S2-MCS21 DAÑO CITOPÁTICO DE CEPAS DE Acanthamoeba

DAÑO CITOPÁTICO DE CEPAS DE Acanthamoeba AISLADAS DE LENTES DE
CONTACTO
*Salazar Villatoro Lizbeth, I.,*Omaña Molina Maritza, *Hernández Martínez Ma.
Dolores, **Castañón Gutiérrez Ma. Guadalupe, *Bonilla Lemus Patricia y
**González Robles Arturo.
*Laboratorio de Microbiología Ambiental-Proyecto CyMA, Facultad de Estudios
Superiores Iztacala UNAM, Av. de los Barrios No. 1. Tlalnepantla, CP. 54090. Estado de
México. E-mail: [email protected]
**Departamento de Patología Experimental, CINVESTAV. Av. Instituto Politécnico
Nacional 2508, Col. San Pedro Zacatenco, CP. 07360 México D.F. E-mail:
[email protected]
RESUMEN
Las amibas de vida libre del género Acanthamoeba pueden comportarse como parásitos oportunistas del
hombre, causando infecciones crónicas fatales en el sistema nervioso central y el ojo en donde ocasionan
queratitis amibiana (QA), infección corneal producida por contacto directo de la amiba con la córnea,
afectando principalmente a usuarios de lentes de contacto.
Con el propósito de conocer los mecanismos de daño que ocasiona Acanthamoeba, se evaluó el potencial
patógeno de dos cepas aisladas de lentes de contacto; Acanthamoeba castellanii y A. polyphaga sobre cultivos
celulares (células MDCK) en diferentes tiempos.
En tiempos tempranos de interacción A. castellanii mostró una adherencia significativamente mayor con
respecto A. polyphaga.
Se realizaron pruebas de patogenicidad en ratones para conocer la virulencia y capacidad invasiva de las
cepas, siendo A. castellanii más virulenta (80%), que A. polyphaga (40%).
A través de microscopia electrónica de barrido se observaron migraciones de trofozoítos a uniones celulares
de las células MDCK así como un efecto citopático el cual consistió en separación celular, lisis y fagocitosis.
Los resultados sugieren que las cepas aisladas cuentan con mecanismos eficientes que les permiten adherirse
y provocar efecto citopático, lo que nos permite inferir los posibles mecanismos que estos organismos llevan a
acabo en la córnea.
1. INTRODUCCIÓN
Las amibas de vida libre, del género Acanthamoeba son protozoos unicelulares microscópicos. Presentan dos
formas de viabilidad biológica; una forma ameboidea clásica, llamada trofozoíto (longitud 15-35 micras) y
otra de resistencia a condiciones adversas del medio, llamada quiste (diámetro 10-15 micras) (Fig. 1).
A
B
Figura 1. Microscopía de luz (contraste de fases) 40X A) Trofozoítos de Acanthamoeba spp. se observan los
acantópodos característicos del género distribuidos a lo largo del cuerpo amibiano (flechas), vacuolas
digestivas y una contráctil prominente (Cabeza de flecha). B) MEB. Quistes maduros se observa la pared
externa del quiste y su ostíolo (Cabeza de flecha).
Su amplia distribución les permite habitar diferentes ambientes; agua dulce, suelo, soluciones limpiadoras de
lentes de contacto y piscinas etc. (Jonh, 1993). En México se han aislado diversas especies de Acanthamoeba
en manantiales de agua termal, aguas intradomiciliarias y de la atmósfera de la ciudad de México (Rivera et
al., 1983 y 1989).
Estas amibas son capaces de vivir como organismos de vida libre y como parásitos oportunistas del hombre,
produciendo desde infecciones leves como una diarrea hasta infecciones crónicas fatales en el Sistema
Nervioso Central, así como infecciones en diferentes órganos (pulmón, riñón, ojos y piel) (John, 1993;
Schuster y Visvesvara, 2004). Recientemente han cobrado gran interés las infecciones oculares producidas
por estas amibas denominada queratitis amibiana (QA), una infección corneal de curso crónico, que se
produce por contacto directo de las amibas con la córnea, hasta el momento no existe un tratamiento adecuado
debido a la alta resistencia de la amiba a diversos fármacos. Afecta principalmente a usuarios de lentes de
contacto, personas sanas expuestas con aguas contaminadas y/o daño corneal producido por un cuerpo extraño
(John, 1993). La primera descripción de queratitis por Acanthamoeba fue reportado por Nagington et al.,
(1974), asociada con traumatismo ocular, sin embargo para los 80’s, la mayoría de los casos (85%)
correspondieron a usuarios de lentes de contacto. Morton y colaboradores (1991), consideraron a las lentes
como la fuente de contaminación y contacto directo con las amibas.
Actualmente se estima que el número de casos de QA superan los 3000 a nivel mundial (Schuster y
Visvesvara, 2004). En México se tiene reporte de al menos 5 casos de QA en el Hospital “Luis Sánchez
Bulnes”, sin embargo se carecen de estadísticas confiables ya que no se considera a esta patología en los
diagnósticos diferenciales iniciales (Omaña, 1997).
Es importante conocer la manera en que las amibas causan daño en la córnea ya que actualmente no se
conocen por completo. De manera general se considera como etapa inicial de la infección, la unión de las
amibas a la córnea. Se ha reportado la existencia de una glucoproteína en la córnea humana, a la cual las
amibas se adhieren (Imbert-Bouyer et al., 2004). Se desconoce también si existen diferencias entre las
especies que producen QA con respecto a su capacidad para adherirse, así como de provocar la infección y
por ende en los tratamientos de cada paciente. Por lo cual este estudio nos permitirá conocer algunos
mecanismos que llevan a cabo estas amibas en cultivos celulares con lo que podremos inferir sobre la manera
en que estas amibas invaden la córnea humana.
2. OBJETIVOS
Determinar algunos de los mecanismos de patogenicidad de Acanthamoeba spp. a través de su interacción con
células MDCK.
 Pruebas de patogenicidad en modelo murino para determinar la virulencia amibiana.
 Determinación cuantitativa de la adherencia a células MDCK de las especies en estudio.
 Evaluación cualitativa del daño citopático que ocasionan las cepas aisladas a la monocapa de células
MDCK mediante microscopía electrónica de barrido
3. MATERIAL Y MÉTODOS
El presente trabajo se llevo a cabo en el Laboratorio de Microbiología Ambiental, perteneciente al proyecto
CyMA de la Facultad de Estudios Superiores Iztacala, en colaboración con el Hospital para evitar la ceguera
en México. Evaluando de manera rutinaria raspados corneales y lentes de contacto de posibles casos de QA,
diagnosticados en el hospital.
Actualmente se trabaja con dos aislados de lentes de contacto determinados hasta nivel de especie de acuerdo
a sus características morfológicas (trofozoíto y quiste) (Page, 1988). Ambas cepas se cultivaron en
condiciones ideales para su crecimiento, a una temperatura de 30 oC y medio idóneo (Bactocasitona y medio
Chang).
Simultáneamente, se llevaron a cabo pruebas de patogenicidad en ratones para evaluar la virulencia y
capacidad invasiva de estas amibas de acuerdo a la metodología de Culbertson (1959). Se trabajó con lotes de
5 ratones machos recién destetados de la cepa CD-1, libres de infecciones, acorde a las normas
internacionales sobre el manejo de animales de experimentación. Las amibas se inocularon vía intranasal
(2x105 trofozoítos/ 20 l de medio de cultivo) y dando seguimiento de las manifestaciones clínicas que los
animales en experimentación presentaban, así como el tiempo que transcurría entre la inoculación y la muerte
de los mismos, extrayendo órganos como; cerebro, hígado, riñón y pulmón a fin de recuperar las amibas y con
ello determinar su capacidad de producir daño en organismos vivos, los ensayos realizaron por triplicado.
Se evaluó la adherencia de estas amibas a cultivos celulares, ya que se considera a ésta como el primer paso
que llevan a cabo las amibas para unirse a la córnea y posteriormente producir la infección. Se utilizaron
monocapas confluentes de células de riñón de perro (Madin-Darby canine kidney MDCK), fijadas con
glutaraldehido al 2.5% en amortiguador de cacodilato de sodio en placas de 96 pozos, interaccionándolas con
75 000 trofozoítos en fase exponencial a diferentes tiempos (5, 10, 15, 30, 45, 60, 120 y 180 min). La
adherencia se determino por el método de ELISA y los ensayos se hicieron por triplicado. Tanto las amibas en
estudio como los cultivos celulares se trabajaron en condiciones de esterilidad y bajo los parámetros
necesarios para su manipulación y observación al microscopio de luz (Ophiphot, Nikon) y al microscopio
electrónico de barrido (Zeiss DSM 982 Gemini).
4. RESULTADOS
Las cepas en estudio fueron aisladas de lentes de contacto, de un paciente con QA y de un paciente
asintomático, detectados en el Hospital “Dr. Luis Sánchez Bulnes”. Las especies correspondieron a;
Acanthamoeba castellanii y A. polyphaga respectivamente.
Pruebas de patogenicidad.
De las dos especies evaluadas A. castellanii fue más virulenta en 80%, con aislamientos positivos en cerebro,
hígado, riñón y pulmón con respecto a A. polyphaga que mostró una virulencia del 40%, aislándose solo de
cerebro y riñón.
Evaluación de la adherencia.
Los resultados obtenidos indican que tanto A. castellanii como A. polyphaga presentan un comportamiento
muy similar, ya que la adherencia se incrementa a medida que pasa el tiempo. Sin embargo A. castellanii
presento una curva de adherencia superior dado que tuvo un mayor número de células adheridas desde los
primeros tiempos de interacción 5, 15, 30, 45, 60, 120 y 180 minutos, con respecto a A. polyphaga que
presentó una menor adherencia lo largo de los 180 min (Gráfica 1).
No de Trofozoítos
120000
100000
80000
A. castellanii
A. polyphaga
60000
40000
20000
0
5
10
15
30
45
60
120 180
Tiempo (min)
Gráfica 1. Curvas de adherencia de A. castellanii (Azul) y A. polyphaga (rosa) a células MDCK a
diferentes tiempos. Interacción en una relación 1:1 en diferentes tiempos. Los resultados muestran promedios
de ensayos por cuadruplicado.
Por microscopía electrónica de barrido, fue posible observar la migración de trofozoítos a las uniones
intercelulares de las células MDCK, así mismo se vio la separación celular llevada a acabo por los trofozoítos
mediante la emisión de sus acantópodos y posteriormente se dio la penetración de la monocapa, y la
formación de amebostoma para fagocitar las células. Observándose un efecto citopático en tiempos largos de
interacción tanto en A. castellanii (Figura 2, 4 y 5) como en A. polyphaga (Figura 3).
Figura 2. Microscopía electrónica de barrido (MEB). Interacción de células MDCK vivas con trofozoítos de
A. castellanii, se observan dos trofozoítos emitiendo amebostomas para fagocitar una célula MDCK (flechas)
A
B
Figura 3. Interacción de A. polyphaga con células MDCK. MEB A) Interacción temprana (30 min), se
observan trofozoítos adheridos a las uniones intercelulares de la monocapa de células MDCK (flecha). B) A
las 2 h de interacción trofozoíto penetrando la monocapa (cabeza de flecha).
A
B
C
D
Figura 4. Interacción de A. castellanii con células MDCK a diferentes tiempos. MEB A) En tiempos cortos
de interacción (30 min), se observan trofozoítos adheridos a la monocapa de células MDCK. B) A 1 h de
interacción migración de trofozoítos a las uniones intercelulares de las células MDCK. C) A las 2 h se observa
daño citopático y zonas desprovistas de células (flechas); D) A mayor aumento trofozoítos adheridos una
célula MDCK emitiendo sus acantópodos (flechas).
AL
Figura 5. MEB. Interacción de 3 h de A. castellanii con células MDCK, se observa efecto citopático, con
evidentes áreas líticas desprovista de células (AL).
5. CONCLUSIONES
Tanto A. castellanii como A. polyphaga, son las especies más comúnmente reportadas como agentes causales
de queratitis amibiana de acuerdo con Nagington y colaboradores, 1974. Dado que la adherencia constituye
un paso crucial en los mecanismos de patogenicidad de las amibas, es decir con la capacidad de producir daño
en la córnea. Se determinaron que no hay diferencias significativas entre las dos especies, mostrando un
comportamiento muy semejante. Desde el patrón de migración y daño hacia las uniones celulares hasta su
adherencia eficiente a las células MDCK, las diferencias observadas están en relación al número de
trofozoítos adheridos a la monocapa, ya que A. castellanii presentó una mayor adherencia concordando con lo
reportado por Morton et al., (1991) que mencionan a A. castellanii como una de las especies con mayor
capacidad de adherencia con respecto a A. polyphaga. Así mismo A. castellanii resulto tener una mayor
virulencia en ratón (80%), siendo capaza de invadir diferentes órganos. Además de que presentó una mayor
adherencia desde tiempos tempranos de interacción y fue capaz de provocar un efecto citopático mayor sobre
las células con respecto a A. polyphaga que mostró un menor daño en los mismos tiempos.
Por microscopía electrónica de Barrido se observo que después de adherirse eficientemente a la monocapa las
amibas se reagrupaban migrando hacia las uniones intercelulares, ocasionando separación celular en la cual se
observa la emisión de acantópodos, que consideramos que a través de estos logran romper la uniones celulares
aunado a la liberación de proteasas, y finalmente se vio la formación de amebostomas para llevar a cabo la
fagocitosis de las células MDCK, dejando zonas desprovistas de células.
De acuerdo a Curson y Brown (1978) cuando no es posible determinar con certeza la virulencia de las cepas
amibianas por medio de la metodología propuesta por Culbertson (1959), se debe recurrir al uso de cultivos
celulares. Por lo anterior la determinación del efecto citopático que producen las amibas de vida libre sobre
cultivos celulares se ha convertido en el método alternativo para evaluar la patogenicidad de cepas amibianas
aisladas de casos clínicos y del ambiente. Las cepas aisladas en este estudio son virulentas aunado a ello el
tiempo que requieren para llevar a cabo daño citopático se pudo evaluar en tiempos cortos de interacción, lo
que sugiere una virulencia mayor a la reportada en otras especies del género Acanthamoeba, ya que en la
mayoría de los trabajos en los que se evalúa el efecto citopático que provocan diversas especies, se ha
encontrado que es necesario que transcurran varios días para observar un daño franco hacia numerosos tipos
celulares (Halenda et al., 1998).
La adherencia de las amibas a la superficie celular, migración hacia las uniones celulares, desprendimiento y
separación celular, así como la posterior fagocitosis de las células recién desprendidas son los mecanismos de
patogenicidad observados en este estudio, sugiriendo un modo similar de acción en la córnea.
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