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PROYECTO
Estudio del papel de la alfa sinucleina y las células madre mesenquimales de
placenta en la enfermedad de Parkinson
Investigadora Principal: Dra. Ana Isabel Flores de la Cal, Grupo de
Medicina Regenerativa del Instituto de Investigación Hospital 12 de
Octubre
Colaborador: Dr. José Antonio Molina Arjona, neurólogo del Hospital 12
de Octubre
INTRODUCCIÓN
La enfermedad de Parkinson es un trastorno neurodegenerativo que, de forma
lenta y progresiva, afecta al movimiento, el control muscular y el equilibrio. Se
produce por la degeneración de las neuronas dopaminérgicas en la zona del
cerebro que se conoce como sustancia nigra. La dopamina es un mensajero
químico responsable de transmitir señales entre la sustancia negra y el cuerpo
estriado, para producir movimientos suaves y decididos. La pérdida de
dopamina produce patrones anormales de activación nerviosa dentro del
cerebro que causan deterioro del movimiento. Cuando aproximadamente el 6080% de las células productoras de dopamina están dañadas aparecen los
síntomas motores de la enfermedad.
La enfermedad de Parkinson afecta a unos cuatro millones de personas en
todo el mundo. En España más de 100.000 personas padecen esta patología, y
cada año surgen veinte nuevos casos de enfermos de Parkinson por cada
100.000 habitantes. Además de los trastornos motores la enfermedad de
Parkinson cursa con numerosos síntomas no motores que afectan a la esfera
cognitiva (demencia, deficit de atención, psicosis), sensorial (sensibilidad al
dolor, anosmia), al humor (depresión, ansiedad), al sueño (insomnio, fatiga
crónica) y al sistema nervioso autónomo (hipotensión ortostática, sudoración
excesiva, problemas urinarios, estreñimiento).
Diversas hipótesis atribuyen la enfermedad a factores genéticos (se han
reconocido algunos genes mutantes como responsables), metabólicos (estrés
oxidativo) o ambientales (plaguicidas, aluminio). El 10 % de los pacientes
muestran predisposición genética.
Histológicamente, la enfermedad se caracteriza por la presencia de los cuerpos
de Lewy en las neuronas de la sustancia negra y el locus coeruleus, aunque
también pueden aparecer en otras localizaciones del sistema extrapiramidal,
como son los plexos entéricos de Auerbach y Meissner [1]. Se trata de
inclusiones intracitoplasmáticas compuestas por proteínas, ácidos grasos
libres, esfingomielina y polisacáridos. El componente mayoritario de los
cuerpos de Lewy son los agregados de la proteína alfa-sinucleína [2]. A pesar
de encontrarse en la mayoría de los compartimentos celulares, la presencia de
alfa sinucleína es mayor en los terminales presinápticos [3] y, así, se le atribuye
un papel en el transporte vesicular y en la liberación de neurotransmisores [4].
El hallazgo de mutaciones por cambio de aminoácido, así como duplicaciones
en el gen SCNA, que codifica para alfa- sinucleína, en pacientes con
enfermedad de Parkinson familiar, sugiere un papel relevante de alfa-sinucleína
en la etiología de la enfermedad [5].
La proteína alfa-sinucleína se encuentra sin plegar a pH neutro, sin embargo,
cuando se une a membranas o vesículas que contienen fosfolípidos ácidos
adopta estructura de alfa-hélice. Bajo determinadas condiciones, alfasinucleína se agrega en forma de oligómeros que sufren una conversión
gradual a estructuras fibrilares con plegamiento en hoja beta. Estas estructuras
forman los cuerpos de Lewy y las evidencias apuntan a que son los
intermediarios oligoméricos solubles los que son tóxicos para la célula.
Recientemente se ha publicado el hallazgo de que neuronas, procedentes de
mesencéfalo embrionario, y que habían sido trasplantadas a enfermos de
Parkinson al menos diez años antes de su muerte, presentaban cuerpos de
Lewy alfa-sinucleína positivos [6-8]. Estas observaciones clínicas sugieren
que alfa-sinucleína podría, por un mecanismo tipo prión, ser transferida de
célula a célula [9, 10]. Es posible detectar formas oligoméricas y monoméricas
de alfa sinucleína en líquido cefalorraquídeo y en el plasma de individuos sanos
y de pacientes de Parkinson [11]. En cultivos celulares también se han
detectado monómeros y agregados de alfa-sinucleína en el medio de cultivo
[12].
Dado que en la enfermedad de Parkinson algunos de los síntomas no motores
bastante frecuentes, tales como la pérdida del sentido del olfato (anosmia), las
alteraciones del sueño y los síntomas gastrointestinales, pueden aparecer
incluso años antes que los síntomas motores, se postula el posible origen de la
enfermedad fuera del cerebro [13]. El hallazgo de cuerpos de Lewy en dos
lugares del tracto digestivo, esófago [14] y colon [15], así como en el plexo
submucoso y en el plexo mientérico en el sistema nervioso entérico (ENS) de
pacientes de Parkinson [16, 17], sustenta la posibilidad de que en los nervios
periféricos pueda estar el origen de la enfermedad. El tracto digestivo y el
cerebro están anatómicamente ligados a través del núcleo posterior del nervio
vago, siendo ésta una de las regiones del cerebro que más tempranamente
muestra la patología por cuerpos de Lewy en el transcurso de la enfermedad
[18]. Las neuronas del plexo submucoso y del plexo mientérico están
expuestas, por su localización en el tracto digestivo, a numerosos agentes
potencialmente dañinos, tales como los productos del metabolismo bacteriano,
con capacidad de inducir estrés oxidativo y mecanismos inflamatorios [19, 20].
Aún más, la composición de la flora bacteriana de los individuos está
influenciada por factores genéticos y por factores ambientales tales como la
dieta [21].
En la Consulta de Trastornos de Movimiento del servicio de Neurología del
Hospital 12 de Octubre se está realizando un tratamiento aprobado por las
autoridades del hospital y las Agencias Española y Europea del Medicamento
en enfermos con un grado avanzado de la enfermedad y sin otras alternativas
terapéuticas. Este tratamiento se denomina Duodopa® y consiste en la
administración de L Dopa en infusión continua en el duodeno. Para la
administración del medicamento se requiere la realización de una
dudodenostomía en los pacientes, lo que ofrece la posibilidad de obtener una
biopsia (previo firma del consentimiento informado que se presenta) en el
mismo acto terapéutico para estudiar la presencia de depósitos de alfa
sinucleína a nivel de los plexos nerviosos submucosos y que podría ser útil
para establecer medidas diagnósticas de la enfermedad de Parkinson en la
práctica clínica. Este mismo procedimiento ya fue aprobado por el CEIC de
este hospital para otro proyecto (“Estudio de un grupo de pacientes con
enfermedad de Parkinson avanzada, subsidiarios de tratamiento con L-Dopa en
infusión continua duodenal” a cargo del Dr. José A. Molina).
RESULTADOS OBTENIDOS HASTA EL MOMENTO.
En el presente proyecto, dirigido por la Dra. Ana Isabel Flores de la Cal y en
colaboración con el Dr. José Antonio Molina ya se han obtenido diversos
resultados. Por un lado, se han obtenido muestras gástricas de pacientes de
Parkinson sometidos a una duodenostomía para recibir el tratamiento de
Duodopa®, así como de individuos sanos que se han empleado como
controles. En las muestras se ha analizado la presencia o ausencia de la
proteína alfa-sinucleína. Los resultados han mostrado la presencia de
sinucleína en la mucosa gástrica de la gran mayoría de los pacientes de
Parkinson y su ausencia en los individuos sanos [22]. Esto sugiere que en la
enfermedad de Parkinson es posible encontrar alteraciones fuera del sistema
nervioso central y cuyo significado fisiopatológico está aún sin clarificar.
Por otro lado, se ha obtenido tejido cerebral del Banco de Tejidos de la
Fundación
CIEN
(BT-CIEN,
Fundación
Centro
de
Investigación
de
Enfermedades Neurológicas). En una primera aproximación se ha evaluado la
estructura de la proteína alfa-sinucleína presente en el cerebro de los enfermos
de Parkinson y se ha comparado con la de los sujetos sanos. Los resultados
indican la presencia de dos formas de la proteína en los enfermos de
Parkinson, una alfa-sinucleína normal o soluble y una alfa-sinucleína mal
plegada o insoluble y que es la estructura patológica. Sin embargo, en el
cerebro de los sujetos sanos no se observa la presencia de la proteína mal
plegada o insoluble.
Además, en el laboratorio se han obtenido y/o cultivado células de
neuroblastoma, células madre de placenta humana, y neuronas obtenidas por
diferenciación de las células madre de placenta. Mediante técnicas de
inmunofluorescencia, así como de western blot, empleando anticuerpos
específicos que detectan la proteína total, se ha comprobado que las células de
neuroblastoma tienen la proteína alfa-sinucleína en cantidades fácilmente
detectables, mientras que dicha proteína está presente aunque es menos
abundante en las células madre de placenta y en las neuronas diferenciadas de
ellas. La presencia de la proteína alfa-sinucleína tanto en células de
neuroblastoma, como en células madre de placenta y en las neuronas
obtenidas a partir de la diferenciación de las células de placenta nos pueden
servir como modelos de estudio de la fisiopatología de la enfermedad y de su
trasmisión célula a célula.
HIPÓTESIS PARA LA CONTINUACIÓN DEL PROYECTO.
Ya hemos demostrado la presencia de alfa-sinucleína a nivel de la submucosa
gástrica en pacientes de Parkinson.
Nuestro grupo de Medicina Regenerativa del Instituto de Investigación Hospital
12 de Octubre (i + 12) ha aislado y caracterizado unas células de tipo
mesenquimal de la placenta humana con gran capacidad regenerativa y de
inmunoprotección.
El presente proyecto pretende estudiar si la alfa-sinucleina presente por un
lado, en el cerebro de los enfermos de Parkinson, y por otro, en las muestras
gástricas de dichos pacientes es capaz de actuar como un factor priónico
capaz de infectar las células madre mesenquimales de placenta sin diferenciar,
células neurales obtenidas mediante diferenciación de las células madre
mesenquimales de placenta, y compararlo con el efecto obtenido sobre una
línea de células neurales en cultivo.
OBJETIVOS:
1.
Para la puesta a punto de las técnicas y de la corroboración de nuestra
hipóteis, incialmente se empleará una proteína alfa-sinucleína recombinante
que se va a fibrilar en el laboratorio con el fin de obtener una alfa-sinucleína
mal plegada y que sea semejante a la encontrada en el cerebro de los
enfermos de Parkinson. Las tres líneas celulares anteriormente descritas se
cultivarán con esta alfa-sinucleína mal plegada. Con esto se pretende ver si en
las células se observa la aparición de alfa-sinucleína mal plegada y/o
agreagada. De ser así, dispondríamos de un modelo fácil y reproducible en el
laboratorio de “transmisión” de la proteína patológica y que nos permitiría el
estudio de este proceso y el ensayo de fármacos. En este objetivo se pretende
además estudiar si existen alteraciones en el funcionamiento celular. En este
sentido se va a analizar si se produce una alteración de la función mitocondrial
y/o si se detecta el aumento de radicales libres que puedan inducir la muerte
celular. En el caso de que alguno de los tipos celulares no presentara esta
forma patológica de la proteína podría sugerir que esas células poseen
mecanismos de protección que sería importante investigar.
2.
Se realizarán estudios semejantes a los descritos en el punto 1, pero
usando como fuente de alfa-sinucleína mal plegada las muestras de tejido de
cerebros de pacientes con Parkinson y/o de muestras de la mucosa gástrica de
dichos pacientes.
PERIODO DE DURACIÓN: 1-2 años
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