prueba rápida para la detección de anticuerpos igm - BVS

MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN
DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN
MEMBRANA DE NITROCELULOSA
(WESTERN BLOT)
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº93
TM MARÍA PAQUITA GARCÍA MENDOZA
BLGA. VICTORIA GUTIERREZ PECEROS
BLGO. ENRIQUE MAMANI ZAPANA
[2006]
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
“Año de la Consolidación Democrática”
I.
Título del Estudio.
2-01-05-02-069
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT).
Jefatura
Cápac Yupanqui Nº 1400
Jesús María - Lima 11
Teléfono: 471-9920
Fax Central: 471-0179
Fax Jefatura: 471-7443
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II.
Autores
Autor principal
TM María Paquita García Mendoza
Instituto Nacional de Salud, Av. Defensores del Morro 2268, Lima 09, Perú. Apartado Postal 471. Telf.
51(1)2516151, Fax 51 (1) 2516151 anexo: 425 o 542. CNSP/INS
Colaboradores
Blga. Victoria Gutierrez Peceros
Instituto Nacional de Salud, Av. Defensores del Morro 2268, Lima 09, Perú. Apartado Postal 471. Telf.
51(1)2516151, Fax 51 (1) 2516151 anexo: 425 o 542.
Blgo. Enrique Mamani Zapana
Instituto Nacional de Salud, Av. Defensores del Morro 2268, Lima 09, Perú. Apartado Postal 471. Telf.
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PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
III.
Indice
I.- TITULO DEL ESTUDIO……………………………………………… 1
Jefatura
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II.- AUTORES…………………………………………………………….
1
III.- RESUMEN……………………………………….……………………
3
IV.- INTRODUCCION…………………………………………………….
3
V.- ANTECEDENTES……………………………………………………
3
SITUACIÓN ACTUAL DEL DENGUE
El virus dengue
Patogenia del dengue
Pruebas de Laboratorio
VI.-OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION…………………………….
Objetivos generales
Objetivos específicos
6
VII.- METODOLOGÍA…………..........................................................
Tipo de estudio
Ubicación del estudio
Obtención de muestras
6
VIII.-RESULTADOS………………………………..……………………
7
IX.- DISCUSION…………………………………………….………… .
8
X.- CONCLUSIONES…………………………………….…………….
9
XI.-REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................
9
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IV.
Resumen
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
El Dengue es actualmente, una de las enfermedades que constituyen un serio problema de Salud Publica en
el mundo y el diagnóstico de laboratorio continúa limitándose a pruebas de laboratorio sofisticadas;
existiendo escasas pruebas rápidas validadas para ser utilizadas en el campo.
La prueba rápida propuesta es una técnica inmunoenzimática rápida como western blot, de fácil manejo con
alta sensibilidad y especificidad debido al uso de antígenos dengue procedentes de lisado viral de cepas
referenciales, que permita detectar anticuerpos IgM dengue en muestras séricas de fase aguda y
convalesciente, que se puedan uilizar en laboatorios de menor complejidad.
V.
Jefatura
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Introducción
La fiebre del dengue y la fiebre del dengue hemorrágico continúa siendo el mayor problema de salud pública
en el trópico del mundo. En el Perú, se evidencia un elevado incremento de casos de dengue y dengue
hemorrágico desde el 2001 en la Macroregion Norte (Tumbes, Piura, Lambayeque, La Libertad) donde se
cuenta con una gran cantidad de casos propios de la zona (autóctonos). Además, en regiones como Ancash
(Casma) y Lima que sufrieron de brotes de dengue. Actualmente el país ha atravesado por brotes de dengue
en las diferentes regiones, observándose algunos casos de dengue hemorrágico confirmados en la selva
central (Chanchamayo) y la costa norte (La Libertad).
Tomando en cuenta algunos en la descentralización a nivel regional y local del método ELISA utilizado en el
INS para la confirmación serológica, de los casos de dengue en el país, es la falta de de equipos
especializados para la prueba (lector y lavador de ELISA). Una alternativa para superar este problema es
contar con otra herramienta de diagnóstico como western blot que no requiere para su desarrollo de equipos
especializados además permite transportar sin cadena de frío estricta los insumos para esta prueba, ya que
el antígeno es impregnado previamente en papel de nitrocelulosa, a los lugares mas apartados, sin perder
su capacidad antigénica.
Por tanto, se propone desarrollar una técnica inmunoenzimática rápida como wester blot, de fácil manejo
con alta sensibilidad y especificidad debido al uso de antígenos dengue aislados en el país, que permita
detectar anticuerpos IgM dengue en muestras séricas de fase aguda.
VI.
Antecedentes
El dengue es una enfermedad viral aguda causada por el virus del dengue y transmitida al hombre por el
mosquito Aedes aegypti, su principal vector. Constituye, entre las arbovirosis, una prioridad de salud pública
en los países tropicales y subtropicales.
Situación actual del Dengue
La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que la infección por este virus amenaza al 40% de la
población mundial (2,500 millones de personas) que habitan en más de 100 países tropicales y
subtropicales. Anualmente se infectan en el mundo
50-100 millones de personas, de los cuales 250,000500,000 presentan DH y 25,000 tienen desenlace fatal (1).
El crecimiento sin precedentes de la población, la urbanización masiva sin planificar, el insuficiente
abastecimiento de agua potable, la disposición inadecuada de los residuos sólidos y de los depósitos no
biodegradables, el aumento del número de viajeros y de las migraciones poblacionales, el deterioro de los
sistemas de salud y de los programas de control, y la pobreza han contribuido a agravar la situación
epidemiológica mundial. La aparición de cepas con mayor virulencia y capacidad de transmisión, así como la
circulación simultánea de varios serotipos y genotipos en una misma región, también han influido en el
agravamiento de las epidemias de dengue y de DH en diversas partes del mundo. Asimismo, se ha
demostrado que los cambios climáticos de los últimos años contribuyen a la transmisión viral, por lo que se
espera que en el futuro aumente el número de enfermos (2)
El impacto económico de las epidemias de dengue no se ha estudiado a fondo. Países como Cuba, Puerto
Rico y Tailandia informan gastos de US$ 6,8 a $103,0 millones solo en atención médica, medidas para el
control vectorial, horas de trabajo perdidas y pérdidas por la disminución del turismo (3).
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
En la región de las Américas se ha observado claramente la emergencia y reemergencia del dengue. En dos
décadas, la región pasó de tener una baja endemicidad a una situación de hiperendemia, con numerosos
casos y epidemias de DC y DH (4).
En el período de 1960 a 1980 se documentaron epidemias en el Caribe con el serotipo 3 (1962–1963), los
serotipos 2 y 3 (1968–1969) y el serotipo 1 (1977–1978) (5).
La década de 1980 representó un cambio en la historia del dengue. En 1981 se documentó en Cuba la
primera epidemia de DH en la Región, causada por el serotipo 2 de un genotipo asiático. Posteriormente, no
se observaron más casos de DH hasta la epidemia en 1989 en Venezuela (6).
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A partir de ese momento ha aumentado el número de países que notifican casos de DH y la incidencia
mantiene una tendencia ascendente. Se ha observado que el número de enfermos de dengue aumenta
cíclicamente de forma epidémica cada 3–5 años, siempre con una tendencia ascendente. La mayor
incidencia en la Región se observó en el año 2002, con más de un millón de casos, entre ellos 14,000 de
DH. Según datos de la OPS, en noviembre de 2005, 27 países habían notificado casos de dengue y de DH y
en 14 de ellos circulaban dos o tres serotipos simultáneamente (5).
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En el Perú la reemergencia del DC se inicia en 1990, con el reporte del primer brote de DC en Iquitos y
Tarapoto, con predominio del serotipo 1 pero también con presencia del serotipo 4 (8,9). En los siguientes
dos años el serotipo 1 se expandió hacia la costa norte del país afectando desde Tumbes hasta Casma
(Ancash). En 1995, se detectó en Iquitos por primera vez un brote de virus dengue serotipo 2, no
relacionado con la variedad asiática (7).
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Los brotes más importantes de dengue, ocurrieron en el año 2001, en los distritos de Sullana y Pariñas
(Piura), Trujillo y El Porvenir (La Libertad) y Jaén (Cajamarca), se afectaron 12 departamentos. Desde el año
2001, se registran casos de DH en nuestro país, representando menos del 1% del total de casos notificados
a nivel nacional; en ese año se notificaron 85 casos confirmados con 04 defunciones (8).
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Durante el año 2001, el Instituto Nacional de Salud del Perú (INS) realizó el aislamiento viral en cultivo
celular en 236 muestras de las 1539 que resultaron positivas a la serología (ELISA IgM de Captura),
lográndose identificar la circulación simultánea de los cuatros serotipos. Asimismo, se identificó en la
macroregión norte la presencia de la variedad asiática de dengue serotipo 2 (9).
En abril del 2005, se reporta el primer brote de casos autóctonos de Lima, en esta ocasión el INS identificó
la presencia del virus dengue 3 genotipo III, el cual podría presentar diferencias en cuanto a su virulencia,
capacidad de transmisión e infectividad en comparación con el genotipo que circula en la costa norte y selva
del país (10).
En los últimos 10 años, la población de 15 a 39 años fue la más afectada en nuestro país; hombres y
mujeres han sido afectados en forma similar y el riesgo de contraer la enfermedad se triplicó entre los años
2003 y 2004 (de 12 a 35 por 100 000 hab.) (8).
El virus del dengue
El virus del dengue está constituido por una cadena simple de alrededor de 11 kilobases (kb) de ARN de
polaridad positiva. Este complejo viral formado por cuatro serotipos filogenéticamente diferentes (DEN-1,
DEN-2, DEN-3 y DEN-4) pertenece al género Flavivirus de la familia Flaviviridae.
Su genoma codifica tres proteínas estructurales: la proteína C, que compone la cápside que rodea y protege
al ácido nucleico; la proteína M, que forma la membrana viral; y la proteína E, que conforma la envoltura; y
siete proteínas no estructurales. Se sabe que la glicoproteína E desempeña un papel fundamental durante la
penetración del virus en la célula y en la respuesta inmunitaria. Por su parte, la proteína no estructural NS1
participa en la maduración viral y pudiera servir para el diagnóstico temprano (11).
La diversidad genética del virus del dengue puede ocasionar la aparición de cepas con mayor capacidad de
replicación, de más fácil transmisión o más virulentas.
El conocimiento del virus en su conjunto, es importante para la elección de la fracción mas adecuada de
éste, y que pueda ser utilizada en pruebas de diagnóstico, principalmente en pruebas rápidas.
Patogenia
En el curso de la infección primaria, el virus penetra en la célula diana mediante su unión a un receptor
celular y se producen anticuerpos neutralizantes capaces de proteger por largo tiempo contra la reinfección
con ese mismo serotipo y durante solo 2-3 meses contra los otros serotipos. En cambio, durante una
infección secundaria con un serotipo heterólogo se forman complejos virus-anticuerpos que penetran en las
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
células del sistema fagocítico mononuclear (monocitos y macrófagos) gracias a la unión del fragmento
constante de la inmunoglobulina (que forma parte del inmunocomplejo) a los receptores celulares del tipo
gamma. Como consecuencia se infecta un mayor número de células y se favorece la diseminación viral.
Este fenómeno se conoce como amplificación dependiente de anticuerpos.
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La activación de los linfocitos T y la producción de citocinas son también factores importantes en la
patogenia del DH. En la actualidad se sabe que después de una infección primaria se producen
clones de células T CD4+ y CD8+ efectoras y con memoria que son específicas para el serotipo
infectante, aunque capaces de reconocer los restantes serotipos. En el curso de una segunda
infección se activan los clones con memoria frente al nuevo serotipo y así se desencadena la
respuesta inmunitaria. Por otro lado, la infección parece inducir a una activación aberrante
transitoria del sistema inmune donde la tasa de CD4/CD8 se invierte y ocurre una sobreproducción
de citoquinas, lo que se relaciona con la mayor gravedad del cuadro clínico (12)
Se ha establecido que el factor de riesgo principal para padecer DH es tener una segunda infección con un
serotipo diferente del que causó la infección primaria. Otro factor que se debe tomar en cuenta al analizar el
complejo mecanismo patogénico del DH es la virulencia de la cepa infectante. En este sentido se ha
reconocido la asociación de algunos genotipos, como los serotipos Den 2 y Den 3 de origen asiático 2, con
casos y epidemias de DH. Recientemente se demostró que los enfermos con dengue presentan una menor
carga viral que los enfermos con DH (13).
Se ha sugerido de que el virus induce a una supresión de la médula ósea deprimiendo la síntesis de
plaquetas, además se ha observado que las plaquetas pueden ser ligadas por los anticuerpos
específicos en presencia del virus y esto originaría una depuración de plaquetas por mecanismos
inmunes. Los títulos de Anticuerpos Antiplaquetas IgM son más elevado en los casos de DH/SSD con
respecto al DC (12).
El virus induce vasculopatía, un aumento difuso de la permeabilidad capilar que es principalmente
producto de una alteración funcional de las células endoteliales a partir de los efectos propios de los
mediadores inflamatorios liberados durante la infección. Sin embargo, las células endoteliales
infectadas por el virus también pueden sufrir daño estructural a través de una respuesta inmune
mediada por el reclutamiento de leucocitos y la presencia de anticuerpos anti-dengue, así como por
un efecto citopático directo. El virus también puede producir apoptosis de las células endoteliales
infectadas (12).
El virus induce coagulopatía, alteración de los mecanismos de la coagulación y la fibrinolisis. Una
prolongación de tiempo parcial de tromboplastina activada (TPTA), elevación de la proporción del
activador del plaminógeno dependiente del tejido (tPA)/ inhibidor del plaminógeno (PAI-1) y niveles
elevados de trombomodulina se correlacionan con severidad clínica de la enfermedad, los tiempos
de protrombina (TP) y trombina (TT) también pueden estar prolongados. Se ha sugerido que las
alteraciones durante la infección por el virus dengue ocurren en la vía intrínseca y no extrínseca de
la coagulación (12).
En general, un mejor conocimiento de los mecanismos patogénicos de esta enfermedad ayudará a
identificar factores de riesgo de las formas más graves, a mejorar el tratamiento de los pacientes y a
abordar más adecuadamente el desarrollo de nuevos fármacos antivirales y vacunas.
Inmunología del dengue
Las personas que nunca han sido infectadas por un flavivirus o que no han sido vacunadas contra fiebre
amarilla, desarrollan una respuesta primaria contra el virus, compuesta principalmente de la producción de
IgM. Estos anticuerpos anti-dengue, aparecen en 50% de los pacientes durante la fase febril de la infección
primaria y en la otra mitad, durante la fase de recuperación. El "pico" de producción de IgM anti-dengue
ocurre alrededor de 2 semanas después de iniciados los síntomas para luego declinar a niveles no
detectables durante los siguientes 2-3 meses. Los anticuerpos IgG comienzan a incrementarse lentamente a
partir del 5°-6° día de enfermedad y son máximos a los 15-21 días; después declinan y permanecen
detectables poco más o menos durante toda la vida.
En infecciones no primarias, con virus de serotipo diferente, los anticuerpos IgG de reacción cruzada
("heterotípicos" o secuenciales) son incapaces de neutralizar el virus y, al contrario, aumentan el número de
macrófagos infectados formando complejos anticuerpos-virus que son internalizados por las células. Dichos
anticuerpos amplificadores parecen persistir hasta 20 años después de la primera infección y quizás se
mantenga de por vida (14).
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
De reciente interés, es el rol que cumplen los anticuerpos IgE en la patogénesis del dengue. Los
anticuerpos totales e IgE específicos se encuentran elevados en pacientes con DH/SSD en
comparación con aquellos que solo tienen DC. Más aún en sujetos con exposición previa, los niveles
de IgE totales son significativamente elevados (15).
En general, aunque estudios recientes demuestran que los títulos de anticuerpos de las clases IgA e IgE se
elevan durante la infección aguda por dengue, no se conoce el papel que desempeñan estos anticuerpos
desde el punto de vista de la respuesta inmunitaria y la patogenia de la enfermedad. Se debe evaluar su
valor diagnóstico y su posible utilidad para pronosticar la evolución a formas graves de la enfermedad.
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Pruebas de Laboratorio
Las pruebas de laboratorio con los que se cuenta actualmente son:
ELISA de captura
Para la determinación de anticuerpos IgM e IgG. Esta prueba consiste en sensibilizar placas con
inmunoglobulinas de cabra anti-inmunoglobulinas humanas, las cuales reaccionarán con los anticuerpos del
tipo correspondiente presentes en la muestra del paciente; con la adición del antígeno del virus del Dengue
(VD) y un conjugado formado por inmunoglobulinas anti-VD acopladas a la enzima peroxidasa del rábano,
una reacción específica se traducirá en un cambio de color (densidad óptica) cuando se adiciona el
substrato. (16).
ELISA de inhibición
Para la determinación de anticuerpos totales y clasificación del tipo de infección (primaria o secundaria).
Esta prueba consiste en sensibilizar placas con inmunoglobulinas humanas anti-VD y a las cuales se añade
el antígeno del VD, que reaccionarán con los anticuerpos específicos presentes en la muestra del paciente e
impedirán la reacción del conjugado cuando este se adicione. (16).
Neutralización por reducción de placas (PRNT)
Para la identificación de los serotipos de dengue involucrados en las infecciones previas. Esta prueba de
elevada especificidad consiste en enfrentar los anticuerpos presentes en la muestra con cada uno de los
serotipos que luego son inoculados en un sistema biológico (cultivo celular), en el cual se evidencia la
neutralización o el bloqueo del efecto citopático por la reacción antigeno-anticuerpo ocurrida. (16).
Aislamiento viral
Procedimiento utilizado para la recuperación del virus Dengue a partir de las muestras de suero en fase de
viremia, lo cual se realiza mediante cultivo en líneas celulares C6/36 obtenido de glándulas salivales de
mosquito Aedes albopictus(16).
Inmunofluorescencia (IF)
Procedimiento utilizado para la tipificación del virus. Esta técnica se basa en la unión inmunológica de
anticuerpos monoclonales de los cuatro serotipos marcados con un fluorocromo (isotiocianato de
fluoresceína). (16).
RT-PCR
La extracción del ARN será a partir de muestra de suero mediante el sistema QIAamp viral RNA minikit
(QIAGEN), para el RT-PCR se utilizara One-Step RT-PCR kit para amplificar 328 nucleótidos de la región ENS1. (16).
Secuenciamiento genético
Se secuenciará 20ng de ADNc del producto amplificado utilizando ABI Prism Dye Terminator (Applied
Biosystems). Las secuencia obtenidas serán analizadas utilizando el software CHROMAS v 1.3 y serán
alineadas usando el programa SEQMAN, para determinar el consenso se aplicará el programa CLUSTAL X,
versión 1.83.
VII.
Objetivos
Generales
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
Validar una prueba rápida de western blot para la detección de anticuerpos IgM anti dengue
Especificos
Implementar la prueba de western blot para la detección de anticuerpos IgM anti dengue.
Determinar la sensibilidad y especificidad de la prueba frente a la prueba ELISA de Captura de IgM.
VIII.
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Metodología
Tipo de estudio
Estudio experimental.
Ubicación del Estudio
El estudio se ejecutó en el Laboratorio de Referencia Nacional de Enfermedades Metaxénicas.
Obtención de muestras
560 muestras fueron obtenidas de pacientes con sospecha de dengue en la DISA
Loreto (209), Ucayali (146) y en Jaén (205), donde una alícuota fue procesada para emitir el resultado
correspondiente y la otra alícuota fue enviada al Laboratorio de Referencia Nacional para
el estudio.
Otro grupo de 100 muestras fueron selecionadas de la seroteca del Laboratorio de Referencia Nacional de
Enfermedades Metaxénicas y corresponden a otras zonas endémicas del país.
Las muestras que ingresaron al estudio fueron confirmadas por aislamiento e identificación viral y PCR y
confirmadas por seroconversión en suero pareado.
Procesamiento de Muestras:
Todas las muestras seleccionadas fueron procesadas por el método ELISA de Captura de IgM.
PREPARACION DEL GEL.- Se evaluaron diferentes concentraciones de Gel partiendo de 8%, 10%, 12% y
14%. La electroforesis de las proteínas de dengue se realizó en geles de SDS – PAGE y la transferencia en
papel de nitrocelulosa.
PREPARACION DE ANTIGENOS.- El antígeno fue obtenido en cultivos de células C6-36 y cerebro de ratón
lactante.
La concentración del antígeno viral fue obtenida mediante la prueba de hemaglutinación y mediante la
medición de las proteínas en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 280nm.
Se evaluó la concentración del antígeno por Western Blot, partiendo de 100ng hasta 2ug/ml.
Se transfirio a una membrana de nitrocelulosa y se enfrentó a sueros positivos y negativos conocidos.
PREPARACION DE SUEROS CONTROLES.- Se realizó a partir de diluciones de 1:40 hasta 1:160
obteniendose una dilución óptima de sueros controles positivos y negativos, de 1:100.
Los demás componentes del sistema fueron evaluados y títulados a fin de encontrar las diluciones óptimas
de trabajo.
FASE DE VALIDACION.- No se realizó la fase de validación de la western blot con sueros de
pacientes de dengue, por que no se logró implementar la prueba de Western Blot.
Se procesaron las muestras por ELISA de Captura de IgM e IgG, sim embargo no fue posible comparar
estos resultados con el Western Blot.
IX.
Resultados
Del total de 560 muestras procesadas por ELISA de captura de IgM obtuvieron 120 positivos y 440
negativos
Procedencia
ELISA IgM POSITIVOS
ELISA IgM NEGATIVOS
TOTAL
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
LORETO
UCAYALI
JAEN
62
25
33
147
121
172
209
146
205
Al realizar la evaluación de las concentraciones del Agar encontramos como óptima, una concentración del
10%.
Jefatura
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Al realizar la evaluación de los antígenos encontramos que el Antígeno lisado viral a partir del sistemas de
cerebro de ratón lactante tiene una concentración de 12ug/ml y un título de 1:320 unidades hemaglutinantes;
en el sistema de cultivo celular (línea C6-36), obtuvimos una concentración de 10ug/ml y un titulo de
1:40unidades hemaglutinantes.
Sistema Biológico
Linea Celular C6-36
Cerebro de Ratón Lactante
Concentración del antígeno
Hemaglutinación Título
Espectofotometro a 280nm
1:40
10ug/ml
1:320
12ug7ml
En la corrida electroforética se evaluaron concentraciones que van de 100ng/ml hasta 2ug/m, encontrando
una concentración de 800ng/ml con bandas mejor definidas para el antígeno en linea celular C6-36.
X.
Discusión
La detección de anticuerpos IgM a dengue por ELISA sigue siendo como uno de los mas importantes
métodos que se utiliza para el diagnóstico de dengue (17,18,19,20) durante una infección primaria y secundaria,
donde la presencia de IgM es transitoria(21).
Existen diversas pruebas para el diagnóstico de dengue en el mundo, y para la detección de anticuerpos
IgM la mas aceptada es el MAC-ELISA que con una simple muestra de suro agudo (> 5 días) es detectable
con una sensibilidad del 92% frente a la inhibición de la hemaglutinación (21).
La prueba rápida (western blot), esta basada en el principio de la detección de IgM sobre una membrana de
nitrocelulosa, es totalmente manual, y todo el proceso puede demorar entre 1 hora a 1.5 horas.
De los 620 sueros obtenidos 170 (27%) son positivos a la infección por virus dengue y 450 son negativos a
la infección por virus dengue por el método de ELISA de Captura de IgM. Estos resultados no pudieron ser
comparados con los resultados de la prueba rápida de Western blot, planteado en nuestro estudio; sin
embargo existen estudios donde se realizan este tipo de comparaciones, como el del AuBioDOT y el ELISA
de captura de IgM, donde solo tres muestras fueron discordante.
XI.
Conclusiones
Se cuenta con las concentraciones óptimas del agar, el antígeno y los sueros controles.
Se cuenta con los resultados de ELISA de Captura de IgM para dengue en los 560 sueros en Loreto,
Ucayali y Jaén.
Se cuenta con los resultados de ELISA de Captura de IgM para dengue en los 100 sueros en
correspondientes a panel de referencia de la seroteca del INS.
No fue posible estandarizar el Western BLot, por falta de insumos críticos para esta etapa; por lo tanto no se
pudieron procesar los sueros por este método y mucho menos compararlos con los resultados de ELISA de
captura de IgM de dengue.
XII.
Referencias Bibliográficas
PRUEBA RÁPIDA PARA LA DETECCIÓN DE ANTICUERPOS IGM DENGUE EN MEMBRANA DE
NITROCELULOSA (WESTERN BLOT)
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