Consideraciones sobre la tinción para Citometría de Flujo

Es importante destacar algunos aspectos de los distintos pasos del proceso de tinción
con anticuerpos:
Lavados: los lavados de la muestra después de cada proceso de tinción con anticuerpos
son un paso importante del proceso de tinción. En primer lugar, son aconsejables para
eliminar el anticuerpo no unido a las células, y en segundo lugar, la supresión de los
lavados provoca un incremento de tinción inespecífica en células no marcadas (fondo)
que puede enmascarar la detección de células con bajos niveles de expresión del
antígeno.
Bloqueo de receptores Fc: Los anticuerpos se unen de manera antígeno independiente a
cualquier célula que tenga receptores Fc no ocupados. Todas las células de la sangre,
excepto las células T y los eritrocitos, tienen receptores Fc. Por ello, antes de realizar
una tinción de estos tipos celulares es imprescindible bloquear estos receptores con una
alta concentración de IgGs purificadas. Si se va a realizar posteriormente una tinción
indirecta es importante tener en cuenta la especificidad de especie del anticuerpo
secundario que se vaya a utilizar, para evitar usar IgGs de esta especie en el bloqueo.
Anticuerpos secundarios. Se deben usar los fragmento F (ab´)2 de las inmunoglobulinas
de un suero policlonal para evitar la unión intercelular no deseada y la unión a
receptores Fc antígeno independiente.
Titulación de los anticuerpos: La determinación de la concentración adecuada a la que
debe utilizarse un anticuerpo para la tinción es un procedimiento necesario para
garantizar la detección óptima de las poblaciones marcadas. Si un anticuerpo es
utilizado a una concentración muy elevada, se incrementa el riesgo de unión
inespecífica del anticuerpo. En la situación contraria, que se utilice por debajo de su
concentración óptima, se corre el riesgo de obtener tinciones muy tenues y no poder
discriminar con exactitud la proporción de poblaciones positivas y negativas para
determinado antígeno. La concentración a la que debe usarse un anticuerpo debe de
determinarse eligiendo la mínima concentración de anticuerpo con la que se detectan la
mayor diferencia de fluorescencia entre células positivas y células negativas para el
antígeno frente al que va dirigido el anticuerpo.
Temperatura: Las tinciones deben de realizarse a 4oC ya que algunos tipos celulares,
como las células mieloides, están metabolicamente activas a temperatura ambiente, y
pude internalizar los anticuerpos unidos a la superficie.
Células fijadas: En algunas ocasiones (como cuando la muestra no se va a analizar de
forma inmediata o si la muestra viva presenta riesgo biológico) resulta ventajoso fijar
las células después de una tinción. La fijación se realiza durante un tiempo mínimo de 1
h en presencia de 2% paraformaldehido o soluciones fijadoras comerciales. Es
importante tener en cuenta que la distribución de los parámetros de dispersión frontal
(FSS) y ortogonal (SSC) de la luz cambia durante el proceso de fijación, ya que el
proceso de entrecruzamiento de proteínas provoca cambios en la forma y granularidad
de las células.
Células muertas: La identificación de las células muertas de una población analizada por
citometría de flujo es importante, porque deben de excluirse del análisis, ya que
presentan características diferentes de autofluorescencia y unen de manera inespecífica
los anticuerpos. Aunque la práctica más habitual es identificar las células muertas en
base a su diferencia de dispersión de luz frontal (debido a su menor tamaño) es más
correcto utilizar marcadores de viabilidad que permitan discriminar de manera más
precisa las células vivas de las células muertas. Otra alternativa es comprobar que en la
ventana de análisis definida en base a las características de tamaño y complejidad no
hay una proporción relevante de células muertas. Normalmente se utilizan para ello
colorantes del ADN, como el yoduro de propidio (IP), el 7-actinomicina D (7-AAD),
Sytox® , To-Pro® que son impermeables y sólo marcan células muertas (aquellas con
la membrana celular dañada).
Fluorocromos: Hay varios aspectos a tener en cuenta a la hora de elegir el o los
fluoróforos utilizados para una tinción. En primer lugar, hay que tener en cuenta la línea
o líneas de láser necesarias para provocar la emisión de dichos fluoróforos y la
especificidad de longitudes de onda de los detectores disponibles en el equipo en el que
se vaya a analizar el ensayo.
En segundo lugar, es importante verificar la compatibilidad de la combinación de
distintos fluoróforos en una misma muestra. Por ejemplo, si se van a utilizar fluoróforos
excitables con la línea de láser rojo (como la APC) hay que tener en cuenta que esto
resulta incompatible con la utilización de algunos fluorófos muy comunes como el
tándem PE-Cy5 o Alexa Fluor® 647.
Es importante además, conocer el grado de solapamiento de los espectros de emisión de
los fluoróforos a utilizar a fin de evitar problemas durante la compensación de
fluorescencia.
Finalmente, sería deseable conocer la intensidad de emisión relativa de los fluoróforos y
los niveles de expresión esperados de la proteína diana, para elegir los fluoróforos de
mayor intensidad para detectar las proteínas de menores niveles de expresión.