10. informe de resultados de las pruebas a los participantes

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MINISTERIO DE SALUD
INSTITUTO NACIONAL DE SALUD
CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO
INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA
INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS
GRANULOSUS EN PERROS Y SU
UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES
CAMPESINAS DE YANAHUANCA
SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº6
DR. CÉSAR MIGUEL GAVIDIA CHUCÁN
ING. ELSA NORA DE LA TORRE TAPIA
2002
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
TITULO:
“Estandarización de un método inmunodiagnóstico para la infección
por Echinococcus granulosus en perros y su utilidad en las
comunidades campesinas de Yanahuanca”
NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES
Investigador Principal FMV-UNMSM:
Dr. César Miguel Gavidia Chucán. MV, MPH. Profesor Asociado de la Universidad Nacional
Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina Veterinaria, Laboratorio de Medicina Veterinaria
Preventiva.
Dirección y teléfonos: Av. Santa Inés 373-377, Chaclacayo, Lima 8. Telf.: 3585469 (domicilio),
4358962 anexo 103 (oficina).
E-mail: [email protected], [email protected]
Investigador Principal DIRESA Pasco:
Ing. Elsa Nora de la Torre Tapia, Directora Ejecutiva de Salud Ambiental Pasco, Telefax 063722582, 063-9919334, [email protected]
Dirección:
Av Los Incas S/N San Juan, Yanacancha Pasco.
Investigadores Colaboradores:
Dra. Rosario Romero (DIRESA Pasco) 063-721512, [email protected]
M.V. Luis Arturo Estares Porras, (DESA PASCO) ) Av.Los Incas S/N Urb San Juan –
Yanacancha Pasco, Unidad de Higiene Alimentaria y Zoonosis, Telefax 063-722582,
[email protected]
Armando González Zariquiey, MV, PhD (UNMSM-FMV)
Luis Lopera Balarezo, MV (UNMSM-FMV)
Carmen Calderón Sánchez, Blg (UNMSM-FMV)
INSTITUCIONES QUE PARTICIPARAN EN LA EJECUCIÓN

Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina Veterinaria, Laboratorio
de Medicina Veterinaria Preventiva
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
Dirección Regional de Salud Pasco – Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental
INVESTIGADORES RESPONSABLES DE LA CORRESPONDENCIA
Investigador Principal FMV-UNMSM e Investigador Principal DIRESA Pasco.
UNIDAD OPERATIVA EN LA CUAL SE VA A TRABAJAR
El proyecto se realizará en las Instituciones antes mencionadas dependiendo de la actividad
que se realice en determinados momentos.
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EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
INDICE
1.
RESUMEN ESTRUCTURADO ........................................................................................... 6
1.1.
1.2.
1.3.
1.4.
1.5.
JUSTIFICACIÓN: ............................................................................................................ 6
OBJETIVOS: ................................................................................................................. 6
METODOLOGÍA: ............................................................................................................ 7
RELEVANCIA: ............................................................................................................... 7
MONTO TOTAL SOLICITADO: .......................................................................................... 7
2. MARCO TEORICO. ............................................................................................................... 8
1.1.
INTRODUCCIÓN. ........................................................................................................... 8
2.2
ANTECEDENTES. .......................................................................................................... 9
2.2.1. AGENTE ETIOLOGICO Y CICLO DE VIDA .................................................................. 9
2.2.2. IMPORTANCIA EN LA SALUD PÚBLICA Y EPIDEMIOLOGIA ....................................10
2.2.3. DIAGNÓSTICO DE LA ECHINOCOCOSIS E HIDATIDOSIS .....................................12
3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................................13
3.1.
3.2.
4.
OBJETIVO GENERAL: ...................................................................................................13
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ............................................................................................13
METODOLOGÍA ...............................................................................................................13
4.1.
ESTANDARIZACION DEL WESTERN BLOT PARA EL DIAGNOSTICO DE
EQUINOCOCOSIS ...............................................................................................................13
4.1.1. LUGAR DE EJECUCION ...........................................................................................13
4.1.2. DETERMINACION DE LOS COMPONENTES ANTIGENICOS .................................14
4.1.2.1. COLECCION DE SUEROS DE PERROS. .............................................................14
4.1.2.2. TAMAÑO MUESTRAL ...........................................................................................14
4.1.2.3. COLECCION Y SEPARACION DE LOS PROTOSCOLICES .................................14
4.1.2.4. OBTENCION DE LOS ANTIGENOS. ....................................................................15
4.1.2.5. CUANTIFICACION DE LAS PROTEINAS DEL ANTIGENO ...................................15
4.1.2.6. CARACTERIZACION ANTIGENICA ......................................................................16
4.1.3. TECNICA ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA BLOT ...........................................16
4.1.3.1. ELECTROFORESIS EN SDS – PAGE ...................................................................16
4.1.3.2. ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA..................................................................16
4.1.3.3. WESTERN BLOT...................................................................................................17
4.1.4. ANALISIS DE RESULTADOS ...................................................................................17
4.2.
EVALUACION DE WB EN COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA –
CERRO DE PASCO ..............................................................................................................18
4.2.1. LUGAR DE EJECUCION ...........................................................................................18
4.2.2. DISEÑO GENERAL ...................................................................................................18
4.2.3. DOSIFICACIÓN CON BROMHIDRATO DE ARECOLINA ..........................................19
4.2.4. EVALUACIÓN DE LA PURGA Y CONTEO DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS. ..19
4.2.5. MUESTRA DE SANGRE DE LOS PERROS DE YANAHUANCA. ..............................20
4.2.6. ANÁLISIS DE DATOS:...............................................................................................20
5.
ORGANIZACIÓN Y RESPONSABILIDADES ...................................................................22
6.
ASPECTOS ÉTICOS - PARTICIPACIÓN DE SERES HUMANOS. ..................................23
7.
PROCESO DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO ........................................................23
8.
CONSECUENCIAS DE LA PARTICIPACIÓN EN EL ESTUDIO ......................................23
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9.
CONFIDENCIALIDAD DE LA INFORMACIÓN OBTENIDA .............................................24
10.
INFORME DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS A LOS PARTICIPANTES .............24
11.
CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES .............................................................................25
12.
PRESUPUESTO ...........................................................................................................26
13.
REFERENCIAS .............................................................................................................29
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1. RESUMEN ESTRUCTURADO
1.1.
Justificación:
La hidatidosis es una zoonosis parasitaria que afecta animales y seres humanos
causada por la fase larvaria del Echinococcus granulosus. Constituye un problema de
salud pública en el mundo donde América Latina es considerada como una de las áreas de
mayor prevalencia de equinococosis. Así se ha reportado que Argentina, Uruguay, Chile y
Perú son los que registran las tasas de infección más elevadas. La equinococosis en la
Sierra del Perú sigue siendo una de las parasitosis más frecuentes. La convivencia del
hombre con los perros y las deficientes condiciones higiénico-sanitarias además de los
bajos niveles socioeconómicos y culturales de la población, facilitan la persistencia de la
enfermedad en nuestro medio. De esta manera los Andes son considerados zonas
endémicas no sólo de equinococosis canina sino también de hidatidosis ovina y humana.
Los programas de control y prevención de esta parasitosis han demostrado su eficacia
en países desarrollados, sin embargo no ha sucedido lo mismo en países en desarrollo
como el nuestro. El diagnóstico oportuno y preciso de la equinococosis canina sería de gran
ayuda durante la implementación y ejecución de los programas de control. En ese sentido,
han aparecido nuevas técnicas para diagnosticar la infección a través de pruebas basadas
en la respuesta inmune del hospedero definitivo. El método hasta ahora usualmente
empleado consiste en el uso de bromhidrato de arecolina, el cual presenta varias
desventajas y riesgos para el operador, el perro y el medio ambiente.
Recientemente se ha reportado el uso de antígenos de excreción/secreción de la
Taenia solium como una buena alternativa para detectar pacientes teniásicos. Existe
además en la literatura evidencia que las pruebas inmunodiagnósticas para la detección de
anticuerpos circulantes sería una alternativa segura y confiable para la equinococosis
canina. Sin embargo ninguna de las técnicas ha sido eficazmente evaluada y estandarizada
en nuestro medio.
1.2.
Objetivos:
Por lo tanto el presente estudio desarrollará la técnica de Western Blot (WB) para la
detección de anticuerpos contra E. granulosus a través de la evaluación de los antígenos
de excreción/secreción del parásito adulto. Luego de su estandarización (sensibilidad,
especificidad, valores predictivos positivo y negativo), se evaluará su utilidad en el
diagnóstico de equinococosis canina en condiciones de campo (comunidades campesinas
de Yanahuanca) comparando con la purga (Bromhidrato de Arecolina).
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1.3.
Metodología:
Para la estandarización del WB se emplearán sueros controles positivos y negativos.
Los sueros positivos serán obtenidos de perros infectados experimentalmente o
naturalmente infectados que hayan eliminado E. granulosus en la purga. Los sueros
negativos serán de perros de zonas libres de la enfermedad (Lima) y que además resulten
negativos al examen parasitológico seriado. Los antígenos de excreción/secreción del
gusano adulto se obtendrán del cultivo in vitro de los mismos. La concentración y
cuantificación de las proteínas antigénicas se evaluará posteriormente. Se usará la técnica
de Electroinmunotransferencia blot (EITB) seguida del WB para el revelado de anticuerpos
específicos a dichas bandas antigénicas.
Una vez estandarizado el WB, se realizarán muestreos en campo usando bromhidrato
de arecolina y tomando muestras de sangre para analizar mediante esta prueba. Un total
de dos muestreos serán realizados de los cuales se estimará la prevalencia e incidencia de
equinococosis canina mediante la purga y WB. Adicionalmente se compararán ambos
métodos para determinar el grado de concordancia.
1.4.
Relevancia:
El éxito de este proyecto podría ofrecer una nueva tecnología para el diagnóstico
temprano de equinococosis canina y poder de esta forma intervenir en el momento
apropiado sobre el hospedero definitivo. Además las dosificaciones consecutivas nos
brindarán información sobre la dinámica de transmisión del E. granulosus y la magnitud de
la enfermedad en el área de estudio.
1.5.
Monto total solicitado:
El monto total solicitado para la ejecución del proyecto es de cincuenta mil y 00/100
nuevos soles (S/. 50,000.00).
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2. MARCO TEORICO.
1.1.
Introducción.
La hidatidosis es una zoonosis parasitaria que afecta animales y seres humanos. Esta
parasitosis es un complejo de enfermedades causadas por las larvas de cuatro especies
del céstodo Echinococcus cuya reproducción y ciclos vitales transcurren en diversos
mamíferos (vacunos, ovinos, roedores, etc.) como huéspedes intermediarios y en
carnívoros domésticos y salvajes como huéspedes definitivos (Eckert, Gemmell et al. 2002).
Constituye un problema de salud pública en el mundo. América Latina es considerada como
una de las áreas de mayor prevalencia de equinococosis (Schantz 1974), siendo Argentina
(Gonzáles, Peralta et al. 1998), Uruguay, Chile (Werner, Perez et al. 2000; Curzel 2003) y
Perú los que registran las tasas de infección más elevadas (Moro, Gilman et al. 1999).
La equinococosis en la Sierra del Perú sigue siendo una de las parasitosis más
frecuentes. La convivencia del ser humano con los cánidos, las deficientes condiciones
higiénico-sanitarias, los bajos niveles socioeconómicos y culturales de la población,
intervienen como factores importantes en la cadena de transmisión y persistencia de la
infección. Estas áreas han sido por lo tanto, reportadas como endémicas no sólo de
equinococosis canina sino también de hidatidosis ovina y humana (Chuquisana, Chavez et
al. 2000).
En este sentido, es urgente elaborar y aplicar métodos eficaces de control y prevención
de la enfermedad. Desde la década de los 80´s, se han producido notables avances en la
comprensión de la epidemiología de la equinococosis. Por ejemplo, han aparecido nuevas
técnicas para diagnosticar la infección en el hombre y los animales, se ha mejorado el
tratamiento de la hidatidosis humana y, con la aparición de una nueva vacuna contra E.
granulosus en huéspedes intermediarios, se han elaborado nuevas estrategias de
prevención (Eckert, Gemmell et al. 2002).
El diagnóstico preciso y rápido de equinococosis canina podría ser también parte
importante en un programa de control al permitir dosificar los perros en el momento
apropiado. El método usualmente empleado consiste en el uso de bromhidrato de
arecolina, el cual presenta varias desventajas y riesgos para el operador (Schantz, Williams
et al. 1973; Moro, Bonifacio et al. 1999). Debido a esto se están buscando otras técnicas
diagnósticas basadas en la respuesta inmune del hospedero definitivo. En la actualidad se
vienen empleando técnicas inmunológicas que detectan anticuerpos circulantes específicos
contra E. granulosus. De otro lado se sabe que los productos de excreción/secreción de las
tenias constituyen elementos potenciales para el diagnóstico serológico.
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Sin embargo ninguna de las técnicas ha sido eficazmente evaluada y estandarizada en
nuestro medio para el diagnóstico de equinococosis canina. Por lo tanto el presente estudio
investigará la posibilidad de desarrollar una técnica serológica (Western Blot) para la
detección de anticuerpos contra E. granulosus a través de la evaluación de los antígenos
de excreción/secreción del parásito adulto. Luego de su estandarización, se evaluará su
utilidad en el diagnóstico de equinococosis canina en condiciones de campo.
2.2 Antecedentes.
2.2.1. AGENTE ETIOLOGICO Y CICLO DE VIDA
La equinococosis es una enfermedad producida por la tenia Echinococcus
granulosus. Este tiene como huéspedes definitivos al perro doméstico y algunos
cánidos silvestres, y como huéspedes intermediarios a los ungulados y al hombre
(Smyth 1994). Es un parásito que en la fase adulta puede medir de 2-7mm de longitud y
normalmente posee tres o cuatro proglótidos. El penúltimo proglótido se encuentra
maduro mientras que el terminal es el proglótido grávido. El rostelo tiene dos hileras de
ganchos, los cuales asemejan a dedos como parte de una extensión del éscolex. El
útero del proglótido grávido tiene divertículos bien desarrollados y pueden contener de
100 a 1500 huevos cada uno (Smyth 1994; Schantz 1999).
Este parásito en su fase larvaria afecta a la mayoría de los herbívoros tales como
ovejas, cabras, vacas, camellos, caballos así como también a los cerdos (Eckert and
Deplazes 2004). El parásito forma quistes los cuales son del tipo unilocular y se
localizan generalmente en los pulmones y/o hígado. Sin embargo pueden ubicarse en
otras áreas del cuerpo siempre y cuando las oncósferas del parásito puedan ser
filtradas de la sangre a la cavidad abdominal, hígado, cavidad pélvica, riñón, cerebro,
ojo, corazón, etc. (McManus, Zhang et al. 2003; Eckert and Deplazes 2004).
En el ciclo normal del E. granulosus, el céstode adulto habita el intestino delgado de
los hospederos definitivos (Eckert, Gemmell et al. 2002). Cuando madura, el céstode
adulto produce huevos y éstos salen con las heces. Los huevos contaminan la
vegetación y luego pueden ser ingeridos por animales al pastoreo. Luego las oncósferas
penetran la mucosa intestinal e ingresan al torrente circulatorio y son transportados a
los principales órganos filtradores (hígado y pulmones). Los embriones se depositan en
dichos órganos y posteriormente se transforman en una forma larval quística
denominada "quiste hidatídico" (Thompson 1986).
El hombre constituye un hospedero accidental, que se infecta al ingerir huevos del
parásito directamente o a través de alimentos contaminados por malos hábitos de
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higiene (Milad 2002). Esto ocurre mayormente cuando los individuos tienen algún
contacto con los perros infectados o inadvertidamente ingieren alimentos o agua
contaminada con materia fecal que contiene huevos del céstode (Eckert and Deplazes
2004).
El quiste hidatídico desarrolla una gruesa pared alrededor del mismo, y numerosas
cabecitas del céstode, denominadas "protoescólices", son producidos vía reproducción
asexual. Estos protoescólices son aproximadamente del mismo tamaño y textura de los
granos de arena, por lo que se le atribuyó el término de "arenilla hidatídica". Los
carnívoros se infectan al ingerir vísceras infectadas del hospedero intermediario. Los
escólex atacan el revestimiento intestinal del carnívoro y alcanzan su madurez en
aproximadamente 40-45 días (Thompson 1986).
2.2.2. IMPORTANCIA EN LA SALUD PÚBLICA Y EPIDEMIOLOGIA
El E. granulosus es el causante de la enfermedad hidatídica y mayormente se
encuentra representada por la transmisión entre el perro doméstico y la oveja. La
hidatidosis es una importante enfermedad zoonótica presente a lo largo de muchas
partes de Sudamérica, Este del África, Australia, Europa Central, Asia Central y el
Litoral Mediterráneo. Esta enfermedad persiste gracias a la presencia de uno o varios
hospederos definitivos y uno o varios hospederos intermediarios (Moro, McDonald et al.
1997; Milad 2002; McManus, Zhang et al. 2003).
A menudo la enfermedad en humanos es detectada como un hallazgo fortuito en la
autopsia o en conjunción con otras enfermedades. Las manifestaciones clínicas de la
hidatidosis se encuentran determinadas mayormente por el tamaño, sitio y número de
quistes involucrados. Aunque la quimioterapia se ha convertido en un importante modo
de tratamiento para la enfermedad hidatídica, aún muchos quistes deben ser removidos
quirúrgicamente en las personas (Moro, McDonald et al. 1997).
La hidatidosis en el hombre es responsable de pérdidas económicas que se
extiende más allá del enfermo. Además se debe tener en cuenta los gastos que
demanda la hospitalización y las intervenciones quirúrgicas de los pacientes, sin contar
con las posibles complicaciones que podrían ocurrir. De la misma manera existe la
posibilidad de recurrencia, activación de quistes en estado de latencia o reinfección de
los pacientes (Torgerson 2003).
Su importancia en Salud Pública por lo tanto, no radica en su incidencia, que no es
muy alta, ni en su mortalidad, sino en su capacidad de prevención. En efecto, la
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destrucción sanitaria de las vísceras decomisadas en los mataderos, así como el
enterramiento de animales muertos son las medidas más adecuadas para la reducción
de la incidencia (Gonzales, Muñoz et al. 1997).
Otro aspecto involucrado en el ciclo de transmisión de esta parasitosis tiene que ver
con el beneficio de los animales de abasto. La persistencia de la infección se debe al
sacrificio clandestino de los animales a campo libre, la falta de inspección veterinaria y
la costumbre de alimentar con vísceras en lugares accesibles para perros, lobos, zorros,
etc. sin tratamiento previo alguno (Moro, Gilman et al. 1999).
En el Perú, el reporte promedio anual de morbilidad para la enfermedad hidatídica
en humanos es 1.04 a 2.04 por 100,000 habitantes. Este reporte es incompleto, debido
a que las verdaderas proporciones se piensan que son dos veces más altas (Delgado
2001). Moro et al (1994), describió que la hidatidosis permanece en los Andes Centrales
Peruanos siendo un problema de menor significancia en Lima. Moro reportó una
prevalencia de hidatidosis en los ovinos entre 4 a 66% y aproximadamente el 30% de
los ovinos beneficiados tuvieron quistes hidatídicos en los pulmones y en el hígado.
Además fue encontrada una seroprevalencia para hidatidosis humana de 1.9% por las
pruebas de Electroinmunotransferencia Blot (EITB) y la prueba de Doble Difusión (Moro,
Guevara et al. 1994).
Otro estudio epidemiológico de la enfermedad fue realizado en los andes centrales
peruanos. Dicho trabajo describió que la prevalencia de infección hidatídica humana
(9.1%) fue el reporte más alto en Latinoamérica. La frecuencia de presentación de la
enfermedad en el hígado, pulmones y en ambos órganos fue 3.4%, 2.0% Y 0.2%
respectivamente. Dichas prevalencias de infección en humanos fueron determinadas
utilizando ultrasonido, rayos X y la prueba de Electroinmunotransferencia Blot (EITB).
Asimismo se encontró una prevalencia extremadamente alta de equinococosis en
perros (32%) después de la purga con Bromohidrato de Arecolina y una prevalencia de
87% de hidatidosis en el ganado ovino (Moro, Gilman et al. 1999).
Los estudios publicados en la zona de Cerro de Pasco sobre hidatidosis y
equinococosis son escasos. Así tenemos que un trabajo realizado en el distrito de
Ninacaca encontró una prevalencia en humanos de 9.8% (zona rural) y 8.2% (zona
urbana) (Nuñez, Calero et al. 2003). Por otro lado la equinococosis canina en la zona
también ha sido estudiada en el Distrito de Simón Bolívar usando arecolina. Este
estudio encontró una prevalencia de 41.4% como figura en un informe del DIRESAPasco (Luis Estares, comunicación personal).
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2.2.3. DIAGNÓSTICO DE LA ECHINOCOCOSIS E HIDATIDOSIS
El diagnóstico de Echinococcus granulosus en perros vivos es realizado usualmente
mediante la purga con Bromhidrato de Arecolina o por detección de coproantígeno
(Lopera 1998). Las muestras obtenidas mediante la purga son examinadas para
detectar la presencia de parásitos adultos. Este procedimiento no sólo es riesgoso para
los perros sino que usualmente representa un riesgo de infección al personal
involucrado y al medio ambiente. Asimismo, dicha purga muchas veces es ineficiente,
particularmente cuando nos encontramos frente a cargas parasitarias bajas (Jenkins
and Rickard 1986). De esta manera la detección inmunológica es una alternativa útil y
segura para el diagnóstico parasitológico.
Moro et al (1997), demostró que la prueba de EITB utilizada para el serodiagnóstico
de hidatidosis ovina tuvo una moderada sensibilidad (73%) y una alta especificidad
(98.6%). También se observó una alta sensibilidad (85%) en animales con infecciones
severas (1-10 quistes mayores de 2cm. de diámetro (Moro, McDonald et al. 1997).
Aunque la sensibilidad del Western Blot es similar a la Hemoaglutinación indirecta o
ELISA, el Western BIot tiene la ventaja de poseer una alta especificidad y de no
observarse reacciones cruzadas con otros céstodes. El EITB puede utilizarse como una
herramienta de campo para determinar la prevalencia de la hidatidosis ovina,
especialmente en áreas donde la Taenia avis y la Taenia hydatigena son endémicas
(Verastegui, Moro et al. 1992).
El desarrollo de pruebas serológicas para la detección del estado adulto de otras
tenias también ha sido investigado. En este sentido, Wilkins et al (1999), desarrolló un
ensayo serológico para detectar T. solium en pacientes teniásicos, utilizando antígeno
excretorio/secretorio de cultivo in vitro de gusanos adultos. Así se ha determinando la
presencia de 2 bandas antigénicas de 32,7 y 37,8 kD que poseían 95% de sensibilidad
y 100% de especificidad (Wilkins, Allan et al. 1999; Levine, Calderon et al. 2004)
Por otro lado se ha desarrollado un estudio descriptivo sobre la caracterización de
los componentes antigénicos de E. granulosus en su estado larval para determinar la
presencia de bandas antigénicas como posible uso diagnóstico. Ese trabajo utilizó
antígenos totales y excretorio/secretorios de protoescólices, observándose 15 bandas
antigénicas para el antígeno total con pesos moleculares entre 8 y 126Kda que no
mostraron diferencias entre los sueros positivos y negativos. A su vez se identificaron 5
bandas para el antígeno excretorio/secretorio de protoescólices con pesos moleculares
de rango 21 a 89Kda encontrándose que la banda antigénica de 21Kda podría ser de
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futuro valor diagnóstico ya que se presentó en 6 de 15 sueros positivos (Delgado 2001).
3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN
3.1.
Objetivo General:
Estandarizar la prueba serológica de Western Blot (WB) para el diagnóstico de
equinococosis canina a través de los antígenos de excreción/secreción del parásito
adulto y evaluar su utilidad en condiciones de campo (Comunidades Campesinas de
Yanahuanca)
3.2.
Objetivos específicos:
 Realizar el cultivo in vitro de gusanos adultos de Echinococcus granulosus

Purificar los productos de excreción/secreción (E/S) y caracterizar los
antígenos E/S del cultivo de Echinococcus granulosus

Evaluar los antígenos seleccionados como posibles bandas diagnósticas
haciendo uso de la técnica de Western Blot.

Estimar la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivo positivo y
predictivo negativo del Western Blot.

Comparar el Western Blot con el diagnóstico mediante el uso de Bromhidrato
de arecolina, para estimar la concordancia de ambos métodos diagnósticos
para equinococosis canina.

Evaluar la utilidad y factibilidad del WB bajo condiciones de campo
realizando muestreos en determinadas comunidades campesinas de
Yanahuanca (Cerro de Pasco).
4. METODOLOGÍA
4.1.
ESTANDARIZACION DEL WESTERN BLOT PARA EL DIAGNOSTICO DE
EQUINOCOCOSIS
4.1.1. LUGAR DE EJECUCION
El trabajo de realizará en el Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San
Marcos en convenio con DIRESA Pasco.
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4.1.2. DETERMINACION DE LOS COMPONENTES ANTIGENICOS
4.1.2.1.
COLECCION DE SUEROS DE PERROS.
Se tomarán muestras de sangre de los siguientes grupos de perros:
(a) Grupo Negativos: Perros negativos a E. granulosus provenientes de zonas
no endémicas (Lima). Los perros serán previamente desparasitados,
clínicamente sanos, y que luego de un muestreo seriado (3 días
consecutivos) resulten negativos a E. granulosus.
(b) Grupo Positivos: Perros positivos a E. granulosus, provenientes de zonas
endémicas de la sierra central - Yanahuanca
(Cerro de Pasco) y de
infección experimental. Los perros serán confirmados mediante eliminación
del parásito después de la purga con Bromhidrato de Arecolina o por
necropsia.
(c) Sueros de perros negativos a E. granulosus y positivos a otros céstodes y
nemátodos, provenientes de zonas no endémicas (Lima). (Evaluación de
Reacción cruzada). Perros que lleguen a la Clínica de Animales Menores de
FMV-UNMSM. Estos tendrán un análisis coproparasitológico seriado para
determinar su carga parasitaria y el tipo de parásito presente. Adicionalmente
se infectará en forma experimental dos perros con Taenia hydatigena.
4.1.2.2.
TAMAÑO MUESTRAL
El presente trabajo se iniciará con un número de 108 muestras de sueros de
perros (54 positivos y 54 negativos a E. granulosus) (Tamaño muestral para
estimación de proporciones) considerando una sensibilidad y especificidad no menor
del 90%.
Donde: z= Nivel de confianza al 95%
n
2
z pq
d2
p= 0.9 ó 90%
q=1-p
d=0.05 (error estimado)
4.1.2.3.
COLECCION Y SEPARACION DE LOS PROTOSCOLICES
Los protoescólices (PSC) y el líquido hidatídico serán removidos y aspirados de
quistes hidatídicos obtenidos de ovinos por infección natural (Jenkins and Rickard
1986) provenientes de los camales de la ciudad de Lima. Se dejará en reposo el
líquido hidatídico y se eliminará el sobrenadante. Se lavará el pellet 3 veces con
PBS estéril 0,05M pH 7,2. Se aspirará la solución y se separará el líquido de los
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EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
protoéscolices.
Los
PSC
serán
suspendidos
en
PBS
y
se
contarán
microscópicamente usando la cámara de Newbauer. La viabilidad de la membrana
se probará por inclusión del Tripan Blue 0,4%. Los PSC viables serán utilizados en
la infección de los perros. Finalmente, con los datos de viabilidad y de cantidad total
de PSC, se calculará la dosis infectante (200,000 por perro).
4.1.2.4.
NFECCION Y EUTANASIA DE LOS PERROS.
Diez perros entre 3 y 6 meses de edad serán experimentalmente infectados con
aproximadamente 2ml de suspensión conteniendo aproximadamente 200,000 PSC
(Lymbery, Hobbs et al. 1989). Los animales serán mantenidos en ayunas (18 a 20
horas antes) previo a la infección. Los perros recibirán su alimento dos a tres horas
después de la infección. Treinta a 35 días después de la infección, los perros serán
sacrificados por inyección de pentobarbital sódico. Serán mantenidos en ayunas 24
horas antes. Al momento de la necropsia se extraerá el intestino delgado en su
totalidad. El intestino se abrirá longitudinalmente a lo largo de la línea mesentérica y
se dividirá transversalmente en 3 secciones iguales (anterior, medio y posterior). A
cada sección se le incubará en una solución de PBS a 37°C por 30 minutos, con la
finalidad que los gusanos sean removidos de la mucosa intestinal. El número de
gusanos de cada sección será contado directamente o por estimación volumétrica.
4.1.2.5.
OBTENCION DE LOS ANTIGENOS.
Para la obtención de los antígenos excretorio/secretorio (E/S) de las tenias
adultas se empleará la metodología descrita por Wilkins P. 1999 (Wilkins, Allan et al.
1999). Se procederá a lavar los gusanos adultos con PBS estéril 3 veces, y luego se
cultivarán en un medio libre de proteínas (MDBK- MM) a 37°C por 24, 48 y 72 horas.
Se recolectará el sobrenadante de los medios cultivados y se les agregará
inhibidores de proteasas (Pefablot, Leupeptin y Pesptatin). Se concentrará usando
YM-10 membrana (Amicón. Bervely, MA) hasta obtener una concentración de 0,1
ug/ul. y se les guardará a -70°C hasta su utilización.
4.1.2.6.
CUANTIFICACION DE LAS PROTEINAS DEL ANTIGENO
Para determinar la concentración de proteínas para el antígeno E/S proveniente
de los gusanos adultos de E. granulosus se realizará el Método de Bradford
(Bradford 1976). Como patrón se utilizará Bovine Serum Albumine (BSA). Se
preparán diluciones conocidas de la proteína patrón y diluciones paralelas. Se
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elaborará una curva de calibración con la proteína patrón de 0 a 25ug/ml suspendido
en 1000 ul de solución salina al 0,85% respectivamente. Las diluciones de la
proteína patrón y de la muestra problema se resuspenderán en la proporción de
1/5 para el antígeno E/S de E. granulosus y se les agregará 250ul de tampón de
trabajo de Bradford. Se esperará 5 minutos y luego se leerá la absorbancia en un
espectrofotómetro (Bauch & Lomb) a 600nm. Las lecturas obtenidas de la muestra
patrón se graficarán para obtener una curva patrón y la cantidad de proteína de la
muestra problema se determinará extrapolando las lecturas en la curva patrón o
curva de calibración.
4.1.2.7.
CARACTERIZACION ANTIGENICA
La caracterización antigénica se realizará empleando el método de EITB según
lo describió Tsang et al. 1989 (Tsang, Brand et al. 1989). El EITB tiene tres pasos,
una primera etapa es la que separa las proteínas empleando electroforesis SDSPAGE. En una segunda etapa las proteínas separadas se transfieren a un papel de
nitrocelulosa empleando electro transferencia. Finalmente, las proteínas se hacen
evidentes mediante una reacción serológica que básicamente constituye el Western
Blot. Para la electroforesis SDS-PAGE, los antigenos serán tratados con SDS 1%,
Azul de bromo fenol 0,1% en Tris- HCL 0,01 M pH 8,0 y calentado a 65˚C por
15min o también con DTT (Dithiotreitol) 50mM y calentado a 65˚C por 15min.
4.1.3. TECNICA ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA BLOT
4.1.3.1.
ELECTROFORESIS EN SDS – PAGE
Se realizarán corridas electroforéticas del antígeno elaborado. Las proteínas
se separarán por peso molecular electroforéticamente en un gel de gradiente de
poliacralamida sodio duodecylsulfato (SDS - PAGE) usando Protean II Sistem
(Biorad). La gradiente de arcrilamida será del 5% al 25%. Los antígenos serán
incubados a 65°C por 20 minutos en tampón de muestra (0,1 SDS, 0,025%
P/vol. Azul de bromofenol, 1% glicerol, y 0,0025 M tris-HCl pH 8.0). Los geles
serán corridos a 5mA/gel para el gel de concentración y a 25 mA/gel para el gel
de separación. Este paso se repetirá a diferentes concentraciones de antígeno
(0,10 ug/ul, y 0,20 ug/l) para determinar la concentración óptima a utilizar.
4.1.3.2.
ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA.
Después de la corrida electroforética los geles serán sumergidos en un
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tampón de transferencia para Blot en un papel de nitrocelulosa, usando TransBlot Cell (Biorad). Los componentes proteicos del gel serán transferidos a un
papel de nitrocelulosa (0,2 um) a 2 amperios durante 90 minutos. El antígeno
E/S se transferirá a un papel de nitrocelulosa con las concentraciones antes
descritas. La técnica se estandarizará haciendo primero, un “pool” de sueros
positivos y otro de sueros negativos. En esta etapa de estandarización previa los
papeles conteniendo los antígenos serán trabajados primero en uno de cinco
pocillos por gel, dos para los marcadores de peso molecular (alto y bajo) y tres
para cada una de las concentraciones de los antígenos. Posteriormente se
trabajará corriendo el antígeno en un pocillo largo, que al cortarse en tiras luego
de la transferencia permitirá evaluar los sueros individualmente.
4.1.3.3.
WESTERN BLOT
Los sueros controles se descongelarán y se diluirán a razón de 1:50 en
tampón de leche (PBS - T20 0,3% -leche descremada Merck 5%). Para la
incubación de los sueros se utilizarán bandejas con 8 canaletas (Accutan). Cada
tira será colocada en una canaleta y a cada canaleta se le añadirá 500ul de
suero diluido en tampón de leche y se le dejará incubar durante una noche a una
temperatura de 20 ˚C en agitación constante.
Las tiras serán lavadas por 5 veces durante 5 minutos cada vez con PBST20 0,3%. En seguida se añadirá 500ul de conjugado cabra anti perro Ig G
(KPL) diluído 1:200 con PBS-T20 0,3%. Se dejará en incubación durante una
hora a temperatura de 20 ˚C en agitación constante. Posteriormente se
procederá a lavar las tiras 3 veces durante 5 minutos cada vez con PBS – T20
0,3% y 3 veces con PBS sólo. Luego se añadirá 500ul de solución sustrato DAB
(3,3´- Diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate) y se le dejará actuar
durante 10 minutos. Por último la reacción se detendrá lavando las tiras con
agua destilada.
4.1.4. ANALISIS DE RESULTADOS
Las diferencias entre presencia o no de bandas antigénicas y tipo de suero se
analizarán empleando una tabla de contingencia de 2x2. La sensibilidad, especificidad y
valores predictivos positivo y negativo serán estimados con sus respectivos intervalos
de confianza al 95%. La asociación entre las variables cualitativas (resultado de la
prueba, grupo etáreo, sexo) serán analizadas mediante la prueba de Chi Cuadrado.
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EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
4.2.
EVALUACION DE WB EN COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
– CERRO DE PASCO
4.2.1. LUGAR DE EJECUCION
El trabajo de campo se realizará en 9 comunidades campesinas ubicadas en la
Provincia Daniel Alcides Carrión (Yanahuanca): Tambochaca, Huarautambo,
Astobamba, Uchumarca, Andachaca, 12 de Octubre, Santiago Pampa, Tambopampa y
Ayayog. (sujeto a modificación de acuerdo a las conversaciones con las autoridades de
estas y otras comunidades)
4.2.2. DISEÑO GENERAL
Diseño epidemiológico longitudinal, en el cual se estimará la incidencia de
equinococosis en dos muestreos consecutivos con un intervalo de 4 meses entre cada
uno. Adicionalmente cada muestreo proveerá información sobre la prevalencia de
equinococosis y factores de riesgo relacionados con la enfermedad. Previa reunión con
las autoridades del lugar y los responsables de los respectivos Centros de Salud se
conseguirá la autorización correspondiente y la divulgación para la campaña de
dosificación de perros. Se ofrecerá la dosificación con bromhidrato de arecolina a todos
los perros mayores de 3 meses de edad, con excepción de perros enfermos y perras
preñadas. Se tomarán además muestras de sangre de los perros tratados. El suero
obtenido de dichas muestras será posteriormente analizado mediante la prueba de
Western Blot.
4.2.3. TAMAÑO MUESTRAL
La equinococosis canina en la zona de estudio no ha sido reportada
anteriormente, al menos oficialmente. Sin embargo estudios en áreas geográficas con
características similares, tales como en Pachacayo y comunidades anexas de la SAIS
Tupac Amaru se ha demostrado una prevalencia de 32% usando arecolina y 46%
usando ELISA para detección de coproantígenos (Moro, Bonifacio et al. 1999).
Igualmente en otro estudio realizado en la comunidad de Vichaycocha (Sierra de Lima)
se encontró una prevalencia de 34% con bromhidrato de arecolina y mucho mayor
(82%) mediante el uso de ELISA para la captura de coproantígeno (Lopera, Moro et al.
2003). Basado en esta información, el tamaño de muestra estimado es de 131 perros,
calculado con la fórmula de estimación de proporciones, con un valor “p” referencial de
34%, nivel de confianza al 95% y error máximo de 7%, como se muestra en la fórmula
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de abajo. La población canina de la zona de estudio está estimada en aproximadamente
500 perros, información proveniente de estudios preliminares pero aún no publicados
por nuestro grupo de trabajo.
n
Z 2 p(1  p)
d2
donde: Z  1.96
p  0.34 d  0.07
4.2.4. DOSIFICACIÓN CON BROMHIDRATO DE ARECOLINA
La preparación del terreno de muestreo consistirá en extender un plástico que
abarque el doble de la longitud corporal de los perros. Se registrarán los perros con un
código numérico el cual será anotado en dos etiquetas autoadhesivas (identificación del
perro y para la purga). Los datos que se tomarán son: propietario, nombre del perro,
sexo, edad y lugar. La dosificación con bromhidrato de arecolina será de 3 a 4mg/Kg vía
oral haciendo uso de una jeringa dosificadora de uso veterinario. El animal será
sujetado a una estaca con una distancia de 10 cm. aproximadamente, y colocado sobre
el plástico para facilitar la recolección de la muestra (purga). Se esperará 40 minutos y
si no se produce la purga, se le redosificará con la mitad de su dosis y se esperará 20
minutos más (Eckert, Gemmell et al. 2002; Lopera, Moro et al. 2003). Se procederá a
recolectar sólo la porción mucosa mediante cucharitas descartables. Esta se colocará
en el envase destinado (depósito pequeño con tapa rosca) y será sellado
adecuadamente. El código del perro será a su vez anotado en el frasco
correspondiente. Todas las muestras serán guardadas con las medidas de seguridad
del caso. Finalmente, se procederá a recoger el plástico y todo el material contaminante
para quemarlo, incluyendo restos de heces que pudieran estar en el lugar.
4.2.5. EVALUACIÓN DE LA PURGA Y CONTEO DE ECHINOCOCCUS
GRANULOSUS.
Los envases conteniendo la porción mucosa de la purga de los perros se abrirá con
cuidado, registrando adecuadamente el código de identificación del animal. Se agregará
10cc de lejía al 10% en una solución al 20% v/v. El contenido de la purga será luego
vertido en un frasco de vidrio (250ml) cerrado con una tapa acondicionada con una
malla de 80 hilos por pulgada. Se agitará el frasco con la tapa orientada hacia el
desagüe del lavadero. Se resuspenderá el contenido del frasco con agua corriente y se
volverá a agitar (se realizará esta operación las veces que sea necesario hasta que la
muestra quede limpia). El contenido del frasco será vertido en una bandeja de vidrio la
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cual será colocada en una base de fondo oscuro para poder visualizar el parásito por
simple contraste.
Cuando se visualice poca cantidad de parásitos, éstos serán contados
individualmente. Cuando se visualice una gran cantidad de parásitos, se procederá a
agitar la bandeja de tal modo que se distribuya lo más uniformemente posible los
parásitos; de esta manera se procederá a contar un cuadrante y luego multiplicar esta
cantidad por 4. Al finalizar cada evaluación de la muestra, se eliminará el contenido de
la bandeja en el lavadero. Los envases serán autoclavados y finalmente se realizará la
limpieza del ambiente con lejía 10% en una solución al 20% v/v. El diagnóstico de la
purga finalmente será expresado en dos formas: 1) negativo/positivo, y 2) número total
de gusanos encontrados.
4.2.6. MUESTRA DE SANGRE DE LOS PERROS DE YANAHUANCA.
Los perros serán muestreados (sangre) mediante punción en la vena cefálica del
brazo usando el sistema Vacutainer. El código de cada perro será registrado además de
la fecha y el sexo. Las muestras serán centrifugadas y los sueros almacenados a -20°C
hasta su uso. Las muestras serán analizadas mediante WB, usando la técnica
previamente descrita en la sección 4.1.3.3 (Western Blot). El diagnóstico para el WB
será presentado como negativo/positivo junto con las bandas que hubieren reaccionado
a la prueba.
4.2.7. ANÁLISIS DE DATOS:
El total de perros trabajados en cada muestreo así como la distribución de sexo,
edad y lugar de procedencia serán resumidos mediante tablas de frecuencia. La
prevalencia será estimada con su respectivo Intervalo de Confianza al 95% usando los
dos métodos diagnósticos (arecolina y WB). Se presentarán los datos estratificados de
acuerdo a edad, sexo y lugar de procedencia. Adicionalmente se evaluará el número de
parásitos presentes así como las bandas de mayor presentación en este grupo de
animales. La tasa de incidencia se estimará entre cada período de muestreo para los
dos métodos de diagnóstico. Igualmente los datos de incidencia se presentarán en
forma agregada y desagregada por edad, sexo y lugar de procedencia. El riesgo relativo
(RR) para las diferentes edades o categorías de edad, así como para sexo y lugar será
estimado tomando la Incidencia de menor valor como el nivel basal o de referencia para
las variables antes mencionadas. Tanto los resultados positivos como negativos a
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ambas pruebas diagnósticas serán comparados entre sí usando una tabla de
contingencia de 2x2. La concordancia será estimada mediante el Indice de Kappa y la
significancia estadística mediante la prueba de McNemar. Los intervalos de confianza
para la tasa de incidencia y RR serán calculados al 95%. Toda la información será
colectada en cuadernos de campo y cuadernos de laboratorio. Posteriormente los datos
serán transcritos a una base previamente diseñada en Excel. Una vez ingresados los
datos, se realizará un control de calidad de los mismos, verificando en forma aleatoria el
20% de ellos comparando los datos ingresados con los datos existentes en los
cuadernos de campo y/o laboratorio. Finalmente los datos serán analizados usando el
paquete estadístico Stata 9.2.
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5. ORGANIZACIÓN Y RESPONSABILIDADES
Participante
Responsabilidad
Ing. Elsa Nora de la
Coordinará las actividades de campo en las comunidades
Torre Tapia y Dra.
campesinas. Será responsable de la entrega de resultados en las
Rosario Romero
respectivas comunidades a través de sus Centros de Salud locales.
(DIRESA-Pasco)
Se encargará de difundir la información necesaria respecto a la
enfermedad en estudio. Además será responsable del dinero que ha
sido presupuestado para la DIRESA Pasco y de la preparación de los
informes respectivos, tanto económicos como técnicos ante el INS.
Dr. César Gavidia
Controlará y monitoreará el buen desenvolvimiento de las actividades
Chucán (FMV-
relacionadas con el proyecto en general, particularmente el
UNMSM)
cumplimiento calendarizado de los fondos así como también de los
informes respectivos. Es el responsable del buen manejo y
desenvolvimiento del proyecto en las sedes de Lima, así como la
coordinación permanente con DIRESA-Pasco a través de la Ing. Elsa
Torre. Se encargará de organizar las infecciones experimentales en la
FMV-UNMSM. Será el encargado de realizar los gastos indicados en
el presupuesto, previa coordinación con la contraparte, de rendir los
informes técnicos y económicos según el calendario.
Dr. Armando
El Dr. González colaborará y asistirá en la elaboración de la base de
González Zariquiey
datos, así como en el análisis estadístico de los mismos.
(FMV-UNMSM)
Dr. Eduardo Barrón
El Dr. Barrón será el encargado de obtener y procesar los quistes
(FMV-UNMSM)
hidáticos necesarios para la infección experimental de perros. Será la
persona responsable del manejo de dichos perros y de la dosificación
de los canes a nivel de las comunidades campesinas.
Dra. Berenice
La Dra. Ninaquispe será la encargada de tomar las muestras de
Ninaquispe (FMV-
sangre de los perros, identificarlas y procesarlas para obtener el suero
UNMSM)
correspondiente.
Blga. Carmen
La Blga. Calderón será la persona encargada de estandarizar el
Calderón Sánchez
Western Blot y de hacer el análisis de todos los sueros de perros
(FMV-UNMSM)
posteriormente.
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Dr. Luis Estares
El Dr. Estares, colaborará en los trabajos de campo, tanto en la
(DESA Pasco, Higiene recolección y procesamiento de los quistes como los muestreos de
Alimentaria y
caninos en las comunidades campesinas. Será el responsable de las
Zoonosis)
coordinaciones para el buen desarrollo de las tareas en campo.
6. ASPECTOS ÉTICOS - PARTICIPACIÓN DE SERES
HUMANOS.
El estudio NO involucra la participación de seres humanos.
7. PROCESO DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO
El estudio no requiere de consentimiento informado
8. CONSECUENCIAS DE LA PARTICIPACIÓN EN EL ESTUDIO

Beneficios. Al final del estudio habremos contribuido en dos aspectos respecto a la
transmisión del Echinococcus granulosus. Primero, el Western Blot podria ser usado
como una herramienta de diagnóstico en perros y permitiría la planificación de
dosificaciones en futuros programas de control. Además el WB ayudaría en el monitoreo
de programas de control tanto en zonas endémicas como zonas que podrían ir
quedando aparentemente libres de esta parasitosis. En segundo lugar, las tres
dosificaciones con bromhidrato de arecolina estarían contribuyendo en algo a disminuir
la carga parasitaria en las comunidades elegidas.

Daños potenciales. En cuanto a la estandarización, los perros infectados
experimentalmente serán manipulados con las medidas de seguridad biológica
correspondiente y por personal con experiencia y previamente entrenado en esta labor.
Respecto a las tareas en campo, se tendrá igualmente la protección para los
manipuladores para evitar la infección con huevos del parásito y se recomendará a la
gente mantener los perros tratados fuera de las casas por al menos 24 horas.
Adicionalmente todo perro tratado recibe a manera de enjuague, una solución de lejía
10% en la zona perianal antes de ser regresado a su dueño. En cada campaña de
dosificación se hará énfasis en que los perros deben ser conducidos por personas
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mayores y no por niños o menores de edad. Esto facilitará las instrucciones sobre el
adecuado manejo de los perros tratados con arecolina.
9. CONFIDENCIALIDAD DE LA INFORMACIÓN OBTENIDA
Aunque el proyecto no cotempla el trabajo directo con personas, los datos obtenidos en los
muestreos de perros serán mantenidos únicamente en las oficinas de los Investigadores
Principales (FMV-UNMSM y DIRESA-Pasco). Las únicas personas con acceso a la base de
datos serán los Investigadores Principales u otro personal con previa autorización de ambos
responsables. Los resultados de los perros serán entregados a los dueños de los mismos en
sobre cerrado; si la entrega no se hace personalmente, los sobres serán dejados en los
Centros de Salud de cada comunidad para que puedan ser recogidos, previa firma de un
listado. Finalizado el proyecto y el análisis de los datos, toda la información será grabada en un
CD y archivada bajo responsabilidad de los Investigadores Principales.
10. INFORME DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS A LOS
PARTICIPANTES

¿Se informará a los participantes los resultados de las pruebas (exámenes)? Sí (a los
dueños de los perros que hayan intervenido en las campañas de dosificación y
muestreo). La entrega de resultados será en sobre cerrado con un listado de aquellos
que participaron en la campaña.

¿Será la información de este estudio accesible públicamente al final del mismo? Sí. Al
final del proyecto se emitirá un informe al INS-VIGIA de acuerdo con lo indicado en las
bases del concurso. Adicionalmente el Investigador Responsable por parte de la
Facultad de Medicina Veterinaria-UNMSM (Dr. César Gavidia Chucán) escribirá un
artículo científico para ser publicado en una revista indexada internacionalmente,
indicando los agradecimientos tal como indican las bases del concurso y en
coordinación con la Ing. Elsa Torre del DIRESA-Pasco.
Version 01
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11. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES
ACTIVIDAD
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Contacto con las comunidades campesinas
x
Infección experimental de perros
x
x
x
x
Obtención de muestras controles positivos y negativos
x
x
x
x
Adquisición de material de laboratorio y campo
x
x
x
x
x
x
x
Estandarización del Western Blot
x
x
Primer muestreo de perros
x
Implementación de base de datos
x
x
x
x
x
x
Segundo muestreo de perros
Procesamiento de muestras
x
x
x
x
x
x
Informe final
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x
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COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
12. PRESUPUESTO
Rubro
Medida Costo Unitario Cant. Costo total
Programación mensual
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
MATERIAL DE CAPACITACION E
IMPLEMENTACION. DE BASE DE DATOS (DIRESA PASCO)
Equipo de Computo CPU, Monitor Teclado e Impresora
Un equipo multimedia
01 Cámara fotográfica digital
Material Educativo (Trípticos)
Subtotal
2850.00
3500.00
400.00
1.00
01
01
01
1000
2850.00 X
3500.00
400.00
X
1000.00
x
7750.00
1.00
100.00
5.00
1000
15
30
1000.00
1500.00
150.00
2650.00
Gasolina 90 Octanos (DIRESA PASCO)
Refrigerios para personal (ambas instituciones)
Viáticos para desplazamiento del personal de Lima/Pasco/Lima (ambas inst.)
13.50
10.00
110.00
100
100
40
1350.00 x
1000.00 x
4400.00 x
x
x
x
Frascos de plástico c/tapa rosca 100 ml.
Pago de terceros (ambas instituciones)
Subtotal
1.20
500.00
500
4
600.00
2000.00
9350.00
X
X
76.00
11.5
97.00
664.00
20
3
1
1
x
x
X
MATERIAL DE CAMPO (ambas instituciones)
Guantes descartables
Guardapolvos, Gorros y botas
Alcohol
Subtotal
X
X
X
REQUERIMIENTOS PARA TRASLADO AL CAMPO, MOVILIDADES Y
CONTACTO CON COMUNIDADES CAMPESINAS
x
x
x
MATERIAL DE LABORATORIO
Y MANTENIMIENTO DE PERROS INFECTADOS (FMV-UNMSM)
Alimento para perros
Crepe indicator tape for autoclaving
Methanol
8210 N95 Respirator, 3M (mascarillas)
Version 01
- 26 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
1
1000ml
8pk
11/13/2015
x
x
1520.00
x
X
34.50
X
97.00
664.00 X
x
x
x
x
X
X
X
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS
COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
Supor*Membrane Disc Filters pore size 0,2. Pall Gelman
Supor*Membrane Disc Filters pore size 0,45. Pall Gelman
Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml yellow
Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml Green
Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml Red
Round Microcapillary and gel loading tips 0,5-200ul rack/200 Tips
Superior Nitrocellulose Membranes BA83
Gel blot paper
D(+) Glucosa
Pyruvic acid sodium salt 99%
Sodium bicarbonate
Trypan Blue Solution (0,4%)
Prestained SDS-PAGE Standars
SDS
DAB
DTT
Temed
Ammonium persulfate
Tris Ultra Pure
Siliconized/low retention microcentrifuge tubes 1,5
Disposable plastic cuvets-semi micronpolystyrene
Silver stain plus. Kit
Acrylamide 99,9%
Biorad Protein Assay
Boric Acid
Bis acrylamide
Anti dog Ig G (H+L)
BSA
Filter millex syringe 0,22 um Millipore blue
Pipet Tips (101 - 1000 ul blue)
Pipet Tips (10 - 200 ul yellow)
Ultra microtips (0,1 - 10 ul)
Tubes centrifuge polypropylene (50ml)
Tubes centrifuge polypropylene (15ml)
MDBK_MM
L-Glutamine 200 mM
Pefablot SC
Version 01
- 27 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
100
100
500
500
500
4rack
1 roll
100
1 kg.
25g
500g
100ml
500ul
100 g
25g
5g
5 ml
10 g
1kg
250
500
1
1kg
450 ml
500g
50g
0,5 mg
50g
50
100
100
96
500
500
1000ml
100ml.
1g
421.50
412.50
100.00
100.00
100.00
395.00
1232.50
125.00
174.00
117.50
100.00
59.50
430.00
130.00
637.50
285.00
70.00
60.00
318.00
92.50
403.50
660.00
925.00
370.00
110.00
155.00
570.00
707.50
465.00
25.00
20.00
50.00
547.50
437.50
192.00
57.00
2910.00
11/13/2015
2
2
2
2
2
1
1
3
2
2
2
2
1
2
1
2
3
2
2
3
1
1
1
1
2
2
4
1
1
5
5
10
1
2
5
4
1
843.00
825.00
200.00
200.00
200.00
395.00
1232.50
375.00
348.00
235.00
200.00
119.00
430.00
260.00
637.50
570.00
210.00
120.00
636.00
277.50
403.50
660.00
925.00
370.00
220.00
310.00
2280.00
707.50
465.00
125.00
100.00
500.00
547.50
875.00
960.00
228.00
2910.00
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
X
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X
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X
X
X
X
X
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X
X
X
X
X
X
X
X
X
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS
COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
Leupeptin
Pepstatin
Sodium hypochlorite
Microtube 0.2 ml
Reusable Filter Holder
Serological pipets BD falcon No. 7551
Bags, Autoclave/Bioharzad large 19''x23'' orange
Bags, Autoclave/Bioharzad large 25''x35'' orange
Parafilm m roll size 4'' x 125'
PBS tablets
Ultrafiltration membrane Filter Discs Amikon
Brand Bottles and Caps 250 ml
Brand Bottles and Caps 1000 ml
Square Dishes with Grid
Subtotal
5mg
5mg
500ml
500
1ea
200
200ea
200ea
1ea
100 tb
1
10ea
10ea
500ea
227.50
157.50
108.00
318.00
669.00
209.00
250.00
450.00
58.50
187.50
720.00
441.50
717.00
1138.50
TOTAL
Version 01
- 28 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
2
2
1
2
1
1
1
1
3
4
1
1
1
1
455.00
X
315.00
X
108.00
X
636.00
669.00
209.00
250.00
450.00
175.50 X
750.00
X
720.00
X
441.50
X
717.00
X
1138.50
X
30250.00
50,000
11/13/2015
X
X
X
X
X
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
13. REFERENCIAS
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Version 01
- 29 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
11/13/2015
ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS
EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA
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Version 01
- 30 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva
11/13/2015
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