Determinación de proteínas en solución Las prácticas de bioquímica a menudo requieren de medidas rápidas de proteínas en cantidades de microgramos. Las publicaciones científicas contienen varios procedimientos para la determinación de proteínas en solución. Los más ampliamente usados son tres métodos clásicos y uno recientemente descubierto. Los cuatro métodos no trabajan todo el tiempo con cualquier tipo de proteínas. Es probable entonces que una misma solución de proteína medida por los cuatro métodos, dé cuatro resultados diferentes. Es importante reconocer que no hay un “método perfecto” para medir proteínas. Cada método presenta ventajas y desventajas que deben ser consideradas para seleccionar el mejor procedimiento. Factores que importan son: La sensibilidad La exactitud deseada La naturaleza de la proteína La presencia de sustancias en solución que interfieren El tiempo disponible para llevar a cabo el ensayo. Los cuatro métodos más ampliamente usados se comparan en la tabla adjunta. Ensayo de biuret Cuando las sustancias contienen dos o más uniones peptídicas reaccionan con sulfato de cobre en medio básico formando un complejo de color púrpura. El producto coloreado es el resultado de la coordinación del N del enlace peptídico con los iones Cu2+ . La cantidad de producto formado depende de la concentración de la proteína. En la práctica se realiza una curva de calibración usando una solución estándar de proteína. Un estándar apropiado es una solución de seroalbúmina bovina. Se tratan cantidades conocidas de la solución estándar con el reactivo de biuret y se permite el desarrollo de color. Las medidas de absorbancia a 540nm (A540) son hechas contra un blanco conteniendo el reactivo de biuret y buffer o agua. La A540 es graficada contra la concentración de proteína en mg/mL ( curva de calibración ). La solución problema de proteína es tratada con reactivo de biuret, se desarrolla el color y se determina su A540. La concentración de la solución problema se determina a partir de la curva de calibración. Pocas sustancias interfieren con el test de biuret. Un color anormal se desarrolla en presencia de buffers de aminoácidos, Goods buffers y Tris. El test de biuret tiene múltiples ventajas incluidas la rapidez, el color similar desarrollado para diferentes proteínas y pocas sustancias que interfieren. Una desventaja es la baja sensibilidad ya que la menor concentración que detecta es de 1mg. Ensayo de Lowry Este ensayo de proteínas es uno de los más sensibles por lo tanto es ampliamente usado. El test de Lowry puede detectar proteínas en niveles tan bajos como 5 g. El principio por el cual se desarrolla el color es idéntico al del ensayo de biuret solo que hay un segundo reactivo ( Folin-Ciocalteu) que se adiciona para incrementar la cantidad de color a desarrollar. Dos reacciones cuentan para desarrollar el color azul intenso, (1) la coordinación de los enlaces peptídicos con cobre en medio alcalino (reacción de biuret) y (2)la reducción con el reactivo de Folin-Ciocalteu ( fosfomolibdato-fosfotungstato ) con los residuos de tirosina (Tyr) y triptofano (Trp) dela proteína. El procedimiento es similar al ensayo de biuret. Se prepara una curva de calibración con seroalbúmina bovina u otra proteína pura y se determina la concentración problema a partir de la curva realizada. La ventaja obvia de este ensayo es la alta sensibilidad que es 100 veces mayor que la de Biuret sin embargo se necesita un mayor tiempo para su realización. El ensayo de Lowry es infortunadamente interferido por diferentes sustancias y un crítico cronometraje es necesario en la adición de los reactivos. Los buffers de Good incrementan la absorbancia del blanco y no pueden estar presentes en el ensayo. Otras sustancias que interfieren son el sulfato de amonio en concentraciones mayores de 0.15%, la glicina en más de 0.5% y los mercaptanos. Como todas las proteínas difieren en la cantidad de tirosina y triptofano que presentan, el desarrollo de color difiere de una proteína a otra inclusive en la seroalbúmina bovina estándar. Es por eso que el ensayo de Lowry debe ser usado solo para medir cambios en la concentración de proteínas y no para determinar valores absolutos de la misma. Esto no disminuye el valor del ensayo porque para muchos ensayos bioquímicos (como la purificación de proteínas ) cambios relativos en la concentración de proteínas son indicados. Ensayo de Bradford Las múltiples limitaciones de los ensayos anteriores estimularon la investigación de mejores métodos de cuantificación de proteínas en solución. Un reciente procedimiento desarrollado se basa en la unión de la proteína a un colorante, con numerosas ventajas. La unión del colorante Coomassie Brilliant Blue a la proteína en solución ácida produce un cambio en la máx. del colorante desde 465nm a 595nm. La absorción a 595nm se relaciona directamente con la concentración de proteína. En la práctica, la curva de calibración es preparada usando gamaglobulina de plasma bovino o seralbúmina bovina como estándar. El ensayo requiere un solo reactivo, una solución ácida de Coomassie Brilliant Blue G-250.Después de la adición de la solución del colorante a la muestra de proteína, el color se desarrolla completamente en dos minutos y permanece estable por más de una hora. La sensibilidad de este ensayo es semejante y a veces supera a la del ensayo de Lowry. Usando un procedimiento de microensayo, el ensayo de Bradford puede ser usado para determinar proteínas en un rango de 1 a 20 g. Éste ensayo muestra variaciones significativas con diferentes proteínas. El método de Bradford no solo es rápido sino que tiene pocas interferencias con compuestos no proteicos. Las únicas interferencias conocidas son los detergentes, Triton X-100 y dodecilsulfato de sodio. Las múltiples ventajas de éste método explican su amplia adopción en laboratorios de investigación bioquímica. Ensayo espectrofotométrico Muchas proteínas presentan intensa absorción de luz ultravioleta centrada en los 280nm. Esto es debido a la presencia de residuos de tirosina y triptofano en la proteína. Sin embargo, la cantidad de esos residuos de aminoácidos es variable en las diferentes proteínas como se señaló anteriormente. Si ciertas precauciones son tomadas el valor de la A280 de una solución de proteína es proporcional a la concentración de proteína. El procedimiento es simple y rápido. Se transfiere la solución de proteína a una cubeta de cuarzo y se lee la absorbancia a 280nm contra una cubeta con solución de referencia conteniendo el solvente de la proteína solamente ( buffer, agua, etc ). Los extractos celulares contienen otros compuestos que manifiestan su absorbancia en la proximidad de los 280nm. Los ácidos nucleicos que comúnmente pueden estar presentes en la solución proteica absorben fuertemente a 280nm ya que su máximo de absorción es de 260nm. Warburg y Chistian desarrollaron un método de corrección para esta interferencia de los ácidos nucleicos. Se prepararon mezclas de proteína pura y de ácido nucleico puro y la relación fue determinada experimentalmente. Calcularon así un factor de corrección (F). La tabla 2 indica una serie de valores de F para diferentes relaciones de A280/A260. La siguiente ecuación debe ser usada para soluciones de proteínas conteniendo más de 20% de ácidos nucleicos. Concentración proteica(mg/mL) = A280 . F Una modificación de la ecuación realizada por Link (1957) que da resultados similares es : Concentración proteica(mg/mL) = 1.55 A280 – 0.76 A260 La Tabla 2 puede ser usada para estimar la cantidad de ácido nucleico en la solución de proteína. Tabla 2. Estimación proteica por absorción ultravioleta A280/A260 1.75 1.63 1.52 1.40 1.36 1.30 1.25 1.16 1.09 1.03 0.95 0.94 0.87 % Ácido Nucleico 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00 5.00 F A280/A260 1.12 1.08 1.05 1.02 0.99 0.97 0.94 0.90 0.85 0.81 0.78 0.74 0.68 0.85 0.82 0.80 0.78 0.77 0.75 0.73 0.71 0.67 0.64 0.62 0.60 - % Ácido Nucleico 5.55 6.00 6.50 7.00 7.50 8.00 9.00 10.00 12.00 14.00 17.00 20.00 - F 0.66 0.63 0.61 0.59 0.57 0.55 0.51 0.48 0.42 0.38 0.32 0.28 - El ensayo espectrofotométrico para proteínas es rápido, relativamente sensible y requiere poca cantidad de muestra pero no es más que una estimación de la concentración de proteínas. Tiene ciertas ventajas frente al método colorimétrico en tanto muchos buffers y el sulfato de amonio, no interfieren. El ensayo espectrofotométrico es particularmente indicado para una medida rápida de una elución de proteína de una columna cromatográfica, donde solo importan los cambios en la concentración de proteína. Tabla 1 .- Comparación de los diferentes métodos de determinación proteica. Método Sensibilidad Tiempo Principio Interferencias Comentarios Biuret Baja sensibilidad Moderado Uniones (1-20mg) (20-30min) peptídicas + Cu2+ complejo púrpura Buffer Tris, Algunos aminoácidos Lowry Alta sensibilidad Lento (1)Reacción de (40-60 min) Biuret 5 g (2) Reducción con fosfomolibdatofosfotungstato de los residuos Tyr y Trp Sulfato de amonio Glicina Mercaptanos Alta sensibilidad 5 g Rápido 15 min. Buffers fuertemente básicos Detergentes como Triton X100 y dodecilsulfato de sodio (SDS) Moderada sensibilidad 50-100 g Rápido 1min Bradford WarburgChistian Espectrofométrico Corrimiento de máx. del colorante Coomassie de 465nm a 595nm cuando está unido a la proteína Absorción en el Purinas UV (280nm) Pirimidinas por residuos de Ácidos nucleicos Tyr y Trp de la proteína Usado para determinaciones rápidas, pero no especialmente sensibles. Similar color desarrollado con diferentes proteínas. Requiere tiempos mas largos La cantidad de color varía con las diferentes proteínas Control exacto de los tiempos es crítico para el procedimiento. Útil para cambios en la conc. de proteínas Excelente método, pocas interferencias, color estable. La cantidad de color cambia con diferentes proteínas. El reactivo es fácil de conseguir. Rápido y no destructivo Absorción de ácidos nucleicos puede ser corregida.