PROYECTO DE INVESTIGACIÓN ESTUDIO EPIDEMIOLÓGICO DE LAS REPERCUSIONES CLÍNICAS, FUNCIONALES Y BIOLÓGICAS DE LA EXPOSICIÓN AL VERTIDO DE FUEL DEL BUQUE 'PRESTIGE' SOBRE LA SALUD RESPIRATORIA EN MARINEROS DE LA COSTA DE GALICIA Auspiciado por la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) Febrero de 2003 RESUMEN En las tareas de limpieza del vertido de fuel ocasionado por el naufragio del petrolero ‘Prestige’ han participado un número elevado de personas, que se han expuesto a posibles efectos tóxicos sobre su salud. Se dispone de escasa información científica sobre la repercusión clínica, funcional y biológica de la exposición a los vertidos de fuel sobre la salud respiratoria. Los estudios realizados han sido recortados en el tiempo, con una valoración funcional poco detallada, y sin investigar marcadores biológicos de daño celular y molecular. HIPÓTESIS: La exposición a algunos de los componentes del fuel puede inducir cambios inflamatorios en la vía aérea que se manifestarían en hiperreactividad bronquial y aumento de síntomas respiratorios. Estos componentes también poseen la capacidad de inducir alteraciones cromosómicas que podrían predisponer al desarrollo de neoplasias. OBJETIVOS: Investigar los efectos respiratorios de la exposcición al vertido de fuel del ‘Prestige’ en la población de marineros de la costa de Galicia, tanto desde una vertiente clínica y funcional, como en marcadores biológicos de inflamación de la vía aérea y de genotoxicidad. MÉTODOS: Estudio transversal en dos etapas consecutivas en poblaciones de marineros de la costa gallega. Mediante muestreo bi-etápico clásico se definirá la población diana. En la segunda etapa se incluirán 2 grupos equivalentes de 500 marineros en cada uno, diferenciados por la exposición al fuel. El estudio incluirá una encuesta de síntomas, el estudio funcional respiratorio (espirometría forzada y prueba de broncoprovocación) y mediciones de sensibilidad mediada por IgE. Se evaluará el estado inflamatorio de la vía aérea mediante el análisis de marcadores de estrés oxidativo y de citocinas en el condensado del aire exhalado. El potencial genotóxico de la exposición se evaluará mediante estudios de inestabilidad genética (análisis de fragilidad cromosómica y técnicas de citogenética molecular) y el análisis de aductos de hidrocarburos aromáticos policíclicos en ADN de linfocitos. 1 EQUIPO INVESTIGADOR Investigador principal Dr. Héctor Verea Hernando Servicio de Neumología, Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A Coruña. Coinvestigadores Dra. Gema Rodríguez Trigo Dra. Marina Blanco Aparicio Servicio de Neumología, Complejo Hospitalario Universitario Juan Canalejo, A Coruña. Dra. Mercedes Suárez Rodríguez Servicio de Neumología, Hospital Xeral, Vigo. Dra. Mª Elena Toubes Servicio de Neumología del Complexo Hospitalario, Ourense. Dra. Ana Palacios Bartolomé Servicio de Neumología, Hospital Clínico, Santiago. D.E. Felip Burgos Rincón Servei de Pneumologia i Al.lèrgia Respiratòria, Hospital Clínic, Barcelona. Jan-Paul Zock, PhD Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental, Institut Municipal d’Investigació Mèdica (IMIM), Barcelona. Dra. Carme Fuster Dra. Mª Angels Rigola Departamento de Biología Celular, Universidad Autónoma de Barcelona. Dra. Isabel Isidro Instituto Nacional de Silicosis, Oviedo. Comité científico asesor Dr. Joan Albert Barberà Mir Presidente del Comité Científico de la SEPAR. Servicio de Neumología, Hospital Clínic de Barcelona. Profesor Asociado, Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona. Dr. Francisco Pozo Rodríguez Máster en Salud Pública. Comité Técnico Centro Respira de Investigación. Responsable Científico del Grupo de Medicina Basada en la Evidencia, Servicio de Neumología, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid. Unidad de Investigación, Hospital Universitario 12 de Octubre, Madrid. 2 Dr. Josep Mª Antó Boqué Coordinador de la Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental, Institut Municipal d’Investigació Mèdica (IMIM), Barcelona. Profesor Titular, Departament de Ciencias Experimentales y de la Salud; Vicerrector de Política Científica, Universitat Pompeu Fabra, Barcelona. Dr. Josep Egozcue Cuixart Catedrático. Area de Biología Celular, Departamento de Biología Celular, Fisiología e Inmunología, Universidad Autónoma de Barcelona. Comité Científico, Sociedad Internacional de Bioética. Dr. Jordi To Figueras Consultor. Servicio de Toxicología, Hospital Clínic de Barcelona. Profesor Titular. Facultad de Medicina, Universidad de Barcelona. 3 ANTECEDENTES Y ESTADO ACTUAL DEL TEMA El 14 de noviembre de 2002 se produjo el hundimiento del petrolero ‘Prestige’ y el subsiguiente vertido de parte de las 77.000 toneladas de fuel contenidas en sus depósitos. Este vertido alcanzó de lleno las costas de Galicia y otras comunidades del norte de España dando lugar a la que se ha considerado mayor catástrofe ecológica en nuestro pais. Desde el momento del naufragio hasta la actualidad se ha producido una importante contaminación por fuel de las playas, las zonas rocosas y los fondos marinos de la costa del noroeste español. La contaminación es extensa pero heterogénea debido a las especiales características geográficas de la costa gallega y a las condiciones metereológicas y de las corrientes marinas. De este modo alternan núcleos de población muy afectados (como Fisterra o Muxía) con municipios vecinos donde la repercusión fue mínima o nula (Noia o Vilagarcía de Arousa). La limpieza del fuel en la costa y su recogida en el mar ha sido una árdua tarea en la que han participado amplios sectores de vecinos de estas localidades gallegas y de otras comunidades, en una de las mayores muestras de solidaridad colectiva vividas en nuestra historia reciente. Las repercusiones sociales han sido muy importantes y han propiciado que una gran parte de los 28.270 tripulantes de la flota que faena habitualmente en aguas territoriales gallegas no pueden pescar y se dedican, diariamente desde hace 2-3 meses, a la recogida de fuel. Las tareas de limpieza del fuel vertido por el buque ‘Prestige’ suponen la exposición a los elementos potencialmente tóxicos que contiene dicho producto, con un potencial efecto deletéreo sobre la salud. De hecho, según datos recientes de la Consellería de Sanidade de la Xunta de Galicia [1] y a pesar de las medidas de protección adoptadas, un número considerable de personas que han participado en 4 las tareas de limpieza del fuel han precisado valoración sanitaria. Es de destacar que un 42% de casos que requirieron atención médica por problemas no traumáticos presentaban irritación de la vía aérea y síntomas respiratorios. El fuel que transportaba el buque ‘Prestige’ está compuesto fundamentalmente por hidrocarburos aromáticos volátiles (benceno, tolueno), hidrocarburos aromáticos policíclicos (naftaleno, fluorantenos, benzopirenos), hidrocarburos saturados, metales pesados (níquel, zinc y vanadio), azufre, resinas y asfaltenos [2]. Es un material de elevada viscosidad y alta densidad, con gran tendencia a formar emulsiones estables con el agua. La pérdida por evaporación es baja (2-5%). Según la International Agency for Cancer Research (Lyon, Francia), el potencial carcinogenético de este producto se clasifica como 2B, lo que indica que en estudios en animales hay evidencia de actividad carcinogenética de sus componentes, si bien se requieren más estudios para determinar su potencial carcinogenético en humanos. En la última década se han producido diversos accidentes de grandes petroleros en las costas de diferentes paises. Para estudiar las posibles consecuencias de estos vertidos de petróleo sobre la salud fueron realizados estudios epidemiológicos dirigidos a evaluar la salud de las poblaciones afectadas. Los trabajos de limpieza de las zonas dañadas dan lugar a la exposición de los individuos por dos vías fundamentales: la cutáneo-mucosa y la inhalatoria. Los síntomas respiratorios son de los que se presentan con mayor frecuencia a corto plazo. Presumiblemente, están relacionados con el contenido en hidrocarburos aromáticos y poliaromáticos en el fuel [3]. Otros componentes químicos, presentes en menor concentración, también pueden estar asociados a problemas respiratorios [4]. 5 Lyons y colaboradores [5] en un estudio de cohortes retrospectivo en 539 sujetos expuestos al fuel del ‘Sea Empress’ (Inglaterra, 1996) y 550 no expuestos, identificaron como problemas fundamentales de la exposición: cefalea, dolor ocular y odinofagia. No se realizó seguimiento posterior ni determinación de biomarcadores. En el naufragio del ‘Nakhodka’ (Japón, 1997) se valoraron los problemas de salud agudos de 282 individuos que participaron en la limpieza [6], de ellos un 69% refería síntomas como lumbalgia, algias en miembros inferiores, cefalea, odinofagia, lagrimeo, visión borrosa y dolor ocular. La intensidad y número de síntomas se relacionaban con el número de días de trabajo y desaparecieron al interrumpir la exposición. Los trabajos realizados para valorar las repercusiones del vertido del buque ‘Erika’ (Francia, 1999) mostraron hallazgos similares en cuanto a sintomatología aguda. En un estudio de 3669 trabajadores en la limpieza del fuel procedente del ‘Erika’ dirigido a identificar problemas de salud y en el que no se realizó seguimiento, el 53% presentaron alguno de los siguientes síntomas: cefalea, dermatitis, enrojecimiento ocular, problemas respiratorios, náuseas, dolor abdominal. Las estimaciones del riesgo teratógeno o cancerígeno a largo plazo se consideraron despreciables [7], excepto en el caso de los limpiadores de aves en quienes existe mayor riesgo de desarrollar cáncer de piel. En estudios de exposición ocupacional, concretamente en el análisis del lavado nasal de trabajadores de calderas que están en contacto con derivados del petróleo, se demostraron niveles altos de vanadio y un estado inflamatorio agudo neutrofílico con elevación de interleuquina (IL) 8 y mieloperoxidasa, con niveles normales de IL-6 y proteína catiónica del eosinófilo [8]. Hauser y colaboradores [9] demostraron que la exposición ocupacional a productos de la combustión de petróleo se asocia a un descenso agudo del flujo espiratorio máximo. 6 En referencia a los naufragios referidos, hay que subrayar que en los estudios efectuados en personas expuestas a los vertidos de petróleo, el impacto respiratorio de la exposición se evaluó con poco detalle, dado que sólo se emplearon cuestionarios de síntomas y mediciones de función muy groseras, como la del flujo espiratorio máximo. Dados los efectos irritantes que la exposición al fuel tiene sobre la vía aérea y las superficies mucosas, y teniendo en cuenta además que alguno de sus componentes tambien se encuentra en el humo del tabaco, es previsible que la inhalación de estos productos produzca cambios inflamatorios sobre la vía aérea, tal y como se ha observado en los lavados nasales en trabajadores de calderas [8].Los mecanismos responsables de dicha respuesta inflamatoria pulmonar no han sido aun completamente dilucidados. La activación de diversas citocinas proinflamatorias, como las interleucinas (IL) o el TNF-alfa así como un incremento de la actividad de la óxido nitrico sintasa (NOS) en las vías aéreas han sido involucrados en la patogénesis de esta respuesta inflamatoria. Asimismo, los fueles residuales pueden ser una fuente considerable de sustancias oxidantes capaces de producir daño pulmonar tanto por sus efectos oxidativos directos como por la activación de mecanismos inflamatorios. El análisis de los constituyentes del exhalado pulmonar es una herramienta incruenta para el diagnóstico y la monitorización de las enfermedades pulmonares. El exhalado pulmonar está constituido por una fase gaseosa, donde es posible detectar distintos compuestos volátiles endógenos tales como óxido nítrico (NO) o el monóxido de carbono (CO), y una fase acuosa donde aparecen en suspensión distintos compuestos no volátiles que pueden ser recuperados mediante la condensación del aire exhalado por técnicas de enfriamiento. Refleja la composición del fluido extracelular de revestimiento epitelial pulmonar y permite la estimación del 7 estrés oxidativo pulmonar a través de la medición de peróxido de hidrógeno o de productos derivados de peroxidacíon lipídica como el 8-isoprostano. Del mismo modo, diversos marcadores inflamatorios como productos derivados del metabolismo del óxido nítrico (nitritos, nitratos, nitrosotioles, nitrotirosina), citocinas (IL-1, IL-8, TNF-alfa) o leucotrienos (LTB4, cisteinil-LTs) también pueden ser cuantificados en el condensado del aire exhalado. La presencia de cambios inflamatorios en la vía aérea podría favorecer la aparición de procesos obstructivos, o bien agravar procesos previamente existentes como el asma o la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). En este sentido, aunque se trata de otro tipo de exposición, cabe destacar que para estudiar las consecuencias respiratorias de los bomberos que participaron en las tareas de desescombro del World Trade Center de Nueva York, el 11 de septiembre de 2001, fueron empleados espirometría y prueba de provocación bronquial, metodología con la cual fue constatado en un significativo número de casos el desarrollo de hiperrreactividad bronquial y tos crónica [10]. Por consiguiente, no puede descartarse a priori que la exposición al vertido de fuel del ‘Prestige’ pueda ocasionar cambios inflamatorios en la vía aérea que favorezcan una mayor reactividad bronquial. Por este motivo es preciso que una correcta evaluación de los efectos sobre la salud respiratoria de la exposición al vertido de fuel, contemple la medición del estado inflamatorio de la vía aérea y de la reactividad bronquial, empleando para ello técnicas de elevada sensibilidad. En la valoración de las repercusiones del vertido del buque 'Braer' (Inglaterra, 1993) se realizaron determinaciones en muestras biológicas en el momento agudo y después de 10 meses para evaluar potencial genotoxicidad secundaria a la exposición [11]. Aunque el número de individuos analizados era muy limitado (20 8 expuestos y 7 no expuestos), no se demostró incremento de los niveles de aductos de ADN relacionados con el vertido. La inestabilidad genética en forma de alteraciones cromosómicas y /o aumento en la expresión de fragilidad cromosómica, se considera un factor de predisposición a diferentes tipos de cáncer. Esta alteración puede ser inducida por condicionantes externos tales como mutágenos químicos o exposición a radiaciones.Los Lugares Frágiles (FS) se expresan como gaps o roturas en bandas específicas de cromosomas metafásicos bajo condiciones específicas de cultivo en los que se inhibe la replicación o la reparación de DNA. Existen evidencias de una correlación entre las bandas correspondientes a FS y los puntos de rotura implicados en reorganizaciones cromosómicas observadas en neoplasia, la localización de oncogenes y genes supresores de tumores así como de puntos de rotura inducidos por mutágenos y carcinógenos [12,13]. Yunis y Soreng en 1984, [14], sugirieron que el incremento de fragilidad podría originar reorganizaciones cromosómicas imprecisas, amplificaciones genéticas, activación de oncogenes o pérdida de genes supresores de tumor. Hasta el momento, se han realizado pocos estudios en los que se analiza la expresión de FS en trabajadores ocupacionalmente expuestos a determinados agentes potencialmente mutágenos, observándose que los FS más expresados coinciden con los puntos de rotura implicados en reorganizaciones típicas de tumores [15]. Las mutaciones que se originaran en FS loci podrían ser responsables del propio proceso canceroso no sólo por ser regiones de DNA inestable sino también por su relación con genes que contribuyen directamente al propio proceso neoplásico [16]. Las alteraciones cromosómicas, numéricas y estructurales, tienen un papel esencial en la aparición de cáncer y también pueden ser inducidas por agentes químicos y /o por radiaciones. El método 9 citogenético clásico utilizado para la detección e identificación de estas alteraciones cromosómicas está basado en la realización y examen de los cromosomas metafásicos mediante bandas G. Actualmente, se dispone de una nueva técnica de citogenética molecular conocida como de hibridación “in situ” fluorescente (FISH) que permite identificar, de forma rápida, anomalías cromosómicas que con las técnicas convencionales pasan desapercibidas, o no pueden llegar a caracterizarse. La FISH multicolor permite detectar reorganizaciones crípticas y con sondas teloméricas (multitel-FISH) se pueden explorar las regiones teloméricas, especialmente ricas en genes. Hasta el momento se han publicado dos estudios en los que se relaciona la sobreexpresión de FS concretos con anomalias cromosómicas en telómeros [17,18]. Dado que la utilización de esta técnica es muy reciente, se dispone de muy poca información respecto al papel que desempeñan estas anomalías cromosómicas cripticas (subteloméricas o no) en la predisposición / aparición de cáncer. Es bien conocido que numerosos carcinógenos ambientales sufren un proceso de bioactivación endógeno-tisular mediado por enzimas de fase I como el citocromo P-450, que conduce a la formación de intermediarios reactivos(epóxidos, electrófilos). Estos intermediarios reactivos tienden a unirse al ADN formando aductos, resultado de la unión del tóxico intermedio con alguna base nitrogenada del ADN. La formación de aductos en genes críticos como p53 induce mutagénesis en el momento de la replicación celular y eventualmente carcinogénesis. Aunque no sea posible analizar directamente los aductos en tejidos diana, actualmente es posible, mediante técnicas cromatográficas y/o inmunológicas, estudiar los aductos en ADN linfocitario. Ello da una medida representativa del grado de exposición y de la dosis interna. Así, se ha utilizado el análisis de aductos de hidrocarburos aromáticos 10 policíclicos en ADN de linfocitos de personas expuestas y fumadores, configurándose como un tipo de análisis muy útil en el campo de la salud pública y la epidemilogía molecular. Un estudio realizado en trabajadores de refinerías de petróleo mostró que el grado de exposición a hidrocarburos aromáticos policíclicos supone un factor de riesgo para la formación de aductos con el DNA [19]. A la vista de estos antecedentes, un comité "ad hoc" designado por la Junta Directiva de la Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) ha considerado que existe la posibilidad de que la exposición al vertido de fuel del buque ‘Prestige’ tenga efectos nocivos sobre la salud respiratoria. Por este motivo, la SEPAR, conjuntamente con el Centro Respira de Investigación (CRI), han impulsado una comisión de estudio sobre los posibles efectos respiratorios de esta exposición, formada por expertos de distintas disciplinas (neumólogos, epidemiólogos, toxicólogos, especialistas en medicina laboral y genetistas). Fruto del trabajo de esta comisión nace este proyecto de investigación, dirigido a evaluar los efectos respiratorios de la exposición al vertido del buque ‘Prestige’ en una amplia población de marineros gallegos. El estudio principal es de corte epidemiológico y estará dirigido a evaluar tanto la prevalencia de síntomas respiratorios como signos de irritación e hiperrreactividad de la vía aérea. Este estudio se complementará con otro sobre biomarcadores de genotoxicidad. El primero estará dirigido a evaluar el estado inflamatorio de la vía aérea, empleando para ello una de las técnicas más novedosas que permite, de modo incruento, analizar marcadores biológicos contenidos en el condensado del aire exhalado. El segundo estará dirigido a analizar el efecto genotóxico de la exposición al fuel en los marineros, estudiando aductos de ADN y determinando si se produce un incremento de inestabilidad genómica, evaluada mediante la expresión de fragilidad 11 cromosómica y la aparición de alteraciones cromosómicas, especialmente crípticas, en linfocitos de estos individuos. De encontrar dicha inestabilidad se establecería la existencia de un mayor riesgo en estos pescadores a desarrollar algún tipo de cáncer, especialmente los que afectarían a los tejidos más expuestos al fuel, como el pulmón. 12 BIBLIOGRAFIA 1. Consellería de Sanidade. Servicio Galego de Saúde. Consultas atendidas polo plan sanitario combinado. http://www.sergas.es/gal 2. Bosch X. Exposure to oil spill has detrimental effect on clean-up workers’ health. Lancet 2003;361:147 3. World Health Organization. Enviromental Health Criteria 202. Selected Nonheterocyclic Policyclic aromatics Hidrocarbons. Geneva. 1998. 4. Shusterman D. Critical Review: The health significance of enviromental odor pollution. Arch. Environ. Health, 1992;47(1):76-78. 5. Lyons RA, Temple JM, Evans D, Fone DL, Palmer SR. Acute health effects of the Sea Empress oil spill. J Epidemiol Community Health 1999;53:306-10. 6. Morita A, Kusaka Y, Deguchi Y, Moriuchi A, Nakanaga Y, Iki M, Miyazaki S, Kawahara K. Acute health problems among the people engaged in the cleanup of the Nakhodka oil spill. Environ Res 1999;81:185-94. 7. Baars BJ. The wreckage of the oil tanker 'Erika' - human health risk assessment of beach cleaning, sunbathing and swimming. Toxicology Letters 2002;128:5568. 8. Woodin MA, Hauser R, Liu Y, Smith TJ, Siegel PD, Lewis DM, Tollerud DJ, Christiani DC. Molecular markers of acute upper airway inflammation in workers exposed to fuel-oil ash. Am J Respir Crit Care Med 1998;158:182-7. 9. R Hauser, C Daskalakis, and DC Christiani. A regression approach to the analysis of serial peak flow among fuel oil ash exposed workers.Am J Respir Crit Care Med. 1996; 154: 974-980. 10. Prezant DJ, Weiden M, Banauch GI, McGuinness G, Rom WN, Aldrich TK, et al. Cough and Bronchial Responsiveness in Firefighters at the World Trade Center Site. N Engl J Med 2002;347:806-815 11. Cole J, Beare DM, Waugh AP, Capulas E, Aldridge KE, Arlett CF, Green MH, Crum JE, Cox D, Garner RC, Dingley KH, Martin EA, Podmore K, Heydon R, Farmer PB. Biomonitoring of possible human exposure to environmental genotoxic chemicals: lessons from a study following the wreck of the oil tanker Braer. Environ Mol Mutagen 1997;30:97-111. 12. Miró et al.(1987).Human Genetics 75:345 349 13. Glover (1998). Recent Results in Cancer Research, vol.154:185-199. SpringVerlag Berlin-Heidelberg. 14. Yunis and Soreng (1984). Science 226:1199-1204 15. Musio and Sbrana (1997).Environ. Mol. Mutagen. 29:250-255 16. Richards (2001). Trends in Genet 17: 339-34 17. Villa et al. (1997). Chromosoma 106:400-404 18. Musio et Mariani (1999). J.Environ. Pathol. Toxol. Oncol. 18:11-15 19. Abdel-Rahman AG, Allam MF, Mansour MT, Mustafa MA. DNA adducts in a petrol refinery in Egypt. Eur J Cancer Prev 2001 Oct;10(5):469-72 13 HIPOTESIS 1º. La exposición inhalatoria repetida a hidrocarburos volátiles del fuel del buque 'Prestige', especialmente cuando ocasiona síntomas irritativos respiratorios, produce inflamación e hiperrespuesta bronquial. 2º. La exposición al fuel da lugar a un incremento de inestabilidad genómica, que podría desembocar en un mayor riesgo de cáncer, especialmente cáncer de pulmón. OBJETIVOS Objetivo principal Investigar los efectos respiratorios clínicos y subclínicos de la exposición al fuel del buque 'Prestige' mediante la evaluación de alteraciones respiratorias biológicas y funcionales. Objetivos intermedios 1.- Definir la población de estudio: 1.1. Evaluación de la salud respiratoria en una población de marineros en relación con las especiales características de su actividad laboral. 1.2. Definición de una población base de marineros gallegos bien caracterizada para seguimiento (estudio de cohorte prospectiva). 1.3. Evaluación de las tareas de recogida del fuel en relación con la exposición inhalatoria por expertos de higiene laboral, con el fin de desarrollar un cuestionario válido para la determinación de la exposición inhalatoria en un diseño epidemiológico. 14 1.4. Estudio de la relación entre tareas de recogida de fuel y síntomas respiratorios. 2.- Recoger la información necesaria: 2.1. Estudio espirométrico y prueba de provocación con metacolina en marineros expuestos y no expuestos 2.2. Análisis de marcadores de la inflamación en condensado de aire exhalado en expuestos y no expuestos 2.3. Análisis y cuantificación de la inestabilidad genómica y de aductos de ADN: 2.3.a) análisis de la fragilidad cromosómica mediante la determinación de la expresión de lugares frágiles en expuestos y no expuestos. 2.3.b) análisis de alteraciones cromosómicas por métodos de citogenética básica (Bandas G) y mediante las técnicas de FISH (alteraciones cromosómicas crípticas por pintado cromosómico multicolor M-FISH y subteloméricas mediante M-TEL-FISH) en marineros expuestos y no expuestos. 2.3.c) estudio de la formación de aductos de hidrocarburos aromáticos policíclicos en el ADN de linfocitos de expuestos y no expuestos. 15 UTILIDAD PRACTICA Los resultados del estudio producirán conocimiento de impacto sanitario en relación con: Intervenciones inmediatas si se detecta una mayor frecuencia de eventos clínicos respiratorios en los sujetos expuestos. Intervenciones cautelares si se detecta una mayor frecuencia de alteraciones biológicas (mediadores de inflamación o daño genético), marcadores de un potencial incremento de riesgo de neoplasias y enfermedades pulmonares inflamatorias crónicas en enfermos expuestos. Y como valor añadido, un primer acercamiento sistemático al conocimiento del estado de salud de una población de trabajadores poco estudiada hasta la fecha. 16 METODOS DISEÑO Estudio transversal en dos etapas consecutivas en poblaciones de marineros de la costa gallega. Se aplicará un muestreo bi-etápico clásico para definir bien la población diana y para controlar la población no respondedora.En la segunda etapa se incluirá un grupo de marineros con exposición al vertido de fuel del 'Prestige', y un grupo sin dicha exposición. POBLACION DE ESTUDIO Los sujetos proceden de la población de marineros asociados con las cofradías gallegas, incluyendo tanto las zonas afectadas como las zonas no afectadas por el fuel. Aplicando esta estrategia, se puede asumir que las características socioeconómicas y laborales de los marineros de bajura sean parecidas en las distintas zonas. En primer lugar se definirá una población de 5.000 marineros de bajura entre 18 y 65 años. Mediante un cuestionario 'screening' se obtendrá información sobre datos personales, participación en las diferentes tareas de recogida y limpieza del fuel y otras variables determinando criterios de inclusión y exclusión en la segunda etapa. Se contactará con >1000 marineros seleccionados a través de la primera etapa, con el fin de establecer una población de 500 con exposición y 500 sin exposición al fuel. Para aumentar el contraste entre los grupos, los 500 expuestos habrán realizado por lo menos tres semanas de trabajos de recogida del fuel. Tanto la distribución de las tareas reportadas en el cuestionario de la primera etapa, como los hallazgos del 17 estudio de higiene ocupacional podrá modificar la definición mencionada. Los 500 sujetos sin exposición no habrán tenido ningún tipo de contacto con el fuel. Es posible que los más expuestos participen más y que los que tienen síntomas sobrevaloren la exposición. También es posible cierto sesgo tipo “efecto del trabajador sano”. Se realizarán esfuerzos para controlar los sesgos de selección y de respuestas relacionadas, incluyendo la recogida de información de no respuestas y el grado de preocupación por los potenciales efectos nocivos de la exposición al fuel. VARIABLES 1. Cuestionario screening de la PRIMERA ETAPA 1.1 Determinación de la exposición a petróleo: la encuesta contendrá preguntas sobre contacto con el fuel a partir del 14 de noviembre de 2002; tipo de tarea incluyendo la recogida de fuel en las rocas, las playas, el fondo, en las rías, limpieza de contenedores, aves, ropa, botas, transporte, número de días y horas al día de cada tarea. Se incluirán también las tareas de recogida de fuel previstas en las próximas semanas, con el fin de definir un grupo de expuestos durante la realización de la segunda etapa. 1.2 Síntomas respiratorios: la encuesta contendrá preguntas sobre síntomas agudos y crónicos de las vías aéreas superiores e inferiores, procedentes de cuestionarios estandarizados y validados [Eur Respir J 2001;18:598-611]. Se incluirán preguntas sobre trastornos crónicos. Con el objetivo de definir criterios de inclusión y de exclusión para la segunda etapa, se harán también algunas preguntas generales como hábitos tóxicos y otros empleos. Se obtendrán datos de los sujetos seleccionados que no acepten participar. 18 SEGUNDA ETAPA 2. Espirometría basal Se realizará espirometría forzada con intrumental común en todos los centros (Sibel 600) y según los criterios de la ATS-Update 94 [Am Rev Respir Dis 1995; 162:110736]. 3. Prueba de la metacolina Se practicará a todos los individuos que realicen correctamente las maniobras espirométricas, que hayan firmado su consentimiento para la prueba de la metacolina, y que no estén en las categorías de exclusión (ataque cardiaco en los últimos 3 meses, padezca una enfermedad cardiaca o epilepsia y tome medicación para ello, esté embarazada, período de lactancia, tome un beta-bloqueante oral o tópico). Además se excluirán los individuos con FEV1 menor del 70 % del predicho, o FEV1 menor de 1.5 litros utilizando los valores de referencia [Roca J, et al, Eur Resp J 1998;11:1354-62]. Los nebulizadores (Mefar) y la presión del dosímetro será calibrada centralmente. La metacolina será suministrada del mismo lote desde un solo centro (Juan Canalejo). La preparación de las soluciones de metacolina se realizará de forma local siguiendo el protocolo ECRHS hasta una dosis acumulada de 2 mg. 4. Prueba broncodilatadora Se realizará en individuos que hayan realizado correctamente las maniobras espirométricas, y se nieguen a realizar o hayan sido excluidos de la prueba de metacolina, y hayan firmado su consentimiento para la prueba broncodilatadora. 5. Control de calidad de las mediciones de la función pulmonar El desarrollo de diversos pilotos de telemedicina en el Hospital Clínic de Barcelona, en el marco de los programas de “Health Telematics”, DG XIII, de la Unión Europea 19 (Mobcare, Chronic C- Arctic) facilita una experiencia única para establecer un programa de control de calidad sobre los resultados de la Función Pulmonar obtenidos. 6. Medición de marcadores biológicos exhalados de la inflamación La recolección del condensado del exhalado respiratorio se realizará utilizando un equipo EcoScreen® (Jäeger, Alemania), empleando la metodología habitual. La recolección se realizará tras un período de reposo de 15 minutos, en posición sentada y utilizando pinzas nasales. Con este método se obtienen 2-3 ml del condensado del exhalado respiratorio. El condensado de cada sujeto se almacenará en tubos de polipropileno (2-4 alícuotas, ~1 ml) a 70ºC para su ulterior análisis antes de 12 semanas. Las muestras, congeladas, se transportarán al Hospital Clínic de Barcelona por mensajería privada. En dichas muestras se analizará: (1) Estrés oxidativo: peróxido de hitrógeno (método colorimétrico), nitritos/nitratos (quimioluminiscencia), 8-isoprostano (EIA); (2) Citocinas: IL-4, IL-8 (ELISA); y (3) marcadores de dilución, Na, K (espectrofotometria de llama) y de contaminación salival (amilasa, método enzimático). 7. Determinaciones inmunológicas El trabajo de marinero implica una amplia variedad de exposiciones algunas de los cuales contienen alergenos capaces de producir sensibilización de tipo IgE. Por ello, se realizarán (a) pruebas cutáneas a alergenos ambientales Dermatophagoides pteronyssinus, gato, Alternaria alternata, (incluyendo Cladosporium herbarum, hierba timotea, abedul y Parietaria judaica) y laborales (alergenos de varios mariscos como almeja, camarón, cangrejo), incluyendo un control positivo (histamina) y negativo; y (b) se determinará IgE total y específica contra alérgenos comunes (Dermatophagoides pteronyssinus, gato). Esto ayudará a definir el estatus 20 atópico para identificar grupos susceptibles con relación a efectos irritativos respiratorios. 8. Sintomatología Se incluirán en la entrevista preguntas estandarizadas y validadas para caracterizar el estado de salud respiratoria de los sujetos (patología y tratamientos) y síntomas potencialmente relacionados con la exposición estudiada. 9. Determinación de la exposición a fuel del ‘Prestige’ Teniendo en cuenta los resultados del estudio ya en marcha sobre exposiciones en personas que están limpiando el fuel, promovido por el Ministerio de Sanidad y Consumo, y la evaluación realizada por el higienista industrial, se desarrollará una lista de preguntas sobre tareas con el fin de estimar de manera retrospectiva la exposición inhalatoria a fuel. Estas preguntas incluirán detalles del tipo y de la duración de las tareas, productos de limpieza utilizados, el uso de agua a presión y aplicación de medidas de control. 10. Otras exposiciones laborales y ambientales En la entrevista se obtendrán datos sobre factores de riesgo de trastornos respiratorios, en particular exposición a irritantes u otras sustancias capaces de provocar inflamación respiratoria y antecedentes familiares y personales de patologías respiratorias. Se detallará la historia laboral mediante preguntas estandarizadas, y las características laborales. El cuestionario incluirá además numerosas preguntas relativas a otras exposiciones individuales (como tabaco) o ambientales (tales como animales domésticos o contaminación atmosférica) las cuales pueden actuar como factores de confusión o como modificadores del riesgo estudiado. 21 11. Células de la sangre, fragmentación del ADN, separación de linfocitos. Fragilidad cromosómica Se extraerán 20 ml de sangre periférica que serán vehiculizadas a través del Hospital Juan Canalejo de A Coruña. En todos los casos, el procesado de la muestra se realizará en el laboratorio de la Unidad de Biología de la Facultad de Medicina de la Universidad Autónoma de Barcelona. En este mismo centro se realizarán los cultivos, el análisis de fragilidad cromosómica y la identificación de alteraciones cromosómicas. Estos trabajos serán realizados básicamente por personal con cargo al proyecto (un técnico y un becario con dedicación exclusiva), y por una persona (dedicación parcial) responsable de la coordinación, interpretación y discusión de los resultados obtenidos. Las muestras que se reserven para el estudio de aductos de ADN se almacenarán en el Hospital Juan Canalejo. Muestras: Sangre periférica (2-4ml) recogida en heparina sódica al 0.1% en condiciones estériles. El envío de las mismas se realizará lo antes posible, debiendo ser iniciado su procesado antes de las 48 horas post-extracción. Cultivo de linfocitos y obtención de preparaciones: se procederá a partir de 0.5-1ml de sangre periférica recogida en heparina sódica, al cultivo de linfocitos durante 72 horas en medio RPMI-1640 complementado con un 20% de suero fetal y un 5% (0.06 microg/ml) de fitohemaglutinina, añadiendo colcemid (0.06 microg/ml) los 20 minutos finales de cultivo. Cultivo para la inducción de fragilidad cromosómica: La fragilidad cromosómica se estudiará añadiendo afidicolina (0.2 molar) durante las últimas 24 horas de cultivo, previa renovación del medio de cultivo. Se procesará el resto como en el caso de un estudio citogenético convencional. 22 Análisis de la fragilidad cromosómica: Se realizará a partir de las preparaciones cromosómicas teñidas uniformemente con Leishman procedentes de ambos tipos de cultivos . Se procederá al recuento del número de 'gaps' y roturas observados en un mínimo de 100 metafases de buena calidad (cromosomas bien extendidos, con las mínimas superposiciones y con buena morfología). Identificación de alteraciones cromosómicas a partir de preparaciones de metafases mediante las técnicas de bandas G y FISH. Las técnicas FISH se desarrollaran utilizando sondas comerciales diferentes, principalmente pintado cromosómico (MFISH) y sondas teloméricas (subtel-M-FISH), de acuerdo con los protocolos indicados por las casas comerciales. Una vez las preparaciones han sido sometidas a la técnica de bandas G o de FISH se procederá a la captura de imágenes para su posterior análisis. Disponemos de microscopios equipados con software específico (Cytovision-Ultra / Vysis) para el cariotipazo de las imágenes obtenidas mediante bandas G. También disponemos de microscopios de epifluorescencia con un equipo de “M-FISH” (Vysis) que permitirá la captura de imágenes fluorescentes para todos los cromosomas al mismo tiempo. RECOGIDA Y ANALISIS DE LOS DATOS 1. Aproximación de la población y realización de las encuestas y las pruebas médicas Se contactará con las 63 cofradías gallegas para recoger datos de los marineros asociados y definir la población diana. Para ello se enviará un cuestionario por correo, con posterior seguimiento telefónico. En la segunda etapa, se contactará con los sujetos que cumplan los criterios definidos en la primera etapa. Se facilitarán equipos móviles para la realización de 23 las entrevistas y de las pruebas médicas en casas del mar. Para garantizar la calidad y la consistencia de la información recogida, se evaluará la consistencia entre los entrevistadores y las pruebas médicas realizadas por diferentes enfermeras con diferentes equipos. Un analista de datos realizará la entrada, la depuración y la edición de la base de datos utilizando programas estadísticos apropiados. 2. Análisis de los datos Sobre los datos obtenidos en la PRIMERA ETAPA se realizará un primer nivel de análisis basado en las comparaciones entre personas que han realizado limpieza y recogida del fuel y personas sin dicha exposición, y se estimará el exceso de riesgo de síntomas respiratorios asociado a los trabajos de limpieza y recogida. El análisis incluirá la estimación del riesgo crudo y del riesgo ajustado mediante el cálculo de las razones de tasas de prevalencia (prevalence rate ratios). Las variables consideradas como confusoras y modificadoras del efecto potencialmente relevantes se determinarán a partir del análisis univariado y de la literatura científica existente. Para el análisis multivariante se utilizarán modelos log-lineares [Skov et al, Int J Epidemiol 1998;27:91-5]. Se identificará la población que cumpla los criterios para ser incluida en la segunda etapa. Sobre los datos obtenidos en la SEGUNDA ETAPA se realizarán análisis de las variables de alteración tanto aplicando definiciones clinicamente relevantes (hiperreactividad bronquial, cierto nivel de inflamación), como indicadores continuos (‘pendiente’ resultado de la broncoprovocación [Chinn S, et al, Eur Respir J 1997;10:2495-501]; concentración de células inflamatorias). Se estimarán las asociaciones entre las distintas tareas de limpieza y recogida del fuel, y las variables relacionadas con los indicadores la salud respiratoria mencionada. 24 PODER ESTADISTICO Asumiendo una tasa de respuesta de 80% (incluyendo seguimiento telefónico) se prevé tener en la PRIMERA ETAPA datos sobre unos 4.000 marineros. Si se supone entre ellos aproximadamente 2000 expuestos y 2000 no expuestos, se podrá demostrar con un poder del 80% y un nivel de significancia del 95%, un riesgo relativo entre 1.2 y 1.4, dada una prevalencia del síntoma entre el 5% y el 20%. En análisis de la SEGUNDA ETAPA (500 expuestos y 500 no expuestos), se puede demostrar con un poder del 80% y un nivel de significancia del 95%, un riesgo relativo entre 1.4 y 2.0, dada una prevalencia de la alteración entre el 5% y el 20%. ASPECTOS ETICOS Dado que el presente estudio incluye personas, así como la obtención de muestras biológicas y de administración de metacolina, todas los sujetos participantes deberán firmar una hoja de consentimiento informado después de conocer de manera adecuada los fines, las características y los riesgos que supone su participación. Se firmará una hoja independiente para la extracción y análisis de material genético. Se seguirán las normas descritas en la Ley Orgánica de Protección de Datos de Carácter Permanente (Ley 15/1999 de 13 de Diciembre de 1999). Esto garantiza la confidencialidad de los datos, el tratamiento de los datos de manera estrictamente anónima, y la disponibilidad de los propios datos sobre la salud para los sujetos participantes.El proyecto ha sido valorado positivamente por el Comité Ético de Investigación Clínica de Galicia. 25 EXPERIENCIA DEL EQUIPO INVESTIGADOR En los últimos años el grupo de Neumología del Hospital Juan Canalejo de A Coruña ha participado activamente en proyectos de investigación sobre salud respiratoria y desarrollado líneas de trabajo con especial énfasis en la epidemiología y manejo clínico de neoplasias respiratorias y enfermedades obstructivas de la vía aérea, con interés especial en polución ambiental( en colaboración con el IMIM). También forma parte de la red del FIS "Nuevos modelos de prestación de servicios sanitarios utilizando telemedicina”. Desde 1984 la Unidad de Investigación Respiratoria y Ambiental (URRA) del Instituto Municipal de Investigación Médica (IMIM) viene realizando estudios epidemiológicos sobre enfermedades respiratorias y especialmente sobre su prevalencia y etiología ambiental. En los últimos 10 años el grupo ha trabajado intensamente en el Estudio Europeo de Salud Respiratoria (ECRHS) siendo el responsable de la coordinación de 5 grupos en España. Dentro de esta línea de trabajo y en relación al presente proyecto, cabe destacar los avances realizados en la estimación del riesgo atribuible de asma a la exposición laboral en la población general (Kogevinas M et al, Lancet 1999; 353: 1750-1754). El grupo de Neumología del Hospital Clínic de Barcelona (HCB) viene colaborando desde 1984 con estudios epidemiológicos, entre los que cabe destacar la caracterización del asma por soja y el Estudio Europeo de Salud Respiratoria. Estos estudios se han extendido al análisis sobre estandarización de la función pulmonar y el estudio longitudinal de la función pulmonar en individuos de referencia. Se han desarrollado actividades conjuntas con el IMIM en la valoración de la calidad de vida en la EPOC y en la evaluación de servicios sanitarios. El grupo del Servicio de Neumología del HCB tiene un fuerte programa de investigación dentro del área de la 26 Fisiopatología Pulmonar Aplicada y la Neumología Clínica. Como resultado de esta actividad se han efectuado de forma continuada contribuciones a la literatura con un significativo impacto a nivel internacional. El HCB dispone de la instrumentación necesaria para el análisis de las muestras del condensado del exhalado pulmonar: peróxido de nitrógeno, nitritos/nitratos, 8-isoprostano y citocinas. Miembros de nuestro laboratorio han sido entrenados en esta metodología en el ELEGI Colt Laboratory, Edimburgh University (Prof. W. McNee). El departamento de Biología Celular, Universidad Autónoma de Barcelona tiene una experiencia de casi treinta años en el campo de la Citogenética. Este grupo ha sido reconocido como “grupo consolidado” en los diferentes programas de Ayudas a Grupos de Investigación Consolidados convocadas por la CIRIT (Generalitat de Catalunya). Los estudios de Fragilidad Cromosómica se iniciaron en 1982 (tesis dosctoral Carme Fuster). Desde el año 1990 se están aplicándo las técnicas de FISH en las distintas líneas de investigación y la de M-FISH multicolo (24 colores)desde el 2000. La Dra. Isabel Isidro trabaja desde 1980 en el Servicio de Neumología Ocupacional del Instituto Nacional de Silicosis y ha realizado desde esa fecha muchos estudios epidemiológicos en Asturias, León, Palencia y Ávila, centrados fundamentalmente en la minería del carbón, explotaciones a cielo abierto, canteras de granito, asma ocupacional, asbesto, fábrica de armas, fundición, trabajadores de astilleros, etc.Tiene experiencia en enfermedades ocupacionales respiratorias y en realización de estudios epidemiológicos en diversos colectivos de trabajadores. La Sociedad Española de Neumología y Cirugía Torácica (SEPAR) es una sociedad científica fundada en 1967 que engloba a la práctica totalidad de los neumólogos y cirujanos torácicos del país (cerca de 2.500 socios). SEPAR destina anualmente a 27 través de su fundación (Fundación Respira) el 50% de su presupuesto (300.000 €) a la financiación de proyectos de investigación (uni y multicéntricos). Con objeto de dar un nuevo impulso estratégico a la investigación respiratoria, en Diciembre de 2001 SEPAR ha aprobado el Centro Respira de Investigación (CRI), formado por una red de centros interesados en la investigación respiratoria con los siguientes objetivos: (1) estimular y facilitar la coordinación entre los principales grupos de investigación existentes en el seno de la sociedad para que desarrollen más y mejor investigación, especialmente de tipo multicéntrica y multidisciplinaria; (2) favorecer la participación de centros con menor tradición investigadora para potenciar y facilitar su desarrollo; y (3) creación de un programa de formación en investigación. El proyecto CRI ha permitido la participación con éxito en la reciente convocatoria del Insituto de Salud Carlos III sobre redes temáticas de investigación cooperativa (RTIC), fruto de lo cual ha sido la evaluación, aprobación y financiación de la denominada Red Respira (RTIC C03/11). 28