a diferentes estructuras, como por ejemplo organelas, vesículas u otras
proteínas del citoesqueleto.
Ejemplos de proteínas motoras:
Ø Miosina que se une a actina
Ø Quinesina o Kinesina que se une a microtúbulos
Ø Dineína que se une a microtúbulos
La movilización de melanosomas dependerá de determinados componentes del citoesqueleto así como de los motores
moleculares como dineína y kinesina.
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Así, ante un estímulo que provoca agregación, los melanosomas se movilizarán en forma retrógrada (minus end)
transportados por la dineína y ante uno de dispersión, los melanosomas se moverán en forma anterógrada (plus end), en
ambos casos en asociación con microtúbulos.
OBJETIVO
 Demostrar la participación de algunos componentes del citoesqueleto y de la dineína en la agregación-dispersión
de melanosomas en melanóforos presentes en escamas de pez. Se utilizarán escamas aisladas del pez
Cichlasoma dimerus, especie que se caracteriza por variaciones en su coloración dependientes del entorno y del
“status” social.
METODOLOGIA
Se realizará una estimulación de la agregación con dopamina (catecolamina natural) que actuará a través del receptor α2
adrenérgico. Si bien estos receptores son específicos para noradrenalina, responden a dosis elevadas de dopamina. Se
utilizarán inhibidores de polimerización de microtúbulos y microfilamentos así como inhibidor de fosfatasas a fin de
demostrar la importancia de éstos en la agregación de los melanosomas.
1. Extraer con una pinza escamas del dorso (por encima de la línea lateral) de peces anestesiados adaptados a distintos
fondos.
2. Colocar una escama por well de una placa multiwell. Mantener sobre el hielo hasta el momento de realizar los
experimentos.
3. Lavar las escamas 15 min en 250 µl solución salina manteniéndolas sobre hielo.
4. Descartar la solución de lavado antes de comenzar cada tratamiento (nunca dejar las escamas sin solución)
5. Agregar en los siguientes tratamientos el volumen indicado en cada caso (realizar de a un tratamiento a la vez):
1) 250 µl Solución salina
2) 250 µl de solución salina con 1,25 µl de la solución 1:2000 de dopamina
3) 250 µl de Ortovanadato 500 µM. Transcurridos 10 min., agregar 1,25 µl de la solución 1:2000 de dopamina.
4) 250 µl de Colchicina 2 mg/ml. Transcurridos 10 min., agregar 1,25 µl de la solución 1:2000 de dopamina.
5) 250 µl de Citocalasina B. Transcurridos 10 min., agregar 1,25 µl de la solución 1:2000 de dopamina
6. Agitar periódicamente.
 Utilizando el microscopio óptico, observar el estado inicial de la agregación/dispersión antes del agregado de dopamina y
luego repetir la observación cada 2 min. durante 10 min. (Utilizar primero el aumento de 4x y luego pasar al siguiente
aumento, cuidando de no mojar el objetivo. NO utilizar los aumentos mayores).
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Biología Celular 2014
SOLUCIONES
Solución salina: NaCl 130 mM, KCl 2.7 mM, D-glucosa 5.6 mM, EDTA 1 mM, Tris 5 mM, pH 7,4. Para preparar 250 ml:
1.899 gr NaCl, 50.32 mg KCl, 252.2 mg D-Glucosa, 93.06 mg EDTA, 151.43 mg Tris. Ajustar pH con HCl.
Dopamina: preparar 1:2000 de solución madre
Ortovanadato: Solución madre de 50 mM en agua destilada.
Colchicina: 2 mg /ml en solución salina
Citocalasina B: 10 mg/ml
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