Trabajo de Investigación Dra. Boglione

COMPARACIÓN ENTRE ENZIMOINMUNOENSAYO E
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA PARA DETECCION DE
ANTICUERPOS ANTICENTROMERO
Boglione, L1; Ferrero, P1; Mussano, E2; Onetti, L2; Acosta, C1.
1
Laboratorio de Inmunología y Virología, Hospital Nacional de Clínicas, Facultad de
Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba
2
Servicio de Reumatología, Unidad Hospitalaria de Medicina Interna I, Hospital Nacional
de Clínicas, Facultad de Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba
Laboratorio de Inmunología y Virología, Hospital Nacional de Clínicas, Facultad de
Ciencias Médicas, Universidad Nacional de Córdoba.
Santa Rosa 1564- Córdoba- Argentina
[email protected]
03525-15534755
RESUMEN
INTRODUCCIÓN: Los anticuerpos anti-centrómero (ACAs) son detectados por
inmunofluorescencia indirecta (IFI) sobre células Hep-2. Los enzimoinmunoensayos
(ELISAs) detectan anticuerpos reactivos contra las distintas subunidades del centrómero
(CENP) como CENP-A y CENP-B.
OBJETIVO: Calcular sensibilidad y especificidad del ELISA anti-CENP-A y CENP-B
(anti-CENPA/B) en relación a la IFI y el índice de concordancia entre ambos métodos.
MATERIALES Y MÉTODOS. Se seleccionaron 81 muestras de suero de pacientes que
acudieron al Laboratorio de Inmunología con solicitud médica de anticuerpos antinucleares
(ANA): 55 de ellos con resultado positivo por IFI y 26 negativo. En los 81 sueros se realizó
la determinación de ACAs por ELISA anti-CENP-A /B.
RESULTADOS: De 28 muestras con ACAs positivos por IFI, 2 resultaron negativas por
ELISA, mientras que de 53 muestras con ACAs negativos por IFI, 2 fueron positivas por
ELISA. La sensibilidad y la especificidad del ELISA resultaron 92,8% (IC 95%=76,46%98,9%)
y 96,2% (IC 95%= 87,0-99,4), respectivamente y el índice kappa= 0,89 (IC
95%=0,79-0,99). En 25 muestras positivas para ANA con patrones no anti-centrómero y
en 26 muestras con ANAs negativos, los anticuerpos anti-CENP-A/B resultaron negativos.
CONCLUSION: ELISA anti-CENPA/B muestra un buena concordancia con IFI en la
detección de ACAs. Los valores de sensibilidad y especificidad respecto de la IFI son
relativamente altos (> 90%).
Palabras clave: centrómero, inmunofluorescencia indirecta, enzimoinmunoensayo, cel-Hep2.
INTRODUCCION
Las enfermedades autoinmunes del tejido conectivo dan lugar a una variedad de signos y
síntomas, que muchas veces se superponen entre una patología y otra. La detección de auto
anticuerpos constituye una herramienta fundamental para el diagnóstico certero. Este hecho
motiva a los profesionales de laboratorio a conocer y mejorar la eficiencia de las pruebas
utilizadas para tal fin. La técnica más usada en el tamizaje de anticuerpos anti-nucleares
(ANAs) es la Inmunofluorescencia Indirecta (IFI) que tiene como sustrato antigénico una
línea celular de carcinoma laríngeo humano (células HEp-2) (1,2). Salvo pocas
excepciones, como es el caso de los anticuerpos anti-centrómero (ACAs), el resultado
positivo de esta prueba indica la presencia de ANAs pero no identifica la especificidad
antigénica de los mismos (3). Por ello, es necesario emplear técnicas adicionales como
Inmunoprecipitación (IP), Inmunoblotting (IB), enzimoimnunoensayo (ELISA) o ensayo
inmunoblot lineal (LIA) (4,5).
La disponibilidad de diferentes métodos y marcas
comerciales en el mercado para la identificación de ANAs es muy amplia, sin embargo
éstos carecen de estandarización adecuada, por lo que en ocasiones, se observan diferencias
significativas en cuanto a la sensibilidad y la especificidad entre estos métodos (6).
Ha sido demostrado reiteradamente el rol de los ACAs como biomarcadores en el
diagnóstico de la Esclerosis Sistémica (ES), ya que están presentes en 20 a 40% de estos
pacientes asociados con la forma cutánea limitada de la enfermedad conocida como
Síndrome
CREST
(calcinosis,
fenómeno
de
Raynaud,
dismotilidad
esofágica,
esclerodactilia y telangiectasia) (7). Si bien los ACAs son relativamente específicos para
ES, han sido detectados, generalmente a bajos títulos, en otras condiciones autoinmunes
como Lupus Eritematoso Sistémico (LES), Cirrosis Biliar Primaria (CBP), Artritis
Reumatoidea (AR), Síndrome de Sjögren (SSj), como también en sujetos sin enfermedad
aparente del tejido conectivo (8,9).
Desde su descripción, los ACAs han sido detectados por IFI utilizando como sustrato las
líneas mencionadas (HEp-2) que permiten identificar el patrón nuclear particular de estos
anticuerpos (10).
El centrómero está formado por distintas subunidades proteicas, dentro de las cuales
CENP-A, CENP-B y CENP-C fueron identificadas tempranamente como blancos de los
ACAs (11). Un estudio reciente demostró que ACAs de suero de pacientes con ES
reconocen al menos 11 subunidades CENP diferentes (12). A partir del aislamiento y la
clonación de algunas de ellas han surgido nuevos métodos de laboratorio como ELISAs que
emplean la proteína de fusión CENP-B (13). Estos equipos comerciales reportan una
sensibilidad que oscila alrededor de 94-95% comparados con IFI sobre células HEp-2 (1315).
Algunos estudios demuestran que los ELISAs que incorporan ambas proteínas, CENP-A y
CENP-B, poseen mayor sensibilidad que los que emplean sólo una de ellas (16-18).
El objetivo de este trabajo fue calcular la sensibilidad y la especificidad de un ELISA para
la detección simultánea de anticuerpos anti-CENP-A y anti-CENP-B utilizando como
técnica de referencia la IFI y la concordancia entre ambos métodos.
MATERIALES Y METODOS
MUESTRAS
Se seleccionaron 81 muestras de suero de pacientes provenientes de distintos servicios
médicos del Hospital Nacional de Clínicas que acudieron al Laboratorio de Inmunología
con solicitud de ANAs: 26 sueros con resultados negativos para ANAs por IFI sobre Hep-2
y 55 sueros con ANAs positivos cuya distribución de patrones de fluorescencia fue la
siguiente: 28 sueros con figura anti-centrómero, 11 nucleolar y 16 moteada. Posteriormente,
los 81 sueros fueron estudiados con una técnica de ELISA que detecta simultáneamente los
anticuerpos anti-CENP-A y anti-CENP-B (CENP-A/B).
ENSAYO DE INMUNOABSORCIÓN LIGADO A ENZIMA (ELISA)
La determinación de anticuerpos anticentrómero por ELISA se realizó con un equipo
comercial a base de antígenos recombinantes CENP-A y CENP-B (QUANTA Lite
TM
Centromere, INOVA Diagnostics, San Diego, EEUU). Las muestras fueron procesadas
siguiendo las instrucciones del fabricante. Brevemente, se incubaron en los pocillos los
sueros diluidos, y duplicados de los siguientes controles de ACAs provistos por el
fabricante: positivo fuerte, positivo débil y negativo. Al término de la incubación se
procedió a una serie de lavados y al agregado de anti-IgG marcado con peroxidasa a cada
pocillo. Luego de la
segunda serie de lavados, se añadió el sustrato 3’3’5’5’
tetrametilbencidina (TMB) en presencia de peróxido de hidrógeno para proceder a la última
incubación. Al término de la misma, se detuvo la reacción con ácido y se leyó a 450 nm en
lector de microplacas Sirio S (SEAC, RADIM, Roma, Italia).
La reactividad de las
muestras está relacionada de manera no lineal con la cantidad de anticuerpo presente. La
reactividad (Unidades) se calculó como la razón entre el valor de DO (densidad óptica) de
cada muestra y el valor promedio de DO del control positivo débil, multiplicado por el
valor de concentración (Unidades) del control positivo débil. Los resultados de la prueba se
interpretaron de la siguiente manera: menor a 20 Unidades= Negativo; entre 20 y 30
Unidades=Débil Positivo; mayor a 30 Unidades= Positivo.
INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA
La IFI se realizó en improntas de células HEp-2 (Bion, España), con dilución fija del suero
1:40 (en los casos de ANA positivos, no anticentrómero se realizaron diluciones hasta título
final para descartar posibles ACA ocultos bajo el patrón predominante); como buffer de
dilución y lavado se usó PBS y como conjugado una antigamaglobulina anti-IgG marcada
con Isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Biocientífica, España), en dilución 1:100. La
observación se realizó en un microscopio de fluorescencia Olympus (Japón).
ANÁLISIS ESTADÍSTICO
Para el cálculo de sensibilidad y especificidad del ELISA anti-CENP-A/B relativas a IFI y
el índice de concordancia kappa (k) se usó el programa estadístico MedCalc.
RESULTADOS
La Tabla 1 muestra la distribución proporcional de resultados categóricos para ACAs
obtenidos por ambas técnicas, ELISA e IFI, en las 81 muestras de suero analizadas. La
sensibilidad calculada del ELISA CENP-A/B fue de 92,8 % (IC 95%=76,46%-98,9%) y la
especificidad de 96,2 % (IC 95%= 87,0-99,4); y el índice kappa = 0,89 (IC 95%=0,790,99). En 25 muestras con patrones de ANAs no anti-centrómero, y en 26 muestras ANAs
negativo, los anti-CENP-A/B resultaron negativos. De 28 muestras con ACAs positivas
por IFI, 2 resultaron negativas por ELISA, mientras que de 53 muestras con ACAs
negativos en IFI, 2 fueron positivas por ELISA. Estas dos últimas mostraron un patrón de
fluorescencia moteado a títulos altos y no fue posible detectar ACAs aún a altas diluciones
del suero.
DISCUSIÓN
Tradicionalmente los ACAs han sido detectados por IFI sobre células HEp-2. Es conocida
la propiedad de esta línea de presentar células en distintos estadios de división que hace
posible identificar el patrón nuclear característico de estos autoanticuerpos, sin necesidad
de recurrir a otras técnicas para confirmar su especificidad. Sin embargo, la identificación y
clonación de nuevas subunidades del centrómero ha promovido el desarrollo de métodos
que las incorporan como base antigénica, por ejemplo: ELISA e IB. Entre los métodos de
detección de ACAs han surgido varios equipos de ELISA que incorporan subunidades
CENP como base antigénica, tanto de manera individual como combinada, y dentro de
ellos, los más difundidos son los que emplean CENP-B y CENP-A (16-18).
Cabe señalar que una de la últimas guías para el uso de pruebas inmunológicas realizadas
por expertos, no presenta evidencias a favor del empleo de otras técnicas para el tamizaje
de ACAs en lugar de IFI en HEp-2 (19,20).
En el presente trabajo, se valoraron los parámetros analíticos: sensibilidad, especificidad de
un ELISA comercial para la detección simultánea de anticuerpos anti-CENP-A y CENP-B
en relación a la IFI en HEp-2, que es la técnica de referencia para la detección de ACAs, y
se calculó, además, la concordancia entre ambos métodos.
Los valores de sensibilidad y especificidad que se obtuvieron para ELISA anti-CENP-A/B
son algo inferior a los reportados por el fabricante (100% de sensibilidad y 98% de
especificidad). Por otra parte, la concordancia entre ambos métodos es buena. En este
estudio no se obtuvieron datos clínicos de los pacientes, por lo que no es posible concluir a
cerca de la conveniencia de reemplazar a la técnica de referencia por el ELISA antiCENPA/B.
Inclusive, debe tenerse en cuenta que el uso de IFI como prueba de pesquisa de auto
anticuerpos permite detectar otros ANAs que pudieran estar presentes en lugar de ACAs
(21).
En este estudio se obtuvieron resultados positivos por ELISA anti-CENPA/B en dos
muestras en las que se observó un patrón fuerte moteado en la IFI. En esta situación, se
podría especular que la presencia de otros ANAs interfiere con la visualización del patrón
anticentrómero, aún a dilución final del suero, por lo que el uso conjunto de ELISA e IFI
podría aumentar la sensibilidad en la detección de ACAs. Por otra parte, se debe considerar
que podría tratarse de resultados falsos positivos del ELISA en ambas muestras ACAs
negativa (ANAs positivos) por IFI.
En cuanto a las dos muestras con ACAs positivo por IFI que resultaron negativas por
ELISA anti-CENPA/B, es posible que el patrón observado en ambas se deba a la
reactividad de los ACAs contra otras subunidades CENP, que no son A y B. Estudios
recientes demuestran que sueros de pacientes con ES poseen ACAs que reconocen
diferentes subunidades del centrómero y que, a su vez, los distintos perfiles de anti-CENP
encontrados en los pacientes se relacionan con manifestaciones clínicas particulares de la
misma enfermedad (12).
CONCLUSIÓN
ELISA anti-CENPA/B muestra un buena concordancia con IFI en la detección de ACAs.
Los valores de sensibilidad y especificidad relativos a la IFI son relativamente altos, sin
embargo, es necesario estudiar sensibilidad y especificidad diagnóstica del ELISA antiCENPA/B para evaluar la posibilidad de emplearlo como método de pesquisa de ACAs en
lugar de IFI.
TABLAS
Tabla 1: Comparación de los resultados entre ELISA e IFI para la determinación de ACA
en los 81 sueros.
ACA ELISA (+)
ACA
IFI(+)
26 (VP)*
ACA
IFI(-)
2 (FP)€
ACA ELISA (-)
2 (FN)&
51(VN)£
53
28
53
81
TOTAL
*VP: Verdaderos Positivos.
£VN: Verdaderos Negativos.
€FP: Falsos Positivos.
BIBLIOGRAFIA
&FN: Falsos Negativos.
TOTAL
28
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