"humanizarse" los anticuerpos monoclonales?. Aplicaciones.

Seminarios 8 y 14.
Humanización de Ac monoclonales y aplicaciones
Maribel Carreres
Mónica Payá
Francisco José Botella
INTRODUCCIÓN
¿Qué es un anticuerpo?
Un anticuerpo es una glicoproteína perteneciente al grupo de las
gammaglobulinas, producidas por linfocitos B, que es capaz de unirse
específicamente a un antígeno.
Los anticuerpos poseen cuatro cadenas polipeptídicas, idénticas dos a dos,
y con diferente peso molecular(pesadas y ligeras), ensambladas entre sí mediante
puentes disulfuro. Cada una de estas cadenas posee regiones con un alto grado
de conservación en su secuencia aminoacídica de anticuerpo a anticuerpo
(regiones constantes), a las cuales se asocian la mayoría de las funciones
efectoras de la molécula, y otras regiones de secuencia menos conservada
(regiones variables), por donde se produce la interacción entre el anticuerpo y el
antígeno. Las regiones variables de sus cadenas ligeras y pesadas poseen hacia el
extremo amino-terminal tres segmentos hipervariables (regiones determinantes
de la complementariedad, CDR) que contienen los residuos que establecen
contacto con los determinantes antigénicos. El resto de la región variable se
denomina marco (M), con cuatro segmentos (M1, M2, M3, M4), que acotan las
tres CDR. La estructura constituida por la proyección tridimensional de las CDR
de ambas cadenas forma el sitio activo que interactúa con el antígeno.
La digestión de anticuerpos con determinados enzimas (papaína) produce
dos tipos de fragmentos proteicos. Uno de ellos cristaliza de forma espontánea,
por lo que recibe el nombre de fragmento cristalizable o Fc, sin apenas capacidad
de unión al antígeno. Este fragmento cristalizable se corresponde con la región
constante del anticuerpo. El otro fragmento es el de unión al antígeno o Fab
(Fragment antigen-binding, en inglés).
Existen dos tipos de preparados de anticuerpos:
 Policlonales, son mezclas de Ac que son los derivados de la acción de
reconocimiento y activación de varios clones de linfocitos B por un antígeno.
Con frecuencia se denominan antisueros.
 Monoclonales, que son producidos por un único clon específico de
linfocitos B, pertenecen a una clase y subclase determinadas y tienen una
especificidad única frente a un antígeno determinado.
Aplicaciones
Los anticuerpos monoclonales están siendo utilizados en innumerables
campos de la investigación biomédica. Así, han sido utilizados como biosensores
acoplados a transductores electrónicos, tanto para la detección de moléculas
orgánicas como inorgánicas (contaminación de metales pesados en alimentos y
agua, detección de gases tóxicos, etc.). También se han utilizado como
catalizadores de múltiples reacciones. En la clínica, uno de los usos más
frecuentes ha sido el del diagnóstico, dada su exquisita especificidad y su
capacidad prácticamente ilimitada para reconocer cualquier estructura química
(por ejemplo, en citometría de flujo para la identificación de poblaciones
leucocitarias y leucemias). Puede reseñarse, asimismo, su uso para la detección
de trombos.
Las aplicaciones terapéuticas constituyen, sin embargo, uno de los
campos más interesantes de aplicación de los anticuerpos monoclonales, ya que
son capaces de destruir células, incluidas las tumorales, mediante distintos
mecanismos. Por esta razón, son excelentes candidatos para el tratamiento de
enfermedades autoinmunes, el cáncer o en trasplantes para evitar el rechazo. Su
aplicación en el tratamiento de enfermedades infecciosas está en desarrollo.
Identificación y clonaje de genes
Investigación Identificación y aislamiento de proteínas
biomédica Activación de enzimas
Arquitectura molecular, morfogénesis
Detección y cuantificación de hormonas, vitaminas, citocinas,
factores tisulares, etc.
Monitorización de drogas
Enfermedades infecciosas, microbiología
Diagnóstico Alergia
Hematología
Trazadores de tumores e infartos de miocardio
Inmunoescintografía (=Inmunogammagrafía)
Aplicaciones forenses
Técnicas (ELISA, EIA, citometría, inmunohistoquímica, etc.)
Catálisis
Biosensores
Enfermedades autoinmunes
Terapia Trasplantes (órganos, médula ósea)
Enfermedades infecciosas (virales, bacterianas y parasitarias)
Cáncer
Degradación del colesterol
Modulación de hormonas
Otras:
Modulación de receptores
Reversión de sobredosis de drogas
Ventajas frente a los antisueros policlonales
 Producción ilimitada de anticuerpos muy específicos (cultivos celulares a
escala industrial)
 Ausencia de requerimientos de antígenos puros para obtener nuevas
cantidades de anticuerpos
 Facilidad de conservar los clones de hibridomas, mediante nitrógeno líquido
u otras técnicas estándar de conservación.
 Desventajas frente a los antisueros policlonales:
 Se requieren niveles notables de tecnología y de especialización profesional
 Los costes son generalmente muy elevados
 El tiempo requerido en el proceso de obtención
 A veces la elevada especificidad puede ser un problema y no una ventaja,
tal como ocurre en determinados usos analíticos.
Inconvenientes
Los anticuerpos monoclonales no son útiles frente a Ag polimórficos, es
decir, frente a Ag que no tengan un epítopo conservado.
Por otra parte, los anticuerpos monoclonales de ratón presentan un
problema ya que, pese a ser perfectamente válidos para todos los usos indicados,
no son útiles para su empleo en seres humanos, especialmente en terapias que
requieran tratamientos prolongados, ya que el sistema inmune los identifica como
cuerpos extraños1 y reacciona para destruirlos, por lo que su eficacia terapéutica
se ve claramente disminuida. Esto último es responsable de la mayoría de los
efectos secundarios, tales como nefrotoxicidad, reacciones anafilácticas, etc.
La alternativa sería, en este sentido, obtener anticuerpos monoclonales
humanos, lo que reviste importantes problemas por razones tanto éticas como
técnicas.
MEJORAS DE AcM PARA
APLICACIONES “IN VIVO”
Para mejorar los problemas que presentan los anticuerpos monoclonales se
están desarrollando gracias a la industria biotecnológica una gran variedad de
anticuerpos recombinantes. A continuación detallamos los más relevantes.
Regiones Fab y Fv
Los fragmentos de anticuerpos -tipos Fv y Fab-, ofrecen gran atractivo en
el campo del diagnóstico y de la terapéutica in vivo merced a su pequeño tamaño.
Los fragmentos Fv están constituidos exclusivamente por las regiones variables
de las cadenas pesada y ligera (VH y VL), formando el sitio activo específico del
anticuerpo sin mediar puentes de azufre para su conformación. Por el contrario,
los Fab también contienen la primera región constante de cada cadena (CH1 y CL).
De pequeño tamaño, parecen ideales para su empleo en la destoxificación,
el transporte dirigido y la catálisis, si bien las interacciones débiles que unen las
regiones variables los hacen muy inestables a temperaturas fisiológicas. Por
tanto, se han ideado toda una serie de péptidos de enlace, generándose proteínas
1
Inmunogenicidad impuesta por las secuencias que se conservan en Ac ratón, y no se dan en Ac de humanos.
de fusión VH-VL. Esto permite que se mantenga la estructura de reconocimiento
del antígeno. Además, también se han creado proteínas de fusión con otros
dominios para aumentar su estabilidad y/o avidez, originándose estructuras
multivalentes.
Estructura:
Obtención:
Se han utilizado distintos sistemas de expresión para la gran variedad de
fragmentos de anticuerpos existentes, incluyendo, bacterias, levaduras, plantas,
células de insecto y células de mamífero. Cada una tiene sus ventajas,
aplicaciones potenciales y limitaciones. Las restricciones de uso de cada modelo,
vienen impuestas, en su mayor parte, por las modificaciones postranscripcionales
y postraduccionales que se tengan que realizar y por la complejidad estructural y
de tamaño de la proteína producida. Así, las bacterias serían muy convenientes
para la producción de fragmentos de anticuerpo, pero no para anticuerpos
completos.
Pros y contras:
Los Fv, con respecto a los Fab, se retienen durante menos tiempo en tejidos
diana, un aclaramiento en sangre más rápido y mejor penetración en tumores.
Además, son menos inmunogénicos y presentan menos problemas cuando se
fusionan con otros péptidos y/o proteínas. Por el contrario, tienen deficiencias en
estabilidad, afinidad y avidez. Tanto los Fab como los Fv tienen la limitación de
carecer de las funciones efectoras mediadas por Fc: activación del complemento,
opsonización, ADCC, que son esenciales cuando se trata de eliminar más que de
bloquear la función.
Aplicaciones:
Imagen de tejidos, destoxificación, direccionamiento de toxinas, drogas,
radionúclidos, etc a células tumorales.
Anticuerpos quimera
Este tipo de anticuerpos monoclonales mantienen las regiones variables
murinas, pero acopladas con regiones constantes humanas, es decir, VH y VL de
ratón, y el resto humano.
2Estructura:
Obtención:
Utilizando la producción de hibridomas, seleccionando por dilución límite, y
modificando por ingeniería genética para obtener un anticuerpo que exprese la
región constante de la IgG humana y la región variable murina.
Como son Ac completos se usan sistemas de expresión distintos de
procariotas, debido a que en sistemas de bacterias no se obtiene proteínas
nativas, ya que es muy frecuente la formación de agregados, y no efectúan las
modificaciones pre y post traduccionales propias de eucariotas.
Pros y contras:
Se consigue aumentar la avidez y la afinidad frente a los Fab, manteniendo
la
especificidad
de
unión.
Además
disminuye,
aunque
no
elimina,
la
inmunogenicidad con respecto a los AcM de ratón manifiestando una mayor vida
media biológica in vivo. La mayoría de los AcM en uso terapéutico son de este
tipo como se detalla más adelante.
Anticuerpos humanizados
Con el fin de aumentar la homología con Ac humanos se han sintetizado Ac
con CDR procedente de ratón, manteniendo las regiones marco (resto de la región
Fab) y la región Fc humanas. Se intenta que sean más similares a los humanos
que los quiméricos, y quizás menos inmunogénicos que los anteriores.
Se requiere máxima homología de secuencia posible entre el donador
(ratón) y el aceptor (hombre) en las regiones marco presentes en la región
2
El color amarillo indica las regiones codificadas por segmentos de ADN murino, y el rojo por ADN humano
variable. Esto se ha visto q es así porque estas dan soporte estructural a las CDR
para mantener la afinidad por el Ag que interesa.
Estructura:
Obtención:
Se pueden generar ratones transgénicos con los genes de producción de
inmunoglobulinas han sido modificados para expresar las CDR de ratón y el resto
humano y generar los hibridomas a partir de estos, o se pueden generar primero
los hibridomas, y modificarlos.
Pros y contras:
Supuestamente son menos inmunogénicos, pero la inmunogenicidad no
depende necesariamente de la cantidad de parte humana, ya que las partes
humanas pueden ser inmunogénicos, si se parecen a Ig de ratón.
Otro factor limitante sería encontrar en las bases de datos secuencias
marco humanas homólogas a las de ratón.
Anticuerpos humanos
No contiene ninguna secuencia procedente de otro organismo.
Estructura:
Obtención:
-
De donadores inmunes. Algunos Ac se han obtenido de donadores
humanos inmunizados usando o células B transformadas por VEB3, o
por RT-PCR, clonaje y phage-display.
-
De librerías de fagos procedentes de combinaciones aleatorias de
regiones V humanas sintéticas.
3
Nótese que aquí la selección clonal es “in vitro”.
-
De ratones transgénicos, en los cuales se han sustituido sus genes para
Ig por genes para Ig humanos utilizando grandes cantidades de DNA en
cromosomas artificiales (YACs). Se denominan xenoratones.
-
De ratones humanizados (hu-mice) Son ratones inmunodeficientes que
son transplantados con médula ósea humana. No rechazan el injerto y
si éste es exitoso regenera un sistema hematopoyético humano.
Pros y contras:
La respuesta inmune desencadenada es teóricamente menor, además de
que las funciones efectoras en el organismo aceptor se van a mantener.
En contra tenemos implicaciones éticas, en el caso de obtención a partir de
donadores.
Otro hecho a tener en cuenta es la obtención de anticuerpos que puedan
ser utilizados en la mayoría de pacientes, por tanto deben tener secuencias
frecuentes, por lo que se deberían hacer estudios estadísticos en la población
humana para ver que secuencias son las más comunes.
USOS Y APLICACIONES ACTUALES
Actualmente ya están disponibles comercialmente más de una decena de
anticuerpos monoclonales empleados para diferentes utilidades terapéuticas o
diagnósticas “in vivo”.
Los mecanismos a través de los cuales un anticuerpo monoclonal puede
resultar útil terapéuticamente son variados, yendo desde el simple bloqueo del
receptor antigénico en las células efectoras, hasta la acción citotóxica sobre las
células que expresan el antígeno correspondiente, pasando por múltiples
opciones de modulación celular.
Asimismo, frecuentemente se utilizan los anticuerpos monoclonales como:
1. Transportadores de toxinas para destruir las células portadoras de
ciertos antígenos.
2. Trasportadores de fármacos para una acción muy localizada.
3. Transportadores de radionúclidos (elementos isotópicos radiactivos).
3.1. Radioterapia muy localizada (radioinmunoterapia).
3.2. Diagnóstico mediante imagen (radioinmunodiagnóstico).
4. Bloqueadores de la función biológica de moléculas endógenas (por
ejemplo bloqueando la función de IgE en alergias).
5. Agentes inductores de citotoxicidad (mediada por complemento o
celular).
Tratamiento del cáncer:
Para el tratamiento del cáncer podemos usar Ac que desempeñen las
funciones 1 a 5 (del anterior punto). El factor limitante reside en encontrar Ag
específicos de células tumorales.
Un ejemplo de su uso está en el tratamiento del cáncer de mama. Una
empresa
farmacéutica
ha
producido
un
Ac
humanizado
recombinante
(trastuzumab, comercializado como herceptin) que es capaz de bloquear el
receptor HER2 de las células tumorales, impidiendo su creciemiento.
Sobreexpresión de HER2 en 20-30% de los tumores de mama
El problema es que ese receptor sólo lo sobreexpresan un 20% de los cánceres de
mama, y el Ac es poco específico para evitar que dañe tejidos sanos. En
combinación con quimioterapia, es la mejor opción terapéutica desponible
actualmente.
Su principal ventaja es que permite tratar estados metastásicos avanzados.
Transplantes
Los anticuerpos monoclonales frente a las células T ofrecen una
concentración mucho mayor de moléculas de anticuerpo con actividad específica
comparados con los sueros policlonales. El AcM murino OKT3 se emplea desde
finales de los 80 en el tratamiento del rechazo agudo. El OKT3 se une al complejo
receptor de antígeno de la célula T (TCR/CD3) provocando inicialmente una
activación inespecífica de la célula T. Posteriormente, el OKT3 bloquea la unión
del TCR al antígeno, lo que da lugar a la modulación de todo el complejo
TCR/CD3 de la superficie de la célula T. En pocas horas los linfocitos T se
eliminan, tanto por activación del complemento como por opsonización.
Se
emplea a dosis suficientes para reducir la cifra de linfocitos T circulantes a <2%
de los linfocitos (normal 60-80%) El OKT3 también se utiliza en el momento del
trasplante; como la GAL, parece que retrasa el inicio de los episodios de rechazo
y reduce su incidencia. Sin embargo, los beneficios obtenidos con la profilaxis
con este agente deben sopesarse frente a sus efectos adversos tóxicos, el riesgo
de una inmunosupresión excesiva y el riesgo de que el paciente desarrolle
anticuerpos neutralizantes frente al anticuerpo monoclonal heterólogo, lo que le
haría ineficaz si se necesitara más tarde para tratar un episodio de rechazo.
Como sucede con la ciclosporina a dosis altas, se ha observado una mayor
incidencia de trastornos linfoproliferativos de células B inducidas por el VEB con
el uso repetido del OKT3.
A medida que conozcamos mejor el papel de las distintas subpoblaciones
de células T en la reacción de rechazo, el uso de los anticuerpos monoclonales
que reaccionen con subpoblaciones específicas permitirá incluso una mayor
selectividad en la supresión inmunitaria. Por ejemplo, se están realizando
ensayos clínicos con anticuerpos monoclonales que reaccionan con antígenos
presentes sólo en las células T activadas (respetando a las células T que no
participan en el rechazo).
Otro ejemplo es el Basiliximab (Simulect), un AcM de tipo quimérico que
se une selectivamente a la cadena alfa del receptor de interleucina 2 (IL-2),
denominado receptor CD25, bloqueando así la activación de los linfocitos T
inducida por IL-2. Este efecto se produce disminuyendo sólo mínimamente el
número de linfocitos T circulantes, lo que se traduce es una escasa incidencia en
los elementos estructurales del sistema inmunológico. La activación de linfocitos
T por la interleucina 2 está implicada en todos los procesos inmunitarios en que
intervienen los linfocitos T, como los procesos de rechazo agudo de injertos.
Es
un
agente
que
se
utiliza
siempre
en
asociación
a
otros
inmunosupresores estándar (ciclosporina/corticosteroides) como tratamiento
preventivo del rechazo agudo en pacientes sometidos a trasplante de riñón,
debido a que su mecanismo de acción es complementario con el de ciclosporina,
el fármaco inmunosupresor de base. Esta última actúa evitando la síntesis de
interleucina 2 (IL-2), mientras que basiliximab previene la estimulación de los
linfocitos T por IL-2.
Es un fármaco moderadamente eficaz en la reducción de las reacciones de
rechazo durante los primeros seis meses tras el trasplante de riñón. Pero
basiliximab presenta otros aspectos interesantes, como son la facilidad del
tratamiento (sólo se requieren dos dosis IV, separadas cuatro días entre sí) y la
excelente tolerabilidad del medicamento. Puede ser una interesante alternativa
en pacientes que vayan a ser sometidos por vez primera a un trasplante renal.
Enfermedades autoinmunes
Se originan por una respuesta del SI frente a Ag propios (autoantígenos).
Infliximab (Remicade).- Es una de los anticuerpos monoclonales actualmente
disponibles en clínica, del que incluso todavía no parece haberse terminado de
sacar todo el potencial terapéutico. Se trata de un anticuerpo monoclonal
quimérico anti TNF-alfa. Se utiliza en el tratamiento de la enfermedad de Crohn,
que es una enfermedad inflamatoria granulomatosa crónica (tHipersensibilidad
de tipo IV) que afecta sobre todo al tramo final del intestino delgado.
Hay importantes expectativas también en torno a su utilidad en artritis
reumatoide, indicación que está siendo objeto actualmente de evaluación en la
EMEA. Por su parte, la FDA autorizó al infliximab para el tratamiento de la
artritis reumatoide en combinación con metotrexato en noviembre de 1999.
En pacientes con artritis reumatoide, el infliximab es capaz de mejorar
sustancialmente los síntomas cuando se administra conjuntamente con
metotrexato.
En los pacientes con artritis reumatoide, el infliximab produce una
reducción de la infiltración de células inflamatorias en las áreas inflamadas de la
articulación, reduciendo la expresión de moléculas implicadas en la adhesión
celular, tales como E-Selectina, Molécula de Adhesión Intercelular-1 (ICAM-1) y
Molécula de Adhesión Vascular-1 (MCP-1), así como en la degradación tisular.
(En un amplio ensayo clínico, denominado ATTRACT (Anti-TNF Trial in
Rheumatoid Arthritis with Concomitant Therapy), el 50% de los pacientes tratados
con esta combinación mostró después de 30 semanas de tratamiento una
mejoría de al menos un 20% en los síntomas inflamatorios y funcionales
articulares, frente a sólo un 20% de los pacientes tratados exclusivamente con
metotrexato.)
Tratamiento de alergias:
Se están probando AcIgE humana. (rhuMab-E25, que reconoce Fc de IgE
y bloquea su unión a RFc de mastocitos y basófilos, inhibiendo la fase inicial de
las reacciones).
Perpesctivas futuras:
El futuro de los AcMH está en manos de los avances reales que se
produzcan en los mencionados procedimientos para la obtención de líneas
humanas estables y secretoras.
Existen ya, sin embargo, varios procedimientos que dan origen a nuevos
tipos de AcM, de segunda generación, en cuyo desarrollo se confía para
solucionar los problemas antes planteados. Sería muy útil, para muchas
aplicaciones potenciales, contar con Ig en las cuales cada sitio de unión
reaccione con un determinante antigénico diferente, y les permita interactuar
simultáneamente
con
antígenos
distintos:
son
los
Ac
bifuncionales
o
biespecíficos.
Se ha demostrado recientemente que la fusión de un hibridoma y linfocitos
de animales inmunizados (triomas), o la de dos hibridomas (cuadromas), puede
constituir una opción biológica alternativa para la producción de anticuerpos
bifuncionales. En cualquiera de estos dos casos, las regiones variables y
constantes de las cadenas de inmunoglobulinas de las células parentales
permanecen en unidades transcripcionales independientes y los "hibridomashíbridos" producen varias especies moleculares, de las cuales será Ac
bifuncional aquella que proceda de la asociación aleatoria de las cadenas
pesadas y totalmente restringida de cadenas ligeras.
En los apenas 15 años que nos separan del descubrimiento de la
tecnología de los anticuerpos monoclonales, estos biorreactivos se han
convertido en la principal aplicación de la biotecnología actual, además de
constituir una solución de futuro para los problemas que plantea el diagnóstico
y la terapia de los tumores malignos. La propia amplitud del repertorio natural
de especificidades de los anticuerpos y las nuevas posibilidades que se suman
gracias a la manipulación de éstos auguran la continuidad de su desarrollo.
BIBLIOGRAFÍA:
 Enlaces:

http://www.cof.es/pam231/revision_anticuerpos.htm Es la base que
hemos tomado.

http://oncologia.roche.es/
Información
monoclonales, obtención y usos.

http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/m_especial/recursos.html
Textos sobre microbiología especial. Incluye buenos textos sobre
producción y usos de anticuerpos e inmunosueros.

http://edicion-micro.usal.es/web/educativo/m_especial/10texto3.htm
Información sobre anticuerpos, características y producción (incluye a los
humanizados).

http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan/intro.html Estructura y diseño
de anticuerpos.

http://members.nbci.com/_XMCM/conganas/index.htm Todo sobre el
cáncer.

http://www.msd.es/publicaciones/mmerck/inicio.html Manual Merck.
Información para personal sanitario. Muy interesante el capítulo 149
TRASPLANTES.

http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/mikeimages.html Todo sobre las
inmunoglobulinas, estructura, función, producción, etc.
sobre
anticuerpos
 Revisiones:

Little M, Kipriyanov SM, Le Gall F, Moldenhauer G. Of mice and men:
hybridoma and recombinant antibodies. Immunol Today. 2000
Aug;21(8):364-70. Review. PMID: 10916138; UI: 20377416
http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/extlinks.html
http://www.path.cam.ac.uk/immuno/part1/
http://www.whfreeman.com/immunology/CHAPS.HTML
http://www.cryst.bbk.ac.uk/~ubcg07s/
http://mathbio.nimr.mrc.ac.uk/jsaldan/index.html
http://www.molbiol.ox.ac.uk/www/pathology/tig/new1/mabth.html
http://www.path.cam.ac.uk/~mrc7/humanisation/TAHHP.html