Genòmica, Proteòmica i Bioinformàtica

Genómica, Proteómica y Bioinformática
Prácticas Genómica
Curso de Postgrado Enero 2005
Ricard Albalat, [email protected]
Neus Cols, [email protected]
Grup de Genètica Molecular
Departament de Genètica
Universitat de Barcelona
2
INTERACCIONES PROTEICAS
A partir de los proyectos genoma se ha identificado un gran número de genes, sin embargo se desconoce su función en
la mayoría de los casos. Para descifrar estas funciones, se han desarrollado varias aproximaciones experimentales
conocidas genéricamente como genómica funcional. Una de estas se basa en el análisis de interacciones proteicas
dado que la mayoría de procesos biológicos se basan en interacciones y reconocimiento entre proteínas. Existen
básicamente dos estrategias para estudiar estas interacciones:
 El sistema de dos híbridos o “two-hybrid system”
 La coprecipitación de proteínas
Actualmente existen proyectos de dos híbridos a gran escala cuyo objetivo es determinar el interactoma de un
organismo. No obstante, las interacciones detectadas con esta metodología no garantizan su relevancia biológica y por
tanto deben ser verificadas mediante técnicas de proteómica ‘clásica’ como la unión y coprecipitación in vitro de
proteínas sobrexpresadas.
El objetivo de estas prácticas es, a partir de ejemplos concretos, introducir al alumno en estas metodologías, dos
híbridos y coprecipitación, familiarizándolo técnica y conceptualmente en estas técnicas para que, eventualmente,
pueda aplicarlas en proyectos a gran escala.
ANÁLISIS DE INTERACCIONES PROTEICAS MEDIANTE "TWO-HYBRID SYSTEM" EN LEVADURAS
Los ensayos de two-hybrid pueden utilizarse para identificar proteínas que interaccionan con una proteína de interés y
los genes que las codifican o para delimitar segmentos o dominios de una proteína responsables de la interacción con
una proteína conocida.
La base experimental del método se basa en tres elementos: i) la presencia en los cromosomas de levadura de un gen
reporter o reportero que se halla bajo el control de un promotor mínimo y una región reguladora (operador), ii) una
proteína que contiene un DBD (DNA Bindind Domain) que reconoce y se une a una serie de elementos de secuencia
contenidos en el operador y iii) una dominio activador de la transcripción el cual, sin embargo, es incapaz de unirse
directamente al DNA. Por tanto, para que se produzca la expresión del gen reportero es necesario que se establezca
una interacción entre la proteína que contiene el DBD con la proteína con capacidad activadora. Esta unión se consigue
si en la levadura existen:
a) una proteína de fusión entre el dominio DBD y la proteína X
b) una proteína de fusión entre el dominio activador y la proteína Y
c) la interacción entre las proteínas X e Y
Así pues, la expresión del gen reportero en las células de levadura se interpreta como la capacidad de las proteínas X e
Y de interaccionar.
3
En estas prácticas se utilizará la cepa de S. cerevisiae L40, el genotipo de la cual es:
MATa trp1 leu2 his3 LYS2::lexA-HIS3 URA3::lexA-lacZ.
Esto significa que hay dos genes reporteros: His3 y lacZ, ambos clonados a continuación de la secuencia reconocida
por la proteína LexA.
Este sistema fue desarrollado por Paul Bartel y Stanley Fields, y consta de los siguientes vectores, todos ellos "shuttle
vectors" de E.coli i S. cerevisiae:
1.
2.
3.
4.
pBTM116: codifica para a la proteína LexA de E.coli que se une a una secuencia específica de DNA
pBTM116-DA: Fragmento de 200 pb del gen daughterless (Da) clonado en el plásmido pBTM116 que codifica para
la proteína de fusión LexA-Da
pVp16: codifica para el activador de la transcripción Vp16 del virus del herpes simple.
pVp16-MyoD: Fragmento de 300 pb del gen MyoD clonado en el plásmido pVp16 que codifica para la proteína de
fusión Vp16-MyoD.
TWO HYBRID
INOCULACIÓN DE LA CEPA DE LEVADURA L40
1. Inocular una colonia de levadura L40 en un tubo con 3 ml de medio YPAD -glucosa
2. Incubar O.N. a 30° C en agitación
Día 1:
TRANSFORMACIÓN DE LEVADURA
1. Verter los 3 ml de cultivo O.N. en 30 ml de medio YPAD-glucosa. Incubar a 30°C en agitación durante 1 hora
2. Dispensar 15 ml de cultivo en un tubo falcon de 15 ml y centrifugarlo a 2500 rpm durante 10’ a temperatura
ambiente. Descartar el sobrenadante
3. Resupender el pellet utilizando el vórtex. Añadir 15 ml TEX1. Vórtex 10” Centrifugar a 2500 rpm 5’ a temperatura
ambiente. Descartar el sobrenadante
4. Resuspender el pellet en 300 l de 100 mM Acetato de litio/TEx0.5. Incubar 10’ a temperatura ambiente
5. Preparar cuatro eppendorf con las siguientes combinaciones de plásmidos:
A)
10 µl de pBTM-Da
y
10 µl de pVp16-MyoD
B)
10 µl de pBTM-Da
y
10 µl de pVp16
C)
10 µl de pBTM116
y
10 µl de pVp16-MyoD
D)
10 µl de pBTM116
y
10 µl de pVp16
6. Añadir 15 µl de solución de ADN de esperma de salmón desnaturalizado (10 µg/µl) a cada tubo y 100 µl de las
levaduras tratadas. Mezclar con una micropipeta
7. Añadir 700 µl de 100 mM LiAc/40% PEG-3350/TEX1. Homogeneizar. Incubar a 30° C durante 30’
8. Añadir 88 µl de DMSO. Homogeneizar. Shock térmico: Incubar a 42° C durante 7’
9. Centrifugar 10”. Descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 1 ml de TE
10. Centrifugar 10”. Descartar el sobrenadante. Resuspender el pellet en 200 µl de TE
11. Dispensar 40 µl de la suspensión de levaduras y añadir 160 µl de TE en un eppendorf y sembrar en las placas UTL
(negro)
12. Sembrar el volumen restante (aprox. 160 µl) de la suspensión de levaduras en las placas THULL (rojo)
13. Incubar las placas a 30° C durante 4 días
Día 3:
ENSAYO CUALITATIVO DE ACTIVIDAD BETA-GALACTOSIDASA
1. Poner los filtros de nylon de aproximadamente 5 cm x 5 cm sobre les colonias de levadura a analizar. Dejarlos 1’
2. Retirar los filtros con cuidado y ponerlos con las colonias hacia arriba dentro de nitrógeno líquido durante 10”.
Sumergirlos completamente durante 10” más. Sacar los filtros y dejarlos a temperatura ambiente hasta que estén
descongelados
3.
Preparar placas de Petri para la reacción: En la tapa de cada placa mezclar 2,5 ml de tampón Z y 65 µl de X-gal
(20 mg/ml). Poner un papel Whatman #1 de manera que quede empapado con la solución anterior
4.
Poner los filtros sobre el papel Whatman con las colonias hacia arriba procurando que no queden burbujas.
Taparlos con la base e incubar a 37°C
INOCULACION DE LES COLONIAS TRANSFORMADAS
1.
Inocular cada una de las colonias que queremos analizar en 3 ml de YPAD-glucosa
2.
Incubar O.N. a 30° C en agitación
Día 4:
ENSAYO CUANTITATIVO DE ACTIVIDAD BETA-GALACTOSIDASA
1.
Transferir 1,5 ml de cada cultivo de levaduras a un eppendorf. Centrifugar 10”
2.
Descartar el sobrenadante y añadir los 1,5 ml restantes de cultivo. Centrifugar 10”
3.
Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón Z
4.
Centrifugar 10”. Descartar el sobrenadante y resuspender el pellet en 1 ml de tampón Z
5.
Determinar la DO-600 nm de una solución de 500 µl de levaduras + 500 µl de tampón Z
6.
Con los 500 µl restantes hacer las siguientes diluciones de las levaduras:
a)
250 µl de levaduras + 750 µl de tampón Z
b)
100 µl de levaduras + 900 µl de tampón Z
También utilizaremos un blanco:
c)
1ml de tampón Z
7.
Añadir 20 µl de 0,1% SDS y 40 µl de cloroformo a cada muestra. Vórtex 10” - 15”.
8.
Añadir 200 µl de una solución de ONPG 4 mg/ml en tampón Z. Vórtex 5”. Incubar a 30°C controlando el tiempo
transcurrido hasta que la solución adquiera color amarillo
9.
Cuando aparezca el color, parar la reacción añadiendo 0,4 ml de 1 M Na2CO3
10. Centrifugar 10”. Determinar la DO-400nm del sobrenadante
11. Calcular las unidades aplicando la siguiente ecuación:
unidades beta-gal = [1000xDO400] / [T x V x DO600]
T = tiempo de reacción (en minutos)
V = volumen utilizado en la reacción (en ml)
6
ANÁLISIS DE INTERACCIONES PROTEICAS MEDIANTE COPRECIPITACIONES DE PROTEÍNAS DE FUSIÓN
En los ensayos de coprecipitación de dos proteínas (X e Y) es necesario disponer de un sistema que permita la
purificación de una de las proteínas (X) para analizar sí la segunda (Y) coprecipita como resultado de la interacción. Una
de las estrategias más comunes es utilizar proteínas fusionadas con Glutatión-S-transferasa (GST-X), las cuales
pueden ser purificadas mediante resinas de sefarosa-glutatión.
En este curso se utilizará la proteína de fusión GST-Da para analizar la interacción con la proteína de fusión (His) 6MyoD. Estas proteínas serán expresadas heterólogamente en dos cepas de E. coli. deficientes en proteasas para
optimizar dicha expresión:
 BL21
 BL21 DE3 (pLys)
Se trabajará con las siguientes vectores de expresión de proteína recombinantes en E. coli:
En estas prácticas utilizaremos 3 construcciones derivadas de estos 2 vectores:
1.
2.
3.
pGEX4T-1 (E. coli BL21): Codifica la proteína GST de aproximadamente 29 kDa de peso molecular.
pGEX-Da (E. coli BL21): Codifica la proteína de fusión GST-Da de aproximadamente 36 kDa.
pRSET-MyoD (E. coli BL21 DE3 [pLys]): Codifica la proteína de fusión (His)6-MyoD de aproximadamente 18 kDa.
COPRECIPITACIÓN
INOCULACIÓN DE E. coli
1.
Inocular una colonia de cada una de las cepas de E. coli que expresan las distintas proteínas de fusión en 3 ml de
medio LB + ampicilina (100 g/ml)
2.
a.
1 tubo pGEX4T-1
b.
1 tubo pGEX-Da
c.
1 tubo pRSET-MyoD
Incubar O.N. a 37° C en agitación
Día 2:
INDUCCIÓN DE LA SÍNTESIS DE PROTEÍNAS Y OBTENCIÓN DE LOS EXTRACTOS PROTEICOS
1.
Diluir 700 l de los cultivos anteriores en 3 ml de LB + ampicilina:
a.
1 tubo pGEX4T-1
b.
1 tubo pGEX-Da
c.
2 tubos pRSET-MyoD
2.
Incubar durante 1 hora a 37° C en agitación
3.
Inducir los cultivos con 1 mM de IPTG durante 2 horas a 37° C en agitación
4.
Transferir 700 l de uno de los cultivos pRSET-MyoD a un tubo eppendorf y centrifugar 10’’
5.
Descartar el sobrenadante y congelar el pellet a –20ºC (será utilizado como control positivo en la
immunodetección)
6.
Dispensar 1,5 ml de cada uno de los cuatro cultivos [GST, GST-Da y His-MyoD (x2)] en un tubo eppendorf y
centrifugar 10’’. Decantar el sobrenadante y añadir 1,5 ml más de cada uno de los respectivos cultivos. Centrifugar
10’’ y volver a decantar el sobrenadante. Añadir el resto de cultivo, volver a centrifugar y decantar el sobrenadante.
7.
Resuspender el pellet con vórtex. Añadir 600 l de tampón BBB (bead binding buffer + inhibidores de proteasas
Roche) + 25 l de lisozima (10 mg/ml) + 1 l de DNAsa (10 mg/ml). Homogeneizar con vórtex. Congelar los tubos
sumergiéndolos en nitrógeno líquido durante 1’
8.
Descongelar los tubos a temperatura ambiente. Vórtex 10’’ y centrifugar 5’
9.
Transferir el sobrenadante a un nuevo tubo eppendorf
UNIÓN IN VITRO Y COPRECIPITACIÓN
1.
Homogeneizar la suspensión de sefarosa-glutatión y dispensar 150 l en un tubo eppendorf
2.
Centrifugar 5’ a 2000 rpm y descartar el sobrenadante con una micropipeta
3.
Añadir 1 ml de PBS frío, centrifugar 5’ a 2000 rpm y descartar el sobrenadante con micropipeta
4.
Añadir 100 l de PBS frío y homogeneizar con micropipeta antes de dispensar los 100 l en las combinaciones
descritas en el siguiente apartado (#5)
5.
Para la unión in vitro y coprecipitación combinar:
TUBO A: 600 l GST-Da + 600 l His6-MyoD + 100 l de sefarosa-glutatión
TUBO B: 600 l GST + 600 l His6-MyoD + 100 l de sefarosa-glutatión
6.
Agitar en el orbital durante 1 hora a temperatura ambiente
7.
Centrifugar 2’ a 2000 rpm.
8.
Descartar el sobrenadante con micropipeta procurando no arrastrar la resina.
9.
Añadir 1 ml de tampón BBB y centrifugar 2’ a 2000 rpm
8
10. Repetir los apartados #8 y #9 dos veces más.
11. Descartar los restos de líquido con una micropipeta
12. Añadir 35 l de glutatión reducido a cada tubo. Incubar 10’ a temperatura ambiente. Centrifugar 2’ a 2000 rpm.
Recuperar el sobrenadante en un nuevo tubo
13. Repetir el paso anterior dos veces más, recuperando cada vez la proteína eluida de cada combinación en el tubo
correspondiente
14. Dispensar 20 l de los tubos en que hemos recogido la proteína eluida en un nuevo tubo. Guardar los seis tubos,
incluidos los que contienen los restos de la matriz de sefarosa-glutatión, congelados a -20ºC
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA (Separador)
1.
(Utilizar guantes)
Preparar el gel separador (12.5 %). Para un volumen de 5 ml:
2.1 ml de solución de acrilamida stock (29:1)
1.25 ml de solución 1.5 M Tris HCl pH 8.8
1.5 ml de H2O destilada
50 µl de SDS 10%
5 µl de TEMED
50 µl de Persulfato Amónico (APS) 10%
2.
Mezclar los componentes para obtener una solución homogénea y añadir aproximadamente 3,6 ml de esta solución
entre los cristales montados previamente
3.
Añadir rápidamente y con cuidado H2O destilada hasta el límite del cristal pequeño
4.
Dejar polimerizar aproximadamente 30’ a temperatura ambiente
PREPARACIÓN DEL GEL DE POLIACRILAMIDA (Concentrador)
1.
Decantar el agua y secar los restos que hayan quedado
2.
Preparar el gel concentrador (4%). Para un volumen de 2.5 ml:
0.32 ml de solución de acrilamida stock (29:1)
0.62 ml de 0.5 M Tris HCl pH 6.8
1.5 ml de H2O destilada
25 µl de SDS 10%
2.5 µl de TEMED
25 µl de Persulfato Amónico (APS) 10%.
3.
Mezclar y añadir sobre el gel separador el volumen necesario de solución concentradora hasta el límite superior de
los cristales
4.
Colocar los peines de 10 pocillos y dejar polimerizar
Día 3:
ELECTROFORESIS (PAGE-SDS)
1.
Preparar 250 l de tampón de carga de proteinas/100 mM DTT.
2.
Descongelar los tubos con las diferentes muestras a analizar
3.
Añadir 20 l del tampón de carga a los tubos que contienen los de 20 l de la proteína eluida.
4.
Añadir 30 l del tampón de carga a los tubos que contienen la matriz de sefarosa glutatión
5.
Añadir 100 l del tampón de carga al pellet bacteriano del cultivo His6-MyoD guardado a –20ºC del apartado #4
del protocolo de Inducción de la síntesis de proteínas y obtención de los extractos proteicos
6.
Incubar los tubos en un baño a 100°C durante 5’
7.
Centrifugar 5' a 13000 rpm
9
8.
Montar el gel de acrilamida en el soporte de electroforesis. Preparar 300 ml de Tampón de electroforesis x1
9.
Cargar las muestras en el gel en el siguiente orden:










15 µl Extracto His6MyoD (Control positivo)
20 µl Interacción GST-Da/His6MyoD
20 µl Interacción GST/His6MyoD
20 µl Matriz Interacción GST-Da/His6MyoD
5 µl Marcador de peso molecular
5 µl Marcador de peso molecular
20 µl Matriz Interacción GST-Da/His6MyoD
20 µl Interacción GST/His6MyoD
20 µl Interacción GST-Da/His6MyoD
20 µl Extracto His6MyoD (Control positivo)
10. Correr la electroforesis a 200 voltios hasta que el azul de bromofenol llegue a la base del gel
11. Dividir el gel en dos mitades. Transferir una mitad (ver siguiente apartado) y teñir la otra con azul de Coomassie
12. Desteñir con una solución de ácido acético/metanol
TRANSFERENCIA A MEMBRANA PVDF: WESTERN-BLOTTING
1.
Sumergir el gel en la solución de transferencia
2.
Recortar 4 papeles Whatman y la membrana de PVDF de 4.5 cm x 6.0 cm
3.
Hidratar la membrana en metanol durante 2"
4.
Sumergir la membrana y los papeles Whatman en la solución de transferencia
5.
Montar el western en el equipo de transferencia semi-dry en el siguiente orden, comprobando que no queden
burbujas de aire:




2 papeles Whatman
gel
membrana
2 papeles Whatman
(-)
(+)
6.
Conectar el equipo a 20 voltios 30 minutos
7.
Desmontar el western y separar el gel de la membrana-PVDF
8.
Saturar la membrana incubándola a 4°C en agitación durante toda la noche en una solución de PBS con un 10%
de leche en polvo desnatada
Día 4
IMMUNODETECCIÓN
1.
Incubar la membrana con el anticuerpo anti-His6-Peroxidasa (Sigma) diluido en MTP (1:3000), durante 1-2 horas a
temperatura ambiente en agitación suave
2.
Preparar 300 ml de MTP. Eliminar el exceso de anticuerpo lavando 3 veces con 100 ml MTP durante 5’ en
agitación
3.
Detección enzimática (utilizar guantes):


4.
Preparar la solución de revelado mezclando:
 25 mg de DAB-HCl
 50 ml de PBSx1
 5l d'H2O2 al 30%
Incubar la membrana en esta solución hasta que aparezcan las bandas
Parar la reacción sumergiendo la membrana en H2O destilada y dejarla secar
10
TAMPONES I MEDIOS
1.4 mM KH2PO4
MEDIO LB:
Para 1 litro de medio:
10 g NaCl
5 g Yeast extract
10 g Bactotryptona
Ajustar el pH a 7,2 - 7,4 con NaOH.
Esterilizar en autoclave.
TAMPÓN DE ELECTROFORESIS (x 1)
192 mM glicina
25 mM Trisbase
Generalmente se prepara una solución stock x10
MEDI0 Yc:
Para 1 litro de medio:
1,2 g Yeast nitrogen base
5 g Sulfato amónico
10 g Acido succínico
6 g NaOH
20 g D-glucosa
SOLUCIONES DE AMINOACIDOS:
1) UTL
Para 1 litro:
0,1 gramos de: Ade, Arg, Cys, Lys, Thr
0,05 gramos de: Asp, His, Ile, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val
2) THULL
Para 1 litro:
0,1 gramos de: Ade, Arg, Cys, Thr
0,05 gramos de: Asp, Ile, Met, Phe, Pro, Ser, Tyr, Val
2 mM de 3-amino-triazol
Para preparar medio sólido añadir 20 gr agar/litro
Esterilizar en autoclave
MEDIO YPAD:
Para 1 litro de medio:
10 g Yeast extract
20 g Bactotryptona
20 g D-glucosa
0,1 g Adenina
Hasta 1 litro con agua destilada
Esterilizar en autoclave
TE:
10 mM Tris-HCl pH=8.0
1 mM EDTA pH=8.0
TAMPÓN Z:
60 mM Na2HPO4
40 mM NaH2PO4.H2O
10 mM KCl
1 mM MgSO4.7H2O
Ajustar a pH=7.0
BBB:
50 mM Tampón fosfato potásico pH=7.5
150 mM KCl
1 mM MgCl2
10% (v/v) Glicerol
1% (v/v) Tritón X-100
PBS:
137 mM NaCl
2.7 mM KCl
4.3 mM Na2HPO4.7H20
TAMPÓN DE CARGA DE PROTEÍNAS: (x2)
129 mM Tris-HCl pH 6.8
20% Glicerol
4% SDS
0.2% Azul de bromofenol
SOLUCIÓN DE FIJACIÓN-TINCIÓN
7% Ácido acético
50% Metanol
0.1% Azul de Coomasie R-250
SOLUCIÓN DE DESTINCIÓN
7% Ácido acético
20% Metanol
TAMPÓN DE TRANSFERENCIA
192 mM Glicina
25 mM Trisbase
20% Metanol
TAMPÓN MTP
0.5% Molico
0.05% Tween-20
PBSx1
MARCADOR DE PESO MOLECULAR PROTEINAS