II. Biología de las células vegetales cultivadas.

VISION FISIOLOGICA DE LA BIOTECNOLOGIA
I.
Introducción.-
Hoy en día la biotecnología abarca un campo muy grande de trabajo. Esta ciencia
viene a ser una fusión entre la fisiología y la biotecnología.
Con el siguiente trabajo, se busca enfocar la parte fisiológica de la biotecnología. También
se busca poner en conocimiento como es que se aplica esta ciencia en la vida cotidiana.
Es muy cierto que la agricultura es una actividad primaria practicada por la
humanidad. El proceso de búsqueda de mejores plantas, es decir, de un mejor rendimiento y
calidad de los productos, ha hecho que el hombre opte por caminos más directos para llegar
a su objetivo, la biotecnología es uno de los caminos por el cual el hombre llega a obtener
nuevas variedades de plantas.
II. Biología de las células vegetales cultivadas.El crecimiento y el desarrollo de las plantas esta controlado por las interacciones
existentes entre el genoma y el medio ambiente, entendiendo por tal el medio intra e
intercelular, así también como la intensidad de luz, temperatura aporte de agua y nutrientes,
etc.
Dentro del organismo, la comunicación intercelular es esencial para un normal
funcionamiento de la planta y se realiza por mecanismos tanto a corta como a larga
distancia. La existencia de conexiones plasmodesmicas significan que el citoplasma de
todas las células de la planta, exceptuando los granos de polen maduros y el embrión, están
en contacto. Otras formas mas especializadas de comunicación a corta distancia incluyen
los canales citomicticos de los meiocitos y o sistemas de reconocimiento, como los
existentes entre los granos de polen y el estigma, el tubo polinico y el ovocito y la raíz y sus
nodulos.
La comunicación a larga distancia incluye el transporte de reguladores de
crecimeiento, iones, metabolitos primarios y secundarios y agua vía xilema y floema.
Dichos sistemas de reconocimiento desempeñan papeles de evidente importancia en la
diferenciación y el desarrollo.
II.1 Determinación.Las células y los tejidos están “determinados” para rutas morfogeneticas y
metabólicas especificas, de modo que, por un proceso ordenado y predecible, forman
órganos y regeneran plantas. La determinación depende, lógicamente, de la propia
naturaleza del tejido, de su estado vegetativo y del tratamiento que ha recibido,
produciéndose, a veces, nuevos fenotipos que perduran en ausencia de los factores
causantes del cambio. Existe una serie de especies que, en estado silvestre, son capaces de
regenerarase a partir de pequeños fragmentos de tejidos cortados. Esto nos muestra la gran
capacidad de plasticidad del desarrollo vegetal.
Otro modelo de determinación estable es el cambio de los tallos de los
espermatófitos (plantas con semilla) de crecimiento vegetativo a reproductivo, inducido
por un estimulo lumínico recibido por las hojas y transmitido al meristemo del tallo.
La determinación en plantas es progresiva y jerárquica. En especies cuyos tejidos,
utilizados para iniciar los cultivos, se hallan en un estado temprano de determinación, los
cultivos mostraran mayor flexibilidad en su desarrollo que en otras especies en estados ya
avanzados de determinación. Por esto hay que tener en cuenta los diferentes estados de
desarrollo de los tejidos y las partes de la planta utilizados para el cultivo con fines
morfogenéticos.
La desorganización es una característica del explante, es decir, del fragmento de la
planta que se va ha cultivar, y que esta asociada a la desorganización física de las células
cultivadas. Al parecer esto esta relacionada a la rotura de la comunicación intercelular(tanto
física como química) que caracteriza a la planta intacta.
El potencial de desarrollo del tejido cambio y se reduce a medida que procede el
estado de determinación. Si embargo estos cambios no siempre son irreversibles, hay varios
tipos de células y órganos, altamente determinados y que son totipotentes si reciben un
estimulo adecuado.
II.2 Competencia.Muchas células vegetales no tienen la capacidad de regenerar nuevas plantas,
aquellas que si tienen esa posibilidad y sufren procesos de morfogenesis cuando tienen el
estimulo adecuado, se dice que tienen competencia.
La competencia de una célula se expresa como la habilidad de esta para la
regeneración de ciertas partes de la planta, por ejemplo, si una célula tiene la facultad de
enraizar fácilmente, no tendrá la misma facilidad de formar retoños.
II.3 Totipotencia.Cada célula posee en su material genético, toda la información necesaria para
especificar cualquier rasgo morfológico, químico y/o funcional de la célula, el tejido y la
planta, durante su ciclo vital. Estas células expuestas a ciertas condiciones, se desarrollan
tipos de organogenesis que excluyen a otros, variando las células cultivadas en su
competencia para la morfogenesis y la sensibilidad a inductores.
II.4 Regeneración y morfogenesis.La regeneración se refiere a la reconstrucción del tejido a partir de una o varias
células. La morfogenesis se comprende el desarrollo de las formas y estructuras de un
organismo o de parte de un organismo.
La regeneración de plantas de células en cultivo depende de la posibilidad de
manipular el proceso de la determinación. Las fitohormonas tienen gran importancia en este
proceso de regeneración por organogenesis, en especial la relación auxina : citoquinina, un
nivel muy bajo de uno de ellos, provoca que la planta presente coloración parda y
posteriormente esa planta llega a morir.
III. Variabilidad
III.1 Mutación.Decimos que una célula ha sufrido mutación cuando el material genético cambia
repentina e inexplicablemente, sin la fusión de gametos. Plantas propagadas de tallos
axilares procesos muestran una proporción de mutación espontanea similar a la que se
produce en las plantas cultivadas por proceloso convencionales. Por el contrario a las
plantas regeneradas de callos y células en suspensión pueden presentar una proporción
variable de anormalidades estructurales o fisiológicas, según la especie de planta, y el
origen y la edad de los cultivos.
Esta variación es de utilidad para el seleccionador, debido a que a veces una
pequeña proporción de las plantas anormales producidas manifiestan caracteres ventajosos
que no se hallan en la planta de origen.
Los tallos adventicios regenerados de tejido de la planta de origen o de callo revelan
mas cambios por mutación que los ápices de tallos axilares, confirmándose así la relativa
estabilidad genética del meristemos organizado del ápice. La estabilidad genética del ápice
de tallo puede deberse, en mayor o menor grado, a su compleja estructura multicelular,
formada principalmente por una túnica simple o múltiple y un cuerpo anterior, que de
mantiene en los meristemos axilares.
Muchas de las mutaciones que ocurren en los cultivos in vitro, son deletéreos, y
cuya expresión determina plantas con reducción de su vigor y normal apariencia.
La variabilidad fenotípica es muy común cuando se trabaja con células indiferenciadas.
En cuanto al cambio genético, este persiste a través de toda la vida de la planta, inclusive es
heredable.
Las variaciones genéticas persistentes (mutaciones) se definen como alteraciones
irreversibles, heredables, sexualmente transmisibles a progenie de las plantas regeneradas
de las células multadas.
Se debería demostrar que las alteraciones se transmiten meioticamente, o bien
poderse reconocer un cambio genético por análisis molecular. El numero de mutaciones
puede ser incrementado tratando las células con mutagenos, como por ejemplo
etilmetilsulfonato (EMS) o nitrosoguanina (Torrey, 1985).
La mayoría de los ejemplos fidedignos de cambios genéticos, estables proceden de
mutaciones de un gen simple, seleccionadas por su resistencia alguna sustancia tóxica, por
ejemplo antimetabolitos, aminoácidos, herbicidas, etc. Los cambios afectan también a
rasgos complejos, multigénicos, como los concernientes al crecimiento, a la anatomía o la
resistencia a enfermedad de la planta.
III.2 Cambios epigenéticos.Los cambios epigenéticos son heredables por mitosis, A diferencia de las
mutaciones, los cambios epigenéticos están frecuentemente dirigidos, es decir, ocurren de
modo regular en respuesta a inductores específicos, son potencialmente reversibles
mediante un proceso igualmente dirigidos, generan fenotipos limitados por los potenciales
genéticos de las células y, por definición, no se transmite meioticamente.
Las células nunca están usando toda la información genética que cargan, algunos genes si
funcionan continuamente, otros solo se utilizan en ocasiones especiales. Muchos cambios
en la expresión de los genes esta regulada por el medio que le rodea, existen ciertos
estímulos que activan la expresión de estos genes, luego que desaparece el estimulo, vuelve
a la normalidad.
Un cambio epigenético puede halarse en tejidos de tabaco y sus necesidades de
citoquinina. El tejido de parenquima de medula de tabaco requiere, para su proliferación
sostenida, auxina y coitoquinina externas, pero por prolongado cultivo, o en condiciones
inductivas especificas, pueden perder su necesidad de citoquinina. El cambio de estado de
necesidad al habituado para citoquinina implica la alteración de la herencia celular, ya que
el fenotipo habituado persiste cuando las células son clonadas. Esta variación heredable,
conocida como habituación a citoquinina es un ejemplo de cambio epigenético.
III.3 Cambios fisiológicos.Además de los cambios mencionados anteriormente, puede haber también cambios
fisiológicos o sensibilidad, que se expresa como una cambio de comportamiento
ocasionado por las condiciones de cultivo; estos cambios ocurren con esterada frecuencia, y
son revestidos cuando el cultivo se vuelve a poner en las condiciones originales.
La variabilidad fisiológica en los cultivos de células vegetales es la más fácil de
aplicar, debido a la rápida reversibilidad del cambio producido.
IV. Fisiología del explante
El tejido explantado deriva de una parte de la planta que tenga per se un crecimiento rápido
o que en un estadio temprano de su desarrollo. Si los explantes se extraen de regiones
progresivamente mas viejas, puede observarse un gradiente de descenso de la capacidad de
producir callos in vitro. Estas diferencias pueden mantenerse de manera estable pero que no
se creen el resultado de ningún tipo de diferencia genética dentro de la planta, se han
descrito anteriormente como epigenéticas. Las células habituadas poseen la capacidad de
poder ser cultivadas en ausencia de auxinas o de citoquininas. Sin embargo, el éxito de la
micropropagación no solo depende de la selección del mejor explante, sino también del
mejor medio de cultivo para dicho órgano o tejido.
IV.1 La edad del explante
Gran parte del éxito de cultivo de tejidos, esta en la edad del explante que va a ser
utilizado para los trabajos. La edad de la planta y el grado de diferenciación del tejido,
muchas veces son están interrelacionados, y pueden producir efectos interactivos cundo se
cultiva in vitro.
Por ejemplo, según los experimentos realizados por Toivonen ty Kartha, en 1988,
quienes trabajaron con Pinus glauca, descubrieron que las plantulas a las que se les extirpo
los cotiledones 7 a 8 días luego de ser plantadas, formaban las primeras yemas adventicias
antes que plantulas cuyas yemas fueron extirpadas luego de los 8 días. Así también la
producción de yemas adventicias en explantes de hojas de Cucumis melo, mostraron mayor
producción en los explantes que tenian un a tamaño entre 0.3 y 0.5mm los cuales tenían 14
días de plantados. Esta propiedad no tenían aquellos explantes que tenían mas de 21 días.
La edad del explante pude clasificarse en cuatro clases:
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Edad del órgano o de la planta desde que ha sido extraída: Es la edad biológica de la
planta, es el tiempo que ha transcurrido desde que la planta comenzó como retoño o
como embrión.
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Edad fisiológica o ontogenética: O fase de crecimiento. Incluye los conceptos de
juvenilidad y adulto.
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El grado de diferenciación: Con este concepto, las partes mas jóvenes de la planta son
células meristemáticas no diferenciadas. Teóricamente se dice que algunas plantas
poseen las células meristematicas siempre en estado juvenil y que podrían vivir para
siempre.
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Periodo de cultivo: Es el tiempo desde que recién se instala el cultivo.
IV.2 Ciclo de crecimiento.El crecimiento de los callos y de las células en suspensión, presenta una serie de
fases de crecimiento que se caracterizan por tener naturaleza sigmoidal, cada fase se
diferencia a la otra, por que presenta cambios en el peso seco, o en él numero de células, en
función al tiempo. Estas fases son:
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Fase de latencia.- Esta fase se inicia cuando la célula es transferida al medio en que se
va a cultivar. Esta célula inicia los procesos metabólicos de división celular, es decir,
mitosis. Hay una gran producción de NAD(P)H y ATP, es decir, el sistema energético
de la célula se activa, las rutas glicoliticas y pentosas fosfatos producen poder reductor.
Estos procesos suceden conforme a los carbohidratos, aportados normalmente como
sacarosa. Además, se incrementa la cantidad de ácidos nucleicos y de proteínas debido,
en parte, a una más eficiente capacidad de translación de los ribosomas. Se incrementa
la actividad de la enzima invertasa, asociada con la síntesis de la pared celular, y el
contenido de RNA celular.
También se ha observado que se incrementa la actividad de la enzima fenilalanina
amonio liasa. Se ha observado también que el nivel de estado de estacionario de RNAs
mensajero, se incrementa al pasar las células cultivadas de un medio carente de 2,4D
(2,4 diclorofenoxiacetico) y NAA (Acido α – naftalenacetico) a otro que si lo
presentaba.
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Fase de división celular.- Una vez que la célula ha sido inducida a la división celular,
esta ocurrirá hasta que uno o más nutrientes comiencen a ser limitante. El aumento en el
número de células precede generalmente al incremento del peso fresco debido al retraso
del aumento del tamaño de la célula.
Llega un momento en que la actividad respiratoria se incrementa significativamente
(medida como consumo de O2) y los niveles de estado estacionario de RNA durante
los tres primeros días de cultivo, suben hasta en un 90%, pero hay una disminución de
los niveles de RNA por célula a causa de del menor tamaño de estas células divididas.
Se produce un incremento en el nitrógeno insoluble en alcohol y de la absorción de
oxigeno, a medida que procede la proliferación celular.
Durante la fase lineal del crecimiento, permanece constante el tamaño celular. La
tasa de síntesis de proteínas y ácidos nucleicos permanece relativamente elevadas.
Las células en suspensión, muestran escasa diferenciación (citodiferenciacion u
organización celular) aparentemente en las fases exponencial y lineal, semejante la
mayoría de ellas a las células meristematicas de ápice de tallo.
Como reflejo de este proceso de desdiferenciacion esta la limitacion impuesta en la
actividad metabólica secundaria comúnmente confiada a la fase estacionaria. En los
cultivos celulares de Hacer pseudoplatanus se demostró la incorporación de
aminoácidos radiactivamente marcados (precursores comunes de proteínas y
compuestos fenolicos)
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Fase estacionaria.- Esta fase se caracteriza por una disminución en la división celular,
actividad respiratoria, síntesis de RNA y proteínas y por un aumento de la proporción
de células vacuoladas. Así también disminuye la actividad de enzimas claves del ciclo
de las pentosas fosfatos.
La diferenciación estructural y la diferenciación bioquímica en la fase estacionaria
se han descrito también por cambios en las actividades de sistemas enzimáticos
particulares.
En algunas especies cultivadas, en especial de las solanaceas, la diferenciación
bioquímica puede estar acompañada por una diferenciación estructural limitada,
especialmente si no hay un aporte de peso fresco, que favorezca a la diferenciación
celular.
Al parecer, la célula cultivada empieza a organizarse estructuralmente y hay un
incremento en la producción de metabolitos secundarios, todo esto sucede al parecer
por la disminución de la división celular. Ambos procesos parecen estar
interrelacionados, y los cambios en la actividad metabólica secundaria, durante la
transformación del explante en células cultivada y en planta regenerada, varia de un
modo que refleja los cambios en la diferenciación estructural.
IV.3 Perdida de la habilidad de regeneración.Ciertos tejidos de callos mantienen la capacidad de regenerar retoños en respuesta a
algún estimulo favorable, incluso pro periodos largos. Según Stimart et al. (1980) obtuvo
regeneración de callos, luego de haber mantenido en cultivo en tres años. Sheridan2974
encontró que la capacidad regenerativa especialmente permanecía en este callo. Los callos
de Dioscorea, solanum nigra, Datura inoxia y Lavandula angustifolia; mantienen la
capacidad de hasta dos años de poder regenerar callos.
En la actualidad aun no se conoce con exactitud la razón por la cual una célula puede
terminar su capacidad de regeneración, pero existen las siguientes posibles causas:
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Variación genética en la población celular: Las células con las cuales se piensa
trabajar, deben tener todas la habilidad de proliferar en un medio favorable de cultivo,
muchas veces dichas células no presentan la habilidad de sufrir morfogenesis.
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Existencia de sustancias promotoras de morfogenesis: Sustancias presentes en el
aislamiento de explantes y que poco a poco van disminuyendo a medida que la planta
crezca in vitro.
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Cambios epigenéticos en el cultivo de células: El genotipo de la célula es conservado
fielmente, pero hay mecanismos reguladores de la información genética que causan
que la morfogenesis sea inactiva y se pierda por completo durante el subcultivo.
V. Biotecnologia aplicada
En esta parte se tratara de dar algunos ejemplos de cómo es que la biotecnología se
aplica en trabajos de mejoramiento.
Por ejemplo el trabajo de Frayssinet, Cardone y Echenique; en 1991, quienes estudiaron el
efecto del cultivo in vitro en la microsporogenesis de dos cultivares de pasto llorón
(Eragrostis), sabiendo que esta planta se propaga generalmente por apomixis, este método
permite de alguna manera generar variabilidad. De este trabajo se concluye entre otras
cosas que una de las variedades con que se trabajo, la Morpa, presenta alteraciones en la
condensación de la cromatina, citomixis, desinapsis y fallas en la formacion de huso. Se
produjo también variaciones en la microsporogenesis que no se encontraron en la planta
donadora del explante. Se concluyo que se debía al nivel de ploidia y al modo reproductivo.
Así también el estudio de los efectos de diferentes métodos de cultivo sobre la
regeneración in vitro de papa var. Chieftain. Este trabajo evalúa la capacidad de
regeneración de explantes de hojas, tubérculos y segmentos de tallo de la variedad
mencionada. Se utilizaron dos métodos de evaluación, en método A, que consistió en que
se utilizo el mismo medio de cultivo con se inicio el experimento, y el método B, donde se
transfirió los callos a un medio de cultivo libre de auxinas antes de la formación de los
brotes. Como resultado se obtuvo una mayor frecuencia de regeneración de discos de
tubérculos con el método A.
M. Tapia V, Wilckens E. Y Campos P., en 1996, hicieron un trabajo sobre regeneración
y organogenesis in vitro de plantas de camote (Ipomoea batata) de Chile. Los objetivos de
este trabajo fueron obtener una metodología para la regeneración in vitro, la induciendo
callo y posterior organogenesis y la caracterización de los puntos de iniciación de la
organogenesis, en explantes de camote provenientes del norte y centro de Chile.
En 1997, Capote R. Y Perez D; hicieron un estudio de la capacidad organogenetica de
diferentes explantes de cebolla (Allium cepa). El objetivo de este trabajo fue estudiar la
capacidad organogenetica de diferentes tipos de explantes de cebolla, con la finalidad de
seleccionar el adecuado para futuras investigaciones relacionadas con las posibilidades de
micropropagación en esta especie.
En 1996, Maritza I. Tapia, estudio la inducción de callo, organogenesis y regeneración
in vitro de plantas de ajo (Allium sativum L.)Se describió un método para la inducción de
callo y organogenesis adventicias en 9poblaciones de ajo provenientes del sur de Chile.
Meristemas de brotes, trozos de tallo y tubérculos meristematicos radiculares (TMR)
obtenidos in vitro fueron incubados en medio básico MS suplementado con 2,4-D con el
propósito de inducir la formación de callo. La presencia de luz tubo una influencia positiva
en el porcentaje de formación y tamaño de callos. Bajo esta condición, el efecto de las
distintas concentraciones de 2,4-D en el proceso de formación y tamaño de callos fue
genotipo dependiente. En ajo rosado Chillan, los TMR produjeron los más altos porcentajes
de formación de callos. Independientemente del genotipo, los callos mostraron una ata
tendencia a la rizogenesis.
También se han hecho investigaciones con cactaceas para zonas áridas. Si bien es
cierto, los sistemas biotecnologicos de propagación es cactaceas, no han sido ampliamente
utilizados como en especies herbáceas. Las razones de este hecho son probablemente el
bajo impacto económico que estas especies aparentemente tienen. Los objetivos principales
que se buscan cumplir al realizar estas investigaciones son:
1. Acelerar procesos de domesticación mediante la propagación masiva de genotipos elite.
2. Reducir tiempo de multiplicación.
3. Obtener grandes cantidades de plantas en forma económica al requerir espacios
reducidos.
4. Tener control sanitario más efectivo.
5. Facilitar el intercambio del germoplasma.
6. Rescatar especies en extinción con alto valor agregado ya que desafortunadamente esta
familia es una de las mas amenazadas con la extinción. (Hunt, 1992; SEDESOL, 1994)
A pesar de que las cactaceas pueden propagarse por métodos convencionales a través de
cortes o semillas, frecuentemente estas practicas presentan dificultades que han hecho
problemático establecer viveros comerciales ya que el costo de producción y sobre todo el
tiempo en que estas especies alcanzan tallas comercialmente atractivas, han ocasionado que
la producción de cactaceas no haya sido desarrollada.
También se han hecho trabajos con orquídeas, las cuales presentan muchas dificultades
para la propagación por semilla, ya que esta no tiene endospermo. La opción de la
biotecnología permite que estas especies puedan permanecer sin peligro de extinción.
VI. Bibliografía
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Serrano G. M, Piñol Serra, T.1991. Biotecnologia vegetal.
FAO/PNUMA. 1996. Técnicas convencionales y biotecnología para la propagación de
plantas de zonas áridas.
Hurtado, D., Merino, M. 1994. Cultivo de tejidos vegetales.
Roca W., Mroginski L,. 1991. Cultivo de tejidos en la agricultura, fundamentos y
aplicaciones.
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http://probe.nalusda.gov.8000/otherdocs/tgc/
www.members.tripod.com/el_diablo/potato.htm#top
INDICE
I.
Introduccion
II.
Biología de las células vegetales cultivadas
II.1 Determinación
II.2 Competencia
II.3 Totipotencia
II.4 Regeneración y morfogenesis
III.
Variabilidad
III.1 Mutación
III.2 Cambios epigenéticos
III.3 cambios fisiológicos
IV.
Fisiología del explante
IV.1 La edad del explante
IV.2 Ciclo de crecimiento
IV.3 Perdida de la habilidad de regeneración
V.
Biotecnologia aplicada
VI.
Bibliografía
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA
DEPARTAMENTO DE HORTICULTURA
PRINCIPIOS DE PROPAGACION DE PLANTAS
VISION FIFIOLOGICA DE LA BIOTECNOLOGIA
ALUMNO : JUAN JOSE CHAU CHU
CODIGO : 970027
Email: [email protected]
PROFESOR : FREDERICK DAVIES
FECHA DE LA PRACTICA: 24 DE NOVIEMBRE DE 1999