Bacterinas para el control inmune de la mastitis

Bacterinas para el control inmune de la mastitis
M.V.Z. PhD. Pablo Hernández Jáuregui A.
Dirección técnica CyTA Labs.
Mayo del 2007.
Escherichia coli
Escherichia. coli es una de las bacterias predominantes en el tracto entérico de la
mayoría de los mamíferos. La colonización por esta bacteria ocurre después del
nacimiento como contaminante del agua y alimento ingerido y que proviene de otros
individuos afines al medio ambiente. Una vez establecida la contaminación, E. coli
puede persistir durante meses en el tracto intestinal y en forma predominante en el
intestino grueso.
Escherichia coli contiene tres antígenos de superficie; O localizados en la pared celular
de la bacteria. K o Vi, localizado en la superficie de la pared celular. H ubicado en los
flagelos. Estos determinantes antigénicos son definidos en forma genética. Las
combinaciones de los determinantes antigénicos son múltiples por lo que la
biodiversidad es amplia, sin embargo de 14,000 aislamientos solo 708 mostraron
combinaciones diferentes de los antígenos H y O.
Patogenicidad de las infecciones extra-intestinales.
En el humano las principales infecciones extra-intestinales se ubican en las meninges y
tracto genitourinario. El contacto del neonato con biotipos de E.coli que expresan
determinantes antigénicos de adhesión a las células epiteliales y colonización son la
causa de presentación de meningitis. La variable mas frecuente de adhesinas que causan
meningitis es K-1. Este antígeno está presente en más de 40 % de las heces de humanos.
La composición de K1 es similar a la del glicocalix de las células del hospedero y por
ello su reconocimiento como antígeno es encubierto. No existen vacunas para esta
variedad de E.coli.
1
En la mujer la contaminación de la uretra propicia la colonización de E. coli y la
presentación de infección en vías urinarias. En el caso de las mujeres con infecciones
frecuentes de las vías urinarias, la vacunación con concentrados de las fimbrias tipo 1 de
E coli protegen contra nuevas exposiciones o reducen el índice de casos clínicos.
En el caso de los bovinos productores de leche, las condiciones de alojamiento y manejo
durante la lactancia predisponen a la introducción de E. coli vía contaminación del
conducto galactóforo. Poco se conoce sobre las variedades de E.coli productoras de
colonización en la glándula mamaria.
Infección intestinal por E coli.
En el hombre se reconocen cuatro subtipos de E. coli capaces de inducir lesiones y
diarrea. Las cepas entero-toxigénicas (ETEC) son las más frecuentes causas de diarrea
en infantes así como en los individuos no familiarizados con estos antígenos como
ocurre en los viajeros de otras localidades. La colonización de estas cepas es
determinada por la presencia de adhesinas codificadas por la presencia de plásmidos.
Las adhesinas de E. coli por ende son especie específicas. En el hombre las adhesina
presentes en las fimbrias son del tipo CFA (Factores de Colonización) 1 y 2 y E8775.
En los porcinos los determinantes antigénicos son del tipo K88, K 46 K 16 K 18. En los
bovinos las E coli productoras de diarrea de los recién nacidos contienen fimbrias con
adhesinas K99. Es probable que existan otros determinantes antigénicos aún no
descubiertos y se desconoce si los casos de mastitis de alta toxicidad corresponden a
estos biotipos de fimbrias y adhesinas.
Toxinas Termo Estable (T S) y Termo Lábil (T L)
Son dos las toxinas presentes en la cepas de E. coli enterotoxigénicas, la toxina termo
estable (TS) y la termolábil (TL). La TL es una proteína de 86,000 daltons y parecida en
su composición y por ende en su efecto y/o acción, con la toxina de vibro cholera. La
TS está constituida por pequeños polipéptidos entre 18 y 50 aminoácidos. Ambas
toxinas son responsables de modificaciones en la fisiología del enterocito dando lugar a
la salida de solutos.
2
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Escherichia coli Como antígeno vacunal
Rainard P, y Caffin J.P. (1983) informaron sobre la estimulación de inmunoglobulinas
del tipo IgG1 y 2, e IgM después de la aplicación de E.coli cepa B117 asociada a un
adyuvante durante el período de secado de la lactancia, seguida cinco semanas después
de la infusión intramamaria de la vacuna sin adjuvante. Los dos grupos de vacas,(
inmunizadas y no inmunizadas ) fueron desafiadas con 104 unidades formadoras de
colonias de la cepa de E-coli B117. La concentración de IgG1 aumentó
considerablemente en la leche así mismo la IgM, la mayor actividad bactericida hacia E.
coli se desarrolló en los cuartos inmunizados . No obstante la biodiversidad de E. coli en
el ambiente intestinal de los bovinos, se ha demostrado por el método experimental, la
respuesta inmune ante la aplicación de E.coli como antígeno vacunal y la respuesta
regulatoria después del desafió con la misma cepa vacunal.
En un experimento paralelo, Rainard P. analizó la respuesta celular inflamatoria y la
actividad de los anticuerpos opsonizantes en la leche en las vacas inmunizadas
Antes del desafió, la leche libre de células y en contacto con leucocitos polimorfo
nucleares agregados, destruyó la E.coli vacunal también incorporadas al sistema,
mientras que la leche de vaca no inmunizada, permitió la sobrevida de E.coli vacunal y
su multiplicación después del desafió in vivo , la respuesta inflamatoria se inició entre
las 8 y 10 horas post inoculación en los dos grupos de vacas , sin embargo en el grupo
inmunizado, la reacción inflamatoria fue notable y de gran celularidad desde la 6 horas.
Los estudio in vitro demostraron la alta actividad bactericida.
Estos experimentos demostraron con claridad que se formaron inmunoglobulinas
específicas contra los determinantes antigénicos presentados mediante la inmunización
al sistema inmune. La mayor actividad bacteriana obedece a la opsonizacion de las
bacterias y a la fagocitosis por células monucleares estimuladas.
3
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BACTERINA con E.Coli J 5
La aplicación a 246 vacas de la bacteriana de la capa mutante rugosa de E-coli 0111:B4,
asociada al adjuvante incompleto de Freund, dos dosis durante el periodo seco y una en
la lactancia temprana, obtuvo un índice de mastitis por bacterias Gram negativas de
2.57% comparadas con 12.77% obtenido en las vacas no inmunizadas. Estos datos son
confiables dado que la estadística mostró p menor a 0.005, lo que indica que existe
correlación directa sobre la incidencia de mastitis, en forma reducida en los animales
tratados comparados con los no inmunizados (González R.N y Col 1989). Sin embargo
el trabajo de Hill AW (1991) demostró que la inmunización con 0111: B4 J5 no protege
a las vacas después del desafió experimental de la aplicación intramamaria, sin embargo
se demostró la elevación de IgG1 y 2 en el grupo inmunizado (Hill AW 1991). En dos
experimentos similares se analizó el efecto de la vacuna J-5 ante un desafío con E.coli
que produce una mastitis moderada. Las vacas inmunizadas con J-5 redujeron el tiempo
y signos clínicos de mastitis comparados con el grupo de vacas no inmunizadas, así
mismo el número de bacterias cuantificadas de los cuartos desafiados, fue menor en el
grupo de vacas inmunizadas (Hogan y col 1992).
En estos trabajos se demostró que la vacunación con la cepa de E.coli 011: B4, J5, no
previene la infección, sin embargo reduce la severidad de los signos clínicos, aún con el
desafió de cepas heterólogas (Hogan J.S. 1992).
La aplicación de E.coli J5 durante la etapa de lactancia resultó en 7% de reducción de la
producción de leche durante 5 días post-aplicación, comparado con un grupo control de
vacas que solo recibió solución salina vía I M (Musser J.M. 1996). En este trabajo se
demostró que la presencia de endotoxinas en el biológico probablemente es responsable
del incremento de factores pro-inflamatorios que incidieron sobre la producción de
leche. El producto J-5 se recomienda usar durante el periodo de secado.
4
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BACTERINA ECOSTAPH PM+3*
La bacterina EcoStaph PM+3 es un biológico preparado con cuatro variables de
Escherichia coli que expresan adhesinas y dos proteínas de Staphylococcus aureus
como factores de adhesión; la proteína de agregación y la de adhesión a la fibronectina.
Es un producto inactivado con aldehidos (muerto) por lo que los microorganismos no se
pueden multiplicar en el receptor de la vacuna. Se puede aplicar en cualquier etapa de la
producción. Si es aplicado en la etapa de lactancia se espera reducción de la producción
de leche entre 7 al 10%. No induce reacciones colaterales locales ni sistémicas graves,
dado el control de esterilidad y de concentración de endotoxinas. Contiene el adyuvante
PM+3, compuesto constituido por dos tipos de glicósidos inmunoestimulantes. En
forma eventual puede ocurrir choque anafiláctico en animales sensibles. Por lo anterior
después de la vacunación, debe de observar el ganado y en caso de choque anafiláctico
aplicar epinefrina y proporcionar tratamiento sintomático.
Escherichia coli
La bio-variabilidad de Escherichia coli en lo que respecta a sus determinantes
antigénicos es muy amplia. Las variables determinantes de virulencia y patogenicidad
5
en Escherichia coli se caracterizan por adhesión a la membrana citoplásmica de las
células. Esos determinantes se encuentran en los pili y fimbrias de la superficie de
Escherichia coli y son los determinantes K30, K35, K85 y K99 que conforman los
antígenos de adhesinas de Eco Staph PM+ 3. Las cepas de Escherichia coli, fueron
obtenidas de casos clínicos de mastitis y seleccionadas por contar con determinantes
antigénicos comunes a la mayoría de las Escherichia coli.
Escherichia coli es una bacteria comensal del tracto entérico de la mayoría de los
mamíferos. Sin embargo algunas variables mutantes son las responsables de
presentación de diarreas una vez que se adhieren a las microvellosidades del intestino.
La adhesión a las células modifica las microvellosidades y el transporte iónico de los
enterocitos, originando la salida de líquidos intracelulares (diarrea). En los bovinos,
Escherichia coli con pilis K-99 son las enterobacterias responsables de la diarrea de los
recién nacidos. La bacterina EcoStaph PM+3 contiene en su formulación dos variables
de Escherichia coli K-99 con producción de toxinas termo sensibles y termoestables. El
resultado de inmunizar a las vacas en la “etapa de secado” es el de un calostro
enriquecido en inmunoglobulinas IgG-2 que protegen al recién nacido mediante
inmunidad pasiva, previniendo la colonización de Escherichia coli productoras de
diarrea.
Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus (S. aureus) pertenece a la familia Micrococcaceae, son cocos
Gram positivos, con un diámetro entre 0,5 a 1,7 μm. La división celular que se produce
en los tres planos perpendiculares no conduce a la separación total de las células hijas
por lo que S. aureus aparece en forma individual, en pares o en cadenas cortas en forma
de racimos. S. aureus es un anaerobio facultativo, sin embargo su desarrollo es más
abundante en condiciones aerobias. La proliferación ocurre en un amplio espectro de
temperatura que oscila de 18 a 40°C. No obstante, la temperatura óptima es de entre 30
a 37°C. El pH óptimo es de 7.0 a 7.5. Presenta requerimientos nutricionales complejos,
desarrollándose bien en casi todos los medios de laboratorio de rutina (1, 2).
S. aureus solía ser considerado un patógeno no invasivo, se sabe ahora que puede
invadir diversos tipos de células debido a un mecanismo que involucra la formación de
un puente de fibronectina en las proteínas de adherencia a la fibronectina de la bacteria
y las a5β1 integrina del hospedero que activan el proceso de internalización de S.
6
aureus (3, 4, 5). El microorganismo puede sobrevivir al interior de la célula en estado
semi-activo generalmente referido como variantes de colonias pequeñas (6).
S. aureus está en la microbiota normal como un comensal, sin embargo en otros casos,
puede ser la causa de enfermedades infecciosas severas (7, 8). S. aureus coloniza
permanentemente el epitelio húmedo escamoso de las fosas nasales anteriores de
aproximadamente 20% de la población humana (9). Cuando S. aureus logra rebasar las
barreras de las mucosas ocurren una serie de patologías, como infecciones neonatales,
abscesos en glándula mamaria o mastitis, infecciones post-operatorias, forúnculos y
carbúnculos, neumonía, bacteriemia, endocarditis, artritis séptica, osteomielitis y
enterocolitis (10). En las infecciones nosocomiales, S. aureus tiene un lugar relevante,
con el agravante de que la resistencia antimicrobiana es creciente; por ejemplo, las
cepas resistentes a la meticilina constituyen entre el 10 y el 60% de las cepas aisladas en
los hospitales (10, 11). Los mecanismos de resistencia a los antibióticos, son diversos.
Uno de los más conocidos es la producción de enzimas del tipo de las β-lactamasas, que
inactivan los antimicrobianos de la familia de las penicilinas y a veces algunas
cefalosporinas (12). La aparición de cepas de S. aureus resistentes a la metilcilina
(SARM), ha ocasionado brotes de infecciones nosocomiales en diferentes países del
mundo (13, 14). La atención que se presenta a SARM no solo radica en su resistencia
intrínseca a penicilinas y cefalosporinas, sino en su mayor patrón de resistencia a otros
antimicrobianos y en su facilidad de transmisión (15).
Se sabe que, aproximadamente del 30% al 50% de los adultos sanos están colonizados
por esta bacteria, a los cuales se les han aislado cepas de S. aureus meticilina-resistentes
y meticilina-sensibles (16, 17). Se ha informado una tasa de infección alta de S. aureus
en personas diabéticas (18, 19), enfermos con tratamiento de hemodiálisis, cirugía (20,
21, 22) y en individuos con síndrome de inmunodeficiencia adquirida (23). S. aureus
presenta un conjunto de elementos de virulencia variables que le permiten causar
diversas infecciones, que van desde un absceso de piel hasta infecciones de compromiso
vital como septicemias mortales y choque tóxico estafilocócico (16, 24).
En animales de interés comercial como el ganado bovino, la resistencia de los gérmenes
a los antibióticos, por el uso indiscriminado en el tratamiento de la infección de la
glándula mamaria, es un tema de importancia para la salud pública. Durante el
tratamiento con antibióticos en casos de mastitis infecciosa, la normativa sanitaria en la
producción de la leche, obliga al productor al descarte de la misma (NOM-091-SSA17
1994). La mastitis en los bovinos es una de las enfermedades que implica importantes
pérdidas al ganadero. Entre los principales gérmenes que originan mastitis en las vacas
productoras de leche, se encuentra el Staphylococcus aureus. La transmisión de este
germen entre las vacas, se facilita por las deficiencias en la higiene de la ordeña, siendo
el hombre con la manipulación del equipo de ordeño y pezones, el principal transmisor
de las infecciones. La mastitis por Staphylococcus aureus en las vacas es una
enfermedad que repercute con altos costos durante la producción (25, 26). Las
variedades de Staphylococcus aureus que causan la mastitis poseen características
genéticas similares, en donde la secuencia de aminoácidos de las proteínas permanece
sin cambios en los diferentes serotipos (27, 28).
El modelo de mastitis en coneja ha sido estudiado previamente con diferentes cepas de
estafilococos, incluyendo el aureus; lo que permite establecer esta especie animal como
susceptible a esta bacteria. Se ha podido demostrar que las infecciones por S. aureus son
las que causan mas problemas en los conejos manifestándose
como abscesos
subcutáneos pododermatitis, septicemia y mastitis (29, 30). Después de la colonización
con Staphylococcus aureus, el sistema inmune del huésped, induce anticuerpos contra la
α toxina, lipasa y ácido teitóico de la bacteria (10); sin embargo esos anticuerpos no
protegen contra nuevas infecciones causadas por el mismo germen (27). El bajo
desempeño de los anticuerpos producidos por infección previa o inducidos por vacunas
de Staphylococcus aureus completos, se podría explicar por la producción in vivo por
Staphylococcus aureus de una membrana de composición compleja, principalmente
conformada por polisacáridos, llamada “biofilme”, que interfiere con la fagocitosis con
las células competentes del sistema inmune (28). Las vacunas completas de
Staphylococcus aureus inactivadas, solo logran protección parcial (31-34).
La búsqueda de nuevos antibióticos es uno de los temas sobresalientes en la industria
farmacéutica, sin embargo, como ocurrió con la penicilina y sus derivados,
posiblemente se encontrarán cepas de S. aureus resistentes a los nuevos antibióticos. De
continuar la tendencia de incremento hacia la resistencia de los antibióticos, en breve
plazo nos encontraremos en una situación de salud pública similar a la presentada en la
era previa al descubrimiento de los antibióticos, en donde las infecciones bacterianas
eran de difícil control (35)
Staphylococcus aureus es una bacteria patógena predominantemente extracelular, que
necesita adherirse a los componentes de la membrana celular del hospedero para poder
iniciar la colonización. Las adhesinas son consideradas como el factor de virulencia más
8
importante durante la fase temprana de la infección por S. aureus (36). Las adhesinas
son una familia de proteínas presentes en la pared celular de la bacteria, son las
encargadas de promover la adhesión al unirse a las moléculas de la matriz extracelular
del hospedero, como son la fibronectina, el fibrinógeno y el colágeno. Sin embargo, las
adhesinas que reconocen a la fibronectina y al fibrinógeno se ubican incluidas en el
biofilme, por lo que no inducen una respuesta inmune eficaz cuando están en su entorno
habitual (37-47). Una de estas adhesinas que se une a la fibronectina (Fn), es la proteína
de adhesión a la fibronectina (fibronectin-binding protein, FnBP). La mayoría de las
variedades expresan dos tipos de FnBP con una secuencia de aminoácidos muy similar,
las dos proteínas son codificadas por dos genes: FnBP A y B. Numerosos estudios
indican que la FnBP participa en los procesos de adhesión de la bacteria a fibronectina
in vitro, en la adhesión a coágulos plasmáticos y en la adhesión a biomateriales que han
estado por largo tiempo en contacto con el hospedero (48-56). Recientemente se reportó
que FnBPA y FnBPB también se adhieren al fibrinógeno (57), aunque con menor
afinidad que a la fibronectina.
Se han realizado varios estudios para evaluar las características de los anticuerpos
producidos contra la FnBP de Staphylococcus aureus. Para lograr una respuesta inmune,
se ha usado la proteína FnBP completa o en parte (58, 59), la FnBP fusionada a otras
proteínas (recombinante) (48, 52, 60-66). Sus dominios D1-3 expresados en la
membrana de virus recombinantes usados como vectores (67-69). El uso de la proteína
nativa FnBP como antígeno ha demostrando un efecto protector parcial contra la
infección por Staphylococcus aureus promoviendo la opsonización en animales
experimentales (60, 64, 70, 71). Para producir anticuerpos que reaccionen sólo a la
FnBP y no al complejo FnBP-Fibronectina, se han usado fragmentos de la FnBP que
contienen partes de los dominios D1-3, pero que no contienen los aminoácidos
esenciales para la adhesión a la fibronectina. Estos antígenos inducen la producción de
anticuerpos que reaccionan sólo con FnBP y no con el complejo FnBP-Fn, por lo que
interfieren en la unión de FnBP a la fibronectina y evitan la adhesión de la bacteria a la
fibronectina del hospedero. Estos anticuerpos interfieren en el proceso de colonización
de la bacteria y además promueven su opsonización, dando por resultado una mayor
protección contra la infección por Staphylococcus aureus (59, 67, 68).
Otra adhesina de importancia en el proceso de adhesión al hospedero, es aquella que se
une al fibrinógeno. Existen varias adhesinas en S. aureus encargadas de adherirse al
9
fibrinógeno, entre las mejor estudiadas están las proteínas Clumping factor A y B (ClfA
y ClfB), presentes en la superficie de la bacteria (72, 73). La región responsable de la
adherencia al fibrinógeno se denomina Región A, compuesta por ~500 aminoácidos
(residuos 44-542 en la proteína), con una similitud del 26% entre ClfA y ClfB, aunque
se unen al fibrinógeno en sitios distintos (73-75). ClfA es expresada en todas las etapas
de crecimiento, mientras que ClfB sólo se expresa en la etapa temprana de crecimiento
exponencial (73). El fragmento mínimo de ClfA que preserva la capacidad de
adherencia al fibrinógeno está formado por los aminoácidos 221-559, y los anticuerpos
generados contra este fragmento bloquean la adherencia al fibrinógeno (46). ClfA es
considerado uno de los más importantes factores de adhesión del S. aureus a las células
hospederas. Se ha descrito la respuesta inmune de una vacuna recombinante en ganado
lechero, donde los resultados muestran que la vacunación con FnBPA inducen a una
fuerte y específica respuesta de anticuerpos al ClfA (76).
Vacunación estratégica para el control de la infección.
Las diferentes variedades patógenas de S. aureus poseen características genéticas
similares, presentando muy poca variabilidad en el genoma entre especies; por lo que
una vacuna contra S. aureus puede tener la potencialidad de proteger contra la infección
de diferentes variedades de la bacteria (26, 27, 28).
Se ha propuesto la elaboración de vacunas contra proteínas involucradas en los procesos
de colonización, de tal manera que se promueve la opsonización de la bacteria y al
mismo tiempo se interfiere con su colonización, la inmunización activa ha demostrado
proteger a animales de laboratorio de la infección (77-80). Adicionalmente, la
inmunización pasiva de ratones con inmunoglobulinas obtenidas de donadores humanos
con títulos altos de anticuerpos anti-ClfA protegieron contra dosis letales intravenosas
de la bacteria (81), y el mismo resultado se obtuvo al utilizar una versión de anticuerpo
monoclonal humanizado dirigido contra ClfA, actualmente en fase clínica II en
pacientes (82, 83).
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Comentarios;
Las bacterinas con composición de cepa de E coli J5, son productos compuestos por
una cepa mutante de E.coli que carece de determinantes antigénicos de superficie. La
estimulación al sistema inmune por este producto se produce a partir de la pared celular
misma que es común a la familia de las enterobacterias, por lo que la estimulación
contra la pared bacteriana, el producto protege contra las bacterias Gram negativas de la
familia enterobacterias.
Las bacterinas que incluyen Staphylococcus aureus incluidas las productoras de “slim”
protegen en forma inespecífica contra los determinantes antigénico variables de la
composición molecular de biofilm y de slim.
La bacterina EcoStaph PM+3* es un producto que contiene cuatro cepas diferentes de
E.coli productoras de adhesinas en la superficie de su pared celular. Contiene cultivos
purificados de Staphylococcus aureus serotipos 5 y 8. Contiene dos antígenos de
S.aureus, la proteína de agregación a la fibrina y la proteína de adhesión a la
fibronectina expresados en Lactococcus lactis como vacuna recombinante. Esta última
fracción se encuentra en fases de registro y patente. La bacterina EcoStaph PM+3
protege en forma selectiva contra la adherencia y colonización de Escherichia coli así
como contra la adherencia de Staphylococcus aureus.
*Desarrollo de CyTA Labs.
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