RESISTENCIA A GEMINIVIRUS EN CHILE: CARACTERIZACIÓN

RESISTENCIA A GEMINIVIRUS EN CHILE: CARACTERIZACIÓN DE UN
ESTADIO DE REMISIÓN (PLANTAS RECUPERADAS)
Resumen ejecutivo
La investigación responde al objetivo de caracterizar a nivel molecular el
estadio de remisión que muestran las plantas de chile inoculadas, analizando el
tejido sintomático versus el recuperado, lo cual constó de dos etapas: a)
estudio del ciclo viral en ambos tejidos (cantidad y calidad del DNA viral;
actividad replicativa y transcripcional, eficiencia en movimiento, posible papel
de los siRNA y miRNA, y b) comparación de la expresión génica de la planta
entre los tejidos sintomáticos y recuperados por medio de bancos de cDNA de
ambos tejidos y diferenciales (substractivos); identificación y secuenciación de
cDNA diferenciales.
En el caso del chile no hay materiales comerciales resistentes al geminivirus;
sin embargo, en algunos casos la planta logra defenderse burlando las
estrategias del virus y logra recuperarse (remisión de los síntomas), pero este
fenómeno es muy variable, poco predecible y difícil de estudiar. El investigador
presenta un sistema reproducible de recuperación de plantas infectadas
después de haber sido infectadas por geminivirus (PepGMV o PHV), el cual
constituye una oportunidad para estudiar cómo una planta susceptible logra
evitar las estrategias de los virus mostrando una recuperación importante. La
caracterización de ese sistema de recuperación permite desarrollar estrategias
de control de enfermedades por geminivirus aun en materiales susceptibles
La caracterización del ciclo viral se llevó a cabo en dos estadios: sintomático y
remisión. Se evaluaron los siguientes aspectos: procedencia de los sRNA de
origen viral y especificidad de los sRNA.
Primero se determinó de qué parte del genoma viral proceden los sRNA, para
lo cual fueron extraidos del gel, marcados con radiactividad e hibridados contra
diferentes fragmentos del genoma viral para ver si la población de sRNA
proviene de todo el genoma o se obtienen preferencialmente de un área
específica.
Para determinar la especificidad de los sRNA se realizaron experimentos de
hibridacón molecular. Los siRNA fueron extraídos, separados y marcados para
ser usados como sondas en experimentos de hibridación con RNAd extraídos
de diferentes plantas infectadas con dos virus diferentes y sus controles de
plantas no infectadas.
Los siRNAs obtenidos fueron específicos contra el virus del cual provenían aun
cuando hay regiones altamente conservadas entre los virus. Esto significa que
los siRNA no son generados al azar y no se inducen de todas las regiones del
genoma viral.
Después se procedió a la comparación de la expresión génica en plantas
infectadas con PepGMV respecto a plantas testigo sin virus. La finalidad fue
encontrar genes de la planta que estuviesen relacionados por una parte con la
infecció geminiviral y por otro lado con la remisión de síntomas. El sistema de
despliegue diferencial fue elegido para tal fin y se realizó en dos tiempos:
tiempos tempranos de la infección (antes de la aparición de síntomas), y
tiempos tardío (donde ya había remisión de síntomas).
El estudio de la expresión de genes se facilita con el uso de genes reporteros,
por eso en esta investigacó se decidió utilizar el gen reportero que codifica para
la proteína verde fluorescente (GFP, por sus siglas en inglés) de la medusa
Aequorea victoria. Este gen presenta varias ventajas sobre los otros genes
reporteros. Una de las ventajas es estructural, ya que el gen está compuesto
de tan sólo 725 pb y la proteína es de 27 kDa. Dicho tamaño reducido simplifica
los proesos de clonación y además permite realizar fusiones traduccionales
conservando una grn parte de la proteína estudiada, resultando al final una
porteína quimérica de un tamaño funcional.
Demanda o problemática que atiende
Estudiar los procesos que componen la resistencia del chile al geminivirus.
Realizar la caracterización de un estadio de remisión de plantas de chile
infectadas con el virus.
Resultados obtenidos y/o descripción. Características de la tecnología
generada
Identificación de genes cuya expresión se modifica durante el estadio de
remisión. Uno de ellos, el DD16, fue caracterizado a profundidad y se logró
identificar un posible factor de transcripción que actúa negativamente sobre un
grupo de genes que responden con el etileno.
Caracterización profunda de los sRNA que fueron estudiados en la primera
etapa, de los cuales se tiene una idea completa de su procedencia en el
genoma del virus.
Además, durante la infección de PHV se sinterizaron transcritos en sentido
complementario que abarcan parte de la región intergénica, lo cual es muy
relevante para el proceso de remisión, ya que sería la base para un proceso
por silenciamiento génico.
Se encontraron evidencias que apoyan la existencia de distintos promotores
para los genes que codifican a Rep y a TrAP.
Rep y a TrAP de PHV A se expresan en una etapa temprana de la infección.
REn de PHV A se expresa en una etapa temprana-tardía de la infección.
CP de PHV A se expresa en una etapa tardía de la infección.
Las células que se expresan en una Rep funcional continúan creciendo, pero
no hay división celular, por lo que son alargadas y grandes.
Las células en suspensión de la línea NT1 son un buen sistema para estudiar
los genes geminivirales, ya que se obtienen resultados similares a los
obtenidos en plantas, en términos de regulación (autoexpresión de Rep y
transactivación de CP mediante TrAP) y de temporalidad de expresión.
Impactos
En la infección de PHV se sinterizaron transcritos en sentido complementario
que abarcan parte de la región intergénica.
Evidencias que apoyan la existencia de distintos promotores para los genes
que codifican a Rep y a TrAP en distintas etapas de la infección.
Costos estimados de la aplicación de los resultados y/o tecnología generada
Esta investigación constituye un avance científico, por lo tanto no es posible
estimar costos de aplicación.
Ámbito de aplicación
Comunidad científica nacional.
Información adicional o comentario
Durante el transcurso de los estudios de remisión resultó importante
determinar más a fondo cómo se expresan las proteínas virales durante la
infección; es decir, determinar si las proteínas virales se expresan todas
simultáneamente o como sucede en otros virus, hay una regulación temporal
en la expresión viral. En el caso de los genimivirus no estaba determinado si
había fases en el ciclo viral y de haberlas, qué proteínas son expresadas en la
fase temprana de la infección y cuáles se expresan en la fase tardía. La
determinación de la expresión viral diferenciada es muy relevante para
determinar cuál o cuáles de las proteínas virales son las responsables de
inducir los genes de la planta hospedera.
Clave del proyecto: SAGARPA 2004-C01-115
Sistema Producto y/o línea estratégica de atención: chile; sanidad vegetal
Investigador: doctor RAFAEL F. RIVERA BUSTAMANTE
Institución: Cinvestav-Irapuato.