Infeccion experimental de gatos con Tricomonas foetus aislado

Infección experimental de gatos con Tritricomonas foetus
aislado desde bovinos.
Abstract
Tritricomona foetus es reconocido como el agente causante de la
tricomoniasis venérea en ganado vacuno. Es caracterizado por muerte
embrionaria temprana y piometra post-coital. Además en felinos se
manifiesta como enfermedad crónica y con una diarrea intestinal. Muchos de
los gatos infectados tenían menos de 2 años y rutas específicas de
transmisión desconocidas. Nosotros recientemente demostramos que los
aislados felinos de T. foetus pueden infectar exitosamente a novillas,
resultando en cambios patológicos similares, pero no idénticos a los
reportados como representativos de la tricomoniasis bovina.
En este estudio infectamos experimentalmente 6 gatos menores de 1 año
con aislado bovino (D-1) de T. foetus. Y se infecto 1 gato con aislado felino
(AUTf-1) de T. foetus.
Dentro de 2 semanas el gato infectado con aislado felino dio positivo al
cultivo de T. foetus en muestras semanales de fecas. Al final de 5 semanas
solo 1 gato infectado con el aislado bovino dio cultivo positivo de tricomonas.
En la necropsia los intestinos de cada gato fueron removidos y divididos en 5
secciones (ileon, ciego, colon anterior, medio y posterior). Los contenidos de
cada sección fueron colectados y cultivados. El gato infectado con aislado
felino dio cultivo positivo en ileon, ciego, colon anterior, medio y posterior. 2
de los gatos infectados con aislado bovino dieron cultivo positivo solo en el
ciego. Además cada sección intestinal fue sometida a reexaminación
patológica e histopatológica.
La combinación de resultados indica que existen diferencias demostrables
entre el aislado felino y bovino en base a su infectividad en gatos.
1.- Introducción
Tricomona foetus es el agente causal de la tricomoniasis bovina, una
enfermedad del tracto reproductivo que desencadena infertilidad y abortos
en las vacas infectadas.
Los toros infectados se transforman en portadores crónicos, mientras que
las vacas infectadas pueden eliminar la infección durante 2-6 meses.
Además t. foetus fue recientemente reconocido como el agente de
enfermedades en le intestino grueso de gatos.
En la década pasada el número de reportes de t. foetus que provoca diarrea
del intestino grueso en gatos, se ha aumentado. Encuestas en gatos de
estados unidos y otros países han demostrado que t. foetus en encontrado
en gatos de raza y mestizos, que pueden o no haber tenido contacto con
ganado vacuno.
Los signos clínicos de la enfermedad en gatos infectados incluyen diarrea con
mucus, letárgica, anorexia, y pérdida de peso.
Además los signos pueden incluir diarrea con sangre, tenesmo, flatulencia y
heces malolientes.
La infección de gatos con aislado felino derivado de t. foetus reprodujo
muchos de estos signos clínicos.
En algunos reportes la diarrea asociada con la tricomoniasis ha sido atribuida
a Pentatrichomonas hominis . Sin embargo mas tarde se demostró que t.
foetus fue el agente causal y no P. hominis.
Investigaciones previas han demostrado que el aislado felino de T. foetus
pueden infectar bovinos. Sin embargo genera patologías diferentes a las del
aislado bovino de t. foetus.
Para nuestro conocimiento existen reportes no publicados de infecciones
experimentales de gatos con aislados bovinos de t. foetus. En este estudio
nosotros reportamos los resultados de la infección experimental de gatos con
el aislado bovino de t. foetus.
2.- Materiales y métodos.
2 aislados de t. foetus, uno felino (AUTf-1) recogido desde un gato infectado
naturalmente que llego a la universidad veterinaria de Aurburn, y otro bovino
(D-1) recogido de una vaca con piometra que se infecto naturalmente.
Fueron obtenidos y cultivados en trypticasa-levadura-maltosa(TYM) sin agar.
Estos aislados fueron mantenidos en congelamiento medio de nitrógeno
líquido hasta una semana antes de su uso. El congelamiento medio consiste
en suero fetal de cordero, dimethyl sulfoxidae (DMSO) y TYM medio en 3:2:5
respectivamente. Luego fueron descongelados y subcultivados en TYM
medio a 37º C.
8 gatos domésticos de pelo corto, 6 hembras y 2 machos, con rangos de edad
entre los 8-12 meses, fueron obtenidos del centro de investigación SCOTTRITCHEY. Las muestras fecales fueron recogidas en cada gato para verificar la
ausencia de T. foetus mediante cultivo y PCR.
Los gatos fueron mantenidos en el mismo cuarto, separados en jaulas de
acero.
La luz y temperatura era controlada automáticamente y el cuidado diario y
mantenimiento fue dado por la división del laboratorio de salud animal de la
universidad de medicina veterinaria de Aurburn.
Los gatos fueron acostumbrados alas jaulas por 10 días antes de la infección
experimental.
El ADN de t. foetus fue aislado de muestras fecales por lavado de heces
mediante tri- EDTA(TE) mas sustancia buffer.
Después del ultimo lavado la muestra fue suspendida en TE y la extracción
del dna por PCR fue llevada a cabo por las descripciones de Billiter et al. El
protocolo de PCR con sus modificaciones descrito en Grahn et al. Fue usado
para identificar t. foetus de un cultivo de muestras fecales por amplificación
del espaciador trascrito interno (ITS1).
Los gatos estuvieron en ayunas por 24 horas antes de la inoculación. Para la
infección experimental los gatos fueron sedados usando una mezcla de
medetomidine hydrochloride y butorphanol tartrate más ketamina. En dosis
de 0.075 ml/Kg.
Los aislados AUTf-1 y D-1 fueron lavados y resuspendidos en sustancia
antibiótica y suero fetal bovino (libre d infección) una hora antes de la
inoculación.
6 gatos recibieron 1.5x10^6 tricomonas (D-1) (en 10 ml) por intubación oro
gástrica.
1 gato fue inoculado con 1.5 x10^6 tricomonas (AUTf-1) en similar condición.
1 gato inoculado solo con la solución (medio) sin tricomonas.
Los gatos se recuperaron naturalmente.
Muestras fecales fueron recogidas desde cada gato 3 veces a la semana por 5
semanas. Eran obtenidas por el recto usando una gasa plástica o frescas
desde la caja de arena.
Cada muestra fue inmediatamente suspendida en TYM (2ml) e incubada a
37ºC. Además de la recolección de muestras la consistencia fecal fue
clasificada usando una escala de 1-4 donde 1= diarrea, poco firme o con
sangre. 2= sin forma con charcos. 3= formada, blanda o húmeda. 4= formada
y dura.
Emesis y otros signos también fueron clasificados. Todas las muestras fueron
examinadas a 100x luego de 2 días en cultivo. Las muestras fueron
establecidas como positivas o negativas a la presencia de trofozoitos móviles
de t. foetus y fueron verificadas por PCR. Las muestras negativas se
mantenían por 10 días y rechequeadas cada 2 días.
A la 5º semana post-inoculación (PI) los gatos fueron sedados como
anteriormente. Seguido de la sedacion los gatos fueron eutanasiados por
administración endovenosa de sodio pentobarbital en dosis de 17.7mg/kg.
En la necropsia el ileon, ciego y colon fueron removidos como una sección. El
ileon anterior y colon posterior fueron ligados con hilo de algodón. Las
ligaduras fueron también puestas en ileon posterior, la base del ciego y el
colon anterior. El colon fue luego subdividido en 3 secciones iguales usando
más ligaduras.
Esto nos da un total de 5 partes separadas de intestino: ileon Terminal, ciego,
colon anterior medio y posterior.
Luego 2-5 ml de TYM dependiendo del tamaño y contenido fecal de cada
sección intestinal, fue inyectado dentro de cada sección usando una aguja
estéril y jeringa de 10 ml. Las secciones fueron cortadas y el contenido de
cada sección fue recogido dentro de otro recipiente.
Un mililitro de contenido recogido de cada sección de intestino fue
resuspendido en 5ml de TYM e incubado a 37ºC. Las muestras fueron
examinadas como se vio anteriormente en busca de trofozoitos visibles y
verificando mediante PCR.
Los tejidos para la examinacion histopalogica fueron fijados en 10% de
formalina buffer y teñidos con hematoxilina-eosina.
La inflamación en la lamina propia del ileon, ciego y colon fueron examinados
bajo la luz del microscopio a 100x.
La inflamación fue caracterizada basada en la presencia de linfocitos y
células plasmáticas y su distribución dentro de la lámina propia intestinal.
Fueron evaluadas usando una escala de severidad(- a +) 1= mínima, 2=
moderado, 3= severo o marcado.
3.-Resultados
Tricomonas móviles fueron observadas en cultivos desde muestras fecales
obtenidas desde un gato como control positivo, inoculado con el aislado
felino (AUTf-1), comenzando el día 16 PI. (tabla1).
De los 6 gatos inoculados con el aislado bovino (D-1), solo un gato (n2) dio
cultivo positivo el día 32 PI (tabla1). Los 5 gatos restantes inoculados con el
aislado bovino mantuvieron un estado negativo al cultivo durante todo el
estudio. Ninguno de los 2 gatos (n2 bovino y n7 felino) que dieron positivo,
desarrollo diarrea o vómitos o pérdida de apetito o fiebre durante el estudio.
En el día 9 (PI) un gato (Nº) que fue inoculado con el aislado bovino tuvo
heces blandas con pequeñas cantidades de sangre y mucus y el gato Nº en el
día 21 (PI) tuvo episodios de vomito y fiebre de 39.3Cº, pero ningún gato fue
positivo para T. foetus.
Tricomonas móviles fueron observadas exitosamente en cultivos desde
contenidos intestinales de 2 cultivos fecales de gatos positivos y todos los
resultados fueron verificados por PCR. El gato Nº con el aislado bovino fue
positivo en el ciego. El gato Nº con el aislado felino fue cultivo positivo en el
ileon, ciego, colon medio y posterior.
Además el gato Nº con el aislado bovino dio cultivo positivo en el ciego. Gato
Nº (solo con el medio) dio cultivo positivo en le ileon.
Sin embargo estos fueron resultados erróneos debido a la impropia
etiquetacion de los tubos durante el subcultivo. Que un diagnostico negativo
fuera apropiado para el cultivo fue apoyado por el hecho de que los
resultados de PCR en todas las muestras obtenidas del espécimen original en
la necropsia y muestreos semanales d muestras de heces obtenidas a través
del estudio fueron negativas.
Las muestras de tejidos fueron obtenidas y evaluadas como se describe
debajo de cada sección intestinal. Todas las muestras intestinales fueron
tomadas desde los gatos inoculados con el aislado felino que mostró un
aumento en los linfocitos y células plasmáticas en la mucosa, los cuales
parecían migrar desde las placas de peyer.
Todas las muestras tomadas desde gatos inoculados con el aislado bovino
demostraron lesiones similares, cada gato tenía algún nivel de infiltración de
linfocitos y células plasmáticas en la mucosa de las secciones intestinales,
aunque algunos más notorios que otros.
Las muestras recogidas desde el gato control no infectado mostraron niveles
similares de linfocitos y células plasmáticas sin embargo las placas de peyer y
la mucosa alrededor parecían normales.
4.- Discusión
Los resultados de este estudio sugieren que existen diferencias en la
infectividad y patogenicidad de los aislados bovinos y felinos en los gatos
infectados experimentalmente.
Estos resultados son similares a los de nuestro estudio previo en novillos
infectados con el aislado felino de T. foetus que demostró diferencias
temporales en la infección y severidad de la enfermedad cuando se comparo
con novillos infectados con aislado bovino de t. foetus.
De los 6 gatos inoculados con el aislado bovino solo uno fue positivo en el
cultivo fecal durante las 5 semanas de estudio. Esto ocurrió el último día de
muestreo. El gato inoculado con el aislado felino fue positivo al cultivo fecal a
los 15 días PI.
Los resultados de PCR garantizaron que los cultivos fecales negativos fueron
realmente negativos.
Los cultivos positivos por PCR garantizaron la sensibilidad del método del
cultivo fecal.
Resultados similares fueron obtenidos desde cultivos de muestras del
contenido intestinal del ileon, ciego y colon de cada gato en la necropsia. El
gato inoculado con el aislado felino fue nuevamente cultivo positivo en el
ileon, ciego, colon distal y medio.
De los 6 gatos inoculados con el aislado bovino, solo un gato que fue positivo
al cultivo además era positivo al contenido recolectado del ciego.
Un gato adicional fue cultivo positivo en el contenido del ciego recolectado
pero fue negativo en el cultivo fecal. Estos resultados eran verificados usando
PCR.
Es posible que las tricomonas salgan en heces intermitentemente o en bajo
numero durante episodios de diarrea.
Consecuentemente las técnicas en las muestras in situ podrían ser más
sensitivas que las técnicas del cultivo fecal.
El uso de procedimiento de PCR para detección de tricomonas en contenidos
de órganos o en heces podría esperarse que fuera más sensible que el
cultivo, solo requiriendo una pequeña cantidad de dna y con la capacidad de
diferenciar entre tricomonas diferentes. Esto es importante cuando se
sospecha de infección de poblaciones de tricomonas bajas o mezcladas.
La interpretación de los cambios histológicos en el colon puede ser difícil. Los
linfocitos y células plasmáticas normalmente responden a anfígenos dentro
del lumen del colon.
Una amplia variación en el número de linfocitos y células plasmáticas es
común y puede ser interpretada como una respuesta normal a cualquier
cambio en el micro ambiente enterico. Análisis de cambios histopatológicos
en cada sección intestinal de los gatos revela agregados de linfocitos y
células plasmáticas de igual frecuencia e intensidad en ambos grupos en
tratamiento.
Basado en una investigación anterior el resultado de la infección
experimental sugiere que en infecciones por mayor tiempo podría ser
importante mostrar eventos patológicos diferentes en los gatos.
Estos gatos no estaban libres de patógenos específicos y los cambios
patológicos observados en la mucosa intestinal podría ser una respuesta a
cualquier antigeno intraluminal como antígenos de la comida o antígenos de
una o muchas especies de bacterias y otros microorganismos que viven en el
contenido del colon.
El resultado de este estudio junto con la investigación anterior en bovino
sugiere que existen diferencias en el comportamiento biológico o patológico
de los aislados de bovino y gato que no pueden ser ignorados. Estos datos
sugieren también que la transmisión directa desde bovinos a felinos no es la
primera causa de infección de tricomonas en gatos.
Los 2 estudios nos dan evidencia de que existen diferencias fundamentales
entre los diferentes aislados de T. foetus.
En la opinión de los autores estas diferencias superan lo que uno podría
esperar observar en una variación normal intra-especifica.
ANEXOS
Tabla 1.- Los gatos fueron inoculados con aislado bovino D-1 o aislado felino AUTf-1 de T.
foetus. Un gato (8) no fue inoculado con tricomonas y fue usado como control negativo.
Sobre un periodo de 5 semanas, las 15 muestras fueron tomadas de cada gato,
comenzando al segundo DIA post- inoculación. Todas las muestras fecales fueron
ordenadas desde 3 a 4 (formada, blanda, húmeda, dura). ª Día donde se obtuvo el
primer cultivo positivo.
Tabla 2.- secciones intestinales fueron teñidas con hematoxilina y eosina, y la presencia
de linfocitos y células plasmáticas fueron evaluadas en una escala de aumento de
severidad (1= mínimo, 2=moderado, 3= severo).
Figura 1.- muestras de tejidos tomados en la necropsia de intestinos de gatos infectados
con T. foetus. El aislado felino AUTf-1(A), aislado bovino D-1 (B), y el control no infectado
(C). Imágenes tomadas a 100X.
REFERENCIAS