3.1.1 Materiales para colectar la muestra

1
TAMIZAJE FITOQUIMICO DE HOJAS Y SEMILLAS DE (Bixa
Orellana)
UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA DE LA SELVA
FACULTAD DE RECURSOS NATURALES RENOVABLES
Av. Universitaria S/n Telef.: 561647, E-mail [email protected]
TANIA GUERRERO VEJARANO 1/
JOSE LUIS PAREDES SALAZAR 2/
1/ Ingeniero Químico, Docente Asociado de la Facultad de Recursos Naturales Renovables
2/ Ingeniero Quimico Jefe de Control de Calidad de MTC Internacional
RESUMEN
En el presente trabajo de investigación se ha realizado el reconocimiento de
Metabolitos Secundarios (Tamizaje Fitoquimico) de hojas y semillas de Bixa
Orellana, utilizando la metodología descrita por (Miranda, 2003) en donde se
encontró que las hojas presentaron escasos alcaloides, cantidad moderada de
flavonoides, abundantes leucoantocianidinas,y una cantidad moderada de
tainos; no se encontró cardiotónicos, saponinas y quinonas, presento una
reacción dudosa para esteroles y/o triterpenos. En las semillas se encontraron
escasos flavonoides, moderada cantidad de leucoantocianidinas y escasos
taninos, presento una reacción dudosa frente a la prueba de alcaloides y de
esteroles y/o triterpenos no se encontró saponinas, quinonas y cardiotónicos
ABSTRACT
In the present work of investigation the recognition of Secondary Metabolitos
(Tamizaje Fitoquimico) of leaves and seeds has been made of Bixa Orellana,
using the methodology described by (Miranda, a 2003) in where was that the
leaves presented displayed little alkaloids, moderate amount of flavonoides,
abundant leucoantocianidinas, and moderate amount of taninos; one was not
2
cardiotónicos, saponinas and quinonas, I present/display a doubtful reaction for
esteroles and/or triterpenos. In the seeds were little flavonoides, moderate
amount of leucoantocianidinas and little tannins, I present/display a doubtful
reaction forehead to the test of alkaloids and of esteroles and/or triterpenos it
was not saponinas, quinonas and cardiotónicos
PALABRAS
CLAVE:
Metabolitos
Secundarios,
flavonoides,
alcaloides,
leucoantocianidinas, cardiotónicos, esteroles, triterpenos, taninos, Bixa orellana
I. INTRODUCCION:
La medicina tradicional, una de las expresiones mas importantes
de la memoria ancestral de los pueblos amazónicos, hace uso, entre otras
prácticas, de gran número de especies vegetales para curar enfermedades y
síndromes.
El achiote es una de las plantas medicinales utilizadas en la
medicina popular para infecciones en la piel, infecciones respiratorias,
desinflamación de la próstata, etc. Su uso esta restringido a las personas que
creen en la medina natural, de tal manera que un estudio fitoquimico contribuye
a validar la especie sobre los metabolitos secundarios presentes, los cuales
ayudarían a posteriores estudios farmacológicos, toxicológicos, preclínicos y
clínico de la especie.
Para el presente trabajo de investigación se presento la siguiente
interrogante ¿Cuáles son los metabolitos secundarios que presenta en tamizaje
fitoquimico de la especie Bixa orellana?, con los siguientes objetivos:
3
OBJETIVO GENERAL:

Encontrar
que tipo de metabolitos secundarios contiene la
especie Bixa Orellana.
OBJETIVOS ESPECIFICOS:

Determinación de la presencia de alcaloides

Determinación de la presencia de flavonoides

Determinación leucoantocianidinasy cardiotónicos

Determinación de saponinas y triterpenos

Determinación de quinonas y taninos

Determinación de antocianidinas
II.
REVISION DE LITERATURA:
2.1 GENERALIDADES:
El achiote es un árbol originario de la América Tropical donde
crece en forma espontánea, es de rápido desarrollo y alcanza de 3 a 4 metros
de altura y tiene 20 a 30 cm. de diámetro en la base del tallo. Su raíz es
pivotante y bien desarrollada, las hojas son cordiformes y las flores
hermafroditas de un color rosado a blanco, dispuestas en panojas terminales.
El fruto es una cápsula que contiene de 30 a 60 semillas, las mismas que están
cubiertas de una pulpa rojiza y cerosa que constituye el tinte llamado achiote.
Este árbol se lo cultiva bien entre los 300 a 1.000 metros de altura, aunque se
adapta bien desde el1 nivel del mar.
El achiote crece en óptimas condiciones en un amplio margen de
suelos, desde los francos arenosos hasta los arcillosos; pero, los mejores
4
resultados se han conseguido en suelos francos con un marcado índice de
fertilidad y si bien es cierto que crece en todo tipo de suelo, también es cierto
que es muy exigente en cuanto al drenaje, ya que su desarrollo en suelos mal
drenados es deficiente y aún improbable. En lo que se refiere al agua, el
achiote es muy resistente a las sequía, y se ha observado que a pesar que
durante el periodo seco sufre ciertos trastornos fisiológicos como es la fuerte
defoliación, se repone rápidamente después de caer las primeras lluvias. Las
plantaciones establecidas en buenas condiciones de humedad durante todo el
año, producen excelentes rendimientos. La temperatura varía de los 24 a los 30
grados centígrados. (MOSQUERA,1989)
Básicamente tiene la siguiente clasificación: (VILLA, 1995)
Subdivisión : agiosperma
Clase
: dicotiledoneas
Orden
: parietales
Familia
: Bixaceas
Genero
: bixa
Especies: Bixa orellana linneo, B. sphaerocarpa Triana, B. urucurana willd,
B. purpurea hort, etc.
2.2 COMPOSICION QUIMICA:
Las investigaciones fitoquímicas anteriores han revelado presencia de varios
derivados del carotenoides incluyendo el bixina y norbixina (Satyanarayana y
otros., 2003), algunos terpenoides, tocotrienoles, y flavonoides (luteolina
incluyendo y apigenina) en Orellana de Bixa semillas (Jondiko y Pattenden,
1989; Frega y otros., 1998; Pino y Correa, 2003), citado por Ahmad et.al., Otras
5
investigaciones han revelado que las hojas Orellana de Bixa presentan
flavonoides bisulfatos (Harborne, 1975) y de abarcar del aceite esencial
principalmente sesquiterpenes con el ishwarane como el compuesto principal
(Lorenzo y Hogg, 1973). Se han encontrado las raíces para contener el ácido
tomentosico del triterpeno
Contiene dos principios colorantes, uno de los cuales es la
"bixina". - rojo-anaranjado -, una sustancia algo cristalina de color rojo oscuro.
El otro, que también es un elemento colorante, es la "nor-bixina" (orellina) amarillo -. La bixina es soluble en alcohol, más lo es en alcohol hirviente, éter y
cloroformo, aceites y grasas; es poco soluble en agua. La nor-bixina, en cambio,
es insoluble en éter, pero soluble en agua y alcohol.
El principal constituyente colorante de la semilla del achiote es la bixina,
que
se encuentra en la cubierta exterior
de la semilla de l fruto,
representa mas del 80% de los pigmentos presentes, lo cual facilita su
extracción los
componentes
principales
de la
semilla
del achiote
son(Córdoba,1987; Mosquera, 1989; Jaramillo, 1992; CNP, 2001; SDIC,2001).
 Resina
 Orellina (materia colorante amarilla)
 Bixina(materia colorante roja)(80%)
 Aceite volátil y aceite graso.
Según diferentes
fuentes, la composición tanto química como
nutricional de la semilla del achiote es muy variada, como puede observarse
en las tablas 1 y 2 (Córdoba,1987; ; Jaramillo, 1992; CNP, 2001; SDIC,2001).
6
Tabla1. Composición química de la semilla del achiote
Composición química (%)
Humedad
8.00 -13.00
Proteína
13-14.24
Celulosa
13.8
Fibra Cruda
18.48
Almidones
11.45
Carbohidratos totales
39.91
Ceniza
4.50-7.97
Energía
54 Kcal
Tabla 2. Composición nutricional de la semilla del achiote
Composición( mg/100g)
Calcio
7
Fósforo
10
Hierro
1.4
Vitamina A
45 mg
Riboflavina
0.2
Niacina
1.46
Tiamina
0.39
Ácido Ascórbico
12.5
Tabla 3. Composición del pigmento del achiote
7
Composición (g/100g)
Proteínas
12.3-13.2
Pectina
0.23
Carbohidratos
39.91-47.90
Ceniza
5.44-6.92
Taninos
0.33-0.91
Pentosanos
11.35-14.97
Carotenoides
1.21-2.30
β- Carotenos
6.8-11.30 mg
El colorante. El principal componente colorante de la semilla es la
bixina, de color rojo oscuro. Químicamente es un ácido caretonoico de fórmula
empírica C25H30O4, que se presenta como isómero geométrico del tipo cis, pero
que puede convertirse a su forma trans, mas estable(Jaramillo, 1992). Es
insoluble en y en cloroformo, aceites vegetales, acetato de etilo y propilenglicol.
En la figura 1 aparece su formula estructural (Mosquera, 1989; Kalsec, 2001).
El pigmento de la semilla de achiote, que se encuentra en la parte más externa,
tiene diferentes compuestos según se muestra en la Tabla 3 (Cordoba,1987;
Bernal, 1989; Jaramillo, 1992).
Al hervir la bixina en una solución de álcali, se forma una molécula de
metanol y una sal dipotásica que por acidificación, produce el ácido dibásico
norbixina,
C24H26O4
(Figura
2),
pigmento
carotenoide
agua(Bernal,1989; Jaramillo,1992)
Figura 1. Acido cis-polieno monometilester dicarboxilico
soluble
en
8
CH3
CH3
CH3
H3COOCHC
CHCOOH
CH3
Figura 2. Estructura de la norbixina (Kalsec, 2001)
CH3
CH3
CH3
HOOC HC
CHCOOH
CH3
III- MATERIALES Y METODOS:
3.1 MATERIALES Y REACTIVOS:
3.1.1 Materiales para colectar la muestra:

Bolsas de papel

Registro de campo
3.1.2 Materiales del laboratorio:

Material de uso común de laboratorio
3.1.3 Equipos utilizados

Balanza analítica

Estufa

Molino

Centrífuga

Espectrofotómetro UV- Visible
3.1.4 Reactivos y soluciones

Agua destilada

Metanol

Ferrocianuro de potasio

Cloruro de Fierro

Acido Clorhidrico

Cloroformo

Diclorometano

Etanol
9

Sulfato de sodio anhidro

Hidroxido de amonio cc.

Cloruro de Sodio

Acetato de Plomo

Limaduras de Magnesio

Alcohol amilico

Cloruro férrico

Acido Tánico

Acido Sulfurtico

Anhidrido acético

Benceno

Tolueno

Agua oxigenada

Hidroxido de Sodio

Hidroxido de potasio

Reactivo de Dragendorff

Reactivo de Mayer

Reactivo de Malser

Reactivo de Reineckato de amonio

Sulfato de quinina

Reactivo de ninhidrina
3.2 METODOLOGIA:
Se va utilizar la metodología descrita por (MARTINEZ, et.al, 2003
y MIRANDA, 2000)
a) Recolectar y preparar las muestras frescas
b) Reconocimiento de Alcaloides:
Desmenuzar finamente unos 10 g de muestra fresca y colocarlos
en un erlemeyer. Añadir un volumen suficiente de HCl al 5% para que toda la
10
muestra este en contacto con la solución ácida. Calentar con agitación al baño
Maria durante 5 minutos. Enfriar y Filtrar. Colocar en 4 tubos de ensayo 2 ml de
filtrado ácido. Añadir a cada uno dos gotas de los reactivos de Dragendorff,
Mayer, Valser y Reineckato de amonio. Si observa turbidez o precipitados por
lo menos en tres tubos, se considera que la muestra contiene alcaloides.
c) Reconocimiento
de
Flavonoides,
leucoantocianidinas
y
Cardiotónicos:
En un erlemeyer colocar 10 g de muestra fresca finamente
desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol etílico que cubra toda la
muestra y le confiera fluidez. Calentar al baño maria durante 5 minutos, con
agitación. Enfriar, Filtrar. Al filtrado añadirle un volumen igual de solución de
acetato de plomo al 4 % que contenga ácido acético al 0.5 %. Agitar. Dejar en
reposar 15 minutos. Filtrar. Con el filtrado realizar ensayos de reconocimiento
de flavonoides, leucoantocianidinas y cardiotónicos.

Ensayo para flavonoides: Colocar varias limaduras de magnesio en un
tubo de ensayo. Añadir 2ml del filtrado y por la pared del tubo, gota a gota
dejar caer varias gotas de HCl cc. La aparición de colores naranja, rosado,
rojo, o violeta es prueba positiva para la existencia de flavonoides en la
muestra.

Ensayo para leucoantocianidinas: colocar 2ml del filtrado en un tubo de
ensayo.Añadir 1 ml de ácido clorhídrico cc. calentar en baño de agua
hirviendo durante 15 minutos. La aparición de coloraciones rojas es
prueba positiva de la existencia de leucoantocianidinas en la muestra.
11

Ensayo para cardiotónicos: en un tubo de ensayo colocar 1 ml del filtrado.
Añadir 0.5 ml de reactivo de Kedde (mezclar 1 ml de solución A con 1 ml
de solución B, para preparar el reactivo antes de su uso). La aparición de
coloraciones violetas o púrpuras es prueba positiva de la existencia de
carditónicos.
d)
Reconocimiento
de
Saponinas,
Taninos,
Esteroles
y/o
Triterpenoides y quinonas:
En un erlemeyer colocar unos 75 g de muestra fresca
finamente desmenuzada. Añadir un volumen suficiente de alcohol. Calentar al
baño maría durante unos 10 minutos con agitación. Filtrar en caliente.
Concentrar hasta la mitad del volumen en el filtrado. Trasvasar a un embudo de
separación. Extraer con dos porciones de 20 ml c/u de diclorometano. Si es
necesario, añadir un volumen de agua para que se formen las dos fases.
Recuperar ambas fases. La fase acuosa se filtra y con el filtrado obtenido se
realizan ensayos para taninos, saponinas y quinonas.
La fase orgánica se recupera, se seca con sulfato de sodio anhidro y se filtra,
con el filtrado realizar el ensayo para triterpenoides o esteroides.

Ensayo para saponinas: agitar en un tubo de ensayo tapado, unos 4 ml
del filtrado acuoso, vigorosamente durante 1 minuto. La formación de
espuma abundante y estable es prueba presuntiva de la presencia de
saponinas en la muestra.

Ensayo para Taninos: Tomar 1 ml del filtrado acuoso en un tubo de
ensayo, añadir 1 ml del reactivo de gelatina-sal. Si se forma un
precipitado, centrifugar a 2000 RPM durante 5 minutos. Desechar el
12
sobrenadante. Redisolver el precipitado en 2 ml de urea 10 M. añadir 2-3
gotas de cloruro ferrico al 10 %. La formación de un precipitado al agregar
el reactivo de gelatina, y la aparición de colores o precipitados verdes,
azules o negros es prueba positiva de la presencia de taninos en la
muestra.

Ensayo para Triterpenos y/o esteroides: En un tubo de ensayo limpio y
completamente seco, colocar 1 ml del filtrado orgánico. Añadir 1 ml de
anhídrido acético. Por la pared del tubo y con mucha precaución, dejar
rebalsar 1-2 gotas de ácido sulfúrico concentrado. La formación de
colores
azules, violetas, rojos o verdes es prueba positiva de que la
muestra contiene esteroidesy/o Triterpenoides.

Ensayo para quinonas: ENSAYO CON UNA FRACCION: Colocar en un
tubo de ensayo unos 5 ml de filtrado acuoso. Añadir 1 ml de peróxido de
hidrógeno al 20 % y 1 ml de ácido sulfúrico al 50 %. Calentar la mezcla en
un baño de agua hirviendo durante 15 minutos. Enfriar. Añadir 5 ml de
tolueno. Agitar sin emulsionar. Recuperar la fase toluénica. Trasvasar 2ml
fase toluenica a un tubo de ensayo. Añadirle 1 ml de una solución de
NaOH al 5 % con amoniaco. Agitar sin emulsionar. Si la capa acuosa
toma una coloración rosada a roja a roja intensa es prueba positiva de la
presencia de quinonas en la muestra. ENSAYO DIRECTO: colocar
g
demuestra fresca (o 1 g de muestra seca y molida), en un sistema de
reflujo, agregar 5 ml de HCl al 5%. Reflejar 5 minutos. dejar enfriar y filtrar.
Con el filtrado acuoso proceder como se describe para el ensayo con una
fracción acuosa
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e)
Reconocimiento para Antocianinas:
En un erlemeyer colocar unos 100 g de muestra fresca finamente
desmenuzada. Añadir unos 200 ml de agua. Calentar a ebullición durante unos
5 minutos, filtrar. Ensayo: en un tubo de ensayo colocar 2 ml de filtrado. Añadir
1 ml de NaOH diluido. Observar el color formado. En otro tubo de ensayo
colocar 2 ml de filtrado. Añadir unas gotas de acido mineral diluido. Observar el
color formado. Las antocianinas se reconocen por formar diferentes colores a
diferentes pH.
IV.- RESULTADOS
Cuadro N⁰4: Determinación de Metabolitos Secundarios presentes en las hojas
y semillas de Bixa Orellana
Metabolito Secundario
Hojas
Semillas
Alcaloides
+
±
Flavonoides
++
+
++++
++
Cardiotonicos
-
-
Saponinas
-
-
++
+
Esteroles y/oTripernos
±
±
Quinonas
-
-
Antocianidinas
+
+
Leucoantocianidinas
Taninos
++++ Abundante
++
Moderado
+
Escaso
±
Dudoso
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V.- DISCUSIÓN:
Como se muestra los resultados en el cuadro N⁰1 las hojas
presentan escasos alcaloides, ya que dio un escaso precipitado con los
reactivos de Mayer, Wagner y Dragendorf, presentando reacción positiva con
los tres reactivos: y para las semillas la reacción fue dudosa, debido a la gran
cantidad de colorante presente en las semillas.
Para la determinación de Flavonoides en las hojas se Bixa
orellana se utilizo la reacción de Shinoda, la cual presento reacción positiva
dando una coloración rosado claro, este resultado es un indicativo de que
puede
tener
una
buena
capacidad
antioxidante, dependiendo
de
la
concentración de flavonoides y de otros polifenoles presentes en la especie; y
en las semillas también s encontró una escasa presencia de flavonoides. Como
reporta (Harbone JB 1975, Li PV 1999) la especie Bixa orellana contribuye al
efecto antiinflamatorio por contener flavonoides, taninos, esteroides, lo cual
esta corroborado en el presente análisis
Tanto las hojas como las semillas de Bixa Orellana presentaron
leucoantocianidinas, aunque las hojas en una cantidad abundante y las
semillas en cantidad moderada tal como lo reporta (Harbone, 1975)
La presencia de taninos fue tanto en hojas como en semillas,
presentando reacción positiva con el reactivo gelatina-sal y cloruro ferrico, lo
cual esta corroborado por (Harbone, 1975 y Ahmad. et.al., 2006)
15
VI. CONCLUSIONES
1. Se encontró escasa presencia de alcaloides en hojas y dudoso en
semillas
2. Presenta cantidad moderada de flavonoides en hojas y en semillas
escaso.
3. Presenta una cantidad abundante de leucoantocianidinas en hojas y
moderado en semillas
4. No se encontró cardiotónicos tanto en semillas como en hojas
5. No se encontró saponinas tanto en hojas como semillas
6. Presenta taninos en cantidad moderada en hojas y escaso en semillas
7. Presento una reacción dudosa para los metabolitos de esteroles y/o
triterpenos.
8. No se encontró quinonas.
VI.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
1. Li PV Actividad biológica del extracto acuoso atomizado de hojas de
Bixa orellana L (Achiote) en animales de experimentación.
2. Harborne, J.B., 1975. Flavonoid bisulfates and their co-occurrences with
ellagicacid in the Bixaceae, Frankeniaceae, and related families.
Phytochemistry 14, 1331–1337.
3. Lawrence, B.M., Hogg, J.W., 1973. Ishwarane in Bixa orellana leaf oil.
Phytochemistry 12, 2995.
4. CORDOVA v., J.A. (1987). “El Achiote”: Cultivo, Beneficio y posibilidades
de Exportación”. Revista ESSO Agrícola vol 34 N°1 pp. 3-7
16
5. JARAMILLO MORENO, C.A. Y MUÑOZ MORENO, O.A. (1992).
Extracción de colorantes de Achiote. Trabajo de Grado (ingeniero
Químico). Medellín. Universidad de Medellín. Facultad de Mina.
Departamento de Procesos Químicos
6. MARTINEZ, A. ; OSPINA, F; VALENCIA,G; JIMENEZ, N. (2003).
Manual de Practicas de Laboratorio de Farmacognosia y Fitoquímica
2003. Universidad de Antioquia. Facultad de Química Farmacéutica.
Departamento de Farmacia. Medellín. Colombia