M M M O M O N G O N G Ó N N O G D O MEEEM MO ORRRIIIAAA PPPRRRIIIM MEEERRR CCCO ON NG GRRREEESSSO O EEESSSTTTAAATTTAAALLL “““LLLAAA IIIN NVVVEEESSSTTTIIIG GAAACCCIIIÓ ÓN N EEEN N EEELLL PPPO OSSSG GRRRAAAD DO O””” DETERMINACIÓN DE PROTEÍNAS DE RESERVA EN SEMILLAS DE SELECCIONES DE GUAYABA (Psidium guajava L.) DEL ESTADO DE AGUASCALIENTES SORIA CRUZ JORGE1, GUEVARA ROMERO ISAAC3, PADILLA RAMÍREZ JOSÉ SAUL2, VASCO MÉNDEZ NORA LILIA3 Proyecto financiado por CONACYT y PROMEP 1 Docente ITEL, [email protected]; 3Investigador Centro Básico UAA, 2 Investigador INIFAP, [email protected], Profesora-Investigadora, Centro Básico, UAA, [email protected] INTRODUCCIÓN El cultivo de la guayaba es sobresaliente en el Estado de Aguascalientes por contribuir al producto interno bruto con su alto valor agregado, genera fuentes de empleo y se considera como potencial si se industrializaran los frutos y semillas. Estas últimas, según fuentes variadas, asciende en promedio a 1,275 toneladas anuales, que hasta el momento son desechadas como basura (1) y de acuerdo con la nueva ecología de reutilizar, reciclar y reducir; para el caso, de las semillas, es posible extraer varios compuestos bioquímicas que pueden servir en la alimentación humana o animal, como proteínas, lípidos, carbohidratos, entre otros. El INIFAP desde 1988 estableció un banco de germoplasma, y suministró doce selecciones para investigar desde el enfoque de la bioquímica los contenidos de las mismas (4), con la finalidad de contribuir a su registro como variedades de México. OBJETIVOS Los objetivos de este trabajo fueron conocer la cantidad de proteínas que se pueden extraer de las semillas de las selecciones de guayaba, y evaluar las fracciones de proteínas en base a su peso molecular. MATERIALES Y MÉTODOS El trabajo se realizó en el centro básico de la UAA en abril del 2004. El INIFAP proporcionó las selecciones: 7, 10, 11,12, 20, 46, 47, 48, 106, 113, 118,126, y el testigo 1 se adquirió en la central de abastos. Para la extracción de las fracciones de proteínas se utilizó el procedimiento de Osborne (3), que consiste en someter la harina de semilla en presencia de diferentes Buffer de extracción, así para las albúminas se empleo agua a pH de 7, las globulinas se extrajeron con una solución 0.5 M de NaCl, las prolaminas con isopropanol al 70 % y las glutelinas con Bórax 0.1 M y SDS 1 % a pH de 10, se emplearon 2 g de muestra con tamaño de partícula 210 µm (tamiz No. 70), en tubo nalgene para centrifuga de 50 ml. Para cada fracción de proteína las muestras se colocaron en agitación por 24 h, a temperatura de 0 ºC y después se centrifugaron a 9000 rpm por 15 min. Para cuantificarlas se utilizó un ensayo colorimétrico de Bio rad, se trazaron curvas patrón de seroalbúmina bovina a diferentes concentraciones y se analizaron en espectrómetro UV a 750 nm. La concentración de proteínas solubles se determinó por interpolación con el ensayo de Lowry y Peterson. Para analizar los resultados de las fracciones de proteínas de reserva se empleó un diseño completamente al azar considerando a cada selección como tratamiento con tres repeticiones. Con los datos registrados se calculó el análisis de varianza y para la comparación de medias se utilizó la prueba DMS. Por otra parte, para analizar las fracciones de proteínas se empleó la técnica de Laemmli (2) de geles continuos desnaturalizantes con SDS. Se emplearon 50 mg de harina de cada selección de guayaba, a los cuales se agregaron 400 ml de buffer de extracción, después de la incubación, se centrifugaron para separar las proteínas de reserva. Para realizar los corrimientos electroforéticos en los geles de separación y concentrador se utilizó cámara de electroforesis con portageles y analizador de imágenes para visualizar los carriles y bandas de las fracciones de proteínas, asimismo, los marcadores de peso molecular empleados fueron: thiosephosfato isomerasa, mioglobina, α lactoalbúmina y aprotinina. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Los resultados de la extracción y cuantificación de las fracciones de proteínas de reserva se muestran en la Fig. 1 y mediante la comparación de medias, se observó que la S-12 contiene mayor cantidad de albúminas 28.81mg, la S-7 valores altos en globulinas 10.48 mg, prolaminas 53.38 mg, y glutelinas 137.25 mg, (cantidades relacionadas a un gramo de harina), aunque ésta fracción de proteína resultó estadísticamente igual a la que exhiben la selección 48 y el testigo. Otra evidencia de la expresión diferencial de proteínas entre selecciones fue el abundante contenido de glutelinas con referencia al resto de las otras fracciones. De acuerdo con los datos obtenidos, las fracciones de las selecciones de guayaba se parecerían más a los cereales que a las leguminosas por el contenido de glutelinas y prolaminas presentes en mayor cantidad que las albúminas y globulinas. Los cálculos estadísticos realizados con los datos obtenidos, de las fracciones de proteína extraídas de las semillas de las selecciones de guayaba indicaron diferencias altamente significativas entre los tratamientos y los coeficientes de variación señalan confianza en los resultados. SE ALBUMI GLOBULI PROLAMI GLUTELIN L. NAS NAS NAS AS T 9.6487 G 6.4600 CD 16.5590 B 132.821 A 7 19.0400 C 10.4765 A 53.3843 A 137.3543 A 10 5.1470 DEF G BC 15.8443 BC 98.2340 11 11.7230 E F 12.9513 E 14.4900 12 28.8137 A 8.2760 B 16.5470 DE 119.4020 B C B 121.5137 B 20 20.7050 B 6.246 CDE 12.2220 46 15.5123 D 5.5335 DEF 14.3740 G 91.3053 E H DE 107.1790 D 47 6.3130 H 4.4870 FG 12.9647 FG 48 9.8993 G 4.6140 FG 12.3960 106 10.7777 G 3.8725 G 13.0160 113 H 4.9685 EFG 13.7933 G 143.2310 A H FG 112.7097 C D G 120.2737 B 118 12.1963 E F 126 9.3587 G 5.3525 DEF 15.4027 7.0500 BC C. V. 13.28 % 4.9960 6.43 % 6.9580 82.2230 E F 11.567 EF 119.0600 B G C H 108.4781 D 3.82 % 3.86 % Fig. 1. Comparación de medias de fracciones de proteínas de harina de semillas de selecciones de guayaba (mg/g de harina). El perfil electroforético para las selecciones de guayaba muestra diferencias entre carriles y bandas, por ejemplo, la S-18, S-126, S-7 y T-1, mostraron tres fracciones de proteína con pesos moleculares mayores al marcador de M M M O M O N G O N G Ó N N O G D O MEEEM MO ORRRIIIAAA PPPRRRIIIM MEEERRR CCCO ON NG GRRREEESSSO O EEESSSTTTAAATTTAAALLL “““LLLAAA IIIN NVVVEEESSSTTTIIIG GAAACCCIIIÓ ÓN N EEEN N EEELLL PPPO OSSSG GRRRAAAD DO O””” peso molecular tiosephosfato isomeraza (26. 625 kDa); las selecciones 106, 113 y 118 tienen fracciones de proteínas que varían entre 23 y 6 kDa (aprotinina 6.5121 kDa) y las selecciones con menor numero de bandas son 46, 47 y 20 y su peso molecular oscila entre 23 y 12 kDa (α lactoalbúmina 14.437 kDa) CONCLUSIONES Las proteínas de reserva extraídas de harina de semillas de guayaba, mostraron expresión diferencial entre selecciones, y los resultados señalan que la selección 7 tiene la mayor cantidad de globulinas, prolaminas y glutelinas y las S-12 de albúminas que las demás selecciones. Asimismo, se encontró que al sumar las fracciones de proteínas; las semillas de las selecciones contienen entre 22 % y 17.5 % de proteína, lo que significa la posibilidad y conveniencia de recuperar este subproducto para emplearlo como alimento. BIBLIOGRAFÍA 1. González, G. E.; Padilla, R. J. S.; Reyes, M. L.; Perales de la Cruz, M. A.; Esquivel, V. F. 2002. Guayabo su cultivo en México. INIFAP. C. E. P. Aguascalientes, México, 182 p. 2. Laemmli, U. K. 1970. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T. Nature. 227:680:685