VACUNA RECOMBINANTE CONTRA STAPHLYLOCOCCUS AUREUS

VACUNA RECOMBINANTE CONTRA STAPHLYLOCOCCUS AUREUS.
Antecedentes Científicos.
Staphylococcus aureus
S. aureus coloniza permanentemente el epitelio húmedo escamoso de las fosas nasales
anteriores de aproximadamente 20% de la población, y esporádicamente en otro 60%
(Peacock 2001). En esa ubicación, no es causa de problemas en el hospedero, sin
embargo cuando la bacteria logra rebasar las barreras de las mucosas, ocurren una serie
de patologías. Se conocen numerosos tipos de infecciones por S. aureus, como
infecciones neonatales, abscesos en glándula mamaria o mastitis, infecciones post
operatorias, forúnculos y carbunclos, neumonía, bacteremia, endocarditis, osteomielitis
y enterocolitis. Algunas signos en los pacientes humanos infectados por S aureus son
causadas por toxinas más que por la infección per se: la intoxicación por alimentos con
S. aureus es causada por la ingestión de enterotoxinas preformadas termoresistentes de
S. aureus. El síndrome de choque tóxico es causada por una exotoxina, que puede
resultar de una complicación post quirúrgica, y el síndrome de piel escaldada por S.
aureus (staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS), una dermatitis frecuente en
niños, es causada por la toxina exfoliatina (Götz, 2004).
Aunque S. aureus solía ser considerado un patógeno no invasivo, se sabe ahora que la
bacteria puede invadir diversos tipos de células con la ayuda de un mecanismo que
involucra la formación de un puente de fibronectina entre las proteínas de adherencia a
la fibronectina de la bacteria y las α5β1 integrina del hospedero que activan el proceso
de internalización de la bacteria (Schwarz-Linek 2004, Schwarz-Linek 2003, Peacock
1999). El organismo puede sobrevivir al interior de la célula en estado semi-activo
generalmente referido como variantes de colonias pequeñas (Small colony variants, von
Eiff 2000)
El uso extensivo de antibióticos se señala como una de las posibles causas del
incremento del número de cepas bacterianas resistentes a antibióticos (Goossens 2005),
no existe un número exacto, pero se calcula que aproximadamente 1 500 toneladas de
antibióticos son usadas en humanos anualmente (Mellon 2001). La mayoría se
administra fuera del ambiente hospitalario, y se estima que la mitad de éstos son autoprescripciones (Gonzales 1997, Nyquist 1998). Cuando se añade el hecho de que la
cantidad de antibióticos administrados a animales para consumo humano es diez veces
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mayor (Mellon 2001), el resultado es la creación de un ambiente propicio para el
surgimiento de bacterias resistentes.
Actualmente en animales de interés comercial alimentado con antibióticos promotores
de crecimiento se han aislado cepas que presentan resistencia a meticilina, por lo que la
aparición de resistencia a Vancomicina en animales de interés comercial ya no es una
posibilidad remota (Lee 2003).
Resistencia contra antibióticos de S. aureus
Un microorganismo puede presentar resistencia intrínseca o adquirida a los antibióticos.
La resistencia intrínseca es una característica genética estable, que surge de mutaciones
en el DNA cromosomal y es compartida por todos los miembros del género. La
resistencia adquirida es obtenida mediante el intercambio genético con otros organismos
del mismo o diferente género
Resistencia Intrínseca: Existen mecanismos celulares que aseguran que la replicación
de DNA sea libre de errores. La probabilidad de que mutaciones puntuales sean
propagados es por lo tanto baja. Como cada mutación confiere solamente una ligera
alteración en susceptibilidad, los microorganismos necesitan acumular varias
mutaciones para ser intrínsicamente resistentes a los antibióticos. Como éste es un
proceso evolutivo, ocurre infrecuentemente y genera mutaciones no benéficas para la
bacteria (Hickey 1997), excepto bajo la presión selectiva del tratamiento con
antibióticos. La mutación cromosomal usualmente causa un blanco alterado del
antibiótico, pero también puede alterar la permeabilidad a un antibiótico de la
membrana de la bacteria, o inactivarla mediante enzimas. La presión selectiva de los
antibióticos es uno de los factores mas importantes que lleva al surgimiento de las cepas
MRSA. En varios estudios se ha establecido que
las cepas de MRSA no son
transmitidas de un hospedero a otro en forma frecuente, sino que surgen de cepas no
resistentes originadas del mismo hospedero (Schentag 1998).
Resistencia Adquirida: Los genes de resistencia pueden ser transferidos entre bacterias
y pueden ser integrados al cromosoma de la bacteria para ser heredado de una
generación a otra, o pueden ser mantenidos en un estado extra cromosomal en un
plásmido bacteriano. Un plásmido es DNA extracromosomal que puede replicarse
independientemente del cromosoma. Los plásmidos que pueden transferir DNA a otras
bacterias se les conoce como plásmidos conjugativos. Pueden ser clasificados entre los
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elementos móviles horizontales (HMEs), que también incluyen Fagos (virus que
infectan bacterias), Integrones y Transposones (secuencias de DNA que pueden "saltar"
de cromosomas a plásmidos y viceversa). La transferencia de HMEs ocurre por
conjugación (Figura 1), transducción, trasnformación y transposición. El material
genético que codifica resistencia es usualmente "clonal" es decir, de secuencia idéntica
en un amplio espectro de bacterias que lo posee, y puede moverse fácilmente a bacterias
de diferentes géneros y especies, especialmente si son transportados en un plásmido o
transposón. Por ejemplo, el gen vanA, que codifica resistencia a vancomicina, es
transportado dentro de un transposón que es fácilmente transmitido entre especies
enterobactéricas y gram-positivos como S. aureus (Dutka-Malen 1990, Sievert 2002).
Los plásmidos tienen dos ventajas: primero, los plásmidos pueden adquirir múltiples
genes de resistencia que benefician al organismo, y segundo, un plásmido no remueve
el material cromosomal del organismo, pero le proporciona material genético adicional,
y las proteínas metabólicamente esenciales son codificadas por el cromosoma y no se
pierde su función como ocurre en las mutaciones.
Evasión de la respuesta inmune de S. aureus
La defensa primaria contra la infección por S. aureus es la inmunidad innata por
neutrófilos, y aparentemente S. aureus tiene la habilidad de desactivar la respuesta de
los neutrófilos, lo que logra principalmente mediante la secreción de diferentes factores
que alteran la respuesta inmune celular y humoral. De esta forma la respuesta inmune
del hospedero es insuficiente para combatir y evitar infecciones subsecuentes (Foster
2005).
S. aureus tiene una gran variedad de factores de virulencia secretados y asociados a la
pared celular, incluyendo proteínas de superficie que promueven la adherencia a tejidos
dañados y a la superficie de las células del hospedero (Foster 1998), que se adhieren a
proteínas de la sangre que le permiten evadir la respuesta inmune y promover la
absorción de hierro (Skaar 2004). Las proteínas de membrana por lo general están
covalentemente asociadas a la pared celular por medio de la enzima sortasa, una enzima
asociada a la membrana que reconoce y corta la secuencia LPXTG en el extremo
carbonilo de la proteína de superficie, o también pueden ser retenidas en la pared celular
por medio de interacciones iónicas (Foster 1998, Mazmanian 2001). Adicionalmente la
mayoría de las cepas expresan una cápsula de polisacáridos (O’Riordan 2004). Como
factores de virulencia S. aureus puede secretar una gama de enzimas extracelulares
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como proteasas, hialuronidasas, lipasas y nucleasas que facilitan la destrucción del
tejido y la expansión en el hospedero, toxinas que dañan membranas que causan efectos
citolíticos, y superantígenos que contribuyen al síndrome de choque tóxico (Bohach
1999, Dinges 2000).
Cuando S. aureus ha atravesado las barreras físicas de la piel y mucosas, se enfrenta a la
respuesta inmune del hospedero. La infección ocasiona una respuesta inflamatoria que
resulta en la migración al sitio de infección de macrófagos y neutrófilos, los que tratarán
de fagocitar a la bacteria con la ayuda de anticuerpos y complemento del suero (Figura
2). En el suero de un individuo expuesto con antelación a S. aureus, se encuentran
anticuerpos contra antígenos de S. aureus, y se sabe que éstos se elevan después de una
infección (Roche 2003, Etz 2002, Dryla 2005). Sin embargo, estos anticuerpos y la
memoria inmunológica asociada parecen no ser suficientes para prevenir infecciones
subsecuentes.
Al momento que S. aureus penetra y crece en el hospedero, una serie de factores
quimio-atrayentes son específicamente reconocidos por los neutrófilos y son liberados.
Los fragmentos del complemento, C3a y C5a, liberados por la activación del
complemento, y fragmentos peptídicos formilados secretados por la bacteria en
crecimiento, son reconocidos con alta afinidad por receptores transmembranales
asociados a proteína G de la superficie de los neutrofilos. Estos son estimulados y
activan una cascada intracelular de señalización que resulta en la migración de
neutrófilos desde los vasos sanguíneos al sitio de inflamación (Murdoch 2000). Cerca
del 60% de las cepas de S. aureus secretan la proteína inhibitoria de la quimiotaxis
(chemotaxis inhibitory protein of staphylococci CHIPS, Figura 3) que reconoce con alta
afinidad tanto al receptor de péptidos formilados (formyl peptide receptor, FPR), como
al receptor del fragmento C5a (C5aR), lo que bloquea el reconocimiento por parte del
receptor de los agonistas correspondientes (de Haas, 2004). Las regiones de CHIPs que
reconocen estos receptores se ubican en diferentes partes de la molécula, puesto que
diferentes sustituciones de aminoácidos, así como diferentes anticuerpos monoclonales,
bloquean la actividad agonista de uno u otro receptor (Haas 2004, Postma 2004, Postma
2005).
Otra de las características de S. aureus para evadir la respuesta inmune del hospedero
consiste en la capacidad de secretar toxinas que dañan las membranas de las células del
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hospedero. La expresión de toxinas citolíticas que dañan leucocitos contribuye al
desarrollo de abscesos mediante la eliminación de neutrófilos que tratan de fagocitar y
eliminar a la bacteria. Las toxinas citolíticas que forman poros en la membrana de las
células provocan pérdida de material citoplasmático, provocando la lisis celular. El
arquetipo de esta clase es la α-toxina, que es secretada como un monómero que se
asocia en heptámero en la membrana creando un poro (Montoya 2003). Las
leucotoxinas bicomponentes consisten en dos subunidades secretadas por separado que
se ensamblan en hexa- o heptameros con una gran afinidad por leucocitos. Existen
cuatro tipos: la γ-toxina o γ-hemolisina (Hlg), la leucocidina Panton-Valentine (PVL),
Leucocidina E/D y Leucocidina M/F-PV-like. De las cuatro, las más estudiadas son las
dos primeras: la γ-toxina provoca la lisis tanto de eritrocitos como de leucocitos,
mientras que PVL sólo ataca leucocitos (Menestrina 2003). El gene de hlg esta presente
en >90% de las cepas de S. aureus, mientras que pvl, originalmente derivado de un
bacteriófago lisogénico, sólo se encuentra en un 1-2% de las cepas (Peacock 2002,
Prevost 1995).
Otra forma de evadir la fagocitosis consiste en la utilización de factores de superficie de
la bacteria que modifican la composición externa, modificando su composición final y
evadiendo la opsonofagocitosis (Figura 4). Entre los factores de superficie mejor
estudiados están la Proteína A, el factor de aglutinamiento A (ClfA) y la cápsula de
polisacáridos; adicionalmente, secreta otros factores entre los que se encuentran la
proteína extracelular acopladora de fibrinógeno (Efb) y la estafiloquinasa. Muchos de
estos factores desarrollan más de una función, como es el caso de la Proteina A y de
Map.
La Proteína A esta anclada a la pared celular de la bacteria, posee 4 o 5 dominios que se
acoplan a la región Fc de IgG (Uhlen 1984). El acoplamiento, la estructura de los
dominios de la Proteína A con el Fc de IgG ha sido resuelta mediante
rayos X
(Deisenhofer 1981). La consecuencia de esta interacción es la de tapizar la superficie de
la bacteria con IgG en la orientación incorrecta para ser reconocidas por el receptor Fc
del neutrófilo, lo que explica la capacidad antifagocítica de la Proteína A y su papel en
la virulencia. Las bacterias deficientes de Proteína A son fagocitadas in vitro en forma
eficiente por los neutrófilos (Gemmell 1991) y presentan menor virulencia en modelos
de infección animal (Palmqvist 2002, Patel 1987).
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Figura 4. Mecanismos de evasión de la opsonofagocitosis de S. aureus. La figura
ilustra (a) la cápsula de polisacáridos, que dificulta el acceso de los neutrófilos a
complemento y anticuerpos acoplados en la superficie de la bacteria; (b) la
estafiloquinasa extracelular (Sak), que activa plasminógeno que degrada IgG y C3b; (c)
proteína A con 5 IgG acoplados por su dominio Fc; (d) proteína acopladora de
fibrinógeno (Efb) se acopla al factor de complemento C3 y bloquea su depósito en la
superficie de la bacteria. La activación del complemento mas allá de la adherencia de
C3b es evitado, previniendo la opsonización. (e) Factor de aglutinamiento A (ClfA), que
se acopla a la cadena γ de fibrinógeno.
El Factor de Aglutinamiento A (Clumping factor A ClfA) es la proteína de adherencia a
fibrinógeno mas abundante y presente en la superficie de S. aureus en la fase
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estacionaria de crecimiento (O’Brien 2002, Bischoff 2004). A diferencia de la mayoría
de las proteínas de superficie que son expresadas predominantemente durante la fase
exponencial de crecimiento, el gene clfA es expresado en la etapa estacionaria a partir
de un promotor dependiente de δB (Bischoff 2004), que resulta en una expresión 10
veces mayor comparada con la etapa exponencial de crecimiento (O’Brien 2002). El
dominio A presente en el extremo N- terminal de ClfA se acopla a la cadena γ de las
moléculas de fibrinógeno (McDevitt 1997). Como resultado, in vivo las bacterias están
recubiertas con moléculas de fibrinógeno en su pared celular. ClfA es un factor de
virulencia demostrado en el modelo de artritis y sepsis de ratón (Josefsson 2001). Se
postula que la virulencia se incrementa durante la fase de bacteremia de la infección así
como durante el crecimiento en las articulaciones infectadas porque las bacterias son
recubiertas con fibrinógeno, lo que impide el acceso y la deposición de opsoninas. Esta
observación se sustenta por el hecho de que ClfA protege a la bacteria de la fagocitosis
por macrófagos (Palmqvist 2004), además de que esta protección depende de la
presencia de fibrinógeno. ClfB, que también se acopla a fibrinógeno y es similar a ClfA,
es expresada durante la fase de crecimiento exponencial además de su expresión en la
fase estacionaria (Ni Eidhin 1998), y probablemente cumplen una función similar.
La mayoría de las cepas de S. auerus presentan una delgada microcápsula compuesta de
polisacáridos de diferente composición, que resulta en diferentes serotipos, los mas
comúnes son el tipo 5, 8 y 336 (O’Riordan 2004, Roghmann 2005). La expresion de los
tipos 5 y 8 se asocia a mayor virulencia en modelos animales de infección (Luong 2002,
Thakker 1998, Nilsson 1997, Baddour 1992), la presencia de la cápsula disminuye la
capacidad de fagocitosis de la bacteria por parte de los neutrófilos en presencia de
opsoninas en ensayos in vitro, por lo que se presume que la cápsula es anti opsónica
(Thakker 1998, Nilsson 1997). En contraste, altos niveles de anticuerpos anti capsulares
promueven la opsonofagocitosis y protegen contra la infección (O’Riordan 2004, Lee
1997).
En los últimos años las investigaciones sobre S. aureus, se han enfocado en el desarrollo
de la bacteria en un ambiente natural, in vivo. Tradicionalmente se han estudiado las
bacterias en ambientes de laboratorio, en donde se evita su interacción tanto con otras
especies como con elementos de su medio ambiente natural. En la actualidad se sabe
que la mayoría de las bacterias forman colonias que generan un microambiente, y les
proporcionan una serie de beneficios, llamados biofilms.
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Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos
en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo
(Costerton 1995). El crecimiento en biofilms representa la forma habitual de
crecimiento de las bacterias en la naturaleza. La capacidad de formación de biofilm no
parece estar restringida a ningún grupo específico de microorganismos y hoy se
considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos los microorganismos son
capaces de formar biofilms. Aunque la composición del biofilm es variable en función
del sistema en estudio, en general, el componente mayoritario del biofilm es el agua,
que puede representar hasta un 97% del contenido total. Además de agua y de las
células bacterianas, la matriz del biofilm es un complejo formado principalmente por
exopolisacáridos (Sutherland 2001). En menor cantidad se encuentran otras
macromoléculas como proteínas, DNA y productos diversos procedentes de la lisis de
las bacterias (Branda 2001).
La etapa inicial del proceso de formación del biofilm es la adherencia sobre la
superficie. En el caso de las bacterias Gram positivas se ha descrito la participación de
proteínas de superficie (AtlE, Bap, Esp) en esta primera etapa de adherencia primaria
(Cucarella 2001, Toledo-Arana 2001). Una vez que la bacteria se ha adherido a la
superficie, comienza a dividirse y las células hijas se extienden alrededor del sitio de
unión, formando una microcolonia similar a como ocurre durante el proceso de
formación de colonias en placas de agar. En una etapa posterior la bacteria comienza a
secretar un exopolisacárido que constituye la matriz del biofilm y forma estructuras
similares a hongos (mushrooms) entre las cuales se observa la presencia de canales.
Finalmente, algunas bacterias de la matriz del biofilm se liberan del mismo para poder
colonizar nuevas superficies cerrando el proceso de desarrollo de formación del biofilm.
La liberación de las bacterias desde el biofilm es el proceso que menos se conoce. En el
caso de Staphylococcus aureus se ha descrito un proceso de variación de fase producido
por la inserción reversible de un elemento de inserción (IS256) en el interior del operón
(icaADBC) responsable de la síntesis del exopolisacárido del biofilm. El proceso de
inserción del elemento parece ocurrir en forma aleatoria en la población con una
frecuencia de 10-6 y produce bacterias deficientes en la síntesis del exopolisacárido y
por tanto deficientes en la formación del biofilm. Esto permite a la bacteria mantener un
pequeño porcentaje de la población incapaz de sintetizar el exopolisacárido y poder
escapar del biofilm. Como la inserción es un proceso reversible, el salto del IS desde el
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operón ica provocará una nueva variación de fase (Ziebuhr 1999). Otra alternativa
descrita en S. aureus consiste en la obtención de variantes deficientes en la formación
del biofilm debido a la eliminación de una isla de patogenicidad que contiene elementos
esenciales para el proceso de formación del biofilm (Ubeda 2003).
Numerosas evidencias experimentales sugieren que el proceso de formación del biofilm
esta regulado por una compleja cascada de reguladores. En S. aureus se ha descrito un
péptido denominado RIP, que inhibe un sistema de quorum-sensing y el proceso de
formación del biofim (Gov 2001). Además del quorum sensing, En S. aureus se ha
demostrado que un regulador global de virulencia denominado SarA es esencial para el
desarrollo del biofilm de esta bacteria. Este trabajo demuestra que un regulador de
virulencia es a su vez un regulador de la formación del biofilm, sirviendo de conexión
entre ambos procesos (Valle 2003).
Finalmente, parece lógico que la formación de biofilm se produzca en respuesta a las
condiciones ambientales y por tanto que existan sistemas de fosfotransferencia de doscomponentes (two-component systems) que transmitan la señal ambiental al interior de
la bacteria para adecuar la expresión de genes a la nueva situación ambiental. De los 16
sistemas de dos-componentes presentes en S. aureus, únicamente el sistema arlRS y el
sistema agr parecen regular negativamente el proceso de formación del biofilm in vitro
(Toledo-Arana 2005).
Tabla 2. Posibles antígenos utilizables en vacunas contra S. aureus (Götz 2004)
Antígenos
Función
Proteínas asociadas a pared celular
FnBPs
(FnBPA y B)
Atl
Ebh
(ECM)
ClfA,B
AAP
Eap
Vwb
Willebrand
Cna
Toxinas
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Proteínas de adherencia a Fibronectina A y B
Autolisina importante, adherencia a fibronectina y
vitronectina
Adherencia a fibronectina y matriz extracelular
Proteínas de adherencia a fibrinógeno
Adherencia a células del epitelio nasal
Involucrado en procesos de internalización
Proteína de adherencia al factor novel von
Proteína de adherencia a colágeno
α toxina
celulares
PVL
Hlg
β toxina
SEs
TSST-1
superantígeno
ETs A-I
escaldada
toxina formadora de poros en membranas
leucocidina Panton-Valentine, formadora de poros
gamma hemolisina
esfingomielinasa
enterotoxinas estafilococales, superantígenos
toxina del síndrome de choque tóxico 1,
Toxinas exfoliativas que causan Síndrome de piel
de S. aureus, superantígeno
Polímeros de la pared celular
CP5
CP8
PIA
ClfA
LTA
polisacárido capsular tipo 5
polisacárido capsular tipo 8
polímero β-1,6 ligado N-acetilglucosamina
Proteína de adherencia a fibrinógeno
Ácido lipoteicóico.
Desarrollo de vacunas. Aunque la vacunación con varios antígenos o con la bacteria
completa de S. aureus se ha utilizado en animales desde hace algún tiempo con éxito
moderado, el desarrollo de nuevas vacunas contribuirá al control de la enfermedad,
especialmente en grupos identificados como de alto riesgo, en la Tabla 2 se presenta una
lista de posibles antígenos.
A pesar de que individuo que ha sufrido una infección de S. aureus normalmente no
está protegido de una infección subsiguiente, hay evidencia de que es posible montar
una respuesta de anticuerpos robusta a componentes de la superficie de la bacteria
altamente purificados, como la cápsula de polisacáridos (Lee 1997), la proteína
acopladora a colágeno Cna y la proteína acopladora a Fibrinógeno ClfA (Josefsson
2001, Nilsson 1998). En cada caso, la inmunización activa ha demostrado proteger a
animales de laboratorio de la infección. Además, la inmunización de pacientes sujetos a
hemodiálisis con staphVAX, constituida por polisacáridos capsulares de tipo 5 y 8
conjugado con la exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa, tuvo éxito en la reducción
de la incidencia de infección en estos pacientes vulnerables en un período de 8 meses
(Fattom
2004).
Adicionalmente,
la
inmunización
pasiva
de
ratones
con
inmunoglobulinas obtenidas de donadores humanos con títulos altos de anticuerpos
anti-ClfA protegieron contra dosis letales intravenosas de la bacteria (Josefsson 2001,
Vernachio 2003), y el mismo resultado se obtuvo al utilizar una versión de anticuerpo
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monoclonal humanizado dirigido contra ClfA (Patti 2004, Hall 2003), la cual está
siendo actualmente probada en fase clínica II en pacientes para tratar bacteremia.
Vacunación: una estrategia para el control de la infección.
El bloqueo de las primeras etapas de infección, es decir el acoplamiento de la bacteria a
los receptores celulares del hospedero y la colonización de las superficies de la mucosa,
puede ser una estrategia muy efectiva para prevenir infecciones bacteriales. Estudios
recientes han demostrado que la vacunación profiláctica utilizando la adhesina FimH de
E. coli uropatogénica puede bloquear la infección de la bacteria (Wizemann 1999). Los
avances recientes en la identificación de posibles adhesinas y otras proteínas de
superficie de diversas bacterias patógenas permiten el desarrollo de estrategias de
vacunación similares para prevenir enfermedades.
El desarrollo de las técnicas modernas de manipulación genética ha permitido el
surgimiento de nuevos tipos de vacunas.
El uso de lactococcus lactis como un vector de vacunación ha emergido como uno de
los mas avanzados prototipos de una posible nueva clase de vacunas bacteriales
derivadas de bacterias gram-positivas no invasivas y no patogénicas (Wells 1996a). L.
lactis es una bacteria clasificada como "generalmente considerada segura" por la larga
historia de su uso en la producción de productos lácteos fermentados. Su pariente
funcional mas cercano es Streptococcus gordonii, con el que comparte la capacidad de
servir como vehículo de transporte de antígeno para inmunización mucosal (Medaglini
1995). A diferencia de S. gordonii, que es un comensal de la cavidad oral, L. lactis
carece de la capacidad de reproducirse in vivo, excepto en ratones gnotobióticos
(Gruzza 1994). Estudios en los que se administra L. lactis vivo a animales y voluntarios
humanos han demostrado que el paso de la bacteria a través del tracto entérico es
transitorio, sin evidencia de colonización (Gruzza 1994, Klijn 1995). A pesar de su no
capacidad de colonizar, L. lactis es capaz de llevar antígenos heterólogos al sistema
inmune mucosal y sistémico a través de la ruta mucosal (Wells 1996b).
Por otro lado, L. lactis puede expresar además de antígenos, moléculas biológicamente
activas, como citoquinas, las cuales al ser expresadas en la membrana de la bacteria,
pueden modular la respuesta inmune y funcionar como adyuvantes para generar una
mejor respuesta inmune: L. lactis recombinante que expresa TTFC en su citoplasma, y
interleucina 2 (IL-2) o IL-6 en su membrana, fueron utilizados en inmunización
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intranasal de ratones. El título de anticuerpos anti-TTFC creció mas rápido y fue mayor
al producido en bacterias sin la expresión de las interleucinas (Steidler 1998). El uso de
adyuvantes adicionales en la inmunización con L. lactis recombinante depende en gran
medida del antígeno. La inmuniz
Lactococcus lactis ha sido manipulado extensamente para la producción de diversas
proteínas (Bermúdez-Humarán 2002, Enouf 2001, Geoffroy 2000, Le Loir 1998),
incluyendo algunos antígenos de origen bacterial o viral (Bermúdez-Humarán 2002,
Enouf 2001, Lee 2001). En la Tabla 5 se muestran algunas proteínas producidas en L.
lactis. L. lactis es de particular interés para la administración oral de proteínas
funcionales ya que es una bacteria no comensal generalmente utilizada en la industria
alimenticia que además no tiene la capacidad de sobrevivir en el tracto digestivo de
modelos animales y humanos (Drouault 1999, Geoffroy 2000). Estas propiedades
pueden asegurar expresión temporal de proteínas como citoquinas, limitando el riesgo
de toxicidad, de tal manera que L. lactis puede ser utilizada para producir tanto antígeno
en su citoplasma, como citoquinas secretadas, lo cual ha sido recientemente explotado
para generar una mejor respuesta inmune al antígeno E7 del virus de papiloma humano
tipo 16, el cual en si no genera una respuesta inmune celular fuerte, pero con la
coexpresión de interleuquina 12 (IL-12) se mejoró significativamente la respuesta
inmune (Bermúdez-Humarán 2003). La administración intranasal de L. lactis
recombinantes que expresan E7 e IL-12 generó una respuesta inmune suficiente para
proteger a ratones en contra de la administración letal de células tumorales TC-1 que
expresan E7. Esta protección se logró tanto en inmunización preventiva, i.e. antes de la
dosis letal, como en inmunización terapéutica, i.e. después de 7 días de la dosis letal, lo
que indica una respuesta tanto humoral como celular (Bermúdez-Humarán 2005).
Otro ejemplo de la diferente capacidad de producción de respuesta inmune por parte de
L. lactis recombinante es la producción de una vacuna candidato contra Brucella
abortus (Ribeiro 2002): la proteína inmunogénica L7/L12 fue expresada en L. lactis,
bajo diferentes señales para su producción en citoplasma, pared celular y secreción
extracelular. En citoplasma la producción fue de 0.5 mg por litro; al ser secretada fue de
3 mg/Lt; y tras la fusión con un propéptido inductor de expresión (Le Loir 1998), se
incrementó la expresión a 8 mg/lt. Al ser administrada oralmente en ratones, L7/L12
expresada intracelularmente en L. lactis generó la producción de IgAs específicos
detectados en heces, lo que constituye una respuesta humoral local. A pesar de no
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detectar anticuerpos anti-L7/L12 en suero, los ratones inmunizados demostraron una
protección inmune parcial contra una cepa de Brucella abortus virulenta inoculada
intraperitonealmente (Pontes 2003). Por otro lado, la expresión de antígeno SpaA
derivado de Erysipelothrix rhusiopathiae en L. lactis protegió a ratones inmunizados
intranasalmente y oralmente con la bacteria de un desafío de 100 LD50 de la bacteria
inoculada en el muslo de los animales. La respuesta inmune generó la producción de
IgG e IgA específicos contra el antígeno, detectados en suero y heces respectivamente
(Cheun 2004).
Actualmente existen varios sistemas de expresión para L. lactis, algunos expresando
constitutivamente, otros bajo estricto control inducido, para expresar diversas proteínas
tanto en citoplasma, pared celular y secretadas (Nouaille 2003). El genoma de L. lactis
ya ha sido secuenciado (Bolotin et al., 2001), y a la fecha se tiene el genoma de cinco
cepas de la bacteria (Klaenhammer et al. 2002, Liu 2005, Tabla 4). Otra herramienta útil
en la expresión de proteínas consiste el análisis de 38 promotores, los cuales que
difieren en su capacidad de inducir expresión fuerte de proteínas, y son clasificados
como constitutivos (de Vos, 1999).
Tabla 4: Genomas secuenciados de L. lactis (Liu 2005).
Subespecie Cepa Tamaño(mb) Origen/uso
Institución
cremoris MG1363 2.53
Netherlands;
Univ. of Groningen, The
Queso/cepa modelo
Univ. College Cork, Republic of
Ireland
IFR, UK; Univ. of Bielefeld,
Germany
cremoris SK11
USA; JGI
cremoris QA5
cremoris* KF147 y
Netherlands
KF282
lactis
IL1403
2.4
Queso
Utah State U., U. of Minnesota,
2.51
>2.4
Perecederos (Dairy) INRA, France
Plantas
NIZO Food Research, The
2.37
*proyecto de secuenciación aún no terminado
Queso/cepa modelo INRA and Genoscope, France
L. lactis es excelente para la expresión y estudio de proteínas integrales de membrana
tanto de procariotes como de eucariotes (Kunji et al. 2003), las proteínas de membrana
expresadas son directamente exportadas a la membrana, la bacteria tiene actividad
proteolítica débil que puede ser eliminada (proteasa HtrA, Miyoshi 2002), la bacteria
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tiene una sola membrana, la cual es fácilmente solubilizada por diferentes detergentes
(Kunji et al. 2003). Adicionalmente, el tener una sola membrana le permite ser un buen
hospedero para expresar proteínas para secreción extracelular y/o anclaje a la
membrana, en donde también ayuda la baja actividad de proteinasas extracelulares: sólo
se conocen hasta ahora dos, la proteinasa anclada a membrana PrtP (200kDa) (Kunji et
al. 1996), y la proteinasa asociada a membrana HtrA (Poquet et al. 2000), la primera se
codifica en un plásmido y por lo tanto esta ausente en las cepas carentes de plásmidos
(Gasson 1983), y para la segunda se dispone de una mutante (Miyoshi et al. 2002;
Lindholm et al. 2004). Varios antígenos han sido expresados en L. lactis (Enouf et al.
2001; Le Loir et al. 2001b; Åvall-Jääskeläinen et al. 2002; Bermúdez-Humarán et al.
2002, 2003; Ribeiro et al. 2002; Chatel et al. 2003; Steen et al. 2003; Lindholm et al.
2004 y otros, ver Tabla 5). Por lo general se usan dos señales peptídicas para la
secreción: La señal peptídica de la proteína mayor secretada Usp45 (van Asseldonk et
al. 1993), y la señal peptídica de proteinasa asociada a la pared celular PrtP. En general
Usp45 da mejores resultados (Arnau et al. 1997; Le Loir et al. 2001a; Nouaille et al.
2003). Para la expresión de proteínas en la pared celular generalmente dos sistemas se
utilizan: el sistema basado en la enzima sortasa que usa la secuencia de aminoácidos
LPXTG tanto en el C-terminal como en el N-terminal de la proteína a expresar (Dieye
et al. 2001; Ton-That et al. 2004), y la secuencia de anclaje de la autolisina mayor de L.
lactis que también puede colocarse tanto en C- como en N- terminal (Steen et al. 2003).
Mientras que las bacterias aeróbicas pueden crecer a una gran densidad en medio de
cultivo, mayores a 100 g/lt de masa celular seca (Riesenberg and Guthke 1999), debido
al metabolismo de fermentación esto no es posible con L. lactis. En un medio de cultivo
amortiguado como M17 la máxima densidad celular es de aproximadamente 1 O.D. (1
g/lt de masa celular seca), el crecimiento se detiene al llegar el pH a un nivel cercano a
5.0 (Pedersen et al. 2002). La razón principal es la acumulación de ácido láctico que
eventualmente detiene el crecimiento. Sin embargo, recientemente se descubrió que L.
lactis puede crecer en condiciones aeróbicas cuando se agrega grupo heme al medio
(Duwat et al. 2001), bajo estas condiciones el periodo de crecimiento y sobrevida de la
bacteria es considerablemente extendido.
En L. lactis la preferencia por ciertos codones en la síntesis de proteínas es un factor
importante a la hora de clonar fragmentos de DNA de otros organismos en la bacteria.
Si el organismo donador es filogenéticamente relativamente cercano a la bacteria, o el
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porcentaje de GC es similar, entonces la probabilidad de una expresión exitosa es alta,
en caso contrario, el gene generalmente es rediseñado para presentar los codones
preferenciales de la bacteria hospedera que expresará la proteína (Fuglsang 2003; Gupta
et al. 2004).
Varios medios de cultivo están disponibles para cultivar L. lactis, el más común en el
laboratorio es el medio M17 (Terzaghi and Sandine 1975) suplementado con glucosa,
lactosa u otros azúcares como fuente de carbón, con el antibiótico correspondiente. Sin
embargo este medio es relativamente caro y debido a la utilización de extracto de carne
puede haber problemas, como la presencia de BSE. Los ingredientes para un medio de
cultivo a mayor escala son generalmente 1-3% peptona, 0.5-2% extracto de levadura, 110% fuente de carbón y pequeñas cantidades de iones de magnesio y manganeso,
regulando el pH del medio activamente; siendo la receta final optimizada según la
aplicación individual (Mierau et al. 2005b).
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Tabla 5 Algunas proteínas producidas en L. lactis. Se indica la localización final de la
proteína expresada: S, secretada, C, Citoplasma, A, anclaje en pared celular.
Proteínas
Gene
Origen
Localización
Referencia
Gene reporteros
Nuc
nuc
Staphylococcus aureus
C/S/A
(Dieye 2001,
Le Loir 1994)
β-lactamasa
bla
Escherichia coli
S
(Sibakov 1991)
β-galactosidasa
lactamasa
β-gal
lacL,lacM
Clostridium acetobutylicum
Leuconostoc mesenteroides
C
C
(Pillidge 1991)
(Israelsen 1995)
α-amilasa
1993,
amyS
Geobacillus stearothermophilus
S
(van Asseldonk
(Le Loir 1998)
α-amilasa
1992)
Cloranfenicol acetil
transferasa
M6
Proteína Fluorescente
Verde (GFP)
Luciferasa
Luciferasa
Estreptavidina
β-Glucuronidasa
amyL
Bacillus licheniformis
S
(Perez-Martinez
cat-86
Bacillus pumilus
C
(Koivula 1991)
gfp
Streptococcus pyogenes
Aequoria victoria
A
C
(Piard 1997)
(Geoffroy 2000)
luxAB
Vflux
SA
Vibrio harveyi
Vibrio fisheri
Streptomyces avidinii
C
C
A
(Corthier 1998)
(Waterfield 1995)
(Steidler 1998b)
gus
Escherichia coli
C
(Thompson 2001)
L7/L12
ureB
ttfc
Brucella abortus
Helicobacter pilori
Clostridium tetani
Antígenos bacteriales
L7/L12
Ureasa subunidad B
TTFC
S/C/A
S
S
(Ribeiro 2002)
(Lee 2001)
(Wells 1993)
S
(Theisen 2004)
Antígenos eucariontes
GLURP-MSP3 proteína fusión
Plasmodium falciparum
Antígenos virales
E7
Humarán 2002
E7
HPV tipo 16
S/C/A
(BermúdezCortes-Perez
2003)
NSP4
BCV epítope
VP8 sub. VP4
HIV envelope
SARS nucleocápside
NSP4
BCV
VP8
env
N
Bovine rotavirus
Bovine coronavirus
rotavirus
Virus inmunodeficiencia humano
SARS coronavirus
C
S
S
A
S/C
(Enouf 2001)
(Langella 1999)
(Gil 2001)
(Xin 2003)
(Pei 2005)
IL-2
IL-6
IL-10
Ratón
Ratón
Ratón
S
S
S
(Steidler 1995)
(Steidler 1998)
(Schotte 2000,
Citoquinas
IL-2
IL-6
IL-10
Steidler 2000)
2011 CyTA Labs S.A. de C.V
IL-12
Humarán 2003)
IL-12
Ratón
S
(Bermúdez-
IFN-ω
Humarán 1998)
IFN-ω
Ovino
S
(Bermúdez-
C/S
S
(Bernasconi 2002,
Chatel 2001,
Alergenos
BLG
Blg
Epítope Blg41-60
Bovino
Bovino
2003)
Factores de Virulencia
Proteína adherencia
a fibronectina A
Factor aglutinamiento A
Factor aglutinamiento
AyB
Proteína serinaaspartato repetida
Proteína A
Enterotoxina A
Substancia de agregación
Polisacáridos capsulares
Internalina
fnbpA
Staphylococcus aureus
A
(Sinha 2000)
clfA
clfB
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus
A
A
(Que 2000)
(O'Brien 2002b)
sdrE
Staphylococcus aureus
A
(O'Brien 2002b)
spA
sea
asc10
genes cps
inlA
Staphylococcus aureus
A
Staphylococcus aureus
S
Enterococcus faecalis
A
Streptococcus pneumoniae CPS excretada
Listeria monocytogenes
A
(Steidler 1998b)
(Le Loir 2005)
(Wells 2000)
(Gilbert 2000)
(Le Loir 2005)
ABP-118
abp118
S
(Flynn 2002)
Enterocina A
Enterocina P
Pediocina PA-I
Colicina V
1997)
genes ent
entP
genes ped
Lactobacillus salivarius
subsp. salivarius
Enterococcus faecium
Enterococcus faecium
Pediococcus acidilactici
Escherichia coli
S
S
S
S
(Martinez 2000)
(Herranz 2005)
(Martinez 2000)
(van Belkum
Sulfolobus solfataricus
C
(Giuliano 2004)
Listeria monocytogenes bacteriófago
clara de huevo gallina
S
C
(Gaeng 2000)
(van de Guchte
Bacillus subtilis
S
(van de Guchte
Lactobacillus helveticus
Lactobacillus delbrueckii
subs. bulgaricus
Leuconostoc mesenteroides
Streptococcus equisimilis
S
A
(Kahala 1999)
(Bernasconi 2002)
S
S
(Neubauer 2003)
(Wolinowska
PC
lip
Bovino
Staphylococcus hyicus
Bovino
S
S
S
(Simons 1991)
(Drouault 2000)
(Arnau 1997)
fedF
Escherichia coli
S/A
(Lindholm 2004)
Bacteriocinas
Enzimas
Alfa-glucosidasa
malA
termoestable
Enzima bacteriófago lítica ply118
Lisozima
hel
1989)
Proteasa neutral
npr
1990)
Aminopeptidasa N
pepN
Proteasa de superficie
prtB
Dextran sucrasa
Estreptodornasa
1991)
Proquimosina
Lipasa
Plasmina
dsrD
sdc
Otros
Adhesina fimbrial F18
2011 CyTA Labs S.A. de C.V
(dominio de acoplamiento de receptor)
Proteína capa S
slpH
Lactobacillus helveticus
2011 CyTA Labs S.A. de C.V
Asoc. pared cel. (Callegari 1998)
Vacuna con antígenos de ClfA y FnbpA.
Ya hemos descrito los papeles que tienen ClfA y FnbpA en el proceso de infección y
colonización de la bacteria. Estas dos adhesinas presentes en la pared celular de S.
aureus promueven la invasión celular por puentes de fibronectina, promueven en parte
la activación de plaquetas, y se adhieren a fibronectina y fibrinógeno, lo que al mismo
tiempo recubre a la bacteria y además promueve el anclaje de la bacteria a las
superficies del hospedero y a biomateriales que han estado por largo tiempo en contacto
con el hospedero. (Luk 1989; Sun 1997, Dziewanowska 1999, 2000; Flock 1987; Sinha
1999; Peacock 1999; Fowler 2000; Miyamoto 2001). Ambas adhesinas poseen
dominios de adherencia a fibrinógeno y fibronectina, pero la afinidad por los sustratos
es diferente: FnbpA se adhiere al fibrinógeno, aunque con menor afinidad que a la
fibronectina (Wann 2000).
La región responsable de la adhesión a la fibronectina se localiza cerca de la región de
la proteína que atraviesa la pared celular de la bacteria. Esta región esta compuesta de 3
regiones repetidas de un dominio de ~38 aminoácidos (regiones D1-D3), y cada una de
ellas muestra capacidad de adherencia a la fibronectina in vitro. (Signas et al, 1989;
Schennings et al, 1993; Flock et al, 1987; Ciborowski, 1992; Penkett et al, 1997, 1998,
2000). Las Fnbp de otras especies de Staphylococcus y de Streptococcus poseen una
secuencia de aminoácidos muy similares; lo que sugiere que las Fnbp presentan poca
variabilidad en las diferentes especies bacterianas del género (Patti, 1994).
Se han realizado varios estudios para evaluar las características de los anticuerpos
producidos contra la Fnbp de Staphylococcus aureus. Para lograr una respuesta inmune,
se ha usado 1) la proteína Fnbp completa o en parte (Espersen 1985; Huesca 2000), 2) la
Fnbp fusionada a otras proteínas (recombinante) (Ciborowski 1992; Flock 1987; Luk
1989; Mamo 1994, 1995; Park 1999; Rozalska 1992, 1993, Schennings 1993; Sun
1997) o 3) sus dominios D1-3 expresados en la membrana de virus recombinantes
usados como vectores. (Brennan 1999; 1999b; Rennermalm 2001). El uso de la proteína
nativa Fnbp como antígeno ha demostrando un efecto protector parcial contra la
infección por Staphylococcus aureus en animales experimentales (Ciborowski 1992;
Rozalska 1992, 1993, 1994). Sin embargo, los anticuerpos producidos no impiden la
adhesión de la Fnbp bacteriana a la fibronectina del hospedero como se esperaba,
observándose en algunos casos un incremento (en lugar de una reducción) a la adhesión.
La razón de este incremento a la adhesión se encontró al observar que la Fnbp en su
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forma nativa carece de estructura secundaria, por lo que no es un buen antígeno; pero al
adherirse a la fibronectina forma un complejo ligando-receptor que si posee una
estructura secundaria (Penkett, 1997, 1998). Como consecuencia, el complejo Fnbp-Fn
se presenta como un buen antígeno e induce anticuerpos que reaccionan sólo al
complejo Fnbp-Fn, promoviendo además una mayor estabilidad del complejo. Los
anticuerpos generados por el complejo Fnbp-Fn no tienen la capacidad de bloquear la
adhesión de Fnbp a la fibronectina (Sun 1997), pero sí promueven la opsonización de la
bacteria, lo que da por resultado la protección parcial observada.
Para producir anticuerpos que reaccionen sólo a la Fnbp y no al complejo FnbpFibronectina, se han usado fragmentos de la Fnbp que contienen partes de los dominios
D1-3, pero que no contienen los aminoácidos esenciales para la adhesión a la
fibronectina. Estos antígenos inducen la producción de anticuerpos que reaccionan sólo
con Fnbp y no con el complejo Fnbp-Fn, por lo que interfieren en la unión de Fnbp a la
fibronectina y evitan la adhesión de la bacteria a la fibronectina del hospedero. Estos
anticuerpos interfieren en el proceso de colonización de la bacteria y además promueven
su opsonización, dando por resultado una mayor protección contra la infección por
Staphylococcus aureus (Brennan 1999, 1999a; Huesca 2000).
En el caso de ClfA, la región responsable de la adherencia al fibrinógeno se denomina
Región A, compuesta por ~500 aminoácidos (residuos 44-542 en la proteína), con una
similitud del 26% entre ClfA y ClfB, aunque se unen al fibrinógeno en sitios distintos
(O'Connell 1998; Ni Eidhin 1998, McDevitt 1997). ClfA es expresada en la etapa
estacionaria de crecimiento, mientras que ClfB se expresa en la etapa de crecimiento
exponencial (Ni Eidhin 1998).
El fragmento mínimo de ClfA que aún retiene la capacidad de adherencia al fibrinógeno
está formado por los aminoácidos 221-559, y los anticuerpos generados utilizando este
fragmento como antígeno bloquean la adherencia de ClfA y S. aureus al fibrinógeno, al
unirse a la región 221-559 de ClfA responsable de la adherencia (Hartford 2001). El
fragmento formado por los aminoácidos 500-559 no tiene capacidad de adherencia al
fibrinógeno, pero los anticuerpos generados utilizando este fragmento aún bloquean la
adherencia de ClfA y S. aureus al fibrinógeno, pues la región 500-559 que reconocen es
necesaria para el proceso de adhesión. El fragmento 500-559 es por lo tanto un buen
candidato para ser usado como antígeno en una vacuna, pues no presenta función de
adherencia al fibrinógeno y los anticuerpos generados son capaces de inhibir la adhesión
2011 CyTA Labs S.A. de C.V
de ClfA al fibrinógeno y de promover la opsonización de la bacteria (Hartford et al,
2001).
Esta tesis presenta los resultados del estudio de la respuesta inmune inducida en ratones
tras la inmunización oral, intranasal e intraperitoneal con y sin adyuvante completo de
Freund, de una cepa de Lactococcus lactis subs. cremoris recombinante, la cual expresa
en su pared celular los antígenos derivados de la secuencia de FnbpA y ClfA arriba
mencionado. Estos fragmentos antigénicos fueron clonados por separado y en tándem
en L . lactis, utilizando el sistema de secreción a membrana mediada por la enzima
sortasa, y el anclaje a pared celular mediado por la señal de reconocimiento LPXTG. La
respuesta inmune se midió en función de los anticuerpos IgG e IgA específicos contra
los dos antígenos generados mediante distintas vías de administración de las diferentes
cepas recombinantes de L. lactis. El resultado de esta investigación permitirá conocer
las formas de clonación y administración mas eficientes para generar una respuesta
inmune, lo que será utilizado en modelos animales de infección para conocer la
capacidad protectora contra la infección generada por esta respuesta inmune. Asimismo,
nos permitirá adaptar el modelo de inmunización y clonación para generar candidatos de
vacunas contra otros antígenos además de S. aureus.
2011 CyTA Labs S.A. de C.V