S4-BYQ14

Microscopía confocal para la observación in vivo del citoesqueleto celular y
proteínas asociadas en hongos filamentosos
Silvia L. Ramos-Garcíaa, Alma A. Arreola-Cruza, Iván J. Galván-Mendozaa, Rosa R.
Mouriño-Péreza
a
Departamento de Microbiología. Centro de Investigación Científica y de Educación
Superior de Ensenada. Km 107. Carretera Tijuana-Ensenada. Ensenada, B. C. 22860.
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RESUMEN
Las proteínas fluorescentes tales como la proteína verde (GFP) y la roja (RFP) han demostrado ser
herramientas poderosas para la observación en vivo de la dinámica de diferentes proteínas y organelos
celulares. El marcaje simultáneo de proteínas con ambos colores es aún de mayor utilidad. En este sentido
la microscopía confocal resulta ser de gran utilidad para la visualización de uno o varios fluoróforos y
realizar un seguimiento en tiempo y espacio (tres dimensiones) que permite tener una representación
precisa de la organización y movimiento de partículas marcadas. Este trabajo es un ejemplo de la
utilización de estas dos herramientas para la observación del citoesqueleto de células de hongos
filamentosos tomando como organismo modelo Neurospora crassa.
Se obtuvieron imágenes por microscopía confocal de cepas de N. crassa transformadas genéticamente
fusionando la GFP a β-tubulina, γ-tubulina, histonas y dineína y la RFP a tropomiosina además de una
doble transformante con β-tubulina::GFP junto con RFP::tropomiosina. Se ensamblaron imágenes en
tiempo y espacio de cada una de ellas. Se utilizaron dos láseres para la iluminación de las muestras, uno de
argón y otro de helio-neón, la longitud de onda usada para la excitación de la GFP fue de 488 nm y para la
RFP fue de 543 nm. Los filtros para el registro de la emisión fueron de 505 a 530 nm para GFP y de 600 a
650 nm para la RFP.
La β-tubulina::GFP marca los microtúbulos que se observaron distribuidos de manera longitudinal al eje de
crecimiento de la hifa, la mayoría de los microtúbulos muestran una curvatura helicoidal con una larga
frecuencia y una amplitud pequeña. Las histonas::GFP mostraron la distribución de los núcleos a lo largo
de la hifa y su movimiento dentro de esta. La γ-tubulina::GFP y la dineína::GFP mostraron una distribución
a lo largo de la hifa; la primera se observó al rededor de los núcleos siendo una proteína asociada a las
terminales negativas de los microtúbulos y teniendo una función como nucleadora; mientras que la dineína
también asociada a los microtúbulos es una proteína motora que se encarga del transporte de ciertos
organelos dentro de la célula. El citoesqueleto de actina marcado con RFP::tropomiosina presentó una
acumulación en el ápice de la célula seguido de una zona de exclusión y posteriormente una red de
filamentos. En la cepa con la doble transformación se pudieron observar los microtúbulos en verde y la
actina en rojo simultáneamente.
En conclusión, con la microscopia confocal se puede hacer una reconstrucción detallada del citoesqueleto
celular y sus proteínas asociadas en tiempo y espacio. Sin embargo, la resolución en tiempo debe ser
mejorada para poder observar eventos que ocurren en fracciones de segundo.
INTRODUCCION
Las perspectivas de la biología celular se han revolucionando con técnicas para capturar imágenes de
células in vivo. El desarrollo de pruebas fluorescentes que van desde colorantes vitales hasta proteínas
fluorescentes ha permitido el estudio y análisis de la dinámica de los organelos y componentes moleculares
de una célula o grupos celulares con una alta resolución. Estos avances en la tecnología han tenido gran
impacto en el observación de organismos procariotas y eucariotas (Cowan et al, 2000; Hickey et al, 2004).
La GFP extraída de la medusa Aequorea victoria ha sido utilizada como un marcador celular en diversas
estructuras de bacterias, animales, plantas y hongos como en este caso Neurospora crassa (Cowan et al.,
2000; Feilmeirr et al., 2000; Freitag et al., 2004). Las RFPs son otro grupo que ha sido identificado y
aislado del arrecife de coral llamado Discosoma sp (Bourett et al, 2002; Freitag et al., 2005).
Por otra parte, la microscopía confocal es una técnica con la que se pueden obtener imágenes con alta
resolución y se caracteriza por utilizar una fuente de iluminación de luz coherente (láser) que se focaliza en
un solo punto de la muestra a la vez, y la reconstrucción de la imagen se hace con el barrido completo,
además de que el plano focal observado esta limitado por un diafragma (pinhole) que permite la exclusión
de la luz emitida por puntos de la muestra fuera del plano focal definido. Lo que incrementa la sensibilidad
y reduce el ruido de fondo. Asimismo, la combinación de imágenes captadas en finos planos focales de una
misma muestra permite a través de un software obtener reconstrucciones tridimensionales del objeto
observado. Otra de las aplicaciones de la microscopía confocal es la habilidad de localizar simultáneamente
señales de diferentes fluorocromos, que es muy útil cuando se utilizan marcajes múltiples en diferentes
colores (Gu, 1996).
MATERIAL Y METODOS
Organismos y medios de cultivo. Se utilizaron seis cepas de N. crassa las cuales fueron transformadas
insertándoles la GFP, RFP o ambas en sitios específicos de diversas estructuras: -tubulina::GFP (N. crassa
N2526), Histonas::GFP (N. crassa N2281-3A), -tubulina::GFP (N. crassa TRM01), dineína::GFP (N.
crassa TRM01-3), RFP::Tropomiosina (N. crassa 614-1) y RFP::Tropomiosina + -tubulina-GFP (N.
crassa 614-1 + N2257). Se mantuvieron a 28 C en Medio Completo de Vogel (VCM) y para la captura de
imágenes al microscopio se utilizó agar-agua al 2 % (WA) para evitar autofluorescencia del medio al
obtener las imágenes.
Microscopía Confocal. Se utilizó un microscopio Confocal LSM Meta (Carl Zeiss). Para las cepas
marcadas con GFP se usó un láser de Argón con una longitud de onda de excitación de 488 nm y un filtro
de emisión de 505 a 530 nm de longitud de onda. Para las cepas con RFP se empleó un láser de Helio-Neón
con una longitud de onda de 543 nm y un filtro de emisión de 600 a 650 nm. En la cepa con doble marcaje
se utilizaron los dos canales simultáneamente. El objetivo utilizado fue un Plan-Apocromático 100x/1.3
A.N, PH3 de inmersión en aceite. Para la reconstrucción tridimensional se tomaron rebanadas focales de
0.7 µm.
RESULTADOS
La -tubulina es un monómero que forma parte del citoesqueleto microtubular alternándose con la αtubulina. De esta manera al marcar la β-tubulina con la GFP se pueden visualizar los microtúbulos que
mostraron una distribución longitudinal al eje de elongación de la hifa con una apariencia helicoidal con
una frecuencia baja y una amplitud pequeña (Fig 1a.). Algunos microtúbulos convergen en el ápice de la
célula.
Los hongos tienen células multinucleadas. Los núcleos marcados con GFP se observan como estructuras
semiesféricas de longitud variable (1.0 a 3.0 m) que se distribuyen a lo largo de la hifa después de una
zona de exclusión en la región apical y subapical que mide entre 15 y 20 m de longitud (Fig. 1b). Para la
observación del contorno de la célula en esta cepa, fue necesario utilizar un fotomultiplicador de luz
transmitida para la obtención de imágenes en contraste de fase (Fig. 1b).
La tropomiosina es una proteína del citoesqueleto de actina que fue marcada con RFP. Los filamentos de
actina se observaron acumulados en el ápice de la célula que coincide con el spitzenkörper (Spk), seguido
de una zona sin fluorescencia de aproximadamente 25 µm y posteriormente en la zona basal de la hifa se
encontró como una red de filamentos (Fig. 1c).
La -tubulina es una proteína que se encuentra asociada a los microtúbulos, localizada en la terminal
negativa de éstos debido a su función nucleadora. A lo largo de la hifa se observaron pequeños puntos
brillantes después de la zona de exclusión de los núcleos. La fluorescencia se observó principalmente
alrededor de estos, aunque también se localizó en forma libre (Fig. 1d y e).
Las proteínas motoras son las encargadas de ciertos movimientos intracelulares de organelos y partículas.
En el caso de la dineína::GFP se pudo observar que su distribución se encuentra por todo el citoplasma,
principalmente asociada a ciertos organelos y/o partículas para su transporte (Fig. 1f y g)
La figura 2 muestra la cepa con los microtúbulos marcados con GFP (Fig. 2a) y los filamentos de actina
con RFP (Fig. 2b). Se observó una distribución muy similar a la descrita para los marcajes simples de estas
proteínas. Pero en este caso es posible observar como se asocian en el ápice de la célula, sin embargo en la
zona basal no se ven asociados (Fig. 2d).
Figura 1. Microscopía confocal de N. crassa transformada con GFP y RFP. a). microtúbulos con GFP; b).
núcleos con GFP; c). tropomiosina con RFP; d). -tubulina con GFP y f). dineína con GFP. e) y g).
imágenes en contraste de fase de d) y f) respectivamente. Las cabezas de flecha muestran acumulaciones de
-tubulina (d), los núcleos están señalados con asteriscos y las flechas destacan acumulaciones de dineína.
Escala: 5 m.
Figura 2. Microscopía confocal de N. crassa doblemente marcada (RFP::tropomiosina+Tubulina::GFP): a).
tropomiosina (actina) con RFP; b). microtúbulos con GFP; c). imagen en contraste de fase; d). combinación
de a) y b). La flecha muestra la asociación de los microtúbulos y de la actina en el ápice de la hifa. Escala:
5 m.
CONCLUSION
La combinación de técnicas moleculares para marcar el citoesqueleto y la microscopia confocal ha
mostrado ser una poderosa herramienta para describir su estructura, dinámica e interrelaciones. Con la
microscopía confocal fue posible llevar a cabo reconstrucciones detalladas de algunos componentes del
citoesqueleto celular en cuatro dimensiones (3-D en espacio y tiempo). La GFP y la RFP fueron muy
estables para ser observada por largos periodos, sin embargo la RFP fue más lábil al fotoblanqueamiento.
La resolución espacial de este tipo de microscopia resulto ser eficiente para resolver la observación de cada
uno de los componentes estudiados. Sin embargo, la resolución en tiempo, resulto ser limitada, ya que la
máxima velocidad de barrido alcanzada fue de 1.5 s, lo que impide la observación de procesos que ocurran
en intervalos menores.
REFERENCIAS
T. M. Bourette, J. A. Sweigard, K. J. Czymmek, A. Carroll, R. J. Howard, “Reef coral fluorescent proteins
for visualizing fungal pathogens”, Fungal Genetics and Biology, Vol. 37, 2002, pp. 211-220.
S. E. Cowan, E. Gilbert, A. Khlebnikov, J. D. Keasling, “Dual labeling with Green Fluorescent Proteins for
Confocal Microscopy”, Applied and Enviromental Microbiology, Vol. 66, 1, 2000, pp. 413-418.
M. Gu, “Principles of Three-Dimensional Imaging Confocal Microscopes”, World Scientific, 1996, pp. 1337.
B. J. Feilmeier, G. Iseminger, D. Schroeder, H. Webber, G. J. Phillips, “Green Fluorescent Protein
Functions as a reporter for protein localization in Escherichia coli”, J. of Bacteriology, Vol. 182, 14, 2000,
pp. 4068-4076.
M. Freitag, P. C. Hickey, N. B. Raju, E. U. Selker, N. D. Read. “GFP as a tool to analyze the organization,
dynamics and function of nuclei and microtubules in Neurospora crassa”, Fung. Genet. Biol, Vol. 41,
2004, pp. 897-910.
M. Freitag, E. U. Selker, “Expression and visualization of red fluorescent protein (RFP) in Neurospora
crassa”, Fungal Genetics Newsletter, Vol. 52, 2005, pp. 14-17.
P. C. Hickey, S. R. Swift, M. G. Roca, N. D. Read, “Live-cell imaging of filamentous fungi using vital
fluorescent dyes and confocal microscopy”, Methods in Microbiology, Vol. 34, 2004, pp. 63-87.