Laboratorio de Farmacolog a - Facultad de Ciencias Químicas e

Universidad Autónoma de Baja California
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería
Químico Farmacobiólogo
Manual del Laboratorio de Farmacología
Semestre 2008-1
Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Manual del Laboratorio de Farmacología
Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
Universidad Autónoma de Baja California
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería
Químico Farmacobiólogo
Práctica No. 1
Experimentación con Animales de Laboratorio
Objetivo
El alumno se familiarizará con los métodos empleados para la sujeción e identificación de
los animales utilizados en la práctica de laboratorio.
Introducción
El bienestar de los animales utilizados en investigación es un tema de interés y en muchos
países se han desarrollado leyes y regulaciones que aseguran ese bienestar. Se han buscado
alternativas para sustituir el uso de animales de laboratorio, como por ejemplo simulación
con computadoras, modelos in-vitro, cultivos de órganos y tejidos, y las modernas técnicas
biotecnológicas.
Sin embargo existen todavía limitantes de estas alternativas para algunos temas, sobre todo
en lo que se refiere a farmacología. Por lo que en algunos casos es indispensable la
utilización de animales, especialmente el de tipo roedor. Deben considerarse entonces
algunas medidas para su mantenimiento en lugares apropiados (bioterios); en donde
recibirán alimentación y cuidados especiales de acuerdo a las características propias de la
especie a que pertenecen, como son: alimentación, jaulas de contención, control de
enfermedades, reproducción, condiciones ambientales, etc.
Notas:
1. Se suspenderá en forma definitiva de las sesiones de laboratorio al alumno que
se sorprenda molestando a los animales (bajo ninguna circunstancia se deberá
hacer sufrir al animal, el maestro responsable deberá indicar la manera en
que ha de ser sacrificado, en caso necesario, así como su manejo durante la
experimentación).
2. En caso de mordedura la persona deberá acudir inmediatamente al CUMAI
para recibir inmunización contra tétanos, así como recibir atención
preventiva, aplica lo mismo para excoriaciones hechas por material que ha
estado en contacto con los animales. El animal agresor deberá ser puesto en
observación durante un período no menor de 10 días, el incidente debe ser
reportado tanto al instructor como al responsable del bioterio.
Procedimiento
1. Se hará un recorrido por las instalaciones en forma ordenada para identificar las
diferentes salas existentes.
2. El instructor mostrará la forma correcta en que se sujeta a cada animal de acuerdo a
su especie (conejo, ratón, rata y perro).
3. Anote todas sus observaciones.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
Universidad Autónoma de Baja California
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Químico Farmacobiólogo
Resultados
1. Elabore un informe escrito de las actividades realizadas durante el recorrido así
como de los siguientes datos:
a. Forma de sujetar a cada animal.
b. En caso de requerirse la administración de una sustancia, cual es el
procedimiento mas adecuado en cada caso (sujeción y administración)?
c. Las características de la cama que utilizan cada uno de ellos.
d. El tipo de alimentación (incluida agua y alimento sólido).
e. Las condiciones ambientales óptimas que deben existir en un bioterio.
f. Las diferentes formas de identificación que existen (marcaje).
2. Elabore sus conclusiones.
Cuestionario Complementario
1.
Cual es la dosis de pentobarbital utilizada por vía intraperitoneal para anestesiar al
ratón, rata, perro y conejo?
2.
Cual es el volumen máximo de una solución farmacológica que puede
administrarse a las especies mencionadas en la pregunta numero uno, por vía IV,
IM, IP, SC y Oral?
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Enero 30 de 2007
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
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Químico Farmacobiólogo
Práctica No. 2
Variabilidad Biológica
Objetivo
El alumno diferenciará los diferentes aspectos que pueden variar el efecto de un fármaco y
aplicarlos en los regimenes de dosificación.
Introducción
Los valores de las magnitudes biológicas no son constantes: varían en un mismo individuo
y entre los individuos. Este fenómeno, se conoce como variabilidad biológica. Esta
variabilidad se divide en variabilidad fisiológica, causada por las fluctuaciones metabólicas
y otros procesos fisiológicos, variabilidad patológica, causada por las enfermedades, y
variabilidad iatrogénica, causada principalmente por los tratamientos farmacológicos. Es
importante subrayar que la variabilidad biológica es un fenómeno absolutamente
independiente de la variabilidad debida a los procedimientos de medida, conocida como
variabilidad metrológica.
Las variaciones iatrogénicas están causadas, estrictamente, por medicamentos o actos
terapéuticos o diagnósticos. Sin embargo, no son los medicamentos los únicos
xenobióticos que pueden provocar la variación del valor de alguna magnitud biológica; los
xenobióticos de uso más generalizado en nuestra sociedad — cafeína, nicotina y etanol— y
las drogas de abuso también pueden hacerlo.
Así pues, la biología y la práctica clínica indican que no hay dos sujetos iguales, la
farmacología demuestra que la misma dosis de fármaco provoca una intensidad de
respuesta diferente en diferentes pacientes. Esta diversidad, en parte a la farmacocinética
(diferente absorción, metabolismo y excreción del fármaco) y a la farmacodinámia
(interacción fármaco-receptor), por causas del tipo genético, ambientales o del curso
clínico de las enfermedades (agudas, crónicas, etc.), hace que la medición de los
fenómenos biológicos varíe a causa de estos factores ingobernables o accidentales.
Los valores obtenidos serán diferentes, sin embargo cada valor se aproxima mas o menos
a un valor medio, por lo que puede decirse que ese conjunto de valores se distribuye en
torno a la media (X). Cuando mayor sea el número total de medidas, el valor de la media
se acercara al valor verdadero del fenómeno de referencia y la distribución de esas medidas
será simétrica porque las variaciones positivas o negativas se equilibran mutuamente. El
valor verdadero lo es teóricamente en un conjunto infinitamente grande o universo, pero
ante la imposibilidad de obtener ese conjunto o universo, podemos obtener un valor
cercano al verdadero si estudiamos una parte de tal universo, o sea efectuar un número
finito de medidas, experimentos u observaciones, que constituyen lo que se llama una
"muestra" colección de ensayo o tanteo.
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Enero 2007
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Procedimiento
1. Nombrar dos voluntarios por equipo, siguiendo los criterios de inclusión
establecidos.
2. Determinar la temperatura corporal basal de cada individuo.
3. Administrar una dosis de aspirina de 500mg a cada uno y determinar la temperatura
en los siguientes intervalos de tiempo: 5, 10, 15, 20, 25, 30 y 60 minutos
postadministración.
4. Concentrar en una tabla los resultados de cada equipo.
5. Con los datos de todo el grupo determinar las variables: media (X) y desviación
estándar (σ) a cada intervalo de tiempo.
6. Hacer una gráfica con los resultados, con un margen de ± una desviación estándar.
Resultados
1. Anota tus observaciones durante el experimento.
2. Elabora tus conclusiones con base en los resultados obtenidos y los plasmados en la
gráfica.
Cuestionario Complementario
1. Que es la desviación estándar.
2. Cuales son los factores más comunes que interfieren en la respuesta de un fármaco.
3. Como puede interferir la variabilidad biológica en un régimen terapéutico.
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Agosto 21 de 2006
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Práctica No. 3
Vías de Administración
Objetivo
El alumno será capaz de observar la influencia de las diferentes vías de administración,
utilizando animales de laboratorio y una solución que permitirá apreciar la llegada de los
compuestos administrados a diferentes órganos y tejidos.
Introducción
Existen diversos medios por los que el medicamento puede introducirse en el organismo.
Es posible que un mismo medicamento esté preparado para utilizar más de una vía, del
mismo modo que existen fármacos diseñados para acceder al organismo por un único
camino. Existen varias vías de administración para los medicamentos como la oral,
sublingual, bucal, tópica, transdérmica, inhalación, instilación ocular, rectal, vaginal o
parenteral (subcutánea, intramuscular, intravenosa). Cada medicamento está preparado
para ser administrado por vía determinada y que ejerza su acción de la forma más
conveniente. Para cada vía de administración existen diferentes formas farmacéuticas. Por
ejemplo, para la vía oral se preparan cápsulas, comprimidos, comprimidos recubiertos,
comprimidos efervescentes, comprimidos masticables, suspensiones, soluciones, jarabes,
elixires, etc.
La elección depende de diversas variables. Algunas son: el tipo de medicamento, es decir,
sus particularidades. La absorción del mismo: en qué lugar del organismo (estómago,
duodeno, piel, etc.) conviene que se produzca y a qué velocidad. El propio paciente; hay
que tener en cuenta los condicionantes fisiológicos (como el estado de su aparato digestivo,
necesidad de una acción más o menos rápida, etc.) y condicionantes psicológicos (es
frecuente que a los niños les entre mejor un jarabe que una grageas).
Procedimiento
1. Pesar las ratas y calcular para cada una el volumen de anestésico a administrar de
acuerdo al peso del animal y a una dosis ponderada de 15mg/100gr de peso.
2. Anestesiar las ratas administrando el volumen total de anestésico por vía
intraperitoneal (IP), dejar reposar 10 minutos.
3. Administrar azul de metileno al 0.01%, utilizar una rata para cada vía de
administración de acuerdo a la siguiente tabla:
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
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Vía de
Administración
Intravenosa (IV)
Intramuscular (IM)
Intraperitoneal (IP)
Subcutánea (SC)
Oral (PO)
Volumen a
Administrar (ml)
0.5
1-2
5-10
5-10
1-2
4. Dejar reposar 20 minutos y hacer la disección de cavidad abdominal.
5. Llevar a cabo una exploración física interna y por observación buscar azul de
metileno en órganos y tejidos.
6. Anotar tus datos en la tabla de resultados.
Cuestionario Complementario
1. Cuales son las principales vías de administración de fármacos?
2. Explique ventajas y desventajas en la terapéutica con fármacos en las siguientes
vías de administración: oral, sublingual, rectal, inhalación, subcutánea, intravenosa,
intratecal y tópica.
3. Define administración parenteral y menciona todos los tipos que conozcas.
4. Mencione dos fármacos que se apliquen por cada vía de administración.
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Agosto 21 de 2006
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
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Práctica No. 4
Fármacos Antihistamínicos
Objetivo
A través de la aplicación dérmica de histamina el alumno observará y medirá el efecto de
fármacos antihistamínicos.
Introducción
Los antihistamínicos han sido usados durante los últimos 50 años y se han convertido en
unos de los medicamentos de mayor prescripción en México. La denominación actual es
“antagonistas de los receptores de la histamina”, su acción consiste en evitar el efecto
de la histamina en los diferentes tejidos del cuerpo. La histamina o b-aminoetilimidazol fue
aislada por vez primera en 1907 por Windaus y Vogt; en 1910, Daley y Laidlow estudiaron
su efecto biológico y descubrieron que estimulaban a diversos músculos lisos. En 1940, se
desarrolló el primer antihistamínico antagonista H1 para uso en el humano: fenobenzamina
con buenos resultados. En 1944 se comercializa el maleato de pirilamina; en 1946, la
difenhidramina y tripelenamina y, en 1949, la clorfeniramina. Todos estos antihistamínicos
H1 han sido denominados de “primera generación, clásicos o sedantes” por ser los
primeros. En los últimos 15 años se han sintetizado antihistamínicos con alto potencial
inhibitorio; a éstos se les denomina antihistamínicos H1 de “segunda generación”. Con el
advenimiento de nuevas técnicas de investigación se fueron descubriendo nuevos
receptores de la histamina: el receptor H1 en 1966, el receptor H2 en 1972, el receptor H3
en 1983 y el receptor H4 en 2000. Cuando la histamina es liberada de mastocitos,
basófilos, neuronas histaminérgicas u otras células, se debe unir a cierto receptor de
histamina: H1, H2, H3 o H4. Los antihistamínicos H1 de primera y segunda generación
antagonizan al receptor H1, utilizandose en la clínica contra rinitis, urticaria, lagrimeo, o
como antialérgicos. Los antagonistas del receptor H2 se utilizan en la clínica para reducir
la secreción de ácido gástrico en el tratamiento del paciente con enfermedad ácido péptica.
Hasta el momento no existen antagonistas del receptor H3 y H4 para uso clínico; sin
embargo, dentro del campo de estudio de estos receptores se ha descubierto que participan,
respectivamente, en la regulación de la neurotransmisión y en procesos inflamatorios.
Material
Balanza granataria
Lancetas estériles
Gotero
Regla
Matraz volumétrico de 10cc
Histamina
Agua estéril
Alcohol
Algodón
Medicamentos antihistamínicos
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Soluciones
Histamina al 10%
Procedimiento
1. Formación de equipos de trabajo.
2. Preparación de soluciones.
 Pesar exactamente 1 gr de histamina.
 Disolver en 3cc de agua estéril.
 En Matraz volumétrico llevar a un volumen de 10cc con agua estéril.
3. Administración de medicamentos antihistamínicos.
 Nombrar un voluntario por equipo y administrarle el medicamento
antihistamínico que señale el instructor.
 Nombrar un equipo para que el voluntario sea el “individuo control”.
 Administrar cada medicamento de acuerdo a la dosis usual del
antihistamínico que se trate.
4. Administración de histamina.
 Después de transcurrida 1 hora de administrado el medicamentos
antihistamínico, asear con una torunda alcoholada el antebrazo del
voluntario.
 Colocar una gotita de histamina al 10% sobre la piel, evitar que esta se
derrame.
 Sobre la gota de histamina, pinchar con una lanceta estéril.
 Tomar lecturas del diámetro del halo de reacción a la histamina
(inflamación y/o enrojecimiento) a los 15, 30, 45, 60, 90 y 120 minutos post
aplicación de la histamina.
5. Con el individuo control proceder igual que en 4; pero sin haber tomado algún
fármaco antihistamínico.
6. Elaborar una tabla con los resultados de todo el grupo.
7. Elabora tus conclusiones.
Cuestionario Complementario
1. Menciona los tipos de receptores histamínicos?, con que efectos están comúnmente
relacionados en nuestro cuerpo?
2. Que efecto(s) tiene la histamina en nuestro cuerpo?
3. Cual es la fórmula desarrollada de la histamina?
4. Que tipo de enlaces químicos puede formar con su receptor biológico?
5. Menciona los fármacos antihistamínicos que se utilizan con fines terapéuticos?
6. Menciona al menos un medicamento para cada fármaco de los mencionados en la
pregunta anterior.
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Enero 30 de 2007
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Práctica No. 5
Distribución de Fármacos
Objetivo
Por medio del análisis cualitativo y cuantitativo determinar la distribución de un fármaco
en los diferentes compartimentos del organismo.
Introducción
La distribución es un proceso farmacocinética en el que tiene lugar el transporte del
fármaco desde su lugar de absorción hasta el órgano donde va a ejercer su efecto. No
obstante, es importante considerar que una vez absorbido el fármaco es distribuido no solo
hasta el sitio donde va a actuar, si no que al mismo tiempo llega a otros órganos en donde
va a ser eliminado, metabolizado o acumulado.
La mayoría de los fármacos se unen a proteínas plasmáticas para circular en el organismo.
La albúmina es la principal de estas proteínas acarreadoras; tiene dos sitios de unión para
fármacos, uno para fármacos de carácter ácido, y otro para fármacos de carácter básico.
Los esteroides corticales y algunos otros fármacos de carácter básico se unen también a las
alfa-1-globulinas.
La unión de los fármacos a las proteínas depende esencialmente de la afinidad que tengan
los fármacos, y constituye una cifra estable para cada fármaco. Esta unión es reversible,
encontrándose siempre un determinado porcentaje libre y cuando éste se elimina del
plasma una nueva cantidad de fármaco se desprende de su unión a proteínas y toma su
lugar, de tal modo que las fracciones libre y unida a proteínas permanecen constantes.
Ocasionalmente, cuando se sobrepase la capacidad de fijación de la albúmina, aumenta la
fracción libre.
Solamente el fármaco libre es activo, puesto que es el único capaz de atravesar barreras y
difundir a los tejidos.
Una vez que el fármaco se encuentra en plasma, la concentración que alcanza en los
diferentes tejidos depende esencialmente de dos factores: el flujo sanguíneo regional, y la
salida del fármaco del interior vascular.
La unión del fármaco a las proteínas y la salida del fármaco del interior vascular
condicionan un parámetro que conocemos con el nombre de volumen de distribución (Vd).
Se define como Vd el volumen de agua corporal en el que el fármaco se encuentra
realmente disuelto. Pero este parámetro de “Vd real” no es fácilmente medible, por lo que
recurrimos al “Vd aparente” que corresponde a:
Vd =
DOSIS
Cp
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Decimos que este volumen de distribución es aparente por que no refleja con exactitud
donde se encuentra el fármaco. Por ejemplo, Si la Cp es muy baja el Vd será muy alto,
indicándonos que esta acumulado en algún tejido; por el contrario, si el fármaco esta muy
unido a proteínas la Cp será alta y el Vd será bajo. A pesar de ello nos sirve para conocer la
distribución corporal de un fármaco:
Vd
Vd
Vd
3 Litros
12 Litros
40 Litros
-------------------------------------------------------------
Fármaco en plasma
Fármaco en plasma + intersticio
Fármaco en plasma + intersticio + células
Material y Equipo
Espectrofotómetro UV-VIS
Balanza analítica
Balanza granataria
Balanza para roedores
Mesa de cirugía para roedores
Equipo de disección completo
Jaula metabólica
Centrífuga
Agitador Vortex
Portaobjetos (6)
Jeringa de 1cc (2)
Tubo de ensaye 16x100 con tapón de rosca (10)
Tubo de ensaye 16x125 con tapón de rosca (10)
Matraz volumétrico de 500 cc (1)
Matraz volumétrico de 100 cc (1)
Matraz volumétrico de 25 cc (8)
Matraz volumétrico de 10 cc (5)
Pipeta volumétrica 0.5 cc (1)
Pipeta volumétrica 1 cc (3)
Pipeta volumétrica 2 cc (1)
Pipeta volumétrica 3 cc (1)
Pipeta volumétrica 5 cc (1)
Pipeta graduada 20 cc (1)
Pipeta graduada de 10 cc (2)
Pipeta graduada 5 cc (1)
Pipeta graduada 1 cc (1)
Soluciones y Reactivos
Pentobarbital sódico
Ácido tricloroacético (TCA)
Nitrito de Sodio
Sulfacetamida
Cloroformo
Hidróxido de sodio
Alfa-naftiletilendiamina
Sulfamato de amonio
Ácido clorhídrico
Sulfacetamida 4 mg/cc (10cc)
Hidróxido de sodio 0.1 N ( 60cc)
Ácido tricloroacético 15% (25cc)
Ácido clorhídrico 4 N (10 cc)
Nitrito de sodio 0.1% (10cc)
Sulfamato de amonio 0.5% (10cc)
Alfa-naftiletilendiamina 0.1% (10cc)
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Procedimiento
Sesión 1 (primera parte)
1. Se administra a la rata sulfacetamida en dosis de 10 mg/Kg de peso.
2. Se coloca el animal en una jaula metabólica por espacio de 30 minutos.
3. Si no se ha colectado orina en este intervalo de tiempo, induzca al animal
presionándole levemente la parte inferior del abdomen.
4. Anestesie al animal y prepárelo en la mesa de cirugía. Abra la cavidad abdominal
(en este momento puede obtener orina por insición directa en la vejiga, si no se
logro anteriormente).
5. Abra además la cavidad toráxico y craneana. Obtenga 1cc de sangre por punción
directa al corazón del animal.
6. Obtenga también muestras de 0.5-1.0 gr de los siguientes órganos: hígado, riñón,
intestino, corazón, cerebro y músculo de la región glútea.
7. Coloque las muestras obtenidas en un portaobjetos y péselo, después de esto
proceda a desmenuzarlas con la ayuda de una navaja de bisturí y transfiéralas a un
tubo de ensaye que contenga 10cc de NaOH 0.1 N, lave el portaobjetos y péselo de
nuevo por diferencia conocerá el peso de la muestra.
8. Procese cada una de las muestras de acuerdo al procedimiento indicado.
Procesamiento de las muestras:
Sangre: Lleve 1cc de sangre a un tubo que contenga 9cc de agua y agite en vortex. Tome
1cc de esta dilución y transfiérala a otro tubo, adicione 12cc de agua y agite de nuevo.
Agregue 4cc de ATC al 15% y agite por 1 minuto. Centrifugue a 3,000 rpm por 3 min. Del
sobrenadante tome una muestra de 5cc y pásela a un tubo limpio. Etiquetar el tubo
especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar en congelación
para la segunda parte de esta práctica.
Orina: Tome 100 mcl de orina y agregue a un tubo que contenga 1.9cc de agua. Agite y
tome 1cc de esta orina diluida y transfiérala a otro tubo conteniendo 11cc de agua.
Adicione 4cc de TCA al 15% agite y centrifugue a 3,000 rpm por 3 minutos. Del
sobrenadante tome una muestra de 5cc y pásela a un tubo limpio. Etiquetar el tubo
especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar en congelación
para la segunda parte de esta práctica.
Tejidos y Órganos: En el tubo que contiene la muestra y la solución de NaOH deberá
agitarse en vortex por 1 minuto en 3 ocasiones, en un período de 10 minutos. Después se
dejará reposar por 15 minutos. Se toman 2cc del sobrenadante y se adicionan 2cc de TCA
al 15%, agitar por 30 seg. Adicionar 6cc de agua y agitar de nuevo. Centrifugar por 5
minutos a 3,000 rpm. Tomar del sobrenadante una muestra de 5cc y pasar a un tubo limpio.
Etiquetar el tubo especificando fecha, laboratorio, número de equipo y contenido. Guardar
en congelación para la segunda parte de esta práctica.
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Sesión 2 (segunda parte)
Para iniciar con esta sesión, permita que las muestras se descongelen a temperatura
ambiente, o en baño de agua a temperatura ambiente.
Cuantificación de Sulfacetamida por la técnica analítica de Bratton-Marshal
1. A 5cc del sobrenadante se le adicionan 1cc de HCl 4N, 1cc de Nitrito de sodio al
01% y se agita en vortex por 5 minutos.
2. Posteriormente agregar 1cc de Sulfamato de amonio al 0.5% y agite de nuevo por 3
minutos, manualmente de manera vigorosa.
3. Por ultimo adicione 1cc de alfa-naftiletilendiamina al 0.1%, agite y repose en la
oscuridad por 10 minutos.
4. Lea la absorbancia en espectrofotómetro a una longitud de onda de 546 nm.
5. Hacer exactamente este mismo procedimiento a un blanco que consiste en 5cc de
agua, que se trata a la par con las muestras..
Curva patrón de sulfacetamida:
Solución patron de Sulfacetamida (100 mcg/cc): Pesar en balanza analítica 50mg de
Sulfacetamida, colocarla en un matraz volumetrico de 500cc. Llevar al aforo con agua.
Soluciones estándar de Sulfacetamida: Tomar la alícuota necesaria de la solución patrón
de sulfacetamida y preparar 25 cc de cada una de las concentraciones descritas a
continuación: 1, 2, 4, 6, 8, 12 y 16 mcg/cc.
Tomar 5 ml de cada una de las soluciones estándar de sulfacetamida y colocar en un tubo
de ensaye y proceder de acuerdo a la técnica de Bratton-Marshal. Hacer este procedimiento
por duplicado para cada una de las concentraciones. Incluir un blanco con 5cc de agua.
Resultados
Con los resultados de la curva estándar calcular el promedio, desviación estándar y el
coeficiente de variación de las absorbancias obtenidas para cada concentración.
Elaborar una gráfica de concentración de sulfacetamida (mcg/ml) vs Absorbancia
promedio; calcular por mínimos cuadrados el coeficiente de correlación.
Con la gráfica obtenida hacer interpolaciones con los valores de absorbancias de las
muestras y calcular las concentraciones de sulfacetamida en sangre, orina y en los
diferentes órganos y tejidos.
Reporte sus resultados en una tabla donde se especifiquen los valores de absorbancia y
concentraciones obtenidas, y la gráfica correspondiente.
Elabora tus conclusiones.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
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Cuestionario Complementario
1. Que propiedades deberá tener un fármaco para poder encontrarse en el eritrocito?
2. Cual es el componente proteico más importante en la distribución de fármacos.
3. La distribución será un proceso reversible?
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Enero 30 de 2007
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Práctica No. 6
Estimulación en Inhibición del Metabolismo Farmacológico
Objetivo
Estudiar la influencia de la inducción del metabolismo por medio de daño hepático y la
estimulación del metabolismo por medio de la administración crónica de un fármaco
utilizando animales de laboratorio.
Introducción
El metabolismo es uno de los principales mecanismos por medio del cual la acción de un
fármaco se puede concluir. La mayoría de los fármacos pasan por un proceso metabólico,
que los convierte en productos más polares (metabolitos). Esto es de suma importancia en
el manejo global de un fármaco, ya que al pasar por esta biotransformación no solo se
diminuye su actividad biológica, si no que lo hace más susceptible a ser excretado.
La intensidad y duración de la acción de un fármaco es determinada por el grado de
biotransformación que sufre y la velocidad con que sea eliminado del cuerpo. Este grado
de transformación o metabolismo puede ser afectado por varios factores como edad, sexo,
raza, dieta, aspectos genéticos, exposición a sustancias químicas, etc. A través de estudio
cinéticos esta demostrado que una sustancia puede ser capaz de modificar el patrón
metabólico de otra. Ejemplos de ello son el Ketoconazol (antimicótico) que es capaz de
inhibir el metabolismo de Diacepam (anticonvulsivo), pudiendo presentarse síntomas de
intoxicación por elevación de niveles plasmáticos de Diacepam.
Mientras que por otro lado Fenobarbital es capaz de inducir el metabolismo de muchos
otros fármacos disminuyendo su concentración, lo que podría hacer que se presenten
niveles subterapéuticos.
Material y Equipo
Balanza para roedores
Jeringa 1cc
Pentobarbital sódico
Tetracloruro de carbono
Algodón
Jaula para ratones
Ratones
Procedimiento
1. Cada equipo tendrá 5 ratones pesados y marcados perfectamente.
2. Los alumnos se dividirán en tres equipos, el equipo numero 1 trabajará con ratones
sin pretratamiento (control); el equipo numero 2 trabajara con ratones inducidos; y
el equipo numero 3, con ratones inhibidos.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
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3. A cada ratón se le administra pentobarbital a una razón de 50 mg/Kg de peso.
4. Determinar el tiempo de inicio del sueño y duración del mismo. El tiempo de inicio
de sueño se determina por la perdida del reflejo de enderezamiento. Esto se logra
cuando al voltear al animal éste no regresa instantáneamente sobre sus patas.
Pretratamiento
Los ratones se tratarán por 5 días previos al experimento, como a continuación se describe:
o Inducción enzimática.- cada ratón recibe pentobarbital a una razón de 10 mg/Kg de
peso, por vía intraperitoneal diariamente.
o Inhibición enzimática.- los ratones se introducen en un frasco que contiene algodón
impregnado de tetracloruro de carbono, hasta que el animal muestre algún signo de
incoordinación. Sáquelo inmediatamente para que pueda recuperarse.
Tenga cuidado al utilizar el tetracloruro de carbono; el algodón no debe contener
líquido en exceso y la exposición no debe ser prolongada, pues puede matar al
animal o sedarlo por completo, lo cual no es recomendable. Esto se repite
diariamente.
Resultados
1. Construya una tabla con los resultados de los tres grupos anotando los tiempos de
perdida del reflejo de enderezamiento (PRE) y duración del efecto o tiempo de
sueño.
2. Calcule los tiempos promedio de cada grupo.
3. Elabore una gráfica de barras y compare los tiempos promedio de inducción (I) y
duración (D), obtenidos para cada grupo.
4. De acuerdo a los resultados y la gráfica obtenidos que puede concluir acerca del
experimento?
Cuestionario Complementario
1. Continuará por siempre la inducción enzimática aún cuando se suspenda la
administración del fármaco que la ocasiona?
2. Defina los términos de inducción e inhibición farmacoinducida.
3. De por lo menos tres ejemplos de otros fármacos que sufran este mismo fenómeno.
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Enero 30 de 2007
Manual del Laboratorio de Farmacología
Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
Universidad Autónoma de Baja California
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería
Químico Farmacobiólogo
Práctica No. 7
Determinación de Dosis Efectiva al 50 (DE50) y Dosis Letal al 50 (DL50)
Objetivo
El alumno se familiarizara con la metodología experimental y los cálculos necesarios para
obtener la Dosis Efectiva al 50 y Dosis Letal al 50 de un compuesto exógeno.
Introducción
Una manera importante de conocer y caracterizar el efecto de un fármaco es la
determinación de su curva dosis-respuesta. En este caso, en la ordenada o eje de las “Y” o
eje vertical se especifica la intensidad del efecto farmacológico hasta su máxima expresión,
relacionándola con la dosis o el logaritmo de la dosis en el eje de las “X” o abscisa o eje
horizontal. En General el incremento de la dosis produce un aumento paralelo en la
intensidad de la respuesta, hasta un determinado limite que es el efecto máximo. En
Farmacología la respuesta aumenta hasta ese punto máximo, después del cual el
incremento de la dosis no va acompañado de un incremento de los efectos farmacológicos.
El efecto máximo determina ante el aumento de la dosis, el plateau o la meseta de la curva.
En caso de aumentar la dosis después del plateau pueden aparecer efectos tóxicos o la
muerte sin aumentar la intensidad de los efectos farmacológicos. La toxicidad de un
fármaco puede medirse con el conocimiento de la dosis letal 50 (DL50), que es la dosis
capaz de provocar la muerte del 50% de los animales de laboratorio. La dosis efectiva 50
(DE50) es por otra parte la dosis que produce los efectos deseados o terapéuticos en el 50%
de los pacientes.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
Universidad Autónoma de Baja California
Facultad de Ciencias Químicas e Ingeniería
Químico Farmacobiólogo
El tratamiento logístico para la transformación lineal de la curva, propuesto por Berkon
(1934) consiste en aplicar logaritmos a las dosis utilizadas y en la transformación de la
respuesta en Logit de la siguiente manera:
L = ln (p/q)
Donde:
p = probabilidad de acierto.
q = probabilidad de error.
Entonces, graficando L vs ln D, obtenemos la ecuación de la recta L = ln D + b; donde m
= pendiente y b = intercepto al eje de las “Y”. Y si queremos encontrar ln D50, despejando:
ln D50 = -b/m
D50 =
e –b/m
Procedimiento
1. Cada equipo de trabajo utilizará un grupo de 5 ratones. A los cuales se les
administrará una misma dosis.
2. Marcar y pesar cada uno de los ratones.
3. Administrar el volumen de anestésico que le corresponda a cada ratón de acuerdo a
su peso y a la dosis que le toca probar al equipo de trabajo.
4. Las dosis a probar durante el experimento son: 10, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 120, y
160 mg/Kg de peso.
5. Determinar el número de animales muertos y vivos.
6. Después de media hora sacrificar los ratones que hallan quedado vivos con una
dosis de pentobarbital a una razón de 200 mg/Kg de peso.
7. Proceder con los ratones muertos de acuerdo a las buenas prácticas de disposición
de RPBI.
Resultados
1. Ordena los resultados de tu experimento de acuerdo a la siguiente tabla:
Dosis
(mg/Kg)
Log D
No. Ratones
Dormidos
Muertos
Porcentaje Ratones
Dormidos
Muertos
p
Dormidos
q
Muertos
Dormidos
ln(p/q)
Muertos
Dormidos
Muertos
10
20
30
40
50
60
80
120
160
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
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Químico Farmacobiólogo
2.
3.
4.
5.
6.
Elabora una gráfica con tus resultados; con los valores de %Efecto vs Log D.
Elabora una gráfica con los valores de L vs ln D.
Determina por el método gráfico la DE50 y DL50.
Calcula por el método Logit los valores de DE50 y DL50.
Elabora tus conclusiones con respecto al experimento.
Cuestionario Complementario
1. Cual es la DE50 y DL50 de pentobarbital sódico rata y ratón, reportados en la
literatura.
2. Como podemos medir la potencia de un fármaco?, explica tu respuesta.
3. Define los conceptos de:
a. Intervalo terapéutico (IT).
b. Dosis Toxica 50 (DT50)
c. Índice de seguridad (IS)
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Octubre 30 de 2006
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Enero 2007
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Químico Farmacobiólogo
Práctica No. 8
Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos
Objetivo
A través de la cuantificación de ácido acetil salicílico en orina el alumno determinará la
influencia del pH urinario en la excreción de fármacos.
Introducción
El riñón es el órgano de excreción de principios activos y de metabolitos. Pera esto, ejecuta
tres funciones: filtración glomerular, secreción tubular y reabsorción tubular.
Filtración glomerular: el paso del fármaco del plasma al filtrado glomerular se efectúa a
través de la pared del glomérulo por filtración debido a un gradiente de presión. Solamente
pueden atravesar esta membrana las moléculas que poseen un tamaño lo suficientemente
reducido: las macromoléculas, como la albúmina, las globulinas y otras proteínas
plasmáticas no pueden atravesarla, ni mucho menos el fármaco que se encuentre unido a
ellas.
La velocidad de filtración es función del flujo sanguíneo renal, por lo que en casos de
insuficiencia cardiaca se producirá un descenso de la excreción renal de los fármacos. Se
trata de un proceso pasivo que no requiere gasto de energía.
Secreción tubular: proceso que sigue un mecanismo de transporte activo, que se efectúa en
el túbulo proximal, por el que algunos fármacos presentes en la sangre pasan a la luz
tubular. Se trata de un proceso saturable, existiendo, por lo tanto, mecanismo de
competencia por un mismo sistema de transporte activo.
Reabsorción tubular: proceso por el que el fármaco que a llegado a la luz tubular, ya sea
por filtración glomerular o por secreción tubular, es reabsorbido a nivel tubular y pasa de
nuevo a la sangre. Este proceso se efectúa por difusión pasiva, por lo que influyen
notablemente la liposolubilidad, el grado de ionización y el peso molecular del fármaco a
reabsorber.
Conviene recordar que el pH de la orina puede modificar el grado de ionización de
numerosos fármacos y, por tanto, su mayor o menor facilidad para poder ser reabsorbidos y
pasar a la sangre o, de forma alternativa, ser excretados en la orina. A la vista de todo lo
anterior, se puede afirmar que la velocidad de excreción renal de un fármaco es igual a la
velocidad de filtración más la secreción, menos la velocidad de reabsorción.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
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Químico Farmacobiólogo
Procedimiento
A) El grupo se dividirá en tres equipos.
Equipo No.1. Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario alcalino.
Equipo N0.2: Estudiará la excreción de aspirina en un pH urinario ácido.
Equipo No.3: Estudiará la excreción de aspirina en un pH normal.
Cada equipo nombrará un voluntario, quien se tomará una dosis de 1 gr de Aspirina vía
oral, y procederá de acuerdo al protocolo experimental que a continuación se muestra.
B) Criterios de inclusión y/o exclusión.
1. Jóvenes sanos de 18 a 28 años de edad.
2. Sexo masculino o femenino.
3. No padecer ningún tipo de enfermedad crónica.
4. Al momento del experimento no estar enfermos.
5. No consumir, al menos una semana antes y durante el experimento, algún fármaco
terapéutico, social o de abuso.
6. No consumir bebidas alcohólicas al menos 3 días antes y durante el experimento.
7. Respetar el protocolo experimental, mismo que se le dará a leer y entenderá antes
de iniciar el estudio.
8. Firmar carta de consentimiento informado, antes de iniciar el estudio.
Protocolo experimental:
1. El día del experimento cada voluntario vaciará completamente la vejiga a las 5:00
am. Llevar a cabo la micción en un vaso de precipitados. Tomar el pH de la orina,
anotar el valor en la hoja correspondiente y desechar la orina.
2. Tomar una tableta de Aspirina de 1g con 200 ml de agua natural. Anotar en la hoja
correspondiente la hora exacta de la toma del medicamento.
3. A las 6:00 am Tomar la siguiente solución:
 Equipo No.1 (orina alcalina): tomar 40 mEq (4 g) de bicarbonato de sodio
(NaHCO3), posteriormente tomar 12 mEq (1 g), cada 4 horas (a las 10:00
am y 2:00 pm).
 Equipo No.2 (orina acida): tomar 4 g de ácido ascórbico, posteriormente
tomar 2 g, cada 4 horas (a las 10:00 am y 2:00 pm).
 Equipo No.3 (control): tomar 200 ml de agua natural.
4. Asegurarse de tomar 200 ml de agua cada hora, las primeras 6 horas
postadministración. Después de las 6 horas consumir agua al gusto.
5. Durante el experimento no consumir ninguna otra clase de líquidos (bebidas
carbonatadas, agua de frutas, agua con saborizantes, etc.).
6. Colectar la orina durante 10 horas (ultima orina colectada a las 3:00 pm)
postadministración del fármaco. Durante este periodo orinar cada vez que el cuerpo
lo requiera. Asegurarse de cada vez de vaciar completamente la vejiga. Depositar la
orina en un vaso de precipitado y medir el volumen total en una probeta graduada.
Tomar el pH de la orina. Guardar una alícuota de 200 ml y desechar el resto.
Anotar volumen de orina, pH urinario y la hora de micción en la hoja
correspondiente.
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Químico Farmacobiólogo
7. A las (8:00 am consumir un desayuno, el cual consistirá de 2 sándwiches;
elaborados con una rebanada de jamón y una de queso, una rodaja de tomate y,
lechuga y mayonesa al gusto. Además, una manzana de tamaño mediano.
8. A las 13:00 consumir una comida al gusto. Incluir una bebida de té helado, máximo
de 300 ml.
Cuantificación de salicilatos en orina
Material
1 matraz volumétrico de 100 ml
1 matraz volumétrico de 50 ml
1 matraz volumétrico de 25 ml
3 pipetas volumétricas de 1 ml
1 pipeta graduada de 5 ml
12 tubos de ensaye de 13x120 mm
Equipo
Balanza analítica
Espectrofotómetro UV-visible
Centrífuga
Agitador vortex
Reactivos
Salicilato de sodio
Nitrato férrico nonahidratado
Cloruro mercúrico
Ácido clorhídrico 1N
Soluciones
Reactivo para desarrollar color: Pesar con exactitud y por separado 4 g de nitrato férrico
nonahidratado y 4 g de cloruro mercúrico, colocarlos en un matraz volumétrico de 100 ml.
Adicionar un poco de agua destilada para disolver, añadir 12 ml de una solución 1 N de
ácido clorhídrico y diluir hasta el aforo con agua destilada.
Solución patrón de referencia de salicilato de sodio a concentración de 100 mcg/ml: Pesar
con exactitud 50 mg de salicilato de sodio y depositarlos en un matraz volumétrico de 50
ml, disolver totalmente en 20 ml de orina libre de medicamentos (diluida 1:1 con agua) y
llevar hasta el aforo con la misma orina. De esta solución tomar con exactitud una alícuota
de 2.5 ml y depositar en un matraz volumétrico de 25 ml, llevar al aforo con agua.
Desarrollo del método analítico para cuantificar salicilatos en orina.
En un tubo de ensaye colocar 1 ml de muestra de orina y adicionar 5 ml del reactivo para
desarrollar color, agitar la muestra en vortex durante 1 min y centrifugar durante 5 min a
2500 rpm para obtener una solución transparente; decantar la solución a un nuevo tubo de
ensaye y determinar absorbancia a una longitud de onda de 540 nm, ajustando a cero con
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Químico Farmacobiólogo
un blanco de agua preparado a las mismas condiciones que la muestra. De igual manera
proceder con 5 ml de la solución patrón de referencia de salicilato de sodio a 100 mcg/ml.
Resultados
1. Calcular la concentración de salicilato en las muestras de orina, utilizando la
siguiente ecuación:
(Concentración solución de referencia)(Absorbancia de la muestra)
Concentración de la muestra =
(Absorbancia solución patrón de referencia)
2. Calcula la cantidad total de salicilato en cada una de las muestras de orina.
3. Determinar la cantidad total de salicilato eliminado durante el periodo completo de
muestreo.
4. Compara los resultados de los tres equipos de trabajo y elabora tus conclusiones.
Cuestionario Complementario
1. Que otro compuesto se puede utilizar para acidificar la orina?
2. Menciona tres fármacos básicos y tres ácidos con los cuales se favorezca su
excreción acidificando o alcalinizando la orina, respectivamente?
Elaboro: Q. Hermelinda de la Cruz Durán
Fecha: Noviembre 08 de 2006
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Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos
Hoja de Registro
Fecha:
Nombre del Voluntario:
Edad:
Peso:
Orina: Acida ( )
Alcalina ( )
pH Urinario Basal:
Hora de toma del medicamento:
Numero
Muestra
Hora
pH Orina
Sexo:
M( )
F( )
Control ( )
Volumen
Excretado
Observaciones
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Comentarios:
Influencia del pH Urinario en la Excreción de Fármacos
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Carta de Consentimiento Informado
Lugar y Fecha: __________________________________________________________________.
Por medio de la presente acepto participar en el estudio de:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________,
correspondiente a la practica No. 7 del manual de laboratorio de farmacología.
El objetivo del estudio es:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________.
Se me a explicado que mi participación consistirá en:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________.
Declaro que se me ha informado ampliamente sobre los posibles riesgos, inconvenientes, molestias
y beneficios derivados de mi participación en el estudio, que son los siguientes:
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
________________________________________________________________________________
_______________________________________________________________________________.
El investigador(es) se ha(n) comprometido a responder cualquier pregunta y aclarar cualquier duda
que le plantee acerca de los procedimientos que se me llevaran a cabo, los riegos, beneficios o
cualquier otro asunto relacionado con el experimento.
Entiendo que conservo el derecho de retirarme del estudio en cualquier momento en que lo
considere conveniente, sin que ello afecte mi perfil como estudiante del Laboratorio de
Farmacología.
Nombre y Firma del Voluntario: _____________________________________________________.
Nombre y Firma del Investigador: ___________________________________________________.
Testigos: ___________________________________ y __________________________________.
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Q. Hermelinda de la Cruz Durán
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