10. informe de resultados de las pruebas a los participantes
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MINISTERIO DE SALUD INSTITUTO NACIONAL DE SALUD CENTRO DE INFORMACIÓN Y DOCUMENTACIÓN CIENTÍFICA ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA SERIE INFORMES TÉCNICOS Nº6 DR. CÉSAR MIGUEL GAVIDIA CHUCÁN ING. ELSA NORA DE LA TORRE TAPIA 2002 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA TITULO: “Estandarización de un método inmunodiagnóstico para la infección por Echinococcus granulosus en perros y su utilidad en las comunidades campesinas de Yanahuanca” NOMBRES Y APELLIDOS COMPLETOS DE LOS INVESTIGADORES Investigador Principal FMV-UNMSM: Dr. César Miguel Gavidia Chucán. MV, MPH. Profesor Asociado de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina Veterinaria, Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva. Dirección y teléfonos: Av. Santa Inés 373-377, Chaclacayo, Lima 8. Telf.: 3585469 (domicilio), 4358962 anexo 103 (oficina). E-mail: [email protected], [email protected] Investigador Principal DIRESA Pasco: Ing. Elsa Nora de la Torre Tapia, Directora Ejecutiva de Salud Ambiental Pasco, Telefax 063722582, 063-9919334, [email protected] Dirección: Av Los Incas S/N San Juan, Yanacancha Pasco. Investigadores Colaboradores: Dra. Rosario Romero (DIRESA Pasco) 063-721512, [email protected] M.V. Luis Arturo Estares Porras, (DESA PASCO) ) Av.Los Incas S/N Urb San Juan – Yanacancha Pasco, Unidad de Higiene Alimentaria y Zoonosis, Telefax 063-722582, [email protected] Armando González Zariquiey, MV, PhD (UNMSM-FMV) Luis Lopera Balarezo, MV (UNMSM-FMV) Carmen Calderón Sánchez, Blg (UNMSM-FMV) INSTITUCIONES QUE PARTICIPARAN EN LA EJECUCIÓN Universidad Nacional Mayor de San Marcos, Facultad de Medicina Veterinaria, Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva Version 01 -2DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA Dirección Regional de Salud Pasco – Dirección Ejecutiva de Salud Ambiental INVESTIGADORES RESPONSABLES DE LA CORRESPONDENCIA Investigador Principal FMV-UNMSM e Investigador Principal DIRESA Pasco. UNIDAD OPERATIVA EN LA CUAL SE VA A TRABAJAR El proyecto se realizará en las Instituciones antes mencionadas dependiendo de la actividad que se realice en determinados momentos. Version 01 -3DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA INDICE 1. RESUMEN ESTRUCTURADO ........................................................................................... 6 1.1. 1.2. 1.3. 1.4. 1.5. JUSTIFICACIÓN: ............................................................................................................ 6 OBJETIVOS: ................................................................................................................. 6 METODOLOGÍA: ............................................................................................................ 7 RELEVANCIA: ............................................................................................................... 7 MONTO TOTAL SOLICITADO: .......................................................................................... 7 2. MARCO TEORICO. ............................................................................................................... 8 1.1. INTRODUCCIÓN. ........................................................................................................... 8 2.2 ANTECEDENTES. .......................................................................................................... 9 2.2.1. AGENTE ETIOLOGICO Y CICLO DE VIDA .................................................................. 9 2.2.2. IMPORTANCIA EN LA SALUD PÚBLICA Y EPIDEMIOLOGIA ....................................10 2.2.3. DIAGNÓSTICO DE LA ECHINOCOCOSIS E HIDATIDOSIS .....................................12 3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN .................................................................................13 3.1. 3.2. 4. OBJETIVO GENERAL: ...................................................................................................13 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: ............................................................................................13 METODOLOGÍA ...............................................................................................................13 4.1. ESTANDARIZACION DEL WESTERN BLOT PARA EL DIAGNOSTICO DE EQUINOCOCOSIS ...............................................................................................................13 4.1.1. LUGAR DE EJECUCION ...........................................................................................13 4.1.2. DETERMINACION DE LOS COMPONENTES ANTIGENICOS .................................14 4.1.2.1. COLECCION DE SUEROS DE PERROS. .............................................................14 4.1.2.2. TAMAÑO MUESTRAL ...........................................................................................14 4.1.2.3. COLECCION Y SEPARACION DE LOS PROTOSCOLICES .................................14 4.1.2.4. OBTENCION DE LOS ANTIGENOS. ....................................................................15 4.1.2.5. CUANTIFICACION DE LAS PROTEINAS DEL ANTIGENO ...................................15 4.1.2.6. CARACTERIZACION ANTIGENICA ......................................................................16 4.1.3. TECNICA ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA BLOT ...........................................16 4.1.3.1. ELECTROFORESIS EN SDS – PAGE ...................................................................16 4.1.3.2. ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA..................................................................16 4.1.3.3. WESTERN BLOT...................................................................................................17 4.1.4. ANALISIS DE RESULTADOS ...................................................................................17 4.2. EVALUACION DE WB EN COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA – CERRO DE PASCO ..............................................................................................................18 4.2.1. LUGAR DE EJECUCION ...........................................................................................18 4.2.2. DISEÑO GENERAL ...................................................................................................18 4.2.3. DOSIFICACIÓN CON BROMHIDRATO DE ARECOLINA ..........................................19 4.2.4. EVALUACIÓN DE LA PURGA Y CONTEO DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS. ..19 4.2.5. MUESTRA DE SANGRE DE LOS PERROS DE YANAHUANCA. ..............................20 4.2.6. ANÁLISIS DE DATOS:...............................................................................................20 5. ORGANIZACIÓN Y RESPONSABILIDADES ...................................................................22 6. ASPECTOS ÉTICOS - PARTICIPACIÓN DE SERES HUMANOS. ..................................23 7. PROCESO DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO ........................................................23 8. CONSECUENCIAS DE LA PARTICIPACIÓN EN EL ESTUDIO ......................................23 Version 01 -4DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 9. CONFIDENCIALIDAD DE LA INFORMACIÓN OBTENIDA .............................................24 10. INFORME DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS A LOS PARTICIPANTES .............24 11. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES .............................................................................25 12. PRESUPUESTO ...........................................................................................................26 13. REFERENCIAS .............................................................................................................29 Version 01 -5DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 1. RESUMEN ESTRUCTURADO 1.1. Justificación: La hidatidosis es una zoonosis parasitaria que afecta animales y seres humanos causada por la fase larvaria del Echinococcus granulosus. Constituye un problema de salud pública en el mundo donde América Latina es considerada como una de las áreas de mayor prevalencia de equinococosis. Así se ha reportado que Argentina, Uruguay, Chile y Perú son los que registran las tasas de infección más elevadas. La equinococosis en la Sierra del Perú sigue siendo una de las parasitosis más frecuentes. La convivencia del hombre con los perros y las deficientes condiciones higiénico-sanitarias además de los bajos niveles socioeconómicos y culturales de la población, facilitan la persistencia de la enfermedad en nuestro medio. De esta manera los Andes son considerados zonas endémicas no sólo de equinococosis canina sino también de hidatidosis ovina y humana. Los programas de control y prevención de esta parasitosis han demostrado su eficacia en países desarrollados, sin embargo no ha sucedido lo mismo en países en desarrollo como el nuestro. El diagnóstico oportuno y preciso de la equinococosis canina sería de gran ayuda durante la implementación y ejecución de los programas de control. En ese sentido, han aparecido nuevas técnicas para diagnosticar la infección a través de pruebas basadas en la respuesta inmune del hospedero definitivo. El método hasta ahora usualmente empleado consiste en el uso de bromhidrato de arecolina, el cual presenta varias desventajas y riesgos para el operador, el perro y el medio ambiente. Recientemente se ha reportado el uso de antígenos de excreción/secreción de la Taenia solium como una buena alternativa para detectar pacientes teniásicos. Existe además en la literatura evidencia que las pruebas inmunodiagnósticas para la detección de anticuerpos circulantes sería una alternativa segura y confiable para la equinococosis canina. Sin embargo ninguna de las técnicas ha sido eficazmente evaluada y estandarizada en nuestro medio. 1.2. Objetivos: Por lo tanto el presente estudio desarrollará la técnica de Western Blot (WB) para la detección de anticuerpos contra E. granulosus a través de la evaluación de los antígenos de excreción/secreción del parásito adulto. Luego de su estandarización (sensibilidad, especificidad, valores predictivos positivo y negativo), se evaluará su utilidad en el diagnóstico de equinococosis canina en condiciones de campo (comunidades campesinas de Yanahuanca) comparando con la purga (Bromhidrato de Arecolina). Version 01 -6DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 1.3. Metodología: Para la estandarización del WB se emplearán sueros controles positivos y negativos. Los sueros positivos serán obtenidos de perros infectados experimentalmente o naturalmente infectados que hayan eliminado E. granulosus en la purga. Los sueros negativos serán de perros de zonas libres de la enfermedad (Lima) y que además resulten negativos al examen parasitológico seriado. Los antígenos de excreción/secreción del gusano adulto se obtendrán del cultivo in vitro de los mismos. La concentración y cuantificación de las proteínas antigénicas se evaluará posteriormente. Se usará la técnica de Electroinmunotransferencia blot (EITB) seguida del WB para el revelado de anticuerpos específicos a dichas bandas antigénicas. Una vez estandarizado el WB, se realizarán muestreos en campo usando bromhidrato de arecolina y tomando muestras de sangre para analizar mediante esta prueba. Un total de dos muestreos serán realizados de los cuales se estimará la prevalencia e incidencia de equinococosis canina mediante la purga y WB. Adicionalmente se compararán ambos métodos para determinar el grado de concordancia. 1.4. Relevancia: El éxito de este proyecto podría ofrecer una nueva tecnología para el diagnóstico temprano de equinococosis canina y poder de esta forma intervenir en el momento apropiado sobre el hospedero definitivo. Además las dosificaciones consecutivas nos brindarán información sobre la dinámica de transmisión del E. granulosus y la magnitud de la enfermedad en el área de estudio. 1.5. Monto total solicitado: El monto total solicitado para la ejecución del proyecto es de cincuenta mil y 00/100 nuevos soles (S/. 50,000.00). Version 01 -7DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 2. MARCO TEORICO. 1.1. Introducción. La hidatidosis es una zoonosis parasitaria que afecta animales y seres humanos. Esta parasitosis es un complejo de enfermedades causadas por las larvas de cuatro especies del céstodo Echinococcus cuya reproducción y ciclos vitales transcurren en diversos mamíferos (vacunos, ovinos, roedores, etc.) como huéspedes intermediarios y en carnívoros domésticos y salvajes como huéspedes definitivos (Eckert, Gemmell et al. 2002). Constituye un problema de salud pública en el mundo. América Latina es considerada como una de las áreas de mayor prevalencia de equinococosis (Schantz 1974), siendo Argentina (Gonzáles, Peralta et al. 1998), Uruguay, Chile (Werner, Perez et al. 2000; Curzel 2003) y Perú los que registran las tasas de infección más elevadas (Moro, Gilman et al. 1999). La equinococosis en la Sierra del Perú sigue siendo una de las parasitosis más frecuentes. La convivencia del ser humano con los cánidos, las deficientes condiciones higiénico-sanitarias, los bajos niveles socioeconómicos y culturales de la población, intervienen como factores importantes en la cadena de transmisión y persistencia de la infección. Estas áreas han sido por lo tanto, reportadas como endémicas no sólo de equinococosis canina sino también de hidatidosis ovina y humana (Chuquisana, Chavez et al. 2000). En este sentido, es urgente elaborar y aplicar métodos eficaces de control y prevención de la enfermedad. Desde la década de los 80´s, se han producido notables avances en la comprensión de la epidemiología de la equinococosis. Por ejemplo, han aparecido nuevas técnicas para diagnosticar la infección en el hombre y los animales, se ha mejorado el tratamiento de la hidatidosis humana y, con la aparición de una nueva vacuna contra E. granulosus en huéspedes intermediarios, se han elaborado nuevas estrategias de prevención (Eckert, Gemmell et al. 2002). El diagnóstico preciso y rápido de equinococosis canina podría ser también parte importante en un programa de control al permitir dosificar los perros en el momento apropiado. El método usualmente empleado consiste en el uso de bromhidrato de arecolina, el cual presenta varias desventajas y riesgos para el operador (Schantz, Williams et al. 1973; Moro, Bonifacio et al. 1999). Debido a esto se están buscando otras técnicas diagnósticas basadas en la respuesta inmune del hospedero definitivo. En la actualidad se vienen empleando técnicas inmunológicas que detectan anticuerpos circulantes específicos contra E. granulosus. De otro lado se sabe que los productos de excreción/secreción de las tenias constituyen elementos potenciales para el diagnóstico serológico. Version 01 -8DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA Sin embargo ninguna de las técnicas ha sido eficazmente evaluada y estandarizada en nuestro medio para el diagnóstico de equinococosis canina. Por lo tanto el presente estudio investigará la posibilidad de desarrollar una técnica serológica (Western Blot) para la detección de anticuerpos contra E. granulosus a través de la evaluación de los antígenos de excreción/secreción del parásito adulto. Luego de su estandarización, se evaluará su utilidad en el diagnóstico de equinococosis canina en condiciones de campo. 2.2 Antecedentes. 2.2.1. AGENTE ETIOLOGICO Y CICLO DE VIDA La equinococosis es una enfermedad producida por la tenia Echinococcus granulosus. Este tiene como huéspedes definitivos al perro doméstico y algunos cánidos silvestres, y como huéspedes intermediarios a los ungulados y al hombre (Smyth 1994). Es un parásito que en la fase adulta puede medir de 2-7mm de longitud y normalmente posee tres o cuatro proglótidos. El penúltimo proglótido se encuentra maduro mientras que el terminal es el proglótido grávido. El rostelo tiene dos hileras de ganchos, los cuales asemejan a dedos como parte de una extensión del éscolex. El útero del proglótido grávido tiene divertículos bien desarrollados y pueden contener de 100 a 1500 huevos cada uno (Smyth 1994; Schantz 1999). Este parásito en su fase larvaria afecta a la mayoría de los herbívoros tales como ovejas, cabras, vacas, camellos, caballos así como también a los cerdos (Eckert and Deplazes 2004). El parásito forma quistes los cuales son del tipo unilocular y se localizan generalmente en los pulmones y/o hígado. Sin embargo pueden ubicarse en otras áreas del cuerpo siempre y cuando las oncósferas del parásito puedan ser filtradas de la sangre a la cavidad abdominal, hígado, cavidad pélvica, riñón, cerebro, ojo, corazón, etc. (McManus, Zhang et al. 2003; Eckert and Deplazes 2004). En el ciclo normal del E. granulosus, el céstode adulto habita el intestino delgado de los hospederos definitivos (Eckert, Gemmell et al. 2002). Cuando madura, el céstode adulto produce huevos y éstos salen con las heces. Los huevos contaminan la vegetación y luego pueden ser ingeridos por animales al pastoreo. Luego las oncósferas penetran la mucosa intestinal e ingresan al torrente circulatorio y son transportados a los principales órganos filtradores (hígado y pulmones). Los embriones se depositan en dichos órganos y posteriormente se transforman en una forma larval quística denominada "quiste hidatídico" (Thompson 1986). El hombre constituye un hospedero accidental, que se infecta al ingerir huevos del parásito directamente o a través de alimentos contaminados por malos hábitos de Version 01 -9DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA higiene (Milad 2002). Esto ocurre mayormente cuando los individuos tienen algún contacto con los perros infectados o inadvertidamente ingieren alimentos o agua contaminada con materia fecal que contiene huevos del céstode (Eckert and Deplazes 2004). El quiste hidatídico desarrolla una gruesa pared alrededor del mismo, y numerosas cabecitas del céstode, denominadas "protoescólices", son producidos vía reproducción asexual. Estos protoescólices son aproximadamente del mismo tamaño y textura de los granos de arena, por lo que se le atribuyó el término de "arenilla hidatídica". Los carnívoros se infectan al ingerir vísceras infectadas del hospedero intermediario. Los escólex atacan el revestimiento intestinal del carnívoro y alcanzan su madurez en aproximadamente 40-45 días (Thompson 1986). 2.2.2. IMPORTANCIA EN LA SALUD PÚBLICA Y EPIDEMIOLOGIA El E. granulosus es el causante de la enfermedad hidatídica y mayormente se encuentra representada por la transmisión entre el perro doméstico y la oveja. La hidatidosis es una importante enfermedad zoonótica presente a lo largo de muchas partes de Sudamérica, Este del África, Australia, Europa Central, Asia Central y el Litoral Mediterráneo. Esta enfermedad persiste gracias a la presencia de uno o varios hospederos definitivos y uno o varios hospederos intermediarios (Moro, McDonald et al. 1997; Milad 2002; McManus, Zhang et al. 2003). A menudo la enfermedad en humanos es detectada como un hallazgo fortuito en la autopsia o en conjunción con otras enfermedades. Las manifestaciones clínicas de la hidatidosis se encuentran determinadas mayormente por el tamaño, sitio y número de quistes involucrados. Aunque la quimioterapia se ha convertido en un importante modo de tratamiento para la enfermedad hidatídica, aún muchos quistes deben ser removidos quirúrgicamente en las personas (Moro, McDonald et al. 1997). La hidatidosis en el hombre es responsable de pérdidas económicas que se extiende más allá del enfermo. Además se debe tener en cuenta los gastos que demanda la hospitalización y las intervenciones quirúrgicas de los pacientes, sin contar con las posibles complicaciones que podrían ocurrir. De la misma manera existe la posibilidad de recurrencia, activación de quistes en estado de latencia o reinfección de los pacientes (Torgerson 2003). Su importancia en Salud Pública por lo tanto, no radica en su incidencia, que no es muy alta, ni en su mortalidad, sino en su capacidad de prevención. En efecto, la Version 01 - 10 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA destrucción sanitaria de las vísceras decomisadas en los mataderos, así como el enterramiento de animales muertos son las medidas más adecuadas para la reducción de la incidencia (Gonzales, Muñoz et al. 1997). Otro aspecto involucrado en el ciclo de transmisión de esta parasitosis tiene que ver con el beneficio de los animales de abasto. La persistencia de la infección se debe al sacrificio clandestino de los animales a campo libre, la falta de inspección veterinaria y la costumbre de alimentar con vísceras en lugares accesibles para perros, lobos, zorros, etc. sin tratamiento previo alguno (Moro, Gilman et al. 1999). En el Perú, el reporte promedio anual de morbilidad para la enfermedad hidatídica en humanos es 1.04 a 2.04 por 100,000 habitantes. Este reporte es incompleto, debido a que las verdaderas proporciones se piensan que son dos veces más altas (Delgado 2001). Moro et al (1994), describió que la hidatidosis permanece en los Andes Centrales Peruanos siendo un problema de menor significancia en Lima. Moro reportó una prevalencia de hidatidosis en los ovinos entre 4 a 66% y aproximadamente el 30% de los ovinos beneficiados tuvieron quistes hidatídicos en los pulmones y en el hígado. Además fue encontrada una seroprevalencia para hidatidosis humana de 1.9% por las pruebas de Electroinmunotransferencia Blot (EITB) y la prueba de Doble Difusión (Moro, Guevara et al. 1994). Otro estudio epidemiológico de la enfermedad fue realizado en los andes centrales peruanos. Dicho trabajo describió que la prevalencia de infección hidatídica humana (9.1%) fue el reporte más alto en Latinoamérica. La frecuencia de presentación de la enfermedad en el hígado, pulmones y en ambos órganos fue 3.4%, 2.0% Y 0.2% respectivamente. Dichas prevalencias de infección en humanos fueron determinadas utilizando ultrasonido, rayos X y la prueba de Electroinmunotransferencia Blot (EITB). Asimismo se encontró una prevalencia extremadamente alta de equinococosis en perros (32%) después de la purga con Bromohidrato de Arecolina y una prevalencia de 87% de hidatidosis en el ganado ovino (Moro, Gilman et al. 1999). Los estudios publicados en la zona de Cerro de Pasco sobre hidatidosis y equinococosis son escasos. Así tenemos que un trabajo realizado en el distrito de Ninacaca encontró una prevalencia en humanos de 9.8% (zona rural) y 8.2% (zona urbana) (Nuñez, Calero et al. 2003). Por otro lado la equinococosis canina en la zona también ha sido estudiada en el Distrito de Simón Bolívar usando arecolina. Este estudio encontró una prevalencia de 41.4% como figura en un informe del DIRESAPasco (Luis Estares, comunicación personal). Version 01 - 11 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 2.2.3. DIAGNÓSTICO DE LA ECHINOCOCOSIS E HIDATIDOSIS El diagnóstico de Echinococcus granulosus en perros vivos es realizado usualmente mediante la purga con Bromhidrato de Arecolina o por detección de coproantígeno (Lopera 1998). Las muestras obtenidas mediante la purga son examinadas para detectar la presencia de parásitos adultos. Este procedimiento no sólo es riesgoso para los perros sino que usualmente representa un riesgo de infección al personal involucrado y al medio ambiente. Asimismo, dicha purga muchas veces es ineficiente, particularmente cuando nos encontramos frente a cargas parasitarias bajas (Jenkins and Rickard 1986). De esta manera la detección inmunológica es una alternativa útil y segura para el diagnóstico parasitológico. Moro et al (1997), demostró que la prueba de EITB utilizada para el serodiagnóstico de hidatidosis ovina tuvo una moderada sensibilidad (73%) y una alta especificidad (98.6%). También se observó una alta sensibilidad (85%) en animales con infecciones severas (1-10 quistes mayores de 2cm. de diámetro (Moro, McDonald et al. 1997). Aunque la sensibilidad del Western Blot es similar a la Hemoaglutinación indirecta o ELISA, el Western BIot tiene la ventaja de poseer una alta especificidad y de no observarse reacciones cruzadas con otros céstodes. El EITB puede utilizarse como una herramienta de campo para determinar la prevalencia de la hidatidosis ovina, especialmente en áreas donde la Taenia avis y la Taenia hydatigena son endémicas (Verastegui, Moro et al. 1992). El desarrollo de pruebas serológicas para la detección del estado adulto de otras tenias también ha sido investigado. En este sentido, Wilkins et al (1999), desarrolló un ensayo serológico para detectar T. solium en pacientes teniásicos, utilizando antígeno excretorio/secretorio de cultivo in vitro de gusanos adultos. Así se ha determinando la presencia de 2 bandas antigénicas de 32,7 y 37,8 kD que poseían 95% de sensibilidad y 100% de especificidad (Wilkins, Allan et al. 1999; Levine, Calderon et al. 2004) Por otro lado se ha desarrollado un estudio descriptivo sobre la caracterización de los componentes antigénicos de E. granulosus en su estado larval para determinar la presencia de bandas antigénicas como posible uso diagnóstico. Ese trabajo utilizó antígenos totales y excretorio/secretorios de protoescólices, observándose 15 bandas antigénicas para el antígeno total con pesos moleculares entre 8 y 126Kda que no mostraron diferencias entre los sueros positivos y negativos. A su vez se identificaron 5 bandas para el antígeno excretorio/secretorio de protoescólices con pesos moleculares de rango 21 a 89Kda encontrándose que la banda antigénica de 21Kda podría ser de Version 01 - 12 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA futuro valor diagnóstico ya que se presentó en 6 de 15 sueros positivos (Delgado 2001). 3. OBJETIVOS DE LA INVESTIGACIÓN 3.1. Objetivo General: Estandarizar la prueba serológica de Western Blot (WB) para el diagnóstico de equinococosis canina a través de los antígenos de excreción/secreción del parásito adulto y evaluar su utilidad en condiciones de campo (Comunidades Campesinas de Yanahuanca) 3.2. Objetivos específicos: Realizar el cultivo in vitro de gusanos adultos de Echinococcus granulosus Purificar los productos de excreción/secreción (E/S) y caracterizar los antígenos E/S del cultivo de Echinococcus granulosus Evaluar los antígenos seleccionados como posibles bandas diagnósticas haciendo uso de la técnica de Western Blot. Estimar la sensibilidad, la especificidad y los valores predictivo positivo y predictivo negativo del Western Blot. Comparar el Western Blot con el diagnóstico mediante el uso de Bromhidrato de arecolina, para estimar la concordancia de ambos métodos diagnósticos para equinococosis canina. Evaluar la utilidad y factibilidad del WB bajo condiciones de campo realizando muestreos en determinadas comunidades campesinas de Yanahuanca (Cerro de Pasco). 4. METODOLOGÍA 4.1. ESTANDARIZACION DEL WESTERN BLOT PARA EL DIAGNOSTICO DE EQUINOCOCOSIS 4.1.1. LUGAR DE EJECUCION El trabajo de realizará en el Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva de la Facultad de Medicina Veterinaria de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos en convenio con DIRESA Pasco. Version 01 - 13 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 4.1.2. DETERMINACION DE LOS COMPONENTES ANTIGENICOS 4.1.2.1. COLECCION DE SUEROS DE PERROS. Se tomarán muestras de sangre de los siguientes grupos de perros: (a) Grupo Negativos: Perros negativos a E. granulosus provenientes de zonas no endémicas (Lima). Los perros serán previamente desparasitados, clínicamente sanos, y que luego de un muestreo seriado (3 días consecutivos) resulten negativos a E. granulosus. (b) Grupo Positivos: Perros positivos a E. granulosus, provenientes de zonas endémicas de la sierra central - Yanahuanca (Cerro de Pasco) y de infección experimental. Los perros serán confirmados mediante eliminación del parásito después de la purga con Bromhidrato de Arecolina o por necropsia. (c) Sueros de perros negativos a E. granulosus y positivos a otros céstodes y nemátodos, provenientes de zonas no endémicas (Lima). (Evaluación de Reacción cruzada). Perros que lleguen a la Clínica de Animales Menores de FMV-UNMSM. Estos tendrán un análisis coproparasitológico seriado para determinar su carga parasitaria y el tipo de parásito presente. Adicionalmente se infectará en forma experimental dos perros con Taenia hydatigena. 4.1.2.2. TAMAÑO MUESTRAL El presente trabajo se iniciará con un número de 108 muestras de sueros de perros (54 positivos y 54 negativos a E. granulosus) (Tamaño muestral para estimación de proporciones) considerando una sensibilidad y especificidad no menor del 90%. Donde: z= Nivel de confianza al 95% n 2 z pq d2 p= 0.9 ó 90% q=1-p d=0.05 (error estimado) 4.1.2.3. COLECCION Y SEPARACION DE LOS PROTOSCOLICES Los protoescólices (PSC) y el líquido hidatídico serán removidos y aspirados de quistes hidatídicos obtenidos de ovinos por infección natural (Jenkins and Rickard 1986) provenientes de los camales de la ciudad de Lima. Se dejará en reposo el líquido hidatídico y se eliminará el sobrenadante. Se lavará el pellet 3 veces con PBS estéril 0,05M pH 7,2. Se aspirará la solución y se separará el líquido de los Version 01 - 14 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA protoéscolices. Los PSC serán suspendidos en PBS y se contarán microscópicamente usando la cámara de Newbauer. La viabilidad de la membrana se probará por inclusión del Tripan Blue 0,4%. Los PSC viables serán utilizados en la infección de los perros. Finalmente, con los datos de viabilidad y de cantidad total de PSC, se calculará la dosis infectante (200,000 por perro). 4.1.2.4. NFECCION Y EUTANASIA DE LOS PERROS. Diez perros entre 3 y 6 meses de edad serán experimentalmente infectados con aproximadamente 2ml de suspensión conteniendo aproximadamente 200,000 PSC (Lymbery, Hobbs et al. 1989). Los animales serán mantenidos en ayunas (18 a 20 horas antes) previo a la infección. Los perros recibirán su alimento dos a tres horas después de la infección. Treinta a 35 días después de la infección, los perros serán sacrificados por inyección de pentobarbital sódico. Serán mantenidos en ayunas 24 horas antes. Al momento de la necropsia se extraerá el intestino delgado en su totalidad. El intestino se abrirá longitudinalmente a lo largo de la línea mesentérica y se dividirá transversalmente en 3 secciones iguales (anterior, medio y posterior). A cada sección se le incubará en una solución de PBS a 37°C por 30 minutos, con la finalidad que los gusanos sean removidos de la mucosa intestinal. El número de gusanos de cada sección será contado directamente o por estimación volumétrica. 4.1.2.5. OBTENCION DE LOS ANTIGENOS. Para la obtención de los antígenos excretorio/secretorio (E/S) de las tenias adultas se empleará la metodología descrita por Wilkins P. 1999 (Wilkins, Allan et al. 1999). Se procederá a lavar los gusanos adultos con PBS estéril 3 veces, y luego se cultivarán en un medio libre de proteínas (MDBK- MM) a 37°C por 24, 48 y 72 horas. Se recolectará el sobrenadante de los medios cultivados y se les agregará inhibidores de proteasas (Pefablot, Leupeptin y Pesptatin). Se concentrará usando YM-10 membrana (Amicón. Bervely, MA) hasta obtener una concentración de 0,1 ug/ul. y se les guardará a -70°C hasta su utilización. 4.1.2.6. CUANTIFICACION DE LAS PROTEINAS DEL ANTIGENO Para determinar la concentración de proteínas para el antígeno E/S proveniente de los gusanos adultos de E. granulosus se realizará el Método de Bradford (Bradford 1976). Como patrón se utilizará Bovine Serum Albumine (BSA). Se preparán diluciones conocidas de la proteína patrón y diluciones paralelas. Se Version 01 - 15 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA elaborará una curva de calibración con la proteína patrón de 0 a 25ug/ml suspendido en 1000 ul de solución salina al 0,85% respectivamente. Las diluciones de la proteína patrón y de la muestra problema se resuspenderán en la proporción de 1/5 para el antígeno E/S de E. granulosus y se les agregará 250ul de tampón de trabajo de Bradford. Se esperará 5 minutos y luego se leerá la absorbancia en un espectrofotómetro (Bauch & Lomb) a 600nm. Las lecturas obtenidas de la muestra patrón se graficarán para obtener una curva patrón y la cantidad de proteína de la muestra problema se determinará extrapolando las lecturas en la curva patrón o curva de calibración. 4.1.2.7. CARACTERIZACION ANTIGENICA La caracterización antigénica se realizará empleando el método de EITB según lo describió Tsang et al. 1989 (Tsang, Brand et al. 1989). El EITB tiene tres pasos, una primera etapa es la que separa las proteínas empleando electroforesis SDSPAGE. En una segunda etapa las proteínas separadas se transfieren a un papel de nitrocelulosa empleando electro transferencia. Finalmente, las proteínas se hacen evidentes mediante una reacción serológica que básicamente constituye el Western Blot. Para la electroforesis SDS-PAGE, los antigenos serán tratados con SDS 1%, Azul de bromo fenol 0,1% en Tris- HCL 0,01 M pH 8,0 y calentado a 65˚C por 15min o también con DTT (Dithiotreitol) 50mM y calentado a 65˚C por 15min. 4.1.3. TECNICA ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA BLOT 4.1.3.1. ELECTROFORESIS EN SDS – PAGE Se realizarán corridas electroforéticas del antígeno elaborado. Las proteínas se separarán por peso molecular electroforéticamente en un gel de gradiente de poliacralamida sodio duodecylsulfato (SDS - PAGE) usando Protean II Sistem (Biorad). La gradiente de arcrilamida será del 5% al 25%. Los antígenos serán incubados a 65°C por 20 minutos en tampón de muestra (0,1 SDS, 0,025% P/vol. Azul de bromofenol, 1% glicerol, y 0,0025 M tris-HCl pH 8.0). Los geles serán corridos a 5mA/gel para el gel de concentración y a 25 mA/gel para el gel de separación. Este paso se repetirá a diferentes concentraciones de antígeno (0,10 ug/ul, y 0,20 ug/l) para determinar la concentración óptima a utilizar. 4.1.3.2. ELECTROINMUNOTRANSFERENCIA. Después de la corrida electroforética los geles serán sumergidos en un Version 01 - 16 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA tampón de transferencia para Blot en un papel de nitrocelulosa, usando TransBlot Cell (Biorad). Los componentes proteicos del gel serán transferidos a un papel de nitrocelulosa (0,2 um) a 2 amperios durante 90 minutos. El antígeno E/S se transferirá a un papel de nitrocelulosa con las concentraciones antes descritas. La técnica se estandarizará haciendo primero, un “pool” de sueros positivos y otro de sueros negativos. En esta etapa de estandarización previa los papeles conteniendo los antígenos serán trabajados primero en uno de cinco pocillos por gel, dos para los marcadores de peso molecular (alto y bajo) y tres para cada una de las concentraciones de los antígenos. Posteriormente se trabajará corriendo el antígeno en un pocillo largo, que al cortarse en tiras luego de la transferencia permitirá evaluar los sueros individualmente. 4.1.3.3. WESTERN BLOT Los sueros controles se descongelarán y se diluirán a razón de 1:50 en tampón de leche (PBS - T20 0,3% -leche descremada Merck 5%). Para la incubación de los sueros se utilizarán bandejas con 8 canaletas (Accutan). Cada tira será colocada en una canaleta y a cada canaleta se le añadirá 500ul de suero diluido en tampón de leche y se le dejará incubar durante una noche a una temperatura de 20 ˚C en agitación constante. Las tiras serán lavadas por 5 veces durante 5 minutos cada vez con PBST20 0,3%. En seguida se añadirá 500ul de conjugado cabra anti perro Ig G (KPL) diluído 1:200 con PBS-T20 0,3%. Se dejará en incubación durante una hora a temperatura de 20 ˚C en agitación constante. Posteriormente se procederá a lavar las tiras 3 veces durante 5 minutos cada vez con PBS – T20 0,3% y 3 veces con PBS sólo. Luego se añadirá 500ul de solución sustrato DAB (3,3´- Diaminobenzidine tetrahydrochloride dihydrate) y se le dejará actuar durante 10 minutos. Por último la reacción se detendrá lavando las tiras con agua destilada. 4.1.4. ANALISIS DE RESULTADOS Las diferencias entre presencia o no de bandas antigénicas y tipo de suero se analizarán empleando una tabla de contingencia de 2x2. La sensibilidad, especificidad y valores predictivos positivo y negativo serán estimados con sus respectivos intervalos de confianza al 95%. La asociación entre las variables cualitativas (resultado de la prueba, grupo etáreo, sexo) serán analizadas mediante la prueba de Chi Cuadrado. Version 01 - 17 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 4.2. EVALUACION DE WB EN COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA – CERRO DE PASCO 4.2.1. LUGAR DE EJECUCION El trabajo de campo se realizará en 9 comunidades campesinas ubicadas en la Provincia Daniel Alcides Carrión (Yanahuanca): Tambochaca, Huarautambo, Astobamba, Uchumarca, Andachaca, 12 de Octubre, Santiago Pampa, Tambopampa y Ayayog. (sujeto a modificación de acuerdo a las conversaciones con las autoridades de estas y otras comunidades) 4.2.2. DISEÑO GENERAL Diseño epidemiológico longitudinal, en el cual se estimará la incidencia de equinococosis en dos muestreos consecutivos con un intervalo de 4 meses entre cada uno. Adicionalmente cada muestreo proveerá información sobre la prevalencia de equinococosis y factores de riesgo relacionados con la enfermedad. Previa reunión con las autoridades del lugar y los responsables de los respectivos Centros de Salud se conseguirá la autorización correspondiente y la divulgación para la campaña de dosificación de perros. Se ofrecerá la dosificación con bromhidrato de arecolina a todos los perros mayores de 3 meses de edad, con excepción de perros enfermos y perras preñadas. Se tomarán además muestras de sangre de los perros tratados. El suero obtenido de dichas muestras será posteriormente analizado mediante la prueba de Western Blot. 4.2.3. TAMAÑO MUESTRAL La equinococosis canina en la zona de estudio no ha sido reportada anteriormente, al menos oficialmente. Sin embargo estudios en áreas geográficas con características similares, tales como en Pachacayo y comunidades anexas de la SAIS Tupac Amaru se ha demostrado una prevalencia de 32% usando arecolina y 46% usando ELISA para detección de coproantígenos (Moro, Bonifacio et al. 1999). Igualmente en otro estudio realizado en la comunidad de Vichaycocha (Sierra de Lima) se encontró una prevalencia de 34% con bromhidrato de arecolina y mucho mayor (82%) mediante el uso de ELISA para la captura de coproantígeno (Lopera, Moro et al. 2003). Basado en esta información, el tamaño de muestra estimado es de 131 perros, calculado con la fórmula de estimación de proporciones, con un valor “p” referencial de 34%, nivel de confianza al 95% y error máximo de 7%, como se muestra en la fórmula Version 01 - 18 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA de abajo. La población canina de la zona de estudio está estimada en aproximadamente 500 perros, información proveniente de estudios preliminares pero aún no publicados por nuestro grupo de trabajo. n Z 2 p(1 p) d2 donde: Z 1.96 p 0.34 d 0.07 4.2.4. DOSIFICACIÓN CON BROMHIDRATO DE ARECOLINA La preparación del terreno de muestreo consistirá en extender un plástico que abarque el doble de la longitud corporal de los perros. Se registrarán los perros con un código numérico el cual será anotado en dos etiquetas autoadhesivas (identificación del perro y para la purga). Los datos que se tomarán son: propietario, nombre del perro, sexo, edad y lugar. La dosificación con bromhidrato de arecolina será de 3 a 4mg/Kg vía oral haciendo uso de una jeringa dosificadora de uso veterinario. El animal será sujetado a una estaca con una distancia de 10 cm. aproximadamente, y colocado sobre el plástico para facilitar la recolección de la muestra (purga). Se esperará 40 minutos y si no se produce la purga, se le redosificará con la mitad de su dosis y se esperará 20 minutos más (Eckert, Gemmell et al. 2002; Lopera, Moro et al. 2003). Se procederá a recolectar sólo la porción mucosa mediante cucharitas descartables. Esta se colocará en el envase destinado (depósito pequeño con tapa rosca) y será sellado adecuadamente. El código del perro será a su vez anotado en el frasco correspondiente. Todas las muestras serán guardadas con las medidas de seguridad del caso. Finalmente, se procederá a recoger el plástico y todo el material contaminante para quemarlo, incluyendo restos de heces que pudieran estar en el lugar. 4.2.5. EVALUACIÓN DE LA PURGA Y CONTEO DE ECHINOCOCCUS GRANULOSUS. Los envases conteniendo la porción mucosa de la purga de los perros se abrirá con cuidado, registrando adecuadamente el código de identificación del animal. Se agregará 10cc de lejía al 10% en una solución al 20% v/v. El contenido de la purga será luego vertido en un frasco de vidrio (250ml) cerrado con una tapa acondicionada con una malla de 80 hilos por pulgada. Se agitará el frasco con la tapa orientada hacia el desagüe del lavadero. Se resuspenderá el contenido del frasco con agua corriente y se volverá a agitar (se realizará esta operación las veces que sea necesario hasta que la muestra quede limpia). El contenido del frasco será vertido en una bandeja de vidrio la Version 01 - 19 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA cual será colocada en una base de fondo oscuro para poder visualizar el parásito por simple contraste. Cuando se visualice poca cantidad de parásitos, éstos serán contados individualmente. Cuando se visualice una gran cantidad de parásitos, se procederá a agitar la bandeja de tal modo que se distribuya lo más uniformemente posible los parásitos; de esta manera se procederá a contar un cuadrante y luego multiplicar esta cantidad por 4. Al finalizar cada evaluación de la muestra, se eliminará el contenido de la bandeja en el lavadero. Los envases serán autoclavados y finalmente se realizará la limpieza del ambiente con lejía 10% en una solución al 20% v/v. El diagnóstico de la purga finalmente será expresado en dos formas: 1) negativo/positivo, y 2) número total de gusanos encontrados. 4.2.6. MUESTRA DE SANGRE DE LOS PERROS DE YANAHUANCA. Los perros serán muestreados (sangre) mediante punción en la vena cefálica del brazo usando el sistema Vacutainer. El código de cada perro será registrado además de la fecha y el sexo. Las muestras serán centrifugadas y los sueros almacenados a -20°C hasta su uso. Las muestras serán analizadas mediante WB, usando la técnica previamente descrita en la sección 4.1.3.3 (Western Blot). El diagnóstico para el WB será presentado como negativo/positivo junto con las bandas que hubieren reaccionado a la prueba. 4.2.7. ANÁLISIS DE DATOS: El total de perros trabajados en cada muestreo así como la distribución de sexo, edad y lugar de procedencia serán resumidos mediante tablas de frecuencia. La prevalencia será estimada con su respectivo Intervalo de Confianza al 95% usando los dos métodos diagnósticos (arecolina y WB). Se presentarán los datos estratificados de acuerdo a edad, sexo y lugar de procedencia. Adicionalmente se evaluará el número de parásitos presentes así como las bandas de mayor presentación en este grupo de animales. La tasa de incidencia se estimará entre cada período de muestreo para los dos métodos de diagnóstico. Igualmente los datos de incidencia se presentarán en forma agregada y desagregada por edad, sexo y lugar de procedencia. El riesgo relativo (RR) para las diferentes edades o categorías de edad, así como para sexo y lugar será estimado tomando la Incidencia de menor valor como el nivel basal o de referencia para las variables antes mencionadas. Tanto los resultados positivos como negativos a Version 01 - 20 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA ambas pruebas diagnósticas serán comparados entre sí usando una tabla de contingencia de 2x2. La concordancia será estimada mediante el Indice de Kappa y la significancia estadística mediante la prueba de McNemar. Los intervalos de confianza para la tasa de incidencia y RR serán calculados al 95%. Toda la información será colectada en cuadernos de campo y cuadernos de laboratorio. Posteriormente los datos serán transcritos a una base previamente diseñada en Excel. Una vez ingresados los datos, se realizará un control de calidad de los mismos, verificando en forma aleatoria el 20% de ellos comparando los datos ingresados con los datos existentes en los cuadernos de campo y/o laboratorio. Finalmente los datos serán analizados usando el paquete estadístico Stata 9.2. Version 01 - 21 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 5. ORGANIZACIÓN Y RESPONSABILIDADES Participante Responsabilidad Ing. Elsa Nora de la Coordinará las actividades de campo en las comunidades Torre Tapia y Dra. campesinas. Será responsable de la entrega de resultados en las Rosario Romero respectivas comunidades a través de sus Centros de Salud locales. (DIRESA-Pasco) Se encargará de difundir la información necesaria respecto a la enfermedad en estudio. Además será responsable del dinero que ha sido presupuestado para la DIRESA Pasco y de la preparación de los informes respectivos, tanto económicos como técnicos ante el INS. Dr. César Gavidia Controlará y monitoreará el buen desenvolvimiento de las actividades Chucán (FMV- relacionadas con el proyecto en general, particularmente el UNMSM) cumplimiento calendarizado de los fondos así como también de los informes respectivos. Es el responsable del buen manejo y desenvolvimiento del proyecto en las sedes de Lima, así como la coordinación permanente con DIRESA-Pasco a través de la Ing. Elsa Torre. Se encargará de organizar las infecciones experimentales en la FMV-UNMSM. Será el encargado de realizar los gastos indicados en el presupuesto, previa coordinación con la contraparte, de rendir los informes técnicos y económicos según el calendario. Dr. Armando El Dr. González colaborará y asistirá en la elaboración de la base de González Zariquiey datos, así como en el análisis estadístico de los mismos. (FMV-UNMSM) Dr. Eduardo Barrón El Dr. Barrón será el encargado de obtener y procesar los quistes (FMV-UNMSM) hidáticos necesarios para la infección experimental de perros. Será la persona responsable del manejo de dichos perros y de la dosificación de los canes a nivel de las comunidades campesinas. Dra. Berenice La Dra. Ninaquispe será la encargada de tomar las muestras de Ninaquispe (FMV- sangre de los perros, identificarlas y procesarlas para obtener el suero UNMSM) correspondiente. Blga. Carmen La Blga. Calderón será la persona encargada de estandarizar el Calderón Sánchez Western Blot y de hacer el análisis de todos los sueros de perros (FMV-UNMSM) posteriormente. Version 01 - 22 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA Dr. Luis Estares El Dr. Estares, colaborará en los trabajos de campo, tanto en la (DESA Pasco, Higiene recolección y procesamiento de los quistes como los muestreos de Alimentaria y caninos en las comunidades campesinas. Será el responsable de las Zoonosis) coordinaciones para el buen desarrollo de las tareas en campo. 6. ASPECTOS ÉTICOS - PARTICIPACIÓN DE SERES HUMANOS. El estudio NO involucra la participación de seres humanos. 7. PROCESO DEL CONSENTIMIENTO INFORMADO El estudio no requiere de consentimiento informado 8. CONSECUENCIAS DE LA PARTICIPACIÓN EN EL ESTUDIO Beneficios. Al final del estudio habremos contribuido en dos aspectos respecto a la transmisión del Echinococcus granulosus. Primero, el Western Blot podria ser usado como una herramienta de diagnóstico en perros y permitiría la planificación de dosificaciones en futuros programas de control. Además el WB ayudaría en el monitoreo de programas de control tanto en zonas endémicas como zonas que podrían ir quedando aparentemente libres de esta parasitosis. En segundo lugar, las tres dosificaciones con bromhidrato de arecolina estarían contribuyendo en algo a disminuir la carga parasitaria en las comunidades elegidas. Daños potenciales. En cuanto a la estandarización, los perros infectados experimentalmente serán manipulados con las medidas de seguridad biológica correspondiente y por personal con experiencia y previamente entrenado en esta labor. Respecto a las tareas en campo, se tendrá igualmente la protección para los manipuladores para evitar la infección con huevos del parásito y se recomendará a la gente mantener los perros tratados fuera de las casas por al menos 24 horas. Adicionalmente todo perro tratado recibe a manera de enjuague, una solución de lejía 10% en la zona perianal antes de ser regresado a su dueño. En cada campaña de dosificación se hará énfasis en que los perros deben ser conducidos por personas Version 01 - 23 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA mayores y no por niños o menores de edad. Esto facilitará las instrucciones sobre el adecuado manejo de los perros tratados con arecolina. 9. CONFIDENCIALIDAD DE LA INFORMACIÓN OBTENIDA Aunque el proyecto no cotempla el trabajo directo con personas, los datos obtenidos en los muestreos de perros serán mantenidos únicamente en las oficinas de los Investigadores Principales (FMV-UNMSM y DIRESA-Pasco). Las únicas personas con acceso a la base de datos serán los Investigadores Principales u otro personal con previa autorización de ambos responsables. Los resultados de los perros serán entregados a los dueños de los mismos en sobre cerrado; si la entrega no se hace personalmente, los sobres serán dejados en los Centros de Salud de cada comunidad para que puedan ser recogidos, previa firma de un listado. Finalizado el proyecto y el análisis de los datos, toda la información será grabada en un CD y archivada bajo responsabilidad de los Investigadores Principales. 10. INFORME DE RESULTADOS DE LAS PRUEBAS A LOS PARTICIPANTES ¿Se informará a los participantes los resultados de las pruebas (exámenes)? Sí (a los dueños de los perros que hayan intervenido en las campañas de dosificación y muestreo). La entrega de resultados será en sobre cerrado con un listado de aquellos que participaron en la campaña. ¿Será la información de este estudio accesible públicamente al final del mismo? Sí. Al final del proyecto se emitirá un informe al INS-VIGIA de acuerdo con lo indicado en las bases del concurso. Adicionalmente el Investigador Responsable por parte de la Facultad de Medicina Veterinaria-UNMSM (Dr. César Gavidia Chucán) escribirá un artículo científico para ser publicado en una revista indexada internacionalmente, indicando los agradecimientos tal como indican las bases del concurso y en coordinación con la Ing. Elsa Torre del DIRESA-Pasco. Version 01 - 24 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 11. CRONOGRAMA DE ACTIVIDADES ACTIVIDAD 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 Contacto con las comunidades campesinas x Infección experimental de perros x x x x Obtención de muestras controles positivos y negativos x x x x Adquisición de material de laboratorio y campo x x x x x x x Estandarización del Western Blot x x Primer muestreo de perros x Implementación de base de datos x x x x x x Segundo muestreo de perros Procesamiento de muestras x x x x x x Informe final Version 01 - 25 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva x 11/13/2015 ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 12. PRESUPUESTO Rubro Medida Costo Unitario Cant. Costo total Programación mensual 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 MATERIAL DE CAPACITACION E IMPLEMENTACION. DE BASE DE DATOS (DIRESA PASCO) Equipo de Computo CPU, Monitor Teclado e Impresora Un equipo multimedia 01 Cámara fotográfica digital Material Educativo (Trípticos) Subtotal 2850.00 3500.00 400.00 1.00 01 01 01 1000 2850.00 X 3500.00 400.00 X 1000.00 x 7750.00 1.00 100.00 5.00 1000 15 30 1000.00 1500.00 150.00 2650.00 Gasolina 90 Octanos (DIRESA PASCO) Refrigerios para personal (ambas instituciones) Viáticos para desplazamiento del personal de Lima/Pasco/Lima (ambas inst.) 13.50 10.00 110.00 100 100 40 1350.00 x 1000.00 x 4400.00 x x x x Frascos de plástico c/tapa rosca 100 ml. Pago de terceros (ambas instituciones) Subtotal 1.20 500.00 500 4 600.00 2000.00 9350.00 X X 76.00 11.5 97.00 664.00 20 3 1 1 x x X MATERIAL DE CAMPO (ambas instituciones) Guantes descartables Guardapolvos, Gorros y botas Alcohol Subtotal X X X REQUERIMIENTOS PARA TRASLADO AL CAMPO, MOVILIDADES Y CONTACTO CON COMUNIDADES CAMPESINAS x x x MATERIAL DE LABORATORIO Y MANTENIMIENTO DE PERROS INFECTADOS (FMV-UNMSM) Alimento para perros Crepe indicator tape for autoclaving Methanol 8210 N95 Respirator, 3M (mascarillas) Version 01 - 26 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 1 1000ml 8pk 11/13/2015 x x 1520.00 x X 34.50 X 97.00 664.00 X x x x x X X X ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA Supor*Membrane Disc Filters pore size 0,2. Pall Gelman Supor*Membrane Disc Filters pore size 0,45. Pall Gelman Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml yellow Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml Green Eppendorf Disposable Microcentrifuge Tubes 1,5 ml Red Round Microcapillary and gel loading tips 0,5-200ul rack/200 Tips Superior Nitrocellulose Membranes BA83 Gel blot paper D(+) Glucosa Pyruvic acid sodium salt 99% Sodium bicarbonate Trypan Blue Solution (0,4%) Prestained SDS-PAGE Standars SDS DAB DTT Temed Ammonium persulfate Tris Ultra Pure Siliconized/low retention microcentrifuge tubes 1,5 Disposable plastic cuvets-semi micronpolystyrene Silver stain plus. Kit Acrylamide 99,9% Biorad Protein Assay Boric Acid Bis acrylamide Anti dog Ig G (H+L) BSA Filter millex syringe 0,22 um Millipore blue Pipet Tips (101 - 1000 ul blue) Pipet Tips (10 - 200 ul yellow) Ultra microtips (0,1 - 10 ul) Tubes centrifuge polypropylene (50ml) Tubes centrifuge polypropylene (15ml) MDBK_MM L-Glutamine 200 mM Pefablot SC Version 01 - 27 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 100 100 500 500 500 4rack 1 roll 100 1 kg. 25g 500g 100ml 500ul 100 g 25g 5g 5 ml 10 g 1kg 250 500 1 1kg 450 ml 500g 50g 0,5 mg 50g 50 100 100 96 500 500 1000ml 100ml. 1g 421.50 412.50 100.00 100.00 100.00 395.00 1232.50 125.00 174.00 117.50 100.00 59.50 430.00 130.00 637.50 285.00 70.00 60.00 318.00 92.50 403.50 660.00 925.00 370.00 110.00 155.00 570.00 707.50 465.00 25.00 20.00 50.00 547.50 437.50 192.00 57.00 2910.00 11/13/2015 2 2 2 2 2 1 1 3 2 2 2 2 1 2 1 2 3 2 2 3 1 1 1 1 2 2 4 1 1 5 5 10 1 2 5 4 1 843.00 825.00 200.00 200.00 200.00 395.00 1232.50 375.00 348.00 235.00 200.00 119.00 430.00 260.00 637.50 570.00 210.00 120.00 636.00 277.50 403.50 660.00 925.00 370.00 220.00 310.00 2280.00 707.50 465.00 125.00 100.00 500.00 547.50 875.00 960.00 228.00 2910.00 X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X X ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA Leupeptin Pepstatin Sodium hypochlorite Microtube 0.2 ml Reusable Filter Holder Serological pipets BD falcon No. 7551 Bags, Autoclave/Bioharzad large 19''x23'' orange Bags, Autoclave/Bioharzad large 25''x35'' orange Parafilm m roll size 4'' x 125' PBS tablets Ultrafiltration membrane Filter Discs Amikon Brand Bottles and Caps 250 ml Brand Bottles and Caps 1000 ml Square Dishes with Grid Subtotal 5mg 5mg 500ml 500 1ea 200 200ea 200ea 1ea 100 tb 1 10ea 10ea 500ea 227.50 157.50 108.00 318.00 669.00 209.00 250.00 450.00 58.50 187.50 720.00 441.50 717.00 1138.50 TOTAL Version 01 - 28 DIRESA-PASCO y UNMSM-FMV-Laboratorio de Medicina Veterinaria Preventiva 2 2 1 2 1 1 1 1 3 4 1 1 1 1 455.00 X 315.00 X 108.00 X 636.00 669.00 209.00 250.00 450.00 175.50 X 750.00 X 720.00 X 441.50 X 717.00 X 1138.50 X 30250.00 50,000 11/13/2015 X X X X X ESTANDARIZACIÓN DE UN MÉTODO INMUNODIAGNÓSTICO PARA LA INFECCIÓN POR ECHINOCOCCUS GRANULOSUS EN PERROS Y SU UTILIDAD EN LAS COMUNIDADES CAMPESINAS DE YANAHUANCA 13. 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