Herramientas moleculares aplicadas en la investigacion de CIP Quito

HERRAMIENTAS MOLECULARES APLICADAS A LA INVESTIGACIÓN
DE PHYTOPHTHORA INFESTANS EN LA ESTACIÓN CIP QUITO.
Por: Biólogo Francisco Jarrín C
Departamento de Patología
Centro Internacional de la Papa – Estación Quito
E-mail: [email protected] / Telf: (593-2) 2690632-2690633 / Fax: 2692604
2006
Introducción
Palabras Clave: Phytophthora infestans, tizón tardío, marcadores moleculares, ADN,
proteínas, aloenzimas,RAPD, RFLP, mtDNA, microsatélite, SSR,
ISSR.
El tizón tardío de la papa causado por el hongo Phytophthora infestans continua
siendo uno de los más serios problemas en el cultivo de la papa en los países en
desarrollo. Por esta razón el CIP ha puesto en marcha desde hace algunos años atrás
programas con herramientas biotecnológicas, las mismas que están ayudando cada
vez mas en entender el comportamiento, evolución, cambios y dinámica poblacional
de este patógeno en nuestro país.
De las herramientas biotecnológicas desarrolladas para este tipo de estudios en
Phytophthora infestans los marcadores a nivel molecular son los mas utilizados
incluso mundialmente para la caracterización y mapeo de muchos organismos en
general. De estos marcadores, los mas utilizados regularmente en la Estación CIPQuito son de dos tipos: proteínicos y los de ADN o ácidos nucleicos, y
adicionalmente e igual importantes a los marcadores moleculares se llevan a cabo
pruebas adicionales como: el tipo de apareamiento (mating type), pruebas de
susceptibilidad a funguicidas y pruebas de virulencia o agresividad a distintos
hospederos de las diferentes entradas encontradas a nivel del país.
Todas estas herramientas biotecnológicas, enmarcadas dentro de un programa de
manejo integral del tizón tardío, pretenden ampliar el conocimiento sobre e patógeno
proporcionando soluciones practicas al problema del tizón tardío en el Ecuador como
puede ser el diseño de estrategias eficaces de control, la disminución en el uso de los
funguicidas, transferencia de tecnologías y saber como combatir el tizón tardío con
efectividad en nuestros campos.
Marcadores Moleculares y su aplicación en el estudio de Phytophthora infestans.
Usualmente un marcador genético es un fragmento de ADN –que puede ser un gen-,
cuyo forma de expresión o fenotipo es fácilmente distinguible, y que debido a esta
característica éste será usado para identificar o distinguir a un individuo u organismo
que lo porta. Dichos marcadores o fragmentos pueden ser utilizados de múltiples
formas en la genética moderna dependiendo del los objetivos del estudio que se este
llevando a cabo.
Según la naturaleza y origen del marcador o fragmento, dependerá también su utilidad
como portador de información de lo que se quiere buscar o estudiar y de la
factibilidad respecto a el costo-beneficio de los resultados que se pueda obtener. El
desarrollo de los llamados marcadores moleculares, los cuales se han basado en
diferencias encontradas en proteínas o ADN, han venido a constituir una gran
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herramienta en la investigación facilitando la investigación en campos como
taxonomía, filogenia, ecología, genética, y mejoramiento.
Entre las características mas deseables que un buen marcador molecular debería tener
encontramos: un alto comportamiento polimórfico, herencia codominante, ser
frecuente en el genoma y estar uniformemente distribuido en el mismo,
comportamiento neutral, fácil y rápida accesibilidad, alta reproducibilidad y fácil
intercambio de datos entre laboratorios. Pero aun no hay marcadores moleculares que
cumplan con todos estos requisitos, sin embargo, acorde la clase de estudio que se
vaya a llevar a cabo se podría escoger alguno que combine al menos algunas de estas
características.
Marcadores Proteínicos:
Por un largo periodo de tiempo los marcadores a base de proteínas fueron los
marcadores mas usados para los estudios de genética, herencia, variabilidad, filogenia,
etc. Específicamente para el estudio de polimorfismos, una de las herramientas mas
utilizadas para separar las proteínas ha sido la electroforesis, proceso el cual
aprovecha la diferente carga eléctrica de dichas moléculas para configurar un patrón
determinado que será especifico para cada individuo.
De las proteínas mas utilizadas, la electroforesis de alo-enzimas han sido las que mas
se han usado con éxito en muchos organismos con bastante éxito en varios campos
como: fisiología, bioquímica, genética y mejoramiento, y en propósitos como:
estructura poblacional, hibridación, poliploidía y sistemática.
Las alo-enzimas, no son mas que las formas o variantes alélicas de una enzima
producto de un mismo locus y que pueden ser distinguidas por electroforesis. En los
laboratorios del Centro Internacional de la Papa se llevan a cabo tres modalidades
electroforéticas acorde a la matriz o soporte molecular para la separación de proteínas,
esencialmente con dos tipos de enzimas; la peptidasa (PEP) y la fosfo-glucoisomerasa (GPI). La electroforesis horizontal en gel o matriz de almidón de papa
hidrolizado es uno de los métodos mas difundidos y eficientes para la separación de
proteínas y en nuestro caso a sido útil para el análisis de la enzima fosfo-glucoisomerasa o GPI, en cambio la electroforesis en gel o matriz de poliacrilamida a
mostrado ser tener mejor para resolver los patrones de peptidasa o PEP.
Adicionalmente otro método usado es la electroforesis en matriz de acetato de
celulosa, el cual permite trabajar con muy pequeñas cantidades de muestras
homogenizada y con buena reproducibilidad. El método para revelar el patrón de
proteínas usado para ambos tipos de matrices es el de ´sustrado específico´ en el cual
una selectiva reacción catalítica desarrolla un tinte que puede ser visualizado a luz
normal para cada enzima en particular de entre los cientos o miles de enzimas que
pueden estar presentes en un extracto crudo de un tejido. Una de las características
que lo hacen a las proteínas útiles en el análisis genéticos es su comportamiento
codominante y relativamente fácil manejo, mientras que su limitación se refleja en la
limitación de formas proteicas que pueden haber acorde al organismo.
Marcadores en base a ADN.
En las casi dos ultimas décadas el interés sobre la molécula de ADN se ha ido
incrementando grandemente como una gran fuente informativa de polimorfismo a casi
todos los organismos. Debido a que en cada organismo se encuentra una secuencia
unica de ADN, esto ha sido explotado para muchos estudios de diversidad genética y
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de relaciones entre diferentes organismos. Una amplia variedad de técnicas y
métodos han sido desarrollados para revelar las secuencias polimorficas de ADN, y a
raíz de estas se han desarrollado una diversidad de marcadores moleculares. En el
Centro Internacional de la Papa se llevan a cabo un determinado grupo de estos
marcadores los cuales nos han permitido entender y visualizar algunas características
de Phytophthora infestans en relación a su dinámica poblacional, diversidad,
comportamiento y relaciones intra-especificas, así como también su interacción con
los distintos hospederos encontrados hasta el momento.
Entre las técnicas mas regularmente utilizadas se encuentran: los que analizan
el Polimorfimos de Longitud de Fragmentos de Restricción o RFLP´S, el ADN
mitocondrial o mtDNA, las secuencias microsatélites o SSR y con menor regularidad
las secuencias ínter-microsatélites o ISSR
Polimorfimo de Longitud de Fragmentos de Restricción o RFLP´S:
El análisis de este tipo de marcador nos permite evaluar la variación que existe en la
secuencia del ADN de un individuo, en nuestro caso esta tipo de herramienta nos
permite identificar los distintos tipos de linajes de Phytophthora infestans que se
encuentran en el Ecuador y compararlas con los que existen o se presentan en otras
regiones u hospederos. Los marcadores RFLPs son generados por la variación en los
sitios de reconocimiento de enzimas de restricción en la cadena de DNA, esta
variación ocurre entre genotipos diferentes. Las enzimas de restricción cortan en
secuencias especificas el DNA, generando así miles de fragmentos de diferente
longitud y peso que son específicos para cada individuo acorde a la secuencia de su
genoma. Por otro lado una mutación puntual dentro de este sitio de restricción
resultará en la pérdida a ganancia de una secuencia de reconocimiento de la
endonucleasa, dando origen a un fragmento de restricción de diferente longitud al
original. Las mutaciones causadas por una inserción, deleción, o inversiones en el
DNA también llevan a variación en la longitud de los fragmentos do restricción.
El ADN geonómico extraído del organismo es digerido con una enzima de restricción
específica que para el caso del ADN de Phytophthora infestans se usa la enzima
EcoR1. Una vez digerido el ADN es separado en una matriz de gel de agarosa al
0.65% por medio de electroforesis y todos estos fragmentos separados son
transferidos e inmovilizados a una membrana de nylon por un proceso de Southern
Blot. El ADN de Phytophthora infestans inmovilizado es marcado con una sonda o
´probe´ específica llamada RG-R7 desarrollada específicamente para este organismo.
La sonda RG 57 utilizada para caracterizar P.infestans tiene una extensión de1.2 Kb,
es altamente polimórfica. DNA nuclear que hibrida más de 25 loci genéticos,, cada
locus segrega para la presencia a ausencia de una banda. produciendo un patrón de
bandas, de las cuales no todas estarán presentes en un individuo (aislamiento),
dependiendo el patrón de bandas de las características genéticas de cada aislamiento
lo cual revela el tipo de linaje del mismo. En el Ecuador se han detectado 5 tipos de
linajes distintos los cuales podrán ir variando en numero acorde nuevos linajes pueden
ser encontrados en la diversidad de hospederos especialmente de naturaleza silvestres.
ADN mitocondrial o mtDNA.
En las células de hongos y plantas, el ADN no solo esta contenido en el núcleo sino
tambien en ciertos lugares del citoplasma. En las plantas existe ADN en los
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cloroplastos y en las mitocondrias, pero en el caso de los hongos como Phytophthora
infestans solo tienen DNA mitocondrial . Usualmente este tipo de genomas son mas
pequeñas que el genoma nuclear y su tamaño varia entre 18 a 121 Kb. El ADN de
tipo mitocondrial puede ser extraído con un proceso regular usado en muchos
laboratorios, y luego de ser extraído este será sometido a una reacción de PCR o
reacción de la polimerasa en cadena, utilizando para esto primers o iniciadores
específicos que producirán fragmentos de un determinado tamaño correspondientes a
las regiones polimórficas del genoma mitocondrial, posteriormente estos fragmentos
serán digeridos con diferentes enzimas de restricción para crear patrones de bandas
que nos da a conocer los diversos haplotipos mitocondriales encontrados en Ecuador
para Phytophthora infestans denominados Ia, IIa, Ib y IIb. Estos patrones serán
resueltos y separados por un proceso de electroforesis en gel o matriz de agarosa al
2%.
Las secuencias microsatélites o SSR.
Las secuencias repetitivas de copia única (Simple Secuence Repeat), es un
componente integral de los genomas de los eucariontes y que en ciertos organismos
podrían comprender de mas de el 90% del DNA total. Acorde a la manera como
estén organizados estos pueden ser ´extendidos internamente´ o ´repetidos en
tandem´. Los primeros ocurren en diversos sitios a través de todo el genoma mientras
que los segundos consisten en arreglos de dos hasta cientos de arreglos con un inicio y
un terminal definidos. Las secuencias microsatélites en general se caracterizan por
arreglos cortos de secuencias (1 a 6 bp) que se repiten a bajo grado.
Específicamente en el caso de Phytophthora infestans los marcadores microsatélites
fueron desarrollados usando la librería genómica de P.infestans enriquecida con
repeticiones (TC)n. En total se seleccionaron sies marcadores microsatélites para la
caracterización de los aislados de Phytophthora infestans., denominados Pi 4B, Pi 4G,
Pi G11, Pi 1D, Pi 2D, Pi 2H.(Tabla 1). Los productos microsatélites fueron llevados a
cabo mediante las Reaccion de la Polimerasa en Cadena (PCR), y separados
posteriormente mediante un proceso de electroforesis en una cámara de secuenciación
en arreglo vertical durante toda la noche en un gel denaturante de matriz de
poliacrilamida al 6% y teñido con nitrato de plata.
Tabla 1
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Las secuencias microsatélites en el estudio de Phytophthora infestans están dando los
mas promisorios resultados para el entendimiento de este organismo al respecto de su
dinámica poblacional, variabilidad y potencial para la identificación de aislados.
Secuencias ínter-microsatélites o ISSR.
Las secuencias ínter-microsatélites o ISSR, son marcadores relativamente nuevos en
el estudio de organismos como Phytophthora infestans. La diferencia en relación a las
pruebas de marcadores microsatélites es que este tipo de marcadores son utilizan
inciadores o primers que pueden ser de uso universal, pues han sido probados con
éxito en muchos organismos superiores. Adicionalmente, no es necesario el
conocimiento previo de secuencias especificas o secuencias flancos, lo cual la hace de
esta prueba muy flexible comparándola con los RAPD´s, pero su reacción es mucho
reproducible y consistente que esta ultima. Por otro lado la cantidad de primers o
iniciadores con un tamaño que varia de 17 a 25 bp llega al centenar, lo cual permite
un amplio rango de ensayos y así escoger la mayor cantidad de información para
estudios de variabilidad. La estructura y configuración de los primers o iniciadores de
los ISSR es que son en si una secuencia microsatélite mas una corta secuencia
arbitraria o ´ancla´ que apunta a un subset de secuencia SSR´s lo cual permite la
amplificación de la secuencias que se encuentran entre dos secuencia microsatélites
cercanas propiamente dicha y opuestamente orientadas.
En el estudio de
Phytophthora infestans estos marcadores nos han permitido en separar grupos de
ciertos aislados de acorde a su hospedero mostrando ser útiles para estudiar la
organización, frecuencia y niveles de polimorfismo de los SSR´s. El revelado es estos
productos es llevado a cabo de mediante una Reacción de la Polimerasa en Cadena y
luego resueltos en un gel de matriz de agarosa al 1% teñido con bromuro de etidio.
Conclusiones:
El estudio del tizón tardío de la papa o lancha en CIP ha sido un de los principales
programas de investigación desde hace mas de una década atrás. Dicho estudio ha
implicado el desarrollar herramientas de investigación que nos permitan entender la
diversidad, dinámica poblacional y cambios a los que este organismo pueda estar
supeditado. Dichos programa de investigación a demandado la participación
multidiciplinaria tanto de investigadores, agrónomos, agricultores e instituiciones
nacionales e internacionales que nos han permitido construir un programa de manejo
de integrado del tizón tardío de la papa. Los métodos a nivel molecular son una
herramienta mas dentro de programa de manejo de integrado que contribuye al
entendimiento del organismo y su interaccion e impacto ante el medio ambiente y el
ser humano.
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