LABORATORIO Nº1

LABORATORIO Nº 3
DETERMINACIÓN DE GLUCOSA POR MÉTODOS CUALITATIVOS Y
CUANTITATIVOS
1. Aspectos teóricos.
En estado de post-absorción la concentración de glucosa sanguínea en el hombre
varía entre 70 -110 mg/100mL. La mantención de valores estables de glucosa en
la sangre es uno de los mecanismos más finamente regulado. En esta regulación
participan el hígado y varias hormonas.
Cuando la glucosa sanguínea alcanza valores relativamente altos, el riñón también
ejerce un efecto regulador. La glucosa filtrada continuamente por los glomérulos
es habitualmente reintegrada por completo a la sangre por el sistema de resorción
de los túbulos renales. La resorción de glucosa está enlazada con el
aprovisionamiento de ATP en las células tubulares. La capacidad del sistema
tubular para absorber glucosa está limitada a una tasa aproximada de 350 mg/min.
Cuando la cantidad de glucosa en la sangre sobrepasa la que puede ser
reabsorbida el exceso pasa a la orina produciéndose glucosuria.
En los individuos normales la glucosuria ocurre cuando la concentración de
glucosa en la sangre venosa es superior a 170 – 180 mg/100 mL.
[glucosa]normal en sangre 70 – 110 mg/dL
[glucosa]normal en orina
1 – 15 mg/dL
( 3,9 – 6,1 mmol/L).
( 0,06 – 0,8 mmol/L).
Método cualitativo: tiras colorimétricas.
La glucosa puede ensayarse cualitativamente con el uso de tiras colorimétricas.
Este test usa glucosa oxidasa que cataliza la oxidación de D-glucosa a ácido
glucónico con formación de H2O2. En presencia de loa enzima peroxidasa, el
H2O2 generado oxida un cromógeno (orto-dianicidina), produciendo un cambio de
color, que indica la presencia de glucosa. Este método es especifico para la
glucosa y la detecta cuando su concentración está sobre el rango normal.
Métodos cuantitativos.
Método químico: o-toluidina.
La o-toluidina se condensa inicialmente con el grupo aldehído de la glucosa para
formar una mezcla en equilibrio de la glucosilamina y la base de Schiff
correspondiente. Las reacciones que tienen lugar después de la condensación
original producen una mezcla de cromógenos verdes con una longitud de onda
analítica a 630 nm.
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Método enzimático: Trinder – 100 (Sigma).
El método enzimático se basa en la especificidad de la enzima glucosa oxidasa
(GOD) por la -D-glucosa. La enzima cataliza la oxidación de la glucosa por
oxígeno molecular dando el D-gluconato y peróxido de hidrógeno (H2O2, agua
oxigenada) (Rxn. 3.1). Para detectar y cuantificar esta oxidación se ocupa una
reacción acoplada (Rxn. 3.2). En forma cuantitativa el H2O2 es oxidado por un
reactivo comercial (4-aminofenazona (4-AF) y 4-hidroxibenzoato), reacción
catalizada por la enzima peroxidasa, para dar como producto un compuesto
coloreado rojo (quinonimina) que se cuantifica midiendo la absorbancia a 505 nm.
  D  glu cos a  enzim a FAD    D  gluconolactona  enzim a FADH 2
enzim a FADH 2  O 2

enzim a FAD  H 2 O 2
  D  gluconolactona  H 2 O  D  gluconato  H 
  D  glu cos a  O 2  H 2 O
GOD

 D  gluconato  H   H 2 O 2
Reacción 3.1
peroxidasa
H2 O2  4 - AF  4 - hidroxibenzoato 

 quinonimina (roja)
Reacción 3.2
2. Objetivos.
Detectar glucosa en una muestra biológica mediante tiras colorimétricas.
Cuantificar glucosa en una muestra mediante un método químico (o-toluidina) y un
método enzimático (Trinder-100).
3. Parte experimental.
3.1 Materiales
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espectrofotómetro/ celdas
trípode/ rejilla / mechero
baño termostatizado
cronómetro
15 tubos de ensayo
2 gradillas
2 pipetas graduadas de 1 mL
1 pipeta graduada de 5mL
1 pipeta graduada de 2 mL
1 pizeta
1 matraz de aforo de 100 mL
1 vaso precipitado de 250 mL
1 vaso precipitado de 500 mL
termómetro
micropipeta de 20 L, puntas
tira colorimétrica
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3.2 Reactivos




glucosa 16 mg/dL
o-toluidina
glucosa estándar (ensayo enzimático Trinder)
reactivo de trabajo Trinder-100
4. Procedimiento.
4.1





4.2
Tiras colorimétricas.
Introduzca una tira de prueba en el tubo que contiene la muestra.
Remueva inmediatamente el exceso de muestra de la tira.
Espere 10 minutos exactos para el desarrollo del color.
Compare el color de la tira con la escala de colores que indica el nivel de
glucosa.
Descarte cambios de colores después del tiempo indicado.
Método de la o-toluidina
De acuerdo a la tabla 3.1:
 Prepare una batería de tubos rotulados.
 Agregue el volumen indicado de la solución estándar de glucosa (16 mg/dL) a
los tubos 2S – 6S.
 Agregue 0,5 ml de las diferentes muestras problemas a los tubos 7MP – 9MP.
 Complete el volumen de los tubos a 0,5 mL agregando el volumen indicado de
agua destilada.
 Agregue 3,0 mL de la o-toluidina con una pipeta graduada de 5 mL. Tape los
tubos con bulbos de vidrio.
 Homogenice y lleve los tubos a un baño de ebullición por 10 minutos
 Enfríe y lea la absorbancia a 630 nm. El color es estable por 30 minutos.
TABLA 3.1
TUBO
1B
2S
3S
4S
5S
6S
7MP
8MP
9MP
Glucosa (ml)
16 mg/dL
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
-------
Glucosa
M. P. (mL)
------------0,5 MP1
0,5 MP2
0,5 MP3
Volumen H2O
(mL)
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,0
0,0
0,0
o-toluidina
(mL)
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
3,0
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De acuerdo a los datos:
 Calcule la concentración de glucosa en los tubos (2S – 6S).
 Complete la tabla con los valores de absorbancia y concentración.
 Construya una gráfica absorbancia versus concentración de glucosa.
 Obtenga la ecuación de la recta por regresión lineal y el coeficiente de
regresión.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas (tubos 7MP – 9MP) en
la cubeta mediante la ecuación 1.5.
 Calcule las concentraciones de las muestras problemas en las soluciones
originales considerando las diluciones realizadas en el ensayo (Ecuación 1.6).
4.3 Método enzimático Trinder 100
De acuerdo a la tabla 3.2:
 Prepare una batería de tubos de ensayo marcados, B (blanco), S (estándar),
MP1, MP2 y MP3.
 Agregue con una micropipeta el volumen indicado de la solución estándar de
glucosa (150 mg/dL) al tubo S.
 Agregue con una micropipeta el volumen indicado de las diferentes muestras
problemas a los tubos correspondientes.
 Agregue el reactivo de trabajo con una pipeta aforada de 2 mL.
 Homogenice e incube los tubos por 5 minutos en un baño termostatizado a
37ºC.
 Lea la absorbancia a 505 nm, llevando el equipo a absorbancia cero con el
blanco.
TABLA 3.2
Estándar ( 150 mg/mL) (L)
Muestra problema (L)
Reactivo de trabajo (mL)
B
-----2.0
S
20
--2.0
MP1
MP2
MP3
20
2.0
20
2.0
20
2.0
De acuerdo a los datos:
 Calcule la concentración de glucosa en las muestras problemas de acuerdo a
la ecuación 3.1.
Glucosa(mg/dl)  (D/S) estándar
Ecuación 3.1
donde:
D y S son las absorbancias obtenidas de cada muestra problema y del estándar,
respectivamente.
5. Bibliografía
Robert Bohinski, 1991. Bioquímica, 5ª Edición, Addison-Wesley, Iberoamericana.
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Preguntas
1. ¿Es el test cualitativo un método adecuado para el control de glucosa urinaria
en pacientes diabéticos?
2. ¿Qué ventajas presenta el método de la glucosa oxidasa con relación al de
o-toluidina en la cuantificación de glucosa en un fluido biológico?
3. Calcule el coeficiente de extinción para el método de o-toluidina considerando
las unidades de concentración: mg/mL, mg/ dL, g/L, g/100 mL, M y mM.
Nota : PM Glucosa = 180 g/mol
1 dL = 0,1 L = 100 mL
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