Determinación de grupo hemático y sérico. Caracterización y
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DETERMINACIÓN DE GRUPOS SANGUÍNEOS. TITULACIÓN DE ANTISUEROS. 1.- INTRODUCCIÓN La determinación del grupo sanguíneo es una práctica habitual e imprescindible para la transfusión de componente hemáticos. La razón está en que el sistema inmune de algunos individuos rechaza los hematíes de otros. Esta reacción inmunológica está mediada por anticuerpos y es fácilmente visualizable in vitro mediante reacciones de aglutinación. Se conocen más de 20 grupos de antígenos eritrocitarios codificados en otros tantos loci génicos, para los cuales existen múltiples variantes alélicas. El resultado son más de 200 antígenos eritrocitarios identificables. Estos antígenos varían en su inmunogenicidad. Los más importantes a efectos transfusionales son los antígenos del sistema H / ABO y los del sistema Rhesus (Rh). Sistemas H y ABO Los epítopos responsables son carbohidratos que aparecen en glicoesfingolípidos de membrana y también en glucoproteínas. El gen H codifica la enzima fucosil transferasa, que adiciona fucosa a una cadena oligosacarídica precursora. Los tres últimos azúcares de la cadena se denominan antígeno H (Figura 1). En un locus aparte está el sistema ABO, con tres alelos. El alelo A codifica una transferasa que une Nacetil galactosamina a la cadena H, mientras que el alelo B codifica una transferasa que une una galactosa. El alelo O no produce transferasa y por tanto no modifica la sustancia H. El azúcar unido al carbono 3 de la galactosa determina la actividad antigénica. La galactosa no acepta azúcar en el carbono 3 a no ser que haya fucosa unida al carbono 2. Figura 1. Es importante destacar que estos genes son codominantes. Los individuos que expresan los alelos A y B tendrán oligosacáridos con los dos tipos de modificaciones. Así, se distinguen 4 grupos: A, B, AB y O. La importancia transfusional de estos antígenos radica en que los individuos de un grupo sintetizan anticuerpos frente a los oligosacáridos que no están en sus hematíes (Tabla 1). Estos anticuerpos, que se denominan isoaglutininas y que suelen ser IgM, aparecen en grandes cantidades en circulación sin necesidad de exposición previa a sangre de otros grupos. La razón parece estar en la reactividad cruzada de sustancias presentes en bacterias de la flora intestinal. Tabla 1 Grupo sanguíneo Genotipo A B AB O AA, AO BB, BO AB OO Antígenos eritrocitarios A B AyB H Anticuerpos séricos Anti-B Anti-A Anti-A, Anti-B Sistema Rhesus Se han identificado más de 40 antígenos del sistema Rh aunque no se sabe cuantos genes son responsables de este sistema. Son proteínas integrales de membrana con un contenido lipídico alto. D es el antígeno Rh más inmunogénico y por tanto el más importante a efectos transfusionales. La presencia de D da lugar al Rh+, mientras que la ausencia (d) da lugar al Rh-. Los anticuerpos anti D, que son IgG, aparecen en la circulación de los individuos Rh- sólo tras una exposición previa a sangre D, por ejemplo por una transfusión de hematíes o tras la gestación de un feto D. Determinación de antígenos eritrocitarios y anticuerpos séricos Antes de una transfusión se analizan los eritrocitos del receptor para ABO y D mediante antisueros anti-A, anti-B y anti-D. Simultáneamente se analiza el suero para detectar anticuerpos contra antígeno eritrocitarios (isoaglutininas), mediante hematíes A y B previamente tipados. Las reacciones positivas dan lugar a la aglutinación de los hematíes. Para asignar un grupo sanguíneo, ambas pruebas deben dar un resultado coincidente. Los resultados discrepantes deben analizarse cuidadosamente. Un test adicional es la prueba cruzada, que examina la compatibilidad entre suero del receptor con los hematíes del/los donantes. Para ello, hematíes lavados del donante se mezclan con suero del receptor, se incuban, se centrifuga y se examina para hemólisis y aglutinación 2.- OBJETIVOS Al finalizar la práctica el alumno será capaz de: - Interpretar reacciones de aglutinación. Determinar los grupos ABO y Rh (D) en hematíes. Determinar ABO en suero. Obtener antisueros para tipaje. Titular un antisuero. 3.- EQUIPAMIENTO - Centrífuga con rotor para tubos de 12x75 ó 10x70 (alternativamente, con rotor para placas microtiter) Centrífuga para tubos eppendorf (tipo Minifuge) Microscopio Transiluminador Portaobjetos o placa microtiter de fondo en U Tubos eppendorf Tubos de 10x70 mm Pipetas de 5-40, 40-200 y 200-1000l y puntas Lancetas de un solo uso 4.- REACTIVOS Y MUESTRAS - Antisueros anti-A, anti-B y anti-D Suero salino fisiológico (NaCl 0.85%) Muestras de sangre anticoagulada con EDTA (tubos de 2 ml descartes rutinarios de los hemogramas). Se emplearán 5 o más tubos por pareja de alumnos. Algodón y alcohol etílico de 70 5.- PROCEDIMIENTO PRECAUCIÓN: Todas las muestras deben considerarse potencialmente infecciosas 5.1 Determinación de ABO y Rh (D) en hematíes 1) Preparar un portaobjetos y un tubo eppendorf rotulado con las iniciales del alumno. En este último se pipetea 1 ml de suero salino fisiológico. 2) Se limpia un dedo con un algodón humedecido en alcohol y se pincha con la lanceta. Alternativamente, puede tomarse la sangre de los tubos anticoagulados con EDTA. 3) Sobre un portaobjetos se depositan tres gotas de aproximadamente 0.5 cm de diámetro (25-50 µl) bien separadas. 4) Tomar 10 µl de sangre y pipetearlos en el tubo eppendorf. Guardar a temperatura ambiente, se procesará al final. 5) Sobre cada gota de sangre del porta se pipetean 25 µl de antisuero. El orden recomendable es anti-A, anti-B, anti-D. 6) Mezclar con una punta de pipeta durante unos segundos 7) Determinar la aglutinación e interpretar el resultado. Puede visualizarse en el transiluminador o utilizar un microscopio en caso de reacción muy débil. 8) Determinar la frecuencia de cada grupo en la clase y compararla con las frecuencias establecidas. Grupo A % en la clase B AB O Rh negativo 5.2 Lavado y preparación de hematíes al 2% 1) Rotular el tubo eppendorf de los 10 µl de sangre con el grupo hemático obtenido (A, B, AB, O). 2) Centrifugar el tubo 1 minuto en la Minifuge a velocidad alta. 3) Descartar el sobrenadante con bomba de vacío. 4) Resuspender el pellet y añadir 1ml de suero fisiológico. 5) Repetir los pasos 2 y 3. 6) Resuspender en 490 µl de suero fisiológico. A esto se denomina hematíes al 2% (v/v). Estos hematíes serán compartidos por todos los alumnos del grupo. 5.3 Determinación de ABO en suero o plasma (opcional) 1) 2) 3) 4) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. Extraer el suero (o plasma) y depositarlo en un tubo eppendorf. Lavar y diluir hematíes A y B al 2% (v/v) en suero fisiológico (Protocolo 5.2). Pipetear 50 µl de suero en dos tubos de poliestireno de 10x70 o en dos pocillos. Pueden también prepararse controles negativos (suero fisiológico) y positivos (suero anti-A,B). 5) Pipetear 25 µl de hematíes A en un tubo (o pocillo) y hematíes B en el otro y mezclar. 6) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 7) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. 5.4 Obtención y titulación de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B a partir de muestras de plasma. 1) Tomar 5 tubos de sangre anticoagulada con EDTA elegidos al azar. 2) Centrifugar la sangre 5 minutos a 400xg. 3) Extraer cuidadosamente el plasma y depositar en un tubo eppendorf rotulado con el número de la muestra. El pellet celular se reserva por si fuera necesario posteriormente. 4) En una gradilla colocar 15 tubos de poliestireno de 10x70 (5 filas x 3 columnas) (o utilizar una placa microtiter de fondo en U) 5) Pipetear 50 µl de cada plasma en los 3 tubos (pocillos) de cada fila (Tabla de resultados). 6) En los 5 tubos de la primera columna pipetear 25 µl de hematíes A. En las columnas 2ª y 3ª pipetear 25 µl de hematíes B y O respectivamente. Puede procesarse una 4ª columna de tubos si se hubieran encontrado hematíes AB (será un control positivo). 7) Incubar 5 minutos. 8) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 9) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. (Si se ha trabajado en placa, dispersar el pellet con una pipeta y observar al microscopio invertido, centrándose en el fondo del pocillo). Calificar cada tubo o pocillo con -, + y ++ según la aglutinación observada y anotar en la tabla de resultados. 10) Preparar pooles de antisueros anti-A, anti-B y anti-A,B mezclando todos los obtenidos en el grupo de prácticas. 11) Titular los pooles de antisueros obtenidos (uno cada pareja de prácticas). Para ello, llevar a cabo una dilución seriada 1/2 y analizar la aglutinación de una cantidad constante de hematíes A o B, tal y como se describe a continuación. 12) Tomar 8 tubos y rotular 1, 1/2, 1/4, 1/8, 1/16, 1/32, 1/64 y 1/128. 13) Pipetear 50 µl de suero salino fisiológico en todos los tubos excepto en el rotulado como 1. 14) Pipetear 50 µl de antisuero en el primer y segundo tubo y mezclar. Del segundo tubo tomar 50 µl y pasarlos al siguiente, y así sucesivamente. Descartar 50 µl del último tubo. 15) Pipetear 25 µl de hematíes que correspondan y mezclar. 16) Incubar 5 minutos. 17) Centrifugar a 400xg 15 segundos. 18) Dispersar el pellet y determinar aglutinación. Anotar en la tabla. 19) El título del antisuero será la inversa de la máxima dilución aglutinante. Tabla de resultados HEMATÍES A PLASMA Plasma 1 B 0 Plasma 2 Plasma 3 Plasma 4 Plasma 5 Titulación Dilución: Aglutinación (++, +, +/- ,- ) 1 1/2 1/4 1/8 1/16 1/32 1/64 PROFESOR Epítopos ABO se encuentran en muchas otras células aparte de los eritrocitos. Se han descrito 11 subgrupos de A. Los más importantes son A1 y A2. Las 1/128 diferencias son cuantitativas. Los hematíes A1 tienen en membrana aprox. Un millón de copias, mientras que los A2 tienen 250 000. Aproximadamente un 78% de los individuos A son A1 y 22% son A2. La sangre AB también puede dividirse en tipos A1B y A2B. Los A o B débiles darán aglutinación con anti-A,B pero no con los otros antisueros. Aproximadamente el 1% de las muestras de sangre elegidas al azar contienen aglutininas que pueden dar anormalidades en la determinación de anticuerpos séricos. Pueden ser anti A1, anti-H, autoanticuerpos, o sueros de mieloma que producen roleaux o bien anticuerpos adquiridos por transfusiones o de origen materno en niños. En otros casos los anticuerpos pueden no detectarse, por ejemplo en inmunodeficiencias o en ancianos o en recién nacidos. En algunos individuos el gen H está ausente. Este fenotipo h homozigótico se denomina Bombay. Los individuos de fenotipo Bombay tienen títulos altos de anti-A, anti-B y anti-H en su circulación. Antígeno A: Existen variantes débiles de D denominadas Du que pueden no detectarse en análisis rutinarios, si se identifican con antiglobulina. No hay peligro ya que los individuos Rhno se sensibilizan con eritrocitos Du positivos. La mayoría de los antígenos sanguíneos restantes raras veces participan en reacciones transfusionales. Los anticuerpos contra los sistemas Kidd, Duffy, Kell y MNS pueden originar hemólisis si un individuo sensibilizado recibe sangre positiva para estos antígenos. En general, los anticuerpos hemolíticos son IgG y reaccionan a 37 C. Casi nunca producen hemólisis los anticuerpos IgM o de reacción en frío. Los antígenos Rh están tan separados en la membrana de los RBC que los Ac IgG anti Rh no fijan complemento ni aglutinan los eritrocitos Rh(+). Lisan los RBC por opsonización. Para detectarlos se emplea anti IgG humana (test de Cooms indirecto) si aglutinan los IgM. En general, estas pruebas de aglutinación se llevan a cabo en solución salina. Se sabe que esto disminuye la sensibilidad a la hora de detectar anticuerpos IgG debido a las fuerzas iónicas de repulsión entre los eritrocitos. Para incrementar la sensibilidad puede añadirse albúmina o solución de baja fuerza iónica o polibreno o tratar a los hematíes con enzimas. La mejor práctica transfusional es dar sangre isogrupo siempre (células, plasma y plaquetas). Cuando esto no se puede, los receptores A o B pueden recibir hematíes O y los AB de cualquier grupo. Los receptores O sólo reciben hematíes O. El plasma con anti-A o anti-B raramente causa problemas salvo en niños muy pequeños. El plasma O es más probable que cause problemas y debe ser la última elección en pacientes de grupo distinto del O. Para concentrado de plaquetas (que tienen ABH y aprox. 50 ml de plasma) se siguen las mismas indicaciones que para hematíes. FRECUENCIAS Grupo sanguíneo A B AB O Rh negativo Frecuencia (%) en caucásicos USA 40 11 4 45 15 Frecuencia (%) en asiáticos USA 28 27 5 40 Menor del 15% Frecuencia (%) en negros USA 27 20 4 49 Menor del 15% ISOINMUNIZACIÓN Rh La prevalencia de la formación de Ac anti Rh depende de la dosis de células recibida. 1ml de células sensibiliza al 15% de individuos expuestos, mientras que 250 ml sensibilizan al 60-70%. Después de la exposición, tan pronto como a las 4 semanas, se detectan ac IgM débiles, seguido de una conversión rápida a IgG. Una segunda exposición a tan solo 0.03 ml de eritrocitos puede desencadenar una formación rápida de IgG. La enfermedad hemolítica del RN ocurre por paso de sangre del feto Rh+ a la madre Rh- (durante el embarazo o durante el parto). Los Ac IgG pueden atravesar la placenta produciendo la hemólisis de los eritrocitos fetales. Inmunización Rh se presenta en el 8-9% (16% según Rosen) de las mujeres Rh- tras el parto del primer hijo Rh+ ABOcompatible y en el 1.5-2% (7% según Rosen) cuando el hijo Rh+ es ABO-incompatible. La inmunización Rh puede evitarse casi totalmente si se administra una dosis alta de anti Rh (RhIg) a las 28 semanas de gestación (300 µg, que no elevan el título de anti Rh materno por encima de 1/4 y no daña al feto) y a las 72 horas del parto (o de la dosis potencialmente sensibilizante de células Rh+). Una dosis de 300 µg de RhIg intramuscular previene la inmunización por exposición a hasta 30 ml de células Rh+. Puede utilizarse como profilaxis en casos de aborto o amniocentesis. La administración de RhIg a mujeres embarazads no tiene efecto perjudicial para el feto. Una vez que el individuo está inmunizado, la administración de RhIg es ineficaz.
