RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA

UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
Grupo de Investigación enotecUPM
Utilización de bloqueadores metabólicos y optimización de las
condiciones de aplicación para la reducción del grado alcohólico
en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas.
TESIS DOCTORAL
PRESENTA
RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA
DIRECTOR
ANTONIO MORATA BARRADO
Madrid, 2013
ii
UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID
ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS AGRÓNOMOS
DEPARTAMENTO DE TECNOLOGÍA DE ALIMENTOS
ANTONIO MORATA BARRADO, Profesor Titular de la Escuela Técnica Superior
de Ingenieros Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid.
CERTIFICA:
Que el presente trabajo de investigación titulado “Utilización de bloqueadores
metabólicos y optimización de las condiciones de aplicación para la reducción del
grado alcohólico en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas”,
que constituye la Tesis presentada por D. RICARDO DAVID VEJARANO
MANTILLA para optar al Grado de Doctor en Ciencia, Tecnología e Ingeniería de
Alimentos, ha sido desarrollado bajo mi dirección en el Departamento de Tecnología de
Alimentos de la E.T.S.I. Agrónomos de la Universidad Politécnica de Madrid.
Madrid, a 06 de Noviembre del 2013
Fdo.: ANTONIO MORATA BARRADO
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DECLARACIÓN JURADA
Declaro por la presente que la Tesis Doctoral titulada “Utilización de bloqueadores
metabólicos y optimización de las condiciones de aplicación para la reducción del
grado alcohólico en vinos elaborados a partir de uva procedente de zonas cálidas”,
presentada para optar al Grado de Doctor en Ciencia, Tecnología e Ingeniería de
Alimentos:
-
Ha sido elaborada completamente por mi persona, sin ninguna ayuda inadmisible
y sin el uso de otras fuentes que no sean aquellas mencionadas en las referencias
bibliográficas.
-
Que todas las personas e instituciones de las cuales he recibido colaboración
directa o indirecta en el desarrollo de la presente Tesis Doctoral, han sido
debidamente agradecidas y mencionadas.
-
Que la presente Tesis Doctoral no ha sido, ni de forma parcial ni en su totalidad,
sometida a ningún tipo de evaluación para obtener Título académico alguno, en
ninguna otra institución que no sea la Universidad Politécnica de Madrid.
Madrid, a 06 de Noviembre del 2013
Fdo.: RICARDO DAVID VEJARANO MANTILLA
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RESUMEN
El presente trabajo de Tesis describe la posibilidad de modular la fermentación
alcohólica utilizando bloqueadores metabólicos como furfural, o-vainillina, ácido
cinámico, glicolaldehído, p-benzoquinona y cobre; para controlar la producción de
etanol. El redireccionamiento de la ruta glicolítica en Saccharomyces cerevisiae
favorece el descenso del grado alcohólico gracias al aumento de la producción de
metabolitos secundarios de interés enológico. La primera parte de la Tesis presenta una
revisión bibliográfica sobre estudios previos en los que se ha evaluado el efecto de los
diferentes bloqueadores metabólicos en la producción de etanol durante la fermentación
alcohólica. La segunda parte muestra los resultados experimentales de producción de
etanol obtenidos con los bloqueadores metabólicos, observándose una amplia
variabilidad en su efecto en función de la naturaleza química de cada bloqueador y de la
naturaleza del medio fermentativo utilizado. Finalmente, la tercera parte del trabajo
muestra el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos y
la producción de metabolitos secundarios, observándose un importante efecto en la
producción de glicerina y en algunos de los compuestos volátiles fermentativos. La
principal aplicación de esta tecnología basada en la utilización de bloqueadores
metabólicos sería la elaboración de vinos con una menor graduación alcohólica a partir
de uva procedente de zonas cálidas.
PALABRAS CLAVE: Bloqueadores metabólicos, inhibidores metabólicos, vinos con
bajo grado alcohólico.
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SUMMARY
This thesis describes the possibility of modulating the alcoholic fermentation using
metabolic blockers such as furfural, o-vanillin, cinnamic acid, glycolaldehyde, pbenzoquinone and copper. The controlled production of ethanol by redirecting of the
glycolytic pathway in Saccharomyces cerevisiae, is achieved through diverting some of
the carbohydrates away from alcohol production into the formation of glycolytic
intermediates of interest to the winemaking industry. The first part of this work shows a
literature review on previous studies about the effect of different metabolic blockers in
order to reduce the ethanol production during alcoholic fermentation. The second part
deals about the experimental results of ethanol production obtained with the metabolic
blockers, showing a wide variation in the inhibitory effect depending on the chemical
nature of each blocker and the nature of the fermentation medium used. Finally, the third
part discussed about the effect of the metabolic blockers on colorimetric parameters and
production of secondary metabolites, showing a significant effect on the production of
glycerol and in some of the volatile fermentative compounds. The main application of
this technology based on the use of metabolic blockers could lie in the preparation of
reduced-alcohol wines from grapes grown in hot climate regions.
KEY WORDS: Metabolic blockers, metabolic inhibitors, reduced-alcohol wines, lowalcohol wines.
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PUBLICACIONES
Artículos en revistas SCI
-
Vejarano, R.; Morata, A.; Loira, I.; González, M.C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013).
Theoretical considerations about usage of metabolic inhibitors as possible
alternative to reduce alcohol content of wines from hot areas. European Food
Research and Technology, 237(3): 281-290.
-
Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Ricardo-da-Silva, J.M.; Laureano, O.; González,
M.C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Effect of Saccharomyces strains on the quality of
red wines aged on lees. Food Chemistry, 139: 1044–1051.
-
Morata, A.; Vejarano, R.; Ridolfi, G.; Benito, S.; Palomero, F.; Uthurry, C.;
Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Reduction of 4-ethylphenol
production in red wines using HCDC+ yeasts and cinnamyl esterases. Enzyme and
Microbial Technology, 52(2): 99-104.
-
Ábalos, D.; Vejarano, R.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). The
use of furfural as a metabolic inhibitor for reducing the alcohol content of model
wines. European Food Research and Technology, 232: 663 – 669.
Congresos internacionales
-
Morata, A.; Vejarano, R.; Benito, S.; Palomero, F.; González, C.; Tesfaye, W.;
Uthurry, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Reduction of 4-ethylphenol contents in red
wines using HCDC yeasts and cinnamyl esterases. XXXVI World Congress of Vine
and Wine (OIV). 2nd–7th June. Bucharest, Romania. ISBN 979-10-91799-16-4.
POSTER.
-
Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Cuerda, R.; González, C.; Calderón, F.; SuárezLepe, J.A. (2013). Industrial scale application of the ageing-on-lees technique to
improve the sensory quality of red wine. XXXVI World Congress of Vine and Wine
(OIV). 2nd–7th June. Bucharest, Romania. ISBN 979-10-91799-16-4. POSTER.
ix
-
Loira, I.; Vejarano, R.; Morata, A.; Cuerda, R.; Awad, A.; González, C.; SuárezLepe, J.A. (2012). Effect of Saccharomyces strain on the quality of red wines aged
on lees. XXXV World Congress of Vine and Wine (OIV). 18–22th June. Izmir,
Turkey. ISBN 979-10-91799-00-3. POSTER.
-
Vejarano, R.; Loira, I.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2012). Use
of metabolic blockers and non-Saccharomyces yeasts in sequential fermentation to
reduce the alcohol content of wine. XXXV World Congress of Vine and Wine (OIV).
18–22th June. Izmir, Turkey. ISBN 979-10-91799-00-3. COMUNICATION.
-
Vejarano, R.; Morata, A.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). Furfural as a
metabolic inhibitor for reducing the alcohol content of wines. XXXIV World
Congress of Vine and Wine (OIV). 20–27th June. Porto, Portugal. ISBN 978-989-202449-3. POSTER.
Congresos nacionales
-
Morata, A.; Tesfaye, W.; Uthurry, C.; González, C.; Calderón, F.; Palomero, F.;
Benito, S.; Loira, I; Vejarano, R.; Suárez-Lepe, J.A. (2013). Empleo de noSaccharomyces para incrementar la formación de pigmentos piranoantociánicos
durante la fermentación. XII Congreso Nacional de Investigación Enológica
(GIENOL). 18-21 Junio. Madrid, España. PÓSTER.
-
Loira, I; Vejarano, R.; Morata, A.; Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A.
(2011). Control de grado alcohólico en zonas cálidas mediante el empleo de
levaduras seleccionadas con ineficiencia glicolítica y bloqueadores metabólicos. XI
Congreso Nacional de Investigación Enológica (GIENOL). 01-03 Junio. Jerez de la
Frontera, España. POSTER.
-
Vejarano, R.; Morata, A.; Tesfaye, W.; González, C.; Suárez-Lepe, J.A. (2011). El
furfural como inhibidor metabólico para reducir el grado alcohólico en vinos.
Reunión anual de Grupos de Trabajo en Viticultura y Enología (GTVE). España.
COMUNICACIÓN.
x
El presente trabajo de Tesis se ha desarrollado en el marco del Proyecto de
Investigación:
“Técnicas vitícolas y enológicas para la regulación del equilibrio
alcohol/acidez y protección del color en vinos tintos”
Proyecto AGL-2008-05603-C02-01/AGR.
Ministerio de Ciencia e Innovación de España (MICINN).
I.P. José Antonio Suárez-Lepe.
En el desarrollo de la primera parte de la Tesis, el doctorando ha contado con una beca
predoctoral obtenida en virtud del Convenio de colaboración entre la Universidad
Politécnica de Madrid y la Fundación del Banco Santander, para el periodo comprendido
entre el 01 de mayo y el 31 de diciembre del 2010.
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AGRADECIMIENTOS
Una Tesis Doctoral requiere mucha dedicación, perseverancia y paciencia con los
resultados. El investigar implica tener una mente siempre abierta ante las posibilidades
que nos ofrece la realidad, a despertar dudas de si lo hasta ahora conocido es lo
definitivo o hay algo más por descubrir. Es por ello que el desarrollar esta Tesis me ha
permitido aprender muchas cosas que posiblemente no lo hubiese hecho en otras
circunstancias, tanto a nivel académico como personal.
En el Departamento de Tecnología de Alimentos me dieron la oportunidad de formar
parte del Grupo de Investigación en Enología, Enotecnia y Biotecnología Enológica
(enotecUPM). Por ello debo expresar mi eterna gratitud a los dos profesores que me
dieron esa oportunidad, al Director del Grupo de Investigación, el profesor José Antonio
Suárez-Lepe, y a mi Director de Tesis, el profesor Antonio Morata Barrado.
Expreso también mi gratitud a los profesores Fernando Calderón, María del Carmen
González, María Jesús Callejo, Guillermo Rodríguez, Santiago Benito, Felipe Palomero,
José Antonio Muñoz, y mención especial para los profesores Wendu Tesfaye y Carlos
Uthurry, con quienes a diario comparto diversos temas de conversación, además de
anécdotas y bromas que nos arrancan de vez en cuando una carcajada.
Debo expresar algo más que gratitud por todos los momentos compartidos, por esa
amistad, por todo lo que me han enseñado y ayudado. Mi gratitud a mis compañeras, Iris
Loira y Susana Somolinos, con quienes he aprendido mucho sobre enología, gracias
chicas.
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Al personal laboral del Departamento, a Belén Cifuentes, Juan Antonio Sánchez, José
Antonio Navarro, Francisco Manzano, Ana Sáez; porque siempre han mostrado
predisposición cuando he necesitado su valioso apoyo.
Igualmente agradezco la amistad compartida con muchos becarios que han pasado por el
Departamento, a Isabel, Ignacio Antón (Nacho), Diego Ábalos, Cristina, Pietro,
Giovanni, Paolo, Isik, Noam, Lan Liu.
Agradezco también a Bodegas y Viñedos Comenge S.A. (Curiel del Duero, España) y a
Lallemand España, por la colaboración que siempre han brindado al Grupo de
Investigación en el desarrollo de los diferentes trabajos de investigación.
A todos, gracias.
xiv
DEDICATORIA
A mi familia en Perú, que a pesar de no tenerles junto a mí, siempre me
han brindado ese ánimo y ese cariño que me dan fuerzas para seguir
adelante.
A mi madre Salomé Mantilla y mi abuela Justa Sánchez, mis viejitas.
Porque a ustedes les debo todo en la vida.
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xvi
PREÁMBULO
Es bien conocida la problemática asociada al aumento de las temperaturas en diferentes
regiones del mundo, especialmente en las cuales se producen cultivos destinados a la
alimentación humana, sean para uso directo o para elaborar otros alimentos como es el
caso del vino. Ello ha dado lugar a que la comunidad científica busque alternativas que
permitan paliar los efectos del aumento de las temperaturas, más aún acentuado por el
cambio climático. Es en dicho contexto que se ha desarrollado la presente Tesis
Doctoral, con el propósito de evaluar una alternativa mediante la cual, utilizando
diferentes sustancias como bloqueadores metabólicos de la fermentación alcohólica, se
pueda reducir el grado alcohólico de los vinos, especialmente los elaborados a partir de
uva procedente de zonas cálidas, en las cuales la alta producción y acumulación de
azúcares durante la maduración dan lugar a un contenido alcohólico alto y desequilibrios
en la relación alcohol/acidez, conduciendo a vinos sin una adecuada estabilidad
fisicoquímica y poco agradables desde el punto de vista sensorial. Además del hecho de
que cada vez aumenta la demanda por vinos con menor grado alcohólico por parte de los
consumidores.
El trabajo se ha realizado de manera experimental, estudiando en primer lugar el efecto
de diferentes bloqueadores metabólicos como el furfural, o-vainillina, ácido transcinámico, glicolaldehído, p-benzoquinona y cobre, sobre la producción de etanol por
Saccharomyces cerevisiae, en diferentes medios fermentativos y diferentes condiciones
de fermentación, condiciones que se han reproducido en base a los diferentes parámetros
tecnológicos propios de la elaboración del vino, obteniéndose resultados con una amplia
variabilidad determinada por la naturaleza química de cada bloqueador utilizado. De
xvii
todas estas sustancias, la bibliografía reporta que únicamente el cobre ha sido evaluado
en estudios previos de fermentaciones con mostos, mientras que para los otros
bloqueadores metabólicos, no se tiene constancia que hayan sido estudiados en el
contexto de la elaboración de vinos, lo cual conlleva a este trabajo de investigación a
abrir nuevas perspectivas en la búsqueda de alternativas que permitan controlar el grado
alcohólico en zonas cálidas.
La otra parte experimental de la Tesis recoge los resultados del efecto de los
bloqueadores metabólicos sobre las repercusiones de su utilización en la producción de
metabolitos que por su naturaleza constituyen una importante fracción en la
composición del vino y en sus características organolépticas, como son la glicerina y los
compuestos volátiles de origen fermentativo como acetaldehído, ésteres, alcoholes y
cetonas; además de presentar los resultados del efecto de los bloqueadores metabólicos
sobre los parámetros colorimétricos en vinos tintos.
xviii
ÍNDICE GENERAL
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN ..................................................................................................1
I.1. LAS ALTAS TEMPERATURAS Y SUS EFECTOS EN EL CULTIVO DE LA VID ................................3
I.1.1. El cambio climático ............................................................................................................3
I.1.2. Efecto de las altas temperaturas sobre la composición de la uva ......................................5
I.1.3. Efectos sobre el pH y estabilidad del vino..........................................................................6
I.1.4. El etanol y su influencia en el perfil aromático del vino ....................................................7
I.2. TÉCNICAS APLICADAS PARA REDUCIR EL GRADO ALCOHÓLICO EN EL VINO ........................9
I.2.1. Etapa prefermentativa: a nivel de mosto ..........................................................................11
I.2.2. Etapa postfermentativa: a nivel de vino elaborado ..........................................................12
I.2.3. Etapa de fermentación alcohólica ....................................................................................12
I.3. BLOQUEADORES METABÓLICOS PARA REDUCIR LA PRODUCCIÓN DE ETANOL DURANTE LA
FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA EN VINOS ..................................................................................... 18
I.3.1. Compuestos furánicos .....................................................................................................19
I.3.1.1. Furfural .....................................................................................................................20
I.3.1.2. Efecto inhibitorio del furfural ...................................................................................21
I.3.2. Compuestos vainíllicos ....................................................................................................27
I.3.2.1. Efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos ......................................................27
I.3.2.2. Efecto inhibitorio de la vainillina y o-vainillina .......................................................30
I.3.3. Glicolaldehído..................................................................................................................33
I.3.3.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído.........................................................................34
I.3.4. Quinonas..........................................................................................................................37
I.3.4.1. Efecto inhibitorio de las quinonas .............................................................................38
I.3.5. Ácido cinámico ................................................................................................................41
I.3.5.1. Efecto inhibitorio del ácido cinámico .......................................................................42
I.3.6. Otros ácidos orgánicos ....................................................................................................47
I.3.6.1. Efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos ................................................................47
I.3.7. Metales .............................................................................................................................49
I.3.7.1. El cobre .....................................................................................................................49
I.3.7.2. Efecto inhibitorio del cobre.......................................................................................50
CAPÍTULO II: OBJETIVOS ........................................................................................................55
II.1. OBJETIVO GENERAL.................................................................................................................57
II.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ..........................................................................................................57
xix
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS .........................................................................59
III.1. CEPAS DE LEVADURAS UTILIZADAS ....................................................................................61
III.2. MEDIOS DE FERMENTACIÓN ................................................................................................61
III.3. BLOQUEADORES METABÓLICOS UTILIZADOS ....................................................................62
III.4. FERMENTACIONES ...............................................................................................................62
III.5. ANÁLISIS REALIZADOS TRAS LAS FERMENTACIONES ........................................................64
III.5.1. Determinación del grado alcohólico .............................................................................64
III.5.2. Determinación de azúcares residuales y glicerina ........................................................64
III.5.3. Parámetros colorimétricos ............................................................................................65
III.5.4. Determinación de la acidez volátil ................................................................................65
III.5.5. Análisis de compuestos volátiles de origen fermentativo ..............................................66
III.5.6. Análisis de los bloqueadores metabólicos y sus derivados tras las fermentaciones......67
III.6. ANÁLISIS ESTADÍSTICO ........................................................................................................68
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN .......................................................................69
IV.1. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS SOBRE EL GRADO ALCOHÓLICO ..........70
IV.1.1. Efecto inhibitorio del furfural ......................................................................................71
IV.1.1.1. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético
con 12,5 % de GAP ...............................................................................................................71
IV.1.1.2. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de furfural sobre diferentes cepas de
Saccharomyces cerevisiae en un medio sintético con alto contenido de azúcar ...................73
IV.1.1.3. Efecto inhibitorio del furfural sobre diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae
y evaluación del momento óptimo de adición en un medio sintético con alto contenido de
azúcar ....................................................................................................................................81
IV.1.1.4. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto inhibitorio del furfural en un
medio sintético con altas concentraciones de azúcar ............................................................83
IV.1.1.5. Efecto inhibitorio de altas dosis iniciales de furfural y conversión en alcohol
furfurílico en un medio sintético ...........................................................................................85
IV.1.1.6. Efecto inhibitorio de altas concentraciones de furfural dosificadas en fase de
crecimiento exponencial y conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético ............90
IV.1.1.7. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de
mosto concentrado.................................................................................................................95
IV.1.2. Efecto inhibitorio de la o-vainillina .............................................................................99
IV.1.2.1. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético
con alto contenido de azúcares ............................................................................................ 100
IV.1.2.2. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio
de las fermentaciones en un medio sintético ....................................................................... 102
IV.1.2.3. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural dosificados al inicio
de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con alto contenido de
azúcares ............................................................................................................................... 104
IV.1.2.4. Conversión enzimática de la o-vainillina y el furfural en sus respectivos derivados
por la levadura Saccharomyces cerevisiae a diferentes momentos de dosificación en mosto
tinto ..................................................................................................................................... 108
IV.1.2.4.1. Dosificaciones al inicio de las fermentaciones ............................................. 110
IV.1.2.4.2. Dosificaciones al finalizar la fase de crecimiento exponencial .................... 111
xx
IV.1.3. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico............................................................... 115
IV.1.3.1. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico en mosto tinto con diferentes
concentraciones de azúcar y análisis del estireno producido .............................................. 116
IV.1.3.2. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico a diferentes concentraciones de azúcar
en un medio a base de mosto concentrado .......................................................................... 120
IV.1.4. Efecto inhibitorio del glicolaldehído .......................................................................... 131
IV.1.4.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en un medio a base de mosto concentrado con
alto contenido de azúcar ...................................................................................................... 131
IV.1.4.2. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 % de grado
alcohólico probable ............................................................................................................. 134
IV.1.4.3. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de grado alcohólico
probable ............................................................................................................................... 136
IV.1.5. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona.................................................................... 139
IV.1.5.1. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en medios a base de mosto concentrado
con diferentes concentraciones de azúcar............................................................................ 139
IV.1.5.2. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en mosto tinto con 14,3 % de grado
alcohólico probable ............................................................................................................. 142
IV.1.6. Efecto inhibitorio del cobre ........................................................................................ 145
IV.1.6.1. Efecto inhibitorio del cobre en un medio sintético con diferentes concentraciones
de azúcar.............................................................................................................................. 146
IV.1.6.2. Efecto inhibitorio del cobre y efecto sinérgico en combinaciones con furfural en
medios a base de mosto concentrado .................................................................................. 149
IV.1.6.3. Efecto inhibitorio del cobre en mosto tinto con 14,3 % de grado alcohólico
probable ............................................................................................................................... 153
IV.2. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS EN LOS PARÁMETROS COLORIMÉTRICOS
Y EN LA PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS EN VINIFICACIONES EN TINTO ......... 157
IV.2.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros colorimétricos en vino tinto
................................................................................................................................................. 157
IV.2.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de glicerina en vino tinto
................................................................................................................................................. 163
IV.2.3. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles
fermentativos en vino tinto ..................................................................................................... 167
IV.2.3.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles
fermentativos en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP .................................................... 167
IV.2.3.1.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 167
IV.2.3.1.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 168
IV.2.3.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles
fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP ........................................ 175
IV.2.3.2.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 175
IV.2.3.2.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 176
xxi
IV.2.3.3 Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles
fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP ..................................... 187
IV.2.3.3.1. Producción de acetaldehído .......................................................................... 187
IV.2.3.3.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas .................................................. 188
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES............................................................................................. 203
V.1. REDUCCIÓN DEL GRADO ALCOHÓLICO .................................................................................. 205
V.2. EFECTO DE LOS BLOQUEADORES METABÓLICOS EN LOS PARÁMETROS COLORIMÉTRICOS Y
PRODUCCIÓN DE METABOLITOS SECUNDARIOS ............................................................................. 205
BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................... 209
APÉNDICES ....................................................................................................................................... 225
APÉNDICE A. CINÉTICA FERMENTATIVA DE DIFERENTES ENSAYOS EXPERIMENTALES ........................................... 227
APÉNDICE B. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON FURFURAL231
APÉNDICE C. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON O-VAINILLINA
............................................................................................................................................................. 237
APÉNDICE D. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON ÁCIDO TRANSCINÁMICO ................................................................................................................................................ 240
APÉNDICE E. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON
GLICOLALDEHÍDO ...................................................................................................................................... 243
APÉNDICE F. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON PBENZOQUINONA ........................................................................................................................................ 245
APÉNDICE G. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LOS ENSAYOS CON COBRE ... 247
APÉNDICE H. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LA PRODUCCIÓN DE GLICERINA
............................................................................................................................................................. 251
APÉNDICE I. ANÁLISIS ESTADÍSTICO MEDIANTE EL TEST DE RANGOS MÚLTIPLES PARA LA PRODUCCIÓN DE COMPUESTOS
VOLÁTILES FERMENTATIVOS ........................................................................................................................ 253
APÉNDICE J. CROMATOGRAMAS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS PARA ESTUDIAR LA CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DEL
FURFURAL Y O-VAINILLINA ........................................................................................................................... 259
APÉNDICE K. CROMATOGRAMAS DE LOS ANÁLISIS REALIZADOS PARA ESTUDIAR LA CONVERSIÓN ENZIMÁTICA DEL ÁCIDO
TRANS-CINÁMICO ...................................................................................................................................... 261
xxii
ÍNDICE DE FIGURAS
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
Figura I.1. Variación de las áreas aptas para el cultivo de la vid a causa del cambio climático…...
Figura I.2. Fermentación secuencial con una levadura Crabtree(-) no-Saccharomyces...................
Figura I.3. Inhibición metabólica y producción de intermediarios metabólicos…………...………
Figura I.4. Compuestos furánicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae…….....
Figura I.5. Conversión del furfural en alcohol furfurílico..………………………………………...
Figura I.6. Compuestos vainíllicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae……....
Figura I.7. Conversión de la vainillina en alcohol vainíllico………..……………………………..
Figura I.8. Molécula de glicolaldehído………..…………………………………………………...
Figura I.9. Conversión del glicoladehído en etilenglicol por Saccharomyces cerevisiae……...…..
Figura I.10. Moléculas de quinonas con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae…..…
Figura I.11. Efecto inhibitorio de las quinonas sobre Saccharomyces cerevisiae………..………..
Figura I.12. Derivados fenilpropanos inhibidores de Saccharomyces cerevisiae.…………………
Figura I.13. Formación de estireno a partir de cinamaldehído por Saccharomyces cerevisiae……
Figura I.14. Vía de degradación del ácido trans-cinámico por la levadura Pichia carsonii…….....
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
Figura III.1. Microvinificadores utilizados……….………………………………..........................
Figura III.2. Equipos utilizados para determinar el grado alcohólico (HPLC-RI) y analizador
automático para determinar azúcares residuales y glicerina..……….………………..………...……
Figura III.3. Equipos para análisis cromatográfico de compuestos volátiles fermentativos y
contenido residual de los bloqueadores metabólicos y sus derivados………………………………..
CAPÍTULO IV. RESULTADOS
Efecto inhibitorio del furfural
Figura IV.1. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con
12,5 % de GAP…………………………………………………………………………..………...
Figura IV.2. Grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de
furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………...
Figura IV.3. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura 7VA a diferentes
dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………..……………….
Figura IV.4. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura Distinction a
diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP……………………..
Figura IV.5. Compuestos volátiles fermentativos producidos por la levadura AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP………………….….
Figura IV.6. Grado alcohólico en un medio sintético con 14,5 % de GAP con diferentes cepas de
S. cerevisiae y evaluación del momento óptimo de adición de furfural……………………………..
Figura IV.7. Incidencia del pH y la temperatura sobre el grado alcohólico en un medio sintético
con 14,5 % de GAP y evaluación del momento óptimo de adición de furfural.…………………….
Figura IV.8. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15
% de GAP……………………………………………………….………………………………..
Figura IV.9. Alcohol furfurílico producido a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio
sintético con 15 % de GAP………………………………………………………………………...
Figura IV.10. Grado alcohólico obtenido al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con
15 % de GAP………………………………………………………………………………………..
Figura IV.11. Alcohol furfurílico producido al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético
con 15 % de GAP……...…………………………………………………………………………….
Figura IV.12. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de
mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………………….
Efecto inhibitorio de la o-vainillina
Figura IV.13. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético
con 15 % de GAP……………………………………………………………………………………
Figura IV.14. Cromatogramas para la identificación del alcohol o-vainíllico producido a partir de
la o-vainillina en un medio sintético con 15 % de GAP………......………………………………...
Figura IV.15. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con
xxiii
5
14
15
19
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29
31
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38
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80
81
82
84
87
89
91
94
96
101
103
furfural en un medio sintético con 12,5 % de GAP……..…………………………………………...
Figura IV.16. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) en sus alcoholes
derivados a partir de su dosificación en mosto tinto al inicio de las fermentaciones ...…………...…
Figura IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) en sus alcoholes
derivados a partir de su dosificación en mosto tinto al finalizar la fase de crecimiento exponencial..
Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico
Figura IV.18. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en mosto tinto
con 11,5 y 14,4 % de GAP…………………………………………..…………………………
Figura IV.19. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a
base de mosto concentrado de 12 y 15 % de GAP………………………………………………….
Figura IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a distintas
dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 % de
GAP……………………………………..…………………………………………………………...
Figura IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a distintas
dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de
GAP………………………………………………………………………………………..………...
Figura IV.22. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12
% de GAP…………………………………………………………………………………….……...
Figura IV.23. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15
% de GAP…………………………………………………….……………………………………...
Efecto inhibitorio del glicolaldehído
Figura IV.24. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a base
de mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………………
Figura IV.25. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con
14,3 % de GAP………………………………………………............................................................
Figura IV.26. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con
12 % de GAP………………………………………………………………………………………...
Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona
Figura IV.27. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en medios a base
de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP……………………………………………………....
Figura IV.28. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en mosto tinto con
14,3 % de GAP……………………………………………………………………………….……..
Efecto inhibitorio del cobre
Figura IV.29. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en un medio sintético con 12
y 14 % de GAP………………………………………………………………………………..……..
Figura IV.30. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en medios a base de mosto
concentrado con 12 y 15 % de GAP y evaluación de la sinergia cobre-furfural…………...……….
Figura IV.31. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto con 14,3 % de
GAP………………………………………………………………………………………………….
Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos en
vino tinto
Figura IV.32. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA………………………………………………..
Figura IV.33. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones con la levadura 7VA………………………………………………………………..
Figura IV.34. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796………………………………………….
Figura IV.35. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones con la levadura AWRI796………………………………………………………….
Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de glicerina en vino
tinto
Figura IV.36. Fermentación gliceropirúvica en Saccharomyces cerevisiae…...…………………..
xxiv
107
111
113
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126
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143
148
152
154
160
160
161
161
164
Figura IV.37. Producción de glicerina al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto con 10 % de GAP……..…………………………………………….
Figura IV.38. Producción de glicerina al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto con 14,3 % de GAP……………..…………………………………..
Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos
volátiles fermentativos en vino tinto
Figura IV.39. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP…………….…………………………
Figura IV.40. Producción de diacetilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………..……………...……………..
Figura IV.41. Producción de lactato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………………………………….
Figura IV.42. Producción de 1-propanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………..……………...……………..
Figura IV.43. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP………………...……...…..………….
Figura IV.44. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en
mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………………………………………………………….
Figura IV.45. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP……….…………………………
Figura IV.46. Producción de acetato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP….........…………………………
Figura IV.47. Producción de 1-propanol e isobutanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al
inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP…….………………….
Figura IV.48. Producción de 2-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio
de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP……………………………….
Figura IV.49. Producción de 3-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio
de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP…..…………………………...
Figura IV.50. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP………………………………...
Figura IV.51. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en
mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP…………………………………………………………
Figura IV.52. Producción de acetaldehído al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP…………….………………….
Figura IV.53. Producción de acetoína al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………..……………………..
Figura IV.54. Producción de acetato de etilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………………………….
Figura IV.55. Producción de acetato de isoamilo al dosificar los bloqueadores metabólicos al
inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………...……….
Figura IV.56. Producción de 1-propanol e isobutanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al
inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………..………..
Figura IV.57. Producción de 1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………….………..………….
Figura IV.58. Producción de 2-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio
de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………....………….
Figura IV.59. Producción de 3-metil-1-butanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio
de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………….....………….
Figura IV.60. Producción de 2-feniletanol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………...…...………….
Figura IV.61. Producción de 2,3-butanodiol al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP………………...……...……….
Figura IV.62. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos en
mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………………………………………………….
xxv
165
166
168
171
172
172
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191
192
193
194
194
195
196
197
198
200
xxvi
ÍNDICE DE TABLAS
CAPÍTULO I. INTRODUCCIÓN
Tabla I.1. Técnicas utilizadas para producir vinos con menor graduación alcohólica……………...
Tabla I.2. Potenciales bloqueadores del metabolismo fermentativo de Saccharomyces cerevisiae...
Tabla I.3. Efecto de los potenciales bloqueadores metabólicos sobre la producción de etanol…….
10
16
17
CAPÍTULO III. MATERIALES Y MÉTODOS
Tabla III.1. Programa de temperaturas para análizar los bloqueadores metabólicos y sus
derivados por GC-MS………………………………………………………………………………..
68
CAPÍTULO IV. RESULTADOS
Efecto inhibitorio del furfural
Tabla IV.1. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con
12,5 % de GAP………………………………………………………………………………………
Tabla IV.2. Acidez volátil con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de
furfural en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………………………
Tabla IV.3. Producción de acetaldehído por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis
iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………….
Tabla IV.4. Producción de compuestos volátiles fermentativos por diferentes cepas de S.
cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP…………..
Tabla IV.5. Grado alcohólico a diferentes valores de pH y temperatura a distintas dosis iniciales
de furfural en un medio sintético con 14,5 % de GAP………………………………………………
Tabla IV.6. Azúcares residuales a diferentes valores de pH y temperatura a distintas dosis
iniciales de furfural en un medio sintético con 14,5 % de GAP……………………………………..
Tabla IV.7. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con
15 % de GAP………………………………………………………………………………………...
Tabla IV.8. Furfural residual y alcohol furfurílico producido a diferentes dosis iniciales de
furfural en un medio sintético con 15 % de GAP……………………………………………………
Tabla IV.9. Azúcares residuales al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de
GAP………………………………………………………………………………………………….
Tabla IV.10. Furfural residual y alcohol furfurílico producido al dosificar furfural a PF = 8 en un
medio sintético con 15 % de GAP…………………………………………………………………...
Tabla IV.11. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de
mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………………….
Tabla IV.12. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de
mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………………….
Efecto inhibitorio de la o-vainillina
Tabla IV.13. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en un medio sintético
con 15 % de GAP…………………………………………………………………………………….
Tabla IV.14. Azúcares residuales a diferentes dosis de o-vainillina y combinación de o-vainillina
y furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio sintético con 12,5 % de GAP…………………………..
Tabla IV.15. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con
furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP………...
Tabla IV.16. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación
con furfural a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP…….
Tabla IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) a diferentes tiempos de
fermentación a partir de su dosificación en mosto tinto……………………………………………..
Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico
Tabla IV.18. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en mosto
tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP……………………………………………………………………..
Tabla IV.19. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a
base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP…………………………………………………
Tabla IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura 7VA a diferentes
dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de
GAP…………………………………………………………………………………………………..
Tabla IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos por la levadura AWRI796 a
xxvii
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75
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114
119
123
125
diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios a base de mosto concentrado con 12 y
15 % de GAP………………………………………………………………………………………...
Tabla IV.22. Producción de acetaldehído a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico en
medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP……………………………………….
Efecto inhibitorio del glicolaldehído
Tabla IV.23. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a base
de mosto concentrado con 15 % de GAP……………………………………………………………
Tabla IV.24. Producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en un medio a
base de mosto concentrado con 15 % de GAP………………………………………………………
Tabla IV.25. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con
14,3 % de GAP………………………………………………………………………………………
Tabla IV.26. Azúcares residuales y producción de glicerina a diferentes dosis iniciales de
glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de GAP…………………………………………………….
Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona
Tabla IV.27. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en medios a base
de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP……………………………………………………….
Tabla IV.28. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona en mosto tinto
con 14,3 % de GAP…………………………………………………………………………………..
Efecto inhibitorio del cobre
Tabla IV.29. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en un medio sintético con
12 y 14 % de GAP…………………………………………………………………………………...
Tabla IV.30. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en medios a base de mosto
concentrado con 12 y 15 % de GAP, y evaluación de la sinergia entre cobre y furfural……………
Tabla IV.31. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto con 14,3 %
de GAP……………………………………………………………………………………………….
Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros colorimétricos en
vino tinto
Tabla IV.32. Intensidad colorante (IC), tonalidad (T) y porcentajes de color al dosificar los
bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones…………………………………………..
Efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de compuestos
volátiles fermentativos en vino tinto
Tabla IV.33. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP…….………
Tabla IV.34. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP……………………………......…………
Tabla IV.35. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP...……...
Tabla IV.36. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP……………………………………...
Tabla IV.37. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……...
Tabla IV.38. Producción de alcoholes al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP……………………………………
xxviii
127
129
133
133
135
137
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149
153
154
158
169
170
177
178
189
190
LISTA DE ABREVIATURAS
ADH
:
Enzima alcohol deshidrogenasa
ADN
:
Ácido desoxirribonucleico
AlDH
:
Enzima aldehído deshidrogenasa
ARN
:
Ácido ribonucleico
ATP
:
Adenosin trifosfato
ATPasa
:
Enzima adenosintrifosfatasa
CCR
:
Columna de conos rotatorios
Ctr1p y Ctr3p
:
Copper transport proteins
Cu/Zn-SOD
:
Enzima superóxido dismutasa con Cu/Zn
DL50
:
Dosis letal mediana
D.O.
:
Denominación de Origen
ERO
:
Especies oxígeno reactivas
FAD / FADH2
:
Flavin adenin dinucleótido (oxidado / reducido)
FDC
:
Enzima descarboxilasa del ácido ferúlico
FEMA
:
Flavour and Extract Manufacturers Association
FML
:
Fermentación maloláctica
FMN / FMNH2
:
Flavin mononucleótido (oxidado / reducido)
GAP
:
Grado alcohólico probable
GAPDH
:
Enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa
GPDH
:
Enzima glicerol-3-fosfato deshidrogenasa
GRAS:
:
Generally Recognized As Safe
(+)
H ATPasa
:
Enzima adenosintrifosfatasa transportadora de hidrogeniones
HMF
:
5-hidroximetilfurfural
IC
:
Intensidad colorante
IC50
:
Inhibición de la tasa de crecimiento celular en un 50%
NAD / NADH
:
Nicotinamida adenina dinucleótido (oxidado / reducido)
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (oxidado / reducido)
NADP / NADPH
PAD
:
Enzima descarboxilasa del ácido fenilacrílico
SIM
:
Selected Ion Monitoring
T
:
Tonalidad
YEPD
:
Yeast Extract Peptone Dextrose
YNB
:
Yeast Nitrogen Base
xxix
xxx
I. Introducción
CAPÍTULO I: INTRODUCCIÓN
I.1. Las altas temperaturas y sus efectos en el cultivo de la vid
I.2. Técnicas aplicadas para reducir el grado alcohólico en vinos
I.3. Bloqueadores metabólicos para reducir el grado alcohólico
1
I. Introducción
2
I. Introducción
I.1. Las altas temperaturas y sus efectos en el cultivo de la vid
I.1.1. El cambio climático
Existen numerosas regiones en las cuales el clima favorece maduraciones sacarimétricas
excesivas que influyen en la composición de la uva y en los vinos que a partir de esta se
elaboran, zonas con elevadas temperaturas medias y escasez de recursos hídricos, que
dan lugar a desequilibrios tanto a nivel vitícola como enológico y hacen muy difícil la
obtención de vinos con un contenido alcohólico estándar comprendido entre 12,5 – 13,5
% v/v y una adecuada acidez, además de otros parámetros de calidad. Son varios los
foros científicos y divulgativos (Balairón, 2006; Poni, 2006; Dokoozlian, 2006; Moutounet,
2006; Butzke, 2006) en los que se citan parámetros anómalos como son las maduraciones
cada vez más tempranas, grados alcohólicos más elevados y deficientes maduraciones
fenólicas, etc.
Estas condiciones, definidas por unas elevadas temperaturas medias y un intenso déficit
hídrico, se ven incrementadas por los efectos del cambio climático (IPCC, 2007), cuyas
repercusiones previstas en las latitudes de tradición vitivinícola son un aumento de las
temperaturas en 2 ºC antes del año 2050, y un aumento en la tasa de evaporación, tanto
en el suelo como en la vid (Schultz, 2007). Algunas predicciones iniciales estimaban que
el grado de reducción de la humedad del terreno podría ser del 20 al 30 % en la mayor
parte de la región mediterránea y valores incluso superiores en la península ibérica
(Stigliani y Salomons, 1992), pero estas predicciones se han puesto en duda recientemente
según las tendencias climáticas pasadas y actuales (Schönwiese y Rapp, 1997). Sin
embargo, el impacto en la vitivinicultura y sus consecuencias socioeconómicas serían
3
I. Introducción
muy importantes especialmente en la cuenca mediterránea donde el agua es un recurso
escaso y el riego no es siempre posible, problemática que se acentúa con el
calentamiento global producido por la actividad industrial humana.
El Modelo de Circulación General (GCM) predice además un calentamiento más rápido
en el hemisferio norte durante los próximos 50 años (Evans, 1996). Se calcula que esto
puede suponer desplazamientos de los límites septentrionales de cultivo de la vid de
unos 10 a 30 Km por década hasta el año 2030 y llegar a duplicarse esta tasa entre 2020
y 2050 (Kenny y Harrison, 1993). Se ha observado que variedades adecuadas en
Geisenheim (Alemania), a 50º de latitud norte, como Riesling, Pinot gris y Pinot noir,
según las condiciones climáticas de los últimos 30 años podrían ser sustituidas en los
próximos 50 años por otras como Cabernet franc y Merlot (Schultz, 2000), típicas de la
cuenca mediterránea.
Se estima que para el año 2050 la superficie adecuada para el cultivo de la vid en
algunas zonas del planeta disminuiría considerablemente a causa del calentamiento
global, como es el caso de la cuenca mediterránea con mermas de hasta un 68% del área
vitícola, en California se perdería el 60%, en Sudáfrica el 51%, mientras que en
Australia esa merma podría alcanzar hasta un 73%. Por el contrario, otras zonas que en
la actualidad no son aptas verían incrementada su superficie vitícola, como son el norte
de Europa hasta en un 99%, mientras que en otras zonas sería mayor, como Nueva
Zelanda y Norteamérica occidental con incrementos de hasta 168 y 231%,
respectivamente (Hannah et al, 2013). Dichas variaciones se recogen en la Figura I.1, que
muestra la zonificación de las regiones vitícolas que se verían afectadas por el cambio
climático en base a estas predicciones.
4
I. Introducción
Actuales áreas adecuadas para viticultura que se perderían en el año 2050.
Áreas que se mantendrían adecuadas para viticultura hasta el año 2050.
Nuevas áreas que serían adecuadas para viticultura en el año 2050.
Figura I.1. Variación de las áreas aptas para el cultivo de la vid a causa del
cambio climático prevista para el año 2050 (Hannah et al, 2013).
I.1.2. Efecto de las altas temperaturas sobre la composición de la uva
Uno de los efectos más importantes del aumento de las temperaturas es la producción de
vendimia con baja acidez y sobre todo una elevada concentración de azúcar en la uva
(Mira de Orduña, 2010), lo cual no sólo aumenta la presión osmótica que la levadura
tiene que tolerar durante las etapas iniciales de la fermentación, sino que además afectan
los niveles de otras sustancias de interés en el vino como la glicerina y el ácido acético
(Bauer y Pretorius, 2000; Mira de Orduña, 2010). También puede influir en el metabolismo
de la levadura mediante la inducción de diversas respuestas al estrés, que influyen en la
5
I. Introducción
expresión génica global y el cambio de la estructura de la membrana celular (Hallsworth,
1998; Alexandre et al, 2001).
Por otro lado, las altas temperaturas ralentizan o inhiben la biosíntesis de antocianos,
produciendo un desfase entre la maduración de la pulpa y la de la piel. Al perseguir una
maduración fenólica más completa, se alarga el periodo en el cual la uva continua
acumulando azúcar en la pulpa (Savé et al, 2010). Además, algunas alteraciones
aromáticas en vinos blancos se han relacionado con la competencia de las vides por el
agua y el nitrógeno en años secos de escasa pluviometría (Rapp et al, 1993).
I.1.3. Efectos sobre el pH y estabilidad del vino
Uno de los problemas asociados al cultivo de vid en zonas cálidas es la producción de
vendimia con baja acidez y por tanto elevado pH (Mira de Orduña, 2010). El pH es un
parámetro clave en la estructura del mosto y por tanto del vino que de éste se elabore, ya
que se trata de un medio biológico naturalmente estable con valores cercanos a 3,5. Al
incrementar su valor, la estabilidad del vino con el transcurrir del tiempo disminuye, su
evolución es más rápida y los riesgos de contaminación son mayores. Su valor influye
en la facilidad con la que se desarrollan microorganismos contaminantes como bacterias
acéticas y lácticas, en la concentración de SO2 molecular disponible (Ribereau-Gayon et
al, 2003a), en el sabor del vino (Ribereau-Gayon et al, 1976), en la sensación de
astringencia de los vinos tintos (Peleg y Noble, 1999), en el color del vino y su estabilidad
físico-química respecto a la solubilidad de las sales tartáricas, en la quiebra férrica, en la
formación de asociaciones tanino-proteínas; y, sobre todo, en la sensibilidad del vino a
los fenómenos oxidativos (Ribereau-Gayon et al, 2003b).
6
I. Introducción
En cuanto a la estabilidad biológica, el pH es un factor esencial con respecto a las
bacterias lácticas (Ribereau-Gayon et al, 2003a), encargadas de conducir la fermentación
maloláctica (FML); pero que también producen compuestos tóxicos como las aminas
biógenas (Santamaría et al, 2005) tales como histamina, tiramina, putrescina y cadaverina
(Coton et al, 1999; Lonvaud-Funel, 2001; Soufleros et al, 1998), a partir de la
descarboxilación de aminoácidos precursores presentes en el mosto/vino. Siendo un pH
alto, una de las condiciones fundamentales para su formación (Ten Brink y Damink,
1990), aunque influyen también otros factores como la temperatura o la cepa bacteriana
(Smit y du Toit, 2013).
I.1.4. El etanol y su influencia en el perfil aromático del vino
La mezcla de todos los componentes mayoritarios de la fermentación alcohólica a las
concentraciones a las que se encuentran habitualmente en el vino confiere el olor típico
de bebida alcohólica que habitualmente se define como vinoso: ligeramente dulce,
picante y agresivo, alcohólico y un poco frutal. Esta mezcla constituye el sistema buffer
o tampón aromático, que tiene la capacidad de neutralizar el efecto aromático ligado
tanto a la adición de sustancias aromáticas, como a la eliminación de alguno de los
constituyentes básicos del buffer (Ferreira, 2007).
El etanol reduce la percepción aromática del vino mediante el aumento de la solubilidad
de los compuestos aromáticos, reduciendo la fracción volátil. En general, la presencia de
alcohol y de los otros componentes mayoritarios provoca que la solubilidad de los
distintos componentes aromáticos sea mayor en vino de lo que lo es en disoluciones
7
I. Introducción
acuosas. Tal aumento de solubilidad, a su vez, provoca que la presión de vapor de los
odorantes disminuya (Ferreira, 2007).
Por otro lado, el alcohol tiene la capacidad de potenciar el olor de algunos compuestos
volátiles, como el eugenol o el decanal (Petka et al, 2003), mejorando por tanto la
transferencia de los componentes volátiles a la fase de vapor (en condiciones
dinámicas), pero este efecto causado por la denominada convección de Marangoni, es
cancelado por las proteínas y otras macromoléculas del vino, siendo perceptible tan sólo
en disoluciones sintéticas o en vinos muy envejecidos (Tsachaki et al, 2005; 2009). Por
tanto, en la mayoría de los vinos, la cantidad de compuesto volátil alcanzando la
pituitaria durante la olfacción está por debajo de la que se encuentra en cantidades
equivalentes en disoluciones acuosas (Ferreira, 2007).
Sin embargo, el mayor efecto de los altos niveles de etanol no es tanto físico-químico
sino sensorial. Hay varias experiencias que lo corroboran, como por ejemplo su
capacidad de enmascarar o suprimir de manera casi completa las notas frutales
(Escudero et al, 2007; Harbertson et al, 2009), o de cambiar el carácter de afrutado a
herbáceo (Goldner et al, 2009). También pueden aumentar la percepción de la
astringencia de los taninos y la amargura, la rugosidad y la sensación cálida y ardiente
del vino (Jones et al, 2008; Obreque-Slìer et al, 2010). Al reducir los niveles de alcohol en
el vino, el perfil aromático se ve favorecido tanto por el fortalecimiento de las
interacciones percibidas entre madera y fruta, así como mediante la modificación de las
proporciones químicas de los compuestos aromáticos (Le Berre et al, 2007).
8
I. Introducción
I.2. Técnicas aplicadas para reducir el grado alcohólico en el vino
La demanda de vinos con una menor graduación alcohólica está creciendo como
consecuencia de una mayor formación por parte del consumidor en cuanto a los
beneficios de un consumo moderado en la salud y sus repercusiones en el estilo de vida
(Pickering, 2000; Pereira et al, 2011; Zhang et al, 2011). Numerosas líneas de investigación
se han iniciado en los últimos años, orientadas a disminuir la concentración alcohólica
en los vinos. La Tabla I.1 resume algunas de las técnicas que permiten actuar a los
diferentes niveles en el proceso de vinificación, como son las etapas prefermentativa,
fermentativa y postfermentativa.
9
I. Introducción
Tabla I.1. Técnicas utilizadas para producir vinos con menor graduación alcohólica.
Nivel de aplicación
Método
Aplicación de enzimas (Por ejm. glucosa oxidasa)
Uso de uva sin madurar recogida durante el aclareo de los viñedos
Concentración por congelación y fraccionamiento
Técnicas de membrana: ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa
Adición de agua / agua acidulada para diluir el mosto
Separación de aguas de vegetación /sangrado y posterior reconstitución
Utilización de levaduras Saccharomyces ineficientes
Empleo de levaduras Saccharomyces genéticamente modificadas
Fermentaciones secuenciales y/o mixtas con levaduras no-Saccharomyces
Metabolismo respiro-fermentativo de azúcares con no-Saccharomyces
Parada temprana de la fermentación
Prefermentación
(Reducción de azúcares fermentables)
Fermentación
Postfermentación
Técnicas por calor
Destilación a vacío en columnas de conos rotatorios (CCR)
Evaporación
Crioconcentración
Diálisis
Ósmosis inversa
Mediante resinas y silica gel
Solventes orgánicos
Fluidos supercríticos
Técnicas de membrana
Adsorción
Extracción
Dilución del vino
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
Pickering (2000).
Schmidtke et al (2012).
Kontoudakis et al (2011).
Petrotos et al (2001); Prodanov et al (2004); Warczok et al (2005; 2007).
California Administrative Code (2012); Code of Federal Regulations USA (2012); Harbertson et al (2009).
Loira et al (2012).
González et al (2013).
10
Referencia
1, 2
1, 2, 3
1
4
1, 2, 5
1, 6
1, 2
1, 2
7
1, 2
1, 2
1
1
1
1, 2
1, 2
1, 2
1
1
I. Introducción
I.2.1. Etapa prefermentativa: a nivel de mosto
Las técnicas fisicoquímicas de extracción/sangrado de parte del mosto y sustitución por
soluciones aciduladas o por aguas de vegetación obtenidas en la concentración de
mostos, deberían ser consideradas, aunque, de forma más cuidadosa y con particular
interés en la viticultura de zonas cálidas. En algunos países, como Estados Unidos, se
permite la adición de agua al mosto antes, durante o después de la fermentación para
ajustar la acidez (proceso conocido con el término inglés “amelioration”) (Code of
Federal Regulations, 2012) o para diluir la concentración azucarada del mosto (Bisson,
1999; Harbertson et al, 2009) y facilitar una normal fermentación (California
Administrative Code, 2012), que sería un proceso de corrección como lo es la adición de
mosto concentrado (España, Ley 24/2003), que se permite en zonas con malas
maduraciones sacarimétricas por peculiaridades climáticas regionales, aunque en un
contexto opuesto.
Otra opción interesante es el uso de mosto de uva no madura recolectada durante el
aclareo, con el cual se puede producir un vino con alta acidez y bajo grado alcohólico
(Kontoudakis et al, 2011), el cual puede ser usado para reemplazar un volumen
equivalente de mosto de uva madura, sin afectar las características sensoriales y el
contenido de antocianos y proantocianidinas. Incluso se puede mejorar el color del vino
elaborado con esta técnica.
También el mosto se puede procesar parcialmente mediante separación física por
tecnologías de membrana para separar como permeato el agua de constitución.
Posteriormente se puede reincorporar al mosto no tratado el agua de constitución,
11
I. Introducción
reduciendo así su concentración azucarada. Existe una amplia bibliografía referente a la
aplicación de ultrafiltración, nanofiltración y osmosis inversa para modificar el
contenido azucarado en mostos (Petrotos et al, 2001; Prodanov et al, 2004; Warczok et al,
2005; 2007), opción viable pero que precisa ser estudiada y optimizada para su uso en
vinificación en zonas cálidas.
I.2.2. Etapa postfermentativa: a nivel de vino elaborado
A nivel de vino elaborado, son aplicables diversas técnicas como la destilación,
crioconcentración, técnicas de membrana, adsorción por resinas o silica gel, extracción
por solventes orgánicos o fluidos supercríticos, dilución del vino, entre otras (Pickering,
2000). Siendo interesante la aplicación de la destilación a vacío en columnas de conos
rotatorios (CCR), en la cual además se puede recuperar y reincorporar al vino
desalcoholizado la fracción volátil (Belisario-Sánchez et al, 2011; Schmidtke et al, 2012).
También puede utilizarse la extracción con CO2 supercrítico para recuperar el
componente aromático (Macedo et al, 2008; Schmidtke et al, 2012) y reincorporarlo
posteriormente al vino.
I.2.3. Etapa de fermentación alcohólica
A nivel de fermentación se puede trabajar desde el punto de vista microbiológico,
seleccionando levaduras de la especie Saccharomyces cerevisiae que sean
glicolíticamente ineficientes (Heux et al, 2006; Kutyna et al, 2010; Loira et al, 2011; SuarezLepe y Morata, 2012), de tal modo que parte del metabolismo de los carbohidratos se
desvíe a la producción de biomasa y de intermediarios glicolíticos fermentativos de
12
I. Introducción
interés enológico (Figura I.3) como glicerina, ácidos, ésteres, aldehídos, etc., mientras
que se puede reducir la producción de acetato de etilo y la acidez volátil (Loira et al,
2011).
También se pueden utilizar levaduras no-Saccharomyces que trabajando en forma
secuencial o en cultivos mixtos con S. cerevisiae pueden permitir la elaboración de
vinos con una menor graduación alcohólica y un mejor perfil organoléptico (Schmidtke
et al, 2012; Gonzalez et al, 2013). En cuanto al perfil organoléptico, en estas levaduras se
puede aprovechar su capacidad para secretar enzimas con impacto positivo en el aroma
primario y secundario del vino, producción de glicerina, liberación de manoproteínas,
baja acidez volátil y mejora de la estabilidad colorante (Strauss et al, 2001; Rojas et al,
2003; Bely et al, 2008; Moreira et al, 2008; Palomero et al, 2009; Viana et al, 2011; SuarezLepe y Morata, 2012).
Con respecto a la aplicación de fermentaciones secuenciales, recientemente se ha
propuesto una alternativa mediante la cual se puede aprovechar el carácter Crabtree(-)
de algunas levaduras no-Saccharomyces, las cuales en una primera fase podrían
consumir parte del azúcar del mosto mediante un metabolismo respiro-fermentativo el
cual requeriría de un aporte de oxígeno; seguido de una segunda fase en la cual se
inocularía una cepa de Saccharomyces cerevisiae para que continúe con una
fermentación alcohólica normal (Gonzalez et al, 2013). Con lo cual el contenido de
azúcares disponibles para la segunda fase de la fermentación sería menor y por tanto el
vino resultante sería de menor grado alcohólico. El procedimiento propuesto se
representa en la Figura I.2.
13
I. Introducción
Figura I.2. Propuesta de fermentación secuencial con una levadura Crabtree(-)
no-Saccharomyces y una levadura Saccharomyces cerevisiae (Gonzalez et al,
2013).
Otra alternativa es el empleo de bloqueadores metabólicos, moléculas que están
presentes en el vino y/u otros alimentos y que durante la fermentación alcohólica
pueden originar redireccionamientos en la ruta fermentativa de las levaduras vínicas,
tales como el furfural (Ábalos et al, 2011), o-vainillina, glicolaldehído, algunas quinonas,
ácido cinámico y otros ácidos orgánicos y metales como el cobre (Tablas I.2 y I.3);
pudiendo constituir una adecuada estrategia para reducir los niveles de etanol con el
consiguiente aumento de otras sustancias de interés enológico (Figura I.3), tal como se
ha reportado en trabajos previos (Pons y Chanel, 1991; Palmqvist et al, 1999; Taherzadeh et
al, 1999; Modig et al, 2002).
14
I. Introducción
Figura I.3. Inhibición metabólica y producción de intermediarios metabólicos de interés
enológico durante la fermentación alcohólica por Saccharomyces cerevisiae en detrimento de
la producción de etanol.
15
I. Introducción
Tabla I.2. Potenciales bloqueadores del metabolismo glicolítico fermentativo de
Saccharomyces cerevisiae.
MOLÉCULA
FÓRMULA
PESO MOLECULAR
g/mol
O
O
96,0
Furfural
DL50
mg/Kg (oral)
65
(Merck)
H
O
OH
o-vainillina
152,5
1330
(Yu et al, 1987)
OMe
O
Ácido cinámico
148,0
2500
(Merck)
OH
Glicolaldehído
HO
60,0
O
280
(Collins, 2006) a
O
108,0
p-Benzoquinona
100
(Sigma-Aldrich)
O
O
OH
Ácido benzoico
(Lück y Pager, 2000)
46,0
(Lück y Pager, 2000)
O
Ácido fórmico
H
OH
O
60,0
Ácido acético
H3C
OH
O
74,1
Ácido propiónico
OH
a) Intraperitoneal (rata).
16
3000
122,1
1200
3310
(Merck)
4000
(Lück y Pager, 2000)
I. Introducción
Tabla I.3. Efecto de los potenciales bloqueadores del metabolismo fermentativo de S. cerevisiae, sobre la producción de etanol.
MOLÉCULA
Furfural
o-Vainillina
Glicolaldehído
Ácido cinámico
Ácido benzoico
Ácido benzoico
Ácido fórmico
Ácido acético
Ácido propiónico
Ácido butanoico
p-Benzoquinona
Cobre
CONCENTRACIÓN
EN EL MEDIO
g/l
0,5
4
2
4
>4
0,02
0,2
0,12
0,6
1,2
1
1
2
4
6
4
3
0,02
0,032
0,032
0,032
INHIBICIÓN PRODUCCIÓN
DE ETANOL
%
21
97
Sólo al inicio a
79
100
0
100
43
72
≈ 100
58
75
> 90
> 90
> 90
> 90
> 90
100
Hasta 80 % (poder fermentativo)
Aumentó la producción de etanol
Aumentó la producción de etanol
a) La producción final no se ve afectada.
b) Glicolaldehído como dímero (PM: 120 g/mol).
c) No se especifica el contenido de azúcar, pero se asume al tratarse de uva de mesa.
17
GLUCOSA EN EL MEDIO
FERMENTATIVO
g/l
20
20
100
30
10
20
20
100
100
100
20
10
10
10
10
10
10
20
19 % (mosto tinto)
≈ 150 (mosto blanco) c
100
REFERENCIA
Banerjee et al, 1981
Banerjee et al, 1981
Boyer et al, 1992
Palmqvist et al, 1999
Huang et al, 2011
Larsson et al, 2000
Jayakody et al, 2011b
Larsson et al, 2000
Huang et al, 2011
Larsson et al, 2000
Brandolini et al, 2002
Azenha et al, 2000
Azenha et al, 2000
I. Introducción
I.3. Bloqueadores metabólicos para reducir la producción de etanol
durante la fermentación alcohólica en vinos
En los siguientes apartados se resume la información bibliográfica referente a algunos
de los compuestos que han sido evaluados como bloqueadores metabólicos para reducir
la producción de etanol en la fermentación alcohólica. La mayoría de ellos han sido
estudiados en el contexto de la producción de biocombustibles, donde el tratamiento del
material lignocelulósico previo a la fermentación genera una amplia diversidad de
compuestos dentro de los cuales se encuentran los ya citados bloqueadores. Compuestos
que afectan el normal metabolismo fermentativo de los microorganismos utilizados para
convertir los azúcares derivados de los materiales lignocelulósicos en etanol,
principalmente la levadura Saccharomyces cerevisiae.
Cabe destacar que de estos compuestos únicamente el cobre ha sido evaluado en
fermentaciones con mostos de uva, cuyas referencias se detallarán en el apartado
correspondiente, mientras que para los demás compuestos no se tiene constancia de
haber sido evaluados en dicho contexto. Razón por la cual no se conoce el efecto sobre
su capacidad inhibitoria bajo algunos parámetros tecnológicos propios de la vinificación
como son la concentración de azúcares en el mosto, temperatura de fermentación, pH
del medio; además de su efecto sobre las levaduras vínicas en cuanto a producción de
etanol, producción de metabolitos secundarios con importante repercusión en la
composición y en el perfil organoléptico del vino, tales como glicerina, compuestos
volátiles fermentativos, así como la generación de nuevos compuestos derivados de los
bloqueadores metabólicos.
18
I. Introducción
I.3.1. Compuestos furánicos
Pertenecen a este grupo de compuestos el furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF),
alcohol furfurílico (Figura I.4), entre otros; los cuales han sido evaluados como
bloqueadores metabólicos durante de la fermentación alcohólica (Palmqvist et al, 1999;
Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002; Liu et al, 2005; Liu y Blaschek 2009; Hawkins y
Doran-Peterson, 2011). En el contexto de los vinos, estos compuestos mayoritariamente
se generan durante el tostado de la barrica como consecuencia de una reacción de
Maillard entre aminoácidos y los compuestos glucídicos de la madera (Cacho, 2006). El
furfural proviene de las pentosas (xilosa), mientras que el HMF de las hexosas (glucosa,
galactosa y manosa) (Palmqvist y Hahn-Hägerdal, 2000). El alcohol furfurílico se forma
por reducción enzimática del furfural durante el envejecimiento del vino, de modo que
factores relativos a la actividad enzimática, como pH y temperatura, afectarán a su
concentración (Towey y Waterhouse, 1996; Aznar et al, 2003). También estos compuestos
pueden aparecer naturalmente en muchos alimentos de origen vegetal (Maarse et al,
1994).
O
Furfural
CHO
HOH2C
O
CHO
5-Hidroximetilfurfural
O
CH2OH
Alcohol furfurílico
Figura I.4. Compuestos furánicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae.
19
I. Introducción
I.3.1.1. Furfural
El furfural es un aldehído aromático con una estructura en anillo también conocido
como furan-2-carboxaldehído, fural, furfuraldehído, aldehído piromúcico (Figura I.4).
Puede aparecer a través de reacciones de Maillard, generalmente a elevadas
temperaturas (Delgado-Andrade et al, 2010), también a partir de la descomposición del
ácido ascórbico (Masatsune et al, 2007). Este furfural de síntesis natural, está presente en
los alimentos a concentraciones que varían entre los 0,05 ppm en ciertas frutas, hasta los
255 ppm en el cacao o el café (Maarse et al, 1994). Además, el furfural sintetizado en
laboratorio es empleado como aditivo modificador de las propiedades organolépticas de
varios productos alimentarios y bebidas, y estudios previos reportan que no implica
ningún riesgo para la salud humana bajo las condiciones de uso como ingrediente
alimentario (Adams et al, 1997).
El furfural fue calificado como una sustancia generalmente reconocida como segura
(Generally Recognized As Safe, GRAS) bajo condiciones de uso como aditivo
alimentario por el panel de expertos de la Asociación de Fabricantes de Sabores y
Extractos (Flavour and Extract Manufacturers’ Association, FEMA) (Adams et al, 1997).
No existen estudios que analicen la acción inhibitoria del furfural a concentraciones
aptas para el consumo humano, que no debe exceder de 0,5 mg/Kg de peso corporal
(FAO/WHO, 2000), aunque estudios previos muestran que ingestas de 60 mg/Kg de peso
corporal por día no muestran efecto nocivo alguno en roedores (Jonker, 2000).
En los vinos, tanto el furfural como sus derivados furánicos están presentes debido a la
extracción de compuestos volátiles durante la crianza en barrica, en la cual aparecen por
20
I. Introducción
hidrólisis de la celulosa durante el tostado (Chatonnet et al, 1989; Cutzach et al, 1999;
Cacho, 2006), frecuentemente a concentraciones inferiores a su umbral de percepción (20
mg/l) (Boidron et al, 1988; Spillman et al, 1998), extracción que depende del tipo de roble
usado (francés o americano), edad del barril (nuevo tostado, usado, o nuevo sin tostar) y
duración del envejecimiento (Quesada et al, 1996). La concentración de furfural en los
vinos también depende de la técnica vinícola de elaboración empleada, así por ejemplo
los vinos tintos suelen contener concentraciones entre 0,8 mg/l (Pérez-Prieto et al, 2003)
hasta 8 mg/l (Garde et al, 2005). En otros vinos como los de Oporto 7,8 mg/l (Ho et al,
1999), o en los de Madeira hasta 24 mg/l (Câmara et al, 2006).
Aporta aromas a almendras y almendras tostadas (Zamora, 2005) aunque también se ha
relacionado con sabores a caramelo y cereal (Scarpellino y Soukup, 1993). El furfural es
importante también porque tiene un efecto potenciador sobre la percepción de las
whiskylactonas, relacionadas con los aromas a coco y vainilla (Reazin, 1991). En vinos
blancos puede formar furfuriltiol al reaccionar con el SH2, que proporciona un fuerte
aroma a café (Blanchard et al, 2001), también reacciona con los antocianos de los vinos
tintos formando compuestos colorantes más estables (Es-Safi et al, 2003).
I.3.1.2. Efecto inhibitorio del furfural
Dentro de los compuestos furánicos que tienen un efecto inhibitorio sobre la actividad
fermentativa de S. cerevisiae están el furfural, 5-hidroximetilfurfural (HMF) o el alcohol
furfurílico, siendo el furfural el que mayor efecto inhibitorio presenta (Palmqvist et al,
1999; Modig et al, 2002). El modo por el cual afectan el metabolismo en las levaduras
fermentativas no es completamente conocido, aunque se sugiere que estos aldehídos al
21
I. Introducción
ser químicamente reactivos, pueden formar compuestos con determinadas moléculas
biológicas como lípidos, proteínas y ácidos nucleicos (Singh y Khan, 1995). Algunos
estudios indican que causan daños en la pared y membrana celulares, inhiben el
crecimiento celular, causan daños en el ADN, inhiben la síntesis de proteínas y ARN y
reducen la producción de etanol (Zaldivar et al, 1999; Modig et al, 2002; Liu y Blaschek
2009).
El furfural produce la inhibición de enzimas glicolíticas y fermentativas (Banerjee et al,
1981; Zaldivar et al, 1999; Modig et al, 2002). Una de las enzimas más afectada es la
alcohol deshidrogenasa (ADH) involucrada en la formación de etanol, lo cual podría
explicar la mayor excreción de acetaldehído observada en la fermentación alcohólica al
añadir furfural al medio (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002). También inhibe la
actividad de la aldehído deshidrogenasa (AlDH) y de enzimas involucradas en el ciclo
de Krebs o ciclo del ácido cítrico (Taherzadeh et al, 2000). Además, se ha sugerido que el
furfural inhibe otras enzimas glicolíticas como la hexoquinasa, fosfofructoquinasa,
triosafosfato deshidrogenada, aldolasa (Banerjee et al, 1981), piruvato deshidrogenasa
(Modig et al, 2002), piruvato descarboxilasa (Taherzadeh et al, 1999) o la glicerol-3fosfato deshidrogenasa (GPDH) (Palmqvist et al, 1999).
Las propiedades inhibitorias del furfural y otros derivados furánicos han sido evaluadas
en el marco de la producción de biocombustibles (Azhar et al, 1981; Banerjee et al, 1981;
Boyer et al, 1992), dada la elevada concentración en que aparecen tras la hidrólisis de la
lignocelulosa, así el furfural aparece a concentraciones de hasta 620 mg/l en
hidrolizados de madera de chopo (Oliva, 2003), 1180 mg/l en hidrolizados de madera de
pino (Hawkins y Doran-Peterson, 2011), 1700 mg/l en hidrolizados de fibra de maíz
22
I. Introducción
(Samala et al, 2012) o inclusive hasta 2500 mg/l en hidrolizados de bagazo de caña de
azúcar (Laser et al, 2002). Otros derivados como el HMF y el ácido furoico han sido
identificados en hidrolizados de madera de pino en concentraciones de 18 y 2153 mg/l
respectivamente (Hawkins y Doran-Peterson, 2011).
Bajo estas condiciones, es conocido el descenso que origina el furfural sobre la tasa de
producción de etanol y sobre la tasa de crecimiento específico de las levaduras
(Taherzadeh et al, 1999), pudiendo inhibir la producción de etanol hasta en un 78% a una
concentración de 0,46 g/l, mientras que con 1,2 g/l la inhibición puede ser total
(Banerjee y Viswanathan, 1974) e inhibir el crecimiento celular a una concentración de 1
g/l, aunque la resistencia de la levadura a sus efectos podría mejorar incrementando la
concentración de glucosa en el medio (Lu et al, 2007). Además de su concentración, su
efecto inhibitorio varía en función de la densidad celular (Chung y Lee, 1985; Navarro et
al, 1994), del tipo de levadura (Lu et al, 2007; Ábalos et al, 2011), de las condiciones de
cultivo (fermentación continua, alimentada o discontinua) (Fireoved y Mutharasan, 1986;
Villa, 1992) y de la aireación (Díaz de Villegas et al, 1992).
Se ha propuesto la inhibición de tipo competitivo que ejerce el furfural sobre las
enzimas encargadas de la producción de etanol (alcohol deshidrogenasa, ADH) y ácido
acético (aldehído deshidrogenasa, AlDH), ambos a partir del acetaldehído (Modig et al,
2002). El furfural es “tóxico” para las levaduras, de modo que éstas lo convierten en
compuestos menos perjudiciales (Nilsson et al, 2005), principalmente por reducción a
alcohol furfurílico (Liu et al, 2005) empleando NADH como cofactor (Palmqvist et al,
1999), de manera que la enzima encargada de reducir el acetaldehído a etanol (ADH) por
vía glicolítica (Figura I.5) es utilizada para este nuevo objetivo (inhibición competitiva),
23
I. Introducción
disminuyendo por consiguiente la síntesis de etanol (Azhar et al, 1981; Navarro et al,
1994), lo cual podría explicar la mayor excreción de acetaldehído observada en la
fermentación alcohólica tras añadir furfural al medio fermentativo (Palmqvist et al, 1999;
Modig et al, 2002).
Glucosa
Alcohol furfurílico
ETANOL
NAD+
Gliceraldehído-3-fosfato
ADH
Piruvato
CO2
CoA
NAD+
NADH
Furfural
ACETALDEHÍDO
NAD+
AlDH
NADH
Ciclo de Krebs
CO2
Acetil CoA
NADH
Ácido acético
Ácido furoico
Figura I.5. Conversión enzimática del furfural (Adaptado de Modig et al, 2002).
Otro metabolito fermentativo afectado por la acción inhibitoria del furfural es la
glicerina, la cual se forma para mantener el equilibrio redox intracelular, mediante la
producción de NAD+ a partir de la reoxidación del NADH citosólico. El NADH es el
cofactor requerido por S. cerevisiae para reducir el acetaldehído a etanol así como para
reducir el furfural a alcohol furfurílico (Figura I.5). Palmqvist et al (1999), han
demostrado una mayor afinidad hacia el NADH por la enzima ADH (responsable de
reducir el furfural a alcohol furfurílico) que por la enzima glicerol-3-fosfato
deshidrogenasa (GPDH, responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato y producir
glicerina), generándose una inhibición de tipo competitiva, con lo cual podría esperarse
24
I. Introducción
que la producción de glicerina sea menor en presencia del furfural. Sin embargo otros
autores (Taherzadeh et al, 1999) han demostrado que la producción de glicerina puede
incrementar después de la adición de furfural, lo cual podría indicar otras fuentes de
NADH requerido para su reducción.
Al respecto se ha sugerido al Ciclo de Krebs o Ciclo de los ácidos tricarboxílicos como
una vía alternativa para generar NADH (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002),
principalmente en las etapas iniciales del proceso fermentativo (Horváth et al, 2003),
incrementándose además la producción de otros intermediarios metabólicos de interés
(Figura 3) como el ácido succínico (Taherzadeh et al, 1999).
La glicerina y el ácido succínico son dos metabolitos de un importante impacto en el
vino, de modo que una interesante posibilidad sería evaluar el incremento de su
producción en presencia de furfural u otro inhibidor metabólico. La glicerina es muy
importante desde el punto de vista sensorial ya que aporta “dulzor” a los vinos y su
viscosidad incrementa la suavidad, estructura y cuerpo (Hidalgo, 2010; Suárez–Lepe y
Morata, 2012). Mientras que el ácido succínico confiere al vino notas saladas y amargas
muy sutiles, y su síntesis por las levaduras fermentativas constituye una de las más
importantes vías para incrementar la acidez titulable del vino (Coulter et al, 2004),
especialmente en vinos producidos a partir de uvas procedentes de zonas cálidas, los
cuales presentan baja acidez (Mira de Orduña, 2010). Además a partir del ácido succínico
pueden formarse ésteres de aromas agradables mejorando el perfil aromático del vino,
como son el succinato de etilo, presente en vinos de Jeréz (Webb et al, 1964) y en vinos
espumosos donde aportan aroma a café con leche (Hidalgo, 2010); el succinato de dietilo,
detectado en vinos de Madeira, Jeréz (Webb et al, 1964; Alves et al, 2005) y en vinos de
25
I. Introducción
uva Verdejo (Herraiz et al, 1991), aportando además aroma a moka en vinos espumosos
(Hidalgo, 2010); y finalmente el succinato de metilo, que confiere el característico aroma
a los vinos de uva Muscadine (Lamikanra et al, 1996).
A partir del furfural también se producen otros metabolitos como el ácido furoico (Villa
et al, 1992), la furoína y el furil (Morimoto et al, 1969). El ácido furoico se produce a partir
de la oxidación del furfural, proceso en el que estaría involucrada la enzima AlDH
(Figura I.5) especialmente en presencia de oxígeno (Taherzadeh et al, 2000; Modig et al,
2002) empleando en este caso NAD+ como cofactor (Horváth et al, 2003). Como resultado
de este proceso, se puede reducir la producción de ácido acético, mientras se incrementa
la producción de ácido pirúvico (Taherzadeh et al, 1999), debido a que la capacidad para
convertirlo en acetaldehído es afectada por la acumulación de este último cuando el
furfural es añadido al medio (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002), aunque también
puede ser causado por un efecto inhibitorio sobre la enzima piruvato descarboxilasa; a la
vez que el ácido acético es convertido en acetil-CoA. Todo ello ocurre mientras el
furfural añadido no es completamente metabolizado.
También Saccharomyces tiene la capacidad de metabolizar el HMF y convertirlo en su
derivado el 2,5-bis-hidroximetilfurano (alcohol 5-hidroximetilfurfurílico) (Liu et al, 2004;
2005) y la enzima codificada por el gen ADH6 (alcohol deshidrogenasa 6) de
Saccharomyces cerevisiae sería la responsable del incremento de la tasa a la cual la
levadura metaboliza este furano (Petersson et al, 2006).
26
I. Introducción
I.3.2. Compuestos vainíllicos
Naturalmente, los compuestos vainíllicos forman parte de la vainilla, uno de los aditivos
alimentarios más usado en el mundo, siendo el compuesto mayoritario la vainillina (pvainillina) con un contenido aproximado en la vaina de vainilla de 2 - 2,5 % (Walton et
al, 2003). Su uso en la industria alimentaria además puede extenderse a la función de
preservante alimentario al mostrar propiedades antioxidantes y antimicrobianas
(Davidson y Naidu, 2000), siendo de especial interés su efecto inhibitorio sobre
Saccharomyces cerevisiae (Fitzgerald et al, 2003; 2004). También muestran este efecto
inhibitorio sus isómeros isovainillina y o-vainillina (Larsson et al, 2000).
En los vinos estos fenoles proceden del roble, como consecuencia de la termólisis
parcial de la lignina durante el tostado de las barricas (Fiddler et al, 1966). Destacando
por su importancia sensorial la vainillina, responsable del olor a vainilla que caracteriza
a muchos vinos de crianza (Chatonnet, 1992; Boidron et al, 1998; Zamora, 2003; 2005).
I.3.2.1. Efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos
Aunque, el mecanismo de inhibición no se conoce completamente, se ha estudiado el
efecto de estos aldehídos aromáticos sobre bacterias como Klebsiella pneumoniae (Tran
y Chambers, 1986; Nishikawa et al, 1988) y Escherichia coli (Zaldivar et al, 1999; Zaldivar y
Ingram, 1999). Su efecto inhibitorio puede deberse a una interacción con determinadas
zonas hidrofóbicas de la célula y causar pérdida de la integridad de la membrana
afectando su capacidad de actuar como barrera selectiva (Heipieper et al, 1994). Además,
se han realizado diversos estudios sobre su efecto en levaduras (Mikulásová et al, 1990;
27
I. Introducción
Delgenes et al, 1996), especialmente Saccharomyces cerevisiae (Jönsson et al, 1998;
Palmqvist et al, 1996; Palmqvist, 1998; Larsson et al, 1999; 2000). Debido a que la estructura
de la membrana plasmática en levaduras es similar a la de las procariotas, se postula que
los mecanismos de inhibición pueden ser similares (Larsson, 2000).
Determinados microorganismos como las bacterias Klebsiella pneumoniae (Nishikawa
et al, 1988) o Zymomona mobilis (Delgenes et al, 1996) y levaduras de los géneros
Saccharomyces, Pichia, Pachysolen y Candida (De Wulf et al, 1986; Delgenes et al, 1996;
Larsson et al, 2000) son capaces de metabolizar los compuestos vainíllicos. Sin embargo,
los datos referentes al papel de la enzima ADH de Saccharomyces cerevisiae en la
conversión de estos compuestos no son del todo claros (Bowen et al, 1986). Además se
considera que otras enzimas involucradas serían la vainillina oxidoreductasa (De Wulf et
al, 1986), aldosa reductasa (Kuhn et al, 1995) o la arilalcohol deshidrogenasa (Delnieri et
al, 1999).
En cuanto al origen de estos compuestos, se ha demostrado que los derivados de la
degradación de la lignina, como los compuestos vainíllicos, tienen un mayor efecto
inhibitorio en S. cerevisiae que los derivados de la degradación de azúcares como el
furfural y el HMF (Lee et al, 1999), destacando además que el efecto inhibitorio depende
de la concentración de azúcares en el medio fermentativo, pues al aumentar la
concentración de glucosa, el efecto de los bloqueadores metabólicos disminuye, tal
como se menciona en otros estudios (Chung y Lee, 1985; Navarro et al, 1994).
En cuanto a su estructura química, en el anillo aromático de estos aldehídos la posición
de los sustituyentes (como el -OH) tiene mayor relevancia en su efecto inhibitorio que
28
I. Introducción
su naturaleza (sean -OH o -CH3) (Figura I.6). Así la posición orto del hidroxilo (-OH) en
la vainillina (o-vainillina) determina un mayor efecto inhibitorio que la posición para
(p-vainillina). Mientras que si se compara la isovainillina con la p-vainillina, no se
observa una diferencia importante (Mikulásová et al, 1990). Por otro lado, el incremento
en grupos metilo (-CH3) como sustituyentes en el anillo aromático, puede reducir el
efecto inhibitorio de estos compuestos (Lee et al, 1999), además estos compuestos son
más tóxicos en su forma aldehído, y en menor grado como ácidos y menos aún como
alcoholes (Mikulásová et al, 1990; Larsson et al, 2000; Huang et al, 2011).
CHO
CHO
CHO
OH
OH
OCH3
OCH3
OH
Vainillina o p-vainillina
OCH3
Isovainillina
o-Vainillina
Figura I.6. Compuestos vainíllicos con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae.
A escala industrial, las propiedades inhibitorias de los compuestos vainíllicos se han
evaluado en el marco de la producción de biocombustibles (Mikulásová et al, 1990; Lee et
al, 1999; Larsson et al, 2000; Huang et al, 2011), dada su elevada concentración tras la
hidrólisis de la lignocelulosa, donde la vainillina y su derivado el ácido vainíllico
pueden aparecer en concentraciones de hasta 22 y 50 mg/l respectivamente (Hawkins y
Doran-Peterson, 2011).
29
I. Introducción
I.3.2.2. Efecto inhibitorio de la vainillina y o-vainillina
La vainillina, también conocida como p-vainillina, 4-hidroxi-3-metoxibenzaldehído, 4hidroxi-m-anisaldehído o aldehído vainíllico, ejerce un importante efecto inhibitorio
sobre la levadura Saccharomyces cerevisiae (Fitzgerald et al, 2003; 2004; Lee et al, 1999),
originando una disminución de la actividad fermentativa a dosis comprendidas entre 1 –
2,5 g/l, sobre todo en las etapas iniciales tras su dosificación en el medio fermentativo,
aunque una vez que la levadura se ha adaptado puede recuperar su capacidad, no
viéndose alterada la producción final de etanol, mientras que a dosis mayores a 3 g/l
puede causar una inhibición total de la levadura (Lee et al, 1999).
La o-vainillina, también conocida como 2-vainillina, 2-hidroxi-3-metoxibenzaldehído,
3-metoxisalicilaldehído
o
2-hidroxi-m-anisaldehído,
puede
ser
sintetizada
industrialmente a partir del guayacol como producto intermedio durante la producción
de vainillina a través de la síntesis de Reimer-Tieman (Geissman, 1974) o a partir de
procesos de recuperación de aguas de licor del proceso kraft usado en la fabricación de
papel (Major y André, 1977).
La o-vainillina inhibe totalmente la producción de etanol y crecimiento celular en S.
cerevisiae a 200 mg/l. Una dosis de 20 mg/l no inhibe la producción de etanol y apenas
tiene efectos sobre el crecimiento celular, siendo el alcohol o-vainíllico el principal
producto de su metabolismo, el cual al parecer es menos nocivo para la levadura
(Larsson et al, 2000), análogamente a la producción de alcohol vainíllico a partir de la
vainillina (Figura I.7) y de alcohol furfurílico a partir del furfural (Liu et al, 2005).
30
I. Introducción
CH2OH
COOH
CHO
NAD+
NADH
Oxidación
Reducción
OCH3
OCH3
OH
Alcohol vainíllico
OH
Vanillina
OCH3
OH
Ácido vainíllico
Figura I.7. Conversión de la vainillina en alcohol vainíllico (Adaptado de Fitzgerald et al, 2003).
La conversión de la vainillina a alcohol vainíllico (Figura I.7) y su posterior
trasformación durante la fermentación es mencionada en la elaboración de cerveza o
vino (Chatonnet et al, 1992), así como en medios modelo (Humphries et al, 1992).
Bioconversión catalizada por un grupo especial de enzimas oxidoreductasas, que
requieren un cofactor como NADH, NADPH, FADH2 o FMN. La enzima responsable
de dicha reducción no está claramente dilucidada (De Wulf et al, 1986), sugiriendo dichos
autores que no se trataría de la enzima ADH, sino de una oxidoreductasa inducida por la
vainillina, pues trabajando con una levadura S. cerevisiae sin actividad ADH, obtuvieron
la misma producción de alcohol vainíllico que con una levadura normal, con una
producción del 95% de alcohol vainíllico con respecto a la vainillina adicionada.
31
I. Introducción
32
I. Introducción
I.3.3. Glicolaldehído
El glicolaldehído, llamado también diosa, 2-hidroxietanal, hidroxiacetaldehído, etc., es
el azúcar más simple (Figura I.8), que al combinarse con otras moléculas puede formar
azúcares más complejos como ribosa y glucosa. Se encuentra naturalmente formando
parte de muchos alimentos y en la industria alimentaria es un compuesto bastante
deseable, usualmente como intermedio en la preparación de otros productos, ya sea
como producto puro, en soluciones acuosas o en soluciones mezclado con otros
compuestos carbonilos de bajo peso molecular.
Figura I.8. Molécula de glicolaldehído.
Importantes fuentes de glicolaldehído son la termólisis a partir de soluciones de
carbohidratos como glucosa o almidón (Majerski et al, 2006; Scott, 1991; Underwood et al,
1994; 1995), del metabolismo del sorbitol (un edulcorante hipocalórico) y a partir de la
degradación oxidativa del ascorbato y del xilitol (O’Brien et al, 2005). También puede ser
sintetizado a partir de ácido dihidroximaleico (Majerski et al, 2006), del etilenglicol (Seto
et al, 1991) y de la pirolisis de materiales lignocelulósicos para la producción de
biocombustibles, encontrándose a concentraciones entre 60 – 1440 mg/l (Katsunobu y
Shiro, 2002; Piskorz et al, 1986; Xin et al, 2009).
En la industria alimentaria es de gran utilidad para mejorar el color de los alimentos,
debido a que su naturaleza de compuesto carbonilo le confiere una alta capacidad
33
I. Introducción
pardeante (Hayashi y Namiki, 1986; Vitasari, 2010). Una interesante aplicación del
glicolaldehído o sus mezclas con otros productos carbonilos, es como promotor de
pardeamientos durante la elaboración de alimentos cocidos, en las cuales los aldehídos,
cetonas y azúcares reductores reaccionan con aminas, aminoácidos y proteínas; dentro
de las cuales las reacciones más importantes son las de tipo amino-carbonilo o
reacciones de Maillard (Majerski et al, 2006), sin impartir el indeseable sabor ahumado de
otras técnicas a los alimentos tratados (Underwood et al, 1995). Además puede ser
aplicado como un agente de entrecruzamiento en materiales de naturaleza proteica
(Geoghegan et al, 1979), siendo una ventajosa aplicación en este sentido su uso en el
fortalecimiento de envolturas para embutidos.
En vinos, el glicolaldehído aparece principalmente gracias a la actividad de las bacterias
lácticas durante la fermentación maloláctica (FML) debido a la reducción del glioxal
procedente de la degradación de los azúcares (Flamini y Dalla Vedova, 2003). Su
concentración en vinos Cabernet sauvignon varía tras la FML, siendo antes de ésta de
0,05 mg/l y tras la FML puede llegar a valores de 0,39 mg/l. Mientras que en otras
variedades como Chardonnay puede pasar de 0,04 a 0,11 mg/l (Flamini y Traldi, 2010).
I.3.3.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído
El efecto inhibitorio del glicolaldehído en Saccharomyces cerevisae ha sido evaluado
durante la fermentación alcohólica para producir biocombustibles (Jayakody et al, 2011;
Katsunobu y Shiro, 2002; Piskorz et al, 1986; Xin et al, 2009), ya que posee un átomo de
carbono altamente electrofílico, el cual interacciona con moléculas de carga negativa
dentro de la célula (Jayakody et al, 2011), lo cual incluye la interacción con el par de
34
I. Introducción
electrones del nitrógeno de los grupos amino de las proteínas, conduciendo a la
formación de bases de Schiff (Glomb y Monnier, 1995). Estas bases de Schiff a su vez
sufren reordenamientos de Amadori, formando cetoaminas estables, que interaccionan
con el nitrógeno de otras proteínas, resultando en el entrecruzamiento de proteínas y una
eventual formación de melanoidinas (Hayashi y Namiki, 1986). Por otro lado, la cisteína
con bajo pKa puede convertirse en anión tiolato; el glicolaldehído interacciona con las
cargas negativas de estes anión, conduciendo a la inactivación de las enzimas que
contengan cisteína (Jayakody et al, 2011). Reacciones que causan efectos en la actividad
metabólica de la levadura.
Un estudio reciente ha mostrado que el glicolaldehído ejerce un mayor efecto inhibitorio
en el crecimiento celular de S. cerevisiae que otros bloqueadores metabólicos como el
furfural y el HMF, aunque su efecto inhibitorio en la producción de etanol no se ha
evaluado en dicho estudio (Jayakody et al, 2012), destacando además que la levadura
convierte el glicolaldehído en etilenglicol como estrategia para disminuir su efecto
inhibitorio, y al parecer la enzima involucrada sería la ADH (Figura I.9), proceso
análogo a la conversión de otros bloqueadores como el furfural (Liu et al, 2005) y la ovainillina (Larsson et al, 2000) antes mencionados.
NAD+
NADH
HO
HO
O
OH
Reducción
Glicolaldehído
Etilenglicol
Figura I.9. Conversión del glicoladehído a etilenglicol por S. cerevisiae (Jayakody et al, 2012).
35
I. Introducción
Con respecto a su efecto sobre S. cerevisiae, Jayakody et al (2011) demostraron que se
inhibe hasta el 58 y 83 % del crecimiento celular de al dosificar concentraciones de
glicolaldehído (en su forma de dímero, masa molecular: 120 g/mol) de 600 y 1200 mg/l
respectivamente, en un medio modelo suplementado con 10 % de glucosa. Además a
una concentración de glicolaldehído de 120 mg/l, la producción de etanol es inhibida un
43 % con respecto al control, mientras que a 600 mg/l la inhibición es del 72 %. A 1200
mg/l, la producción de etanol es casi nula, aunque a concentraciones de glicolaldehído
superiores a 240 mg/l se puede reducir el consumo de azúcares por la levadura.
36
I. Introducción
I.3.4. Quinonas
Las quinonas (Figura I.10) son moléculas presentes ampliamente en la naturaleza y tanto
éstas como sus derivados han sido estudiados por su efecto inhibitorio en
Saccharomyces cerevisiae, como la 2-metil-1,4-naftoquinona (menadiona), 9,10fenantrenoquinona (9,10-PQ) (Rodriguez et al, 2004; 2005) y la p-benzoquinona (Larsson
et al, 2000). También se ha estudiado el efecto de sus derivados, sintetizados durante la
hidrólisis de la lignocelusa para la producción de biocombustible como son el catecol
(Jönsson et al, 1998) y de la hidroquinona (Larsson et al, 1999), derivados de los isómeros
o-benzoquinona y p-benzoquinona, respectivamente.
O
O
O
O
CH3
O
p-Benzoquinona
O
Menadiona
9,10-Fenantrenoquinona
Figura I.10. Moléculas de quinonas con efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae.
De todas estas moléculas, la p-benzoquinona, llamada también 1,4-benzoquinona, pquinona, benzoquinona o simplemente quinona, es la que mayor efecto inhibitorio
presenta sobre el crecimiento celular y producción de etanol en S. cerevisiae, mucho
mayor que su derivado hidroquinona (Larsson et al, 2000), efecto inhibitorio que como
para la mayoría de las quinonas depende también de sus propiedades químicas.
37
I. Introducción
I.3.4.1. Efecto inhibitorio de las quinonas
En Saccharomyces cerevisiae el efecto inhibitorio de las quinonas se manifiesta por dos
mecanismos: la formación de enlaces covalentes con moléculas biológicas por adición
química de Michael (Figura I.11a), y la reducción catalítica del oxígeno a superóxido y
otras especies oxígeno reactivas (ERO) (Figura I.11b) (Rodriguez et al, 2004).
a. Adición química de Michael
O
O
+
OH
RS-
RS-
O
RS
OH
O
RS-: Nucleófilo
p-Benzoquinona
b. Generación de ERO
O
O
O.
-O
1/2 NADPH
1/2 NADP+
OH
HO
1/2 NADPH
1/2 NADP+
O
CH3
O2.-
O2.Menadiona
O2
O2
O
9,10-PQ
Figura I.11. Mecanismos involucrados en el efecto inhibitorio de las quinonas sobre
Saccharomyces cerevisiae (Rodriguez et al, 2004).
En el primer caso pueden actuar como electrófilos vía adición química en los carbonos 1
y 4, conduciendo a una modificación covalente de moléculas biológicas en sus sitios
nucleofílicos, como en los tioles de las proteínas. En el segundo caso, pueden
38
I. Introducción
oxidarse/reducirse en presencia de un reductante biológico y oxígeno para generar ERO
tales como superóxido (O2-) o peróxido de hidrógeno (H2O2), los cuales pueden ser
perjudiciales (O’Brien, 1991; Monks et al, 1992; Kumagai et al, 2002). Tal es el caso de la pbenzoquinona en el primer caso, y las quinonas 2-metil-1,4-naftoquinona (menadiona) y
9,10-fenantrenoquinona (9,10-PQ) en el segundo caso.
Rodriguez et al (2004) evaluaron el efecto de las quinonas antes mencionadas en un
medio con 2% de glucosa, observando que su efecto inhibitorio sobre la tasa de
crecimiento celular (IC50) en S. cerevisiae era variable en función del mecanismo de
inhibición. La menadiona a menor dosis fue más efectiva en condiciones de aerobiosis
(5,7 mg/l) que en anaerobiosis (24,3 mg/l), al igual que la 9,10-PQ a concentraciones de
2,9 y 7,5 mg/l para condiciones de aerobiosis y anaerobiosis, respectivamente. En
contraste, la p-benzoquinona, en anaerobiosis mostró un mayor efecto inhibitorio a una
menor dosis (3,2 mg/l) frente a los 5,3 mg/l necesarios en aerobiosis.
Además, la sensibilidad de S. cerevisiae a las quinonas depende del momento en el cual
se dosifican en el medio. Una concentración de 1 mg/l de 9,10-PQ dosificada en las
primeras etapas de la fase exponencial en condiciones aeróbicas produjo una reducción
de la viabilidad celular en más del 90%, así como una pérdida en la actividad de la
enzima gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenada (GAPDH) en un 70% en comparación a
las dosificaciones en otras etapas de la fermentación. En base a estos resultados, los
mismos autores llevaron a cabo otro estudio con la 9,10-PQ dosificada al principio de la
fase logarítmica pero bajo condiciones de anaerobiosis, obteniendo resultados similares
a los anteriores.
39
I. Introducción
Por otro lado, al comparar el efecto inhibitorio de la 9,10-PQ y la p-benzoquinona en
condiciones anaeróbicas sobre la actividad enzimática de la GAPDH de S. cerevisiae, se
observó una mayor afinidad de la p-benzoquinona con respecto a la enzima - clave en la
síntesis de ATP glicolítico y en la producción de ácido pirúvico como intermediario en
la producción de etanol -, a una dosis mucho menor que la 9,10-PQ (Rodriguez et al,
2005). Resultados comparables a los obtenidos por Larsson et al (2000), quienes
evaluaron comparativamente el efecto de diferentes concentraciones de derivados
lignocelulósicos y la p-benzoquinona sobre el crecimiento celular y la producción de
etanol en S. cerevisiae, siendo la p-benzoquinona la que mayor efecto mostró,
inhibiendo totalmente la producción de etanol y el crecimiento celular a dosis de 20
mg/l.
40
I. Introducción
I.3.5. Ácido cinámico
El crecimiento celular y producción de etanol en Saccharomyces cerevisiae son
afectados por derivados fenilpropanos producidos durante la hidrólisis de lignocelulosa
para la producción de biocombustibles, dentro de los cuales están los ácidos p-cumárico,
ferúlico y 3,5-dimetoxi-4-hidroxi-cinámico, el coniferil aldehído (Larsson et al, 1999),
coniferil alcohol, eugenol e isoeugenol (Jönsson et al, 1998). También se ha evaluado el
efecto de otro derivado fenilpropano, el ácido cinámico (Larsson et al, 2000), conocido
también como ácido fenilacrílico, ácido 3-fenilacrílico, ácido 3-fenilpropenoico o ácido
3-fenil-2-propenoico (Figura I.12). Ácido utilizado en la industria farmacéutica y en
perfumería (Villavecchia y Eigenmann, 1982), así como saborizante en la industria
alimentaria (FDA, 2011; Adams et al, 2004), cuyas concentraciones van desde 0,01 ppm en
caramelos hasta 712 ppm en bebidas alcohólicas (Waddell et al, 2007). Siendo también
utilizado en productos de panadería, bebidas no alcohólicas, gelatinas, lácteos
congelados, etc. Además está incluido en la lista de sustancias permitidas en alimentos
por el Consejo Europeo (Council of Europe, 2000).
Naturalmente, el ácido cinámico se forma en las plantas superiores como un producto
intermedio en la biosíntesis de isoflavonoides (Harada y Mino, 1973; Kape et al, 1991),
encontrándose en forma libre o esterificado en productos como el bálsamo de Perú
(Myroxylon balsamum), bálsamo de Tolú (Myroxylon toluiferum o Toluifera balsamum)
o canela de Ceilán (Cinnamomum zeylanicum o Cinnamomum verum) (Villavecchia y
Eigenmann, 1982). En vinos se encuentran sus derivados hidroxicinámicos como son los
ácidos cafeico, ferúlico y p-cumárico, procedentes de la uva, ya sea esterificados con
ácido tartárico o con glucosa, o en forma libre, más abundantes en uvas tintas que en
41
I. Introducción
blancas, llegando hasta 100 ppm en vinos tintos y hasta 5 ppm en vinos blancos (Gil
Hernández, 2010).
COOH
CH
COOH
COOH
COOH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
OCH3
OCH3
H3CO
OH
OH
OH
Ácido
cinámico
Ácido
ferúlico
CHO
CH2OH
CH2
CH3
CH
CH
CH
CH
CH
CH
CH2
CH
OCH3
OH
Coniferil aldehído
Ácido
p-cumárico
OCH3
Ácido 3,5-dimetoxi-4hidroxicinámico
OCH3
OCH3
OH
OH
Coniferil
alcohol
Eugenol
OH
Isoeugenol
Figura I.12. Derivados fenilpropanos evaluados como inhibidores de Saccharomyces cerevisiae.
I.3.5.1. Efecto inhibitorio del ácido cinámico
Su efecto inhibitorio sobre Saccharomyces cerevisiae ha sido estudiado en la producción
de biocombustibles (Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2000), ya que puede inhibir el 95%
del crecimiento celular y el 58% de la producción de etanol a una dosis de 1 g/l.
Mientras que una dosis de 200 mg/l tan sólo inhibe el crecimiento celular en un 76%
(Larsson et al, 2000).
42
I. Introducción
Como estrategia para disminuir su efecto inhibitorio, diferentes microorganismos
fermentativos han mostrado su capacidad de metabolizar el ácido cinámico,
convirtiéndolo principalmente en estireno (llamado también vinilbenceno, cinameno,
feniletileno o etenilbenceno), por ejemplo las levaduras Cryptococcus elinovii
(Middelhoven y Gelpke, 1995) y Pichia carsonii (Shimada et al, 1992), ambas en
condiciones aeróbicas, o por la levadura Saccharomyces cerevisiae, en condiciones
anaeróbicas (Chen y Peppler, 1956; Schwarz et al, 2012a; 2012b).
El mecanismo mediante el cual el ácido cinámico es convertido en estireno no está
claramente dilucidado, sin embargo, podría ser parcialmente explicado por el trabajo de
Chen y Peppler (1956) en el cual utilizaron cinamaldehído, que fue convertido por S.
cerevisiae en estireno, proceso que tiene como metabolito intermedio al ácido cinámico,
para lo cual utilizaron una cepa mutante en un medio con sacarosa y en condiciones
anaeróbicas.
En base a sus resultados propusieron dos alternativas, en primer lugar que el
cinamaldehído podría ser oxidado a ácido cinámico (Figura I.13a), el cual a su vez se
convertiría en estireno por simple descarboxilación. Como segunda alternativa,
propusieron una hidratación del cinamaldehído, para posteriormente liberar estireno y
ácido fórmico (Figura I.13b). Aunque sus resultados no respaldan la última propuesta,
puede constituir una alternativa para explicar la formación de estireno.
43
I. Introducción
a. Alternativa 1: Formación y descarboxilación del ácido cinámico
COOH
CHO
CH2
CH
CH
H2O
CO2
CH
Cinamaldehído
deshidrogenasa
Cinamaldehído
CH
CH
Descarboxilasa
Estireno
Ácido cinámico
b. Alternativa 2: Formación y escisión del hidrato de cinamaldehído
OH
HO CH
CHO
CH
H2O
CH
CH
CH2
CH
CH
+
Estireno
Cinamaldehído
HCOOH
Ácido fórmico
Figura I.13. Posibles mecanismos propuestos para la formación de estireno a partir de
cinamaldehído por Saccharomyces cerevisiae (Chen y Peppler, 1956).
Con respecto a la descarboxilación propuesta por Chen y Peppler (1956) como vía para
metabolizar y eliminar el ácido cinámico del medio fermentativo, en trabajos posteriores
también se ha descrito dicho proceso (Gramatica et al, 1981; Stratford et al, 2007; Mukai et
al, 2010; Schwarz et al, 2012a), el cual se llevaría a cabo de manera simultánea por las
enzimas descarboxilasa del ácido fenilacrílico (PAD) y descarboxilasa del ácido ferúlico
(FDC) de Saccharomyces cerevisiae, para convertir los ácidos cinámico, ferúlico y pcumárico en sus derivados vinilos tanto en condiciones aeróbicas como anaeróbicas
(Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2001), los dos últimos en 4-vinilguayacol y 4-vinilfenol
respectivamente (Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010). La conversión del ácido
44
I. Introducción
cinámico en estireno ocurriría mucho más rápido sobre todo durante las primeras etapas
de la fermentación (Schwarz et al, 2012a; 2012b), iniciándose inmediatamente después de
la inoculación de la levadura sin un periodo de adaptación al nuevo medio.
Por otro lado, Shimada et al (1992), trabajaron con una cepa de Pichia carsonii capaz de
tolerar hasta 200 mg/l de ácido cinámico (en su forma trans), cepa que tiene la
capacidad de producir estireno a partir de los ácidos trans-p-cumárico y cafeico, ácidos
asociados a la degradación microbiana del ácido trans-cinámico, lo cual indicaría una
nueva vía mediante la cual las levaduras podrían metabolizar el ácido cinámico,
utilizando dichos ácidos como intermediarios (Figura I.14). Proceso que podría ocurrir
en simultáneo con la descarboxilación propuesta por Chen y Peppler (1956).
COOH
COOH
COOH
CH
CH
CH
CH
CH
CH
HO
OH
Ácido trans-cinámico
Ácido trans-p-cumárico
OH
Ácido cafeico
CH2
CH
CO2
Estireno
Figura I.14. Vía de degradación del ácido trans-cinámico por la levadura Pichia carsonii
propuesta por Shimada et al (1992).
45
I. Introducción
46
I. Introducción
I.3.6. Otros ácidos orgánicos
En el contexto de la producción de biocombustibles también se ha evaluado el efecto
inhibitorio de ácidos orgánicos como el benzoico, acético, butanoico, propiónico,
fórmico, láctico, succínico y levulínico (Hawkins y Doran-Peterson, 2011; Huang et al,
2011), algunos de los cuales forman parte de los alimentos (Cubero et al, 2002), ya sea de
forma natural o como aditivos (European Union, 2011; FDA, 2013; García Araez 1953).
Dichos ácidos son producidos durante el pretratamiento de la lignocelulosa,
encontrándose por ejemplo en hidrolizados de madera de pino hasta en concentraciones
de: ácido benzoico (15 mg/l), fórmico (425 mg/l), láctico (100 mg/l), acético (2153
mg/l), succínico (28 mg/l) y levulínico (410 mg/l) (Hawkins y Doran-Peterson, 2011).
Estos ácidos han sido identificados como los principales inhibidores de la fermentación
alcohólica por S. cerevisiae (Huang et al, 2011), siendo el benzoico el que mayor efecto
presenta y a menor concentración, pues a 1 g/l puede reducir en un 75% la producción
de etanol con respecto al control, siendo su concentración crítica de inhibición 2 g/l.
Nivel crítico que para el ácido acético fue 6 g/l, fórmico 4 g/l, butanoico 3 g/l y
propiónico 4 g/l. La vainillina mostró este nivel en 4 g/l, mientras que el furfural y el
HMF mostraron niveles críticos mayores a 4 g/l. Siendo el nivel crítico la concentración
mínima a la cual la inhibición de la síntesis de etanol es mayor al 90%.
I.3.6.1. Efecto inhibitorio de los ácidos orgánicos
Los ácidos débiles producen un descenso en la producción de etanol y biomasa
(Pampulha y Loureiro-Dias, 1989; Taherzadeh et al, 1997; Hazan et al, 2004; Hawkins y
47
I. Introducción
Doran-Peterson, 2011; Huang et al, 2011), aunque el mecanismo por el que se produce el
efecto inhibitorio no está completamente aclarado.
Uno de los mecanismos propuesto es la teoría del desacoplamiento. Según esta teoría, el
efecto depende del pKa de los ácidos y del pH del medio. Únicamente la forma no
disociada de los ácidos penetra en la célula por difusión (Verduyn et al, 1992), donde,
debido al mayor pH intracelular se disocia, provocando un descenso del pH (Pampulha y
Loureiro-Dias, 1989) que debe ser compensado por una ATPasa de membrana que
bombea protones al exterior a costa de la hidrólisis de ATP. La menor cantidad de ATP
disponible para la formación de biomasa explicaría la disminución del crecimiento
celular en presencia de los ácidos. Cuando la concentración de ácido es suficientemente
alta, se supera la capacidad de bombeo de protones, lo que origina la acidificación del
citoplasma y la muerte celular (Imai y Ohono, 1995).
Otro mecanismo propuesto, es la acumulación intracelular de aniones (Russel, 1992),
según la cual, mientras que los protones son excretados los aniones son acumulados en
el interior celular. La inhibición podría estar relacionada con la toxicidad de estos
aniones.
Probablemente, el efecto de estos ácidos también se deba a una acción directa sobre la
integridad de la membrana (Heipieper et al, 1994), mediante una inserción que altera su
estructura e hidrofobicidad, produciendo un aumento de la permeabilidad de la misma y
afectando a su función de barrera selectiva.
48
I. Introducción
I.3.7. Metales
La presencia de metales pesados constituye un problema en los procesos fermentativos,
teniendo muchas veces que recurrir a su eliminación mediante diferentes procedimientos
(Ergun et al, 1997). Los iones metálicos pueden cambiar la tasa de glicólisis y por tanto la
conversión del piruvato a etanol (Pons y Chanel, 1991; Chandrasena et al, 1997; Walker y
Maynard, 1997). Sin embargo los mecanismos mediante los cuales estos metales actúan
no están del todo claros.
I.3.7.1. El cobre
El cobre (Cu) es un nutriente esencial para todos los organismos, siendo el tercer metal
de transición más abundante en organismos vivos y es un grupo prostético esencial de
enzimas como la citocromo oxidasa en la mitocondria (Silva y Williams, 1993),
superóxido dismutasa en el citosol, requerida para la detoxificación de radicales libres
(Brandolini et al, 2002) y ferrooxidasa en la membrana plasmática. Es uno de los
microelementos esenciales requerido en numerosas actividades celulares, incluyendo la
absorción de hierro (Dancis et al, 1994; Eide, 1998; Linder et al, 1996; Stearman et al, 1996;
Fernandez et al, 1998; O’Halloran y Culotta, 2000). A bajas concentraciones, puede actuar
como un micronutriente esencial para el crecimiento microbiano, sirviendo como
cofactor enzimático y como resultado de su capacidad para experimentar transiciones de
Cu (I) a Cu (II), desempeña un importante rol en las reacciones redox (Cervantes y
Gutierrez-Corona, 1994; Stohs y Bagchi, 1995).
49
I. Introducción
Uno de sus orígenes más comunes está en el tratamiento de los viñedos contra el hongo
del mildiu mediante la utilización de sustancias como el sulfato de cobre (Pons y Chanel,
1991). En los mostos usualmente el cobre se puede encontrar en concentraciones entre
0,64 – 6,40 mg/l (Curvelo-Garcia, 1988) y algunas veces es añadido al vino para reducir
los niveles de sulfuroso y sustancias relacionadas. El contenido en vinos, como algunos
de los elaborados en Estados Unidos, se encuentra en el rango entre 0,1 – 0,3 mg/l,
aunque el Código Internacional de Prácticas Enológicas (OIV, 2008) acepta un límite
máximo de 1 mg/l. A mayores concentraciones, el Cu puede inducir la oxidación de los
compuestos fenólicos y a concentraciones superiores a 9 mg/l puede inhibir la
fermentación alcohólica (Zoecklein et al, 1999).
I.3.7.2. Efecto inhibitorio del cobre
Se conoce que el Cu es transportado al interior celular por las proteínas transportadoras
Ctr1p y Ctr3p (copper transporter protein), y distribuido entre las proteínas para las
cuales es requerido. Además existen sensores celulares que detectan altas
concentraciones de Cu, activando los mecanismos de protección (producción de
metalotioneínas, que se unen al Cu) y desactivando los mecanismos de transporte
(Knight et al, 1996; Santoro y Thiele, 1997).
En general se han descrito algunos mecanismos de toxicidad de los metales pesados
sobre Saccharomyces cerevisiae (Blackwell et al, 1995), toxicidad que depende de la cepa
y de las condiciones de crecimiento (Sarais et al, 1994; Pearce y Sherman, 1999). Del
mismo modo se han documentado los mecanismos de protección y desarrollo de
tolerancia (Paraggio et al, 1997; Perego y Howell, 1997). La tolerancia de algunas cepas se
50
I. Introducción
ha asociado con el incremento de la actividad de determinadas enzimas como la Cu/ZnSOD o la H(+)ATPasa (Fernandes y Sá-Correia, 1999), tolerancia que incrementa al
realizar cultivos repetidos de la levadura en presencia de los metales y que afecta la
absorción de estos metales por la célula (White y Gadd, 1986; Brady et al, 1994a).
Los efectos del Cu están relacionados a la fuerte capacidad de coordinación de los
metales pesados, y ellos incluyen bloqueo de grupos funcionales y modificación
conformacional de macromoléculas celulares, desplazamiento de iones esenciales y
disrupción de membranas organelares y celulares (Gadd, 1993). Interactúa con los ácidos
nucleicos celulares y con sitios activos de las enzimas, aunque se considera que la
membrana plasmática es el principal sitio de acción (disrupción de la membrana)
(Ohsumi et al, 1988; Cervantes y Gutierrez-Corona, 1994; Stohs y Bagchi, 1995). Por tanto,
la exposición a elevadas concentraciones de Cu puede conducir a un rápido
debilitamiento de la membrana celular, lo cual generalmente se manifiesta a través de la
pérdida de solutos celulares como el potasio (K+) y la muerte celular (Ohsumi et al, 1988;
Avery et al, 1996). Otros metales menos tóxicos como el Zn, Co y Mn no inducen un
eflujo de K+ de esta naturaleza (Ohsumi et al, 1988).
Además, su efecto inhibitorio podría deberse presumiblemente a la unión indiscriminada
del Cu a restos tiol, o por catalizar reacciones tipo Fenton, produciendo el radical
hidroxilo (OH-) altamente dañino (Stillman y Presta, 2000), a partir del peróxido de
hidrógeno (H2O2) y del anión superóxido (O-2) (Halliwell y Gutteridge, 1999; Avery, 2001).
La exposición a niveles sub letales de Cu induce un estrés oxidativo similar al inducido
por los radicales libres (ERO) (Shanmuganathan et al, 2004).
51
I. Introducción
Efectos similares reportados en organismos superiores son atribuidos a la naturaleza
redox del Cu y a su capacidad de catalizar la generación de ERO y promover la
peroxidación lipídica de la membrana (Mehlhorn, 1986; Halliwell y Gutteridge, 1999; Stohs
-
-
y Bagchi, 1995). Las ERO como H2O2, O 2 y OH se generan normalmente durante el
metabolismo aeróbico (Richter y Schweizer, 1997), pudiendo comprometer severamente
la salud y viabilidad celular al causar daño en macromoléculas como ácidos nucleicos y
proteínas celulares, ya sea a través de la oxidación de aminoácidos a derivados hidroxilo
o carbonilo, o por ruptura de sus enlaces peptídicos (Cabiscol et al, 2000; Costa et al,
2002). Las proteínas individualmente muestran diferentes susceptibilidades al ataque
oxidativo, dependiendo de su composición en grupos sulfhidrilo, clusters Fe-S,
fracciones hemo y grupos prostéticos de cobre (Davies, 1995). El daño oxidativo a las
membranas lipídicas, ha sido identificado como un modo de acción sobre
Saccharomyces cerevisiae (Avery et al, 1996; Howlett y Avery, 1997), toxicidad que
incrementa considerablemente con la insaturación de los ácidos grasos de la membrana
plasmática, promoviendo una mayor permeabilización de ésta (Avery et al, 1996),
convirtiendo a los ácidos grasos poliinsaturados en el principal objetivo de los radicales
libres (Halliwell y Gutteridge, 1999).
El estrés oxidativo ocurre durante las primeras horas de exposición y es un proceso
dinámico que involucra a enzimas claves en el catabolismo de la glucosa como la
alcohol deshidrogenasa (ADH), enolasa, fructosabifosfato aldolasa (aldolasa),
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa
(GAPDH),
hexoquinasa,
piruvato
decarboxilasa, fosfoglicerato quinasa, entre otras (Shanmuganathan et al, 2004). La
oxidación de la enzima ADH es un mecanismo por el cual la fermentación de la glucosa
puede ser rápidamente afectada, que junto con la aparente oxidación de otras enzimas
52
I. Introducción
glicolíticas, produce una respuesta metabólica celular similar a otras formas de estrés
oxidativo (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003). Esta respuesta involucra un
redireccionamiento metabólico transitorio de equivalentes de glucosa a través de la vía
de la pentosa fosfato (que resulta de la inactivación selectiva de determinadas enzimas
glicolíticas). Se ha propuesto que este cambio metabólico puede proveer el poder
reductor necesario (NADPH2) para las enzimas antioxidantes como las glutaredoxina
(Holmgren, 1989; Godon et al, 1998; Cabiscol et al, 2000).
Los organismos aeróbicos han desarrollado una red de mecanismos de defensa contra las
ERO, que incluyen moléculas encargadas de eliminarlas (por ejemplo superóxido
dismutasas, catalasas), enzimas reparadoras del daño oxidativo (por ejemplo metionina
sulfóxido reductasa) (Cadenas, 1989; Santoro y Thiele, 1997; Jamieson, 1998; Avery y Avery,
2001), y mecanismos tales como la S-tiolación de proteínas susceptibles de oxidación, lo
cual previene la oxidación por formación reversible de enlaces disulfuro mixtos con
tioles (Grant et al, 1998).
53
I. Introducción
54
II. Objetivos
CAPÍTULO II: OBJETIVOS
55
II. Objetivos
56
II. Objetivos
II.1. Objetivo general
Realizar una valoración sobre el efecto de los diferentes bloqueadores metabólicos sobre
la producción de etanol por la levadura Saccharomyces cerevisiae en diferentes
condiciones de fermentación y su repercusión en la composición de los vinos
elaborados, estudiando las desviaciones en los parámetros tecnológicos más
representativos.
II.2. Objetivos específicos
-
Verificar el grado de especificidad de cada bloqueador metabólico en relación a
la levadura sobre la que actúa, así como el efecto con respecto a diferentes
condiciones de fermentación como temperatura, pH y concentración de azúcares
en el mosto.
-
Estudiar el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de
metabolitos secundarios de importante repercusión en el vino como la glicerina,
aldehídos, alcoholes, ácidos, ésteres y cetonas. Así como su efecto sobre los
parámetros colorimétricos más importantes, especialmente en vinos tintos.
-
Estudiar el momento óptimo de adición de los bloqueadores metabólicos,
determinando la etapa fermentativa en la que tienen un mayor efecto inhibitorio,
así como los mecanismos mediante los cuales son metabolizados por las
levaduras y la síntesis de compuestos derivados que puedan tener repercusión en
el vino.
57
II. Objetivos
58
III. Materiales y métodos
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODOS
III.1. Levaduras empleadas
III.2. Medios de fermentación
III.3. Bloqueadores metabólicos utilizados
III.4. Fermentaciones
III.5. Análisis realizados tras las fermentaciones
III.6. Análisis estadístico
59
III. Materiales y métodos
60
III. Materiales y métodos
III.1. Cepas de levaduras utilizadas
Se han empleado diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae: 7VA (D.O. Ribera del
Duero) y CM15 (D.O. Somontano), aisladas por el Grupo de Investigación
enotecUPM de la Universidad Politécnica de Madrid. Además de las cepas
comerciales Distinction y AWRI796 (Maurivin, Queensland, Australia).
La cepa AWRI796, catalogada como una levadura de bajo rendimiento de etanol y alta
producción de glicerina (Maurivin, 2013), ha sido previamente evaluada como una cepa
glicolíticamente ineficiente al producir bajas cantidades de etanol (Loira et al, 2012).
III.2. Medios de fermentación
Se han utilizado tres tipos de medios fermentativos:
-
Medio sintético a base de extracto de levadura (3 g/l), peptona (3 g/l), tartrato de
potasio (0,8 g/l) (Pronadisa, España) y de concentraciones variables de azúcar,
principalmente glucosa (Panreac, Barcelona, España).
-
Medios a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen
suplementandos con 200 mg/l de activador de fermentación Actimax PLUS
(Agrovin, España).
-
Medios fermentativos a partir de mosto fresco de uva tinta de las variedades
Tempranillo y Syrah, para estudiar el efecto de los bloqueadores metabólicos
sobre los parámetros tecnológicos más representativos en vinos tintos.
61
III. Materiales y métodos
Los medios fermentativos se han utilizado a concentraciones variables de azúcar para
verificar el efecto de los bloqueadores en función del grado alcohólico probable (GAP).
El pH se ha estandarizado a 3,5 mediante la adición de ácido tartárico (Pronadisa,
Madrid, España), excepto en los ensayos en los que se ha estudiado el efecto de
diferentes valores de pH, lo cual se indica en el apartado correspondiente.
Antes de inocular los medios con las respectivas levaduras, se han sometido a un
proceso de pasteurización a 100 ºC por 3 minutos con el fin de reducir la carga
microbiana que pueda estar presente en los medios fermentativos.
III.3. Bloqueadores metabólicos utilizados
Se han utilizado los siguientes compuestos reportados en la bibliografía por su
capacidad para inhibir la fermentación alcohólica en Saccharomyces cerevisiae: furfural
(Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Alemania), o-vainillina, glicolaldehído, pbenzoquinona, ácido trans-cinámico (Fluka, Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza) y
cobre como CuSO4.5H2O (Panreac, Barcelona, España). Todos ellos adicionados en los
medios fermentativos según se describe en los apartados correspondientes.
III.4. Fermentaciones
Las microfermentaciones se han realizado con los medios fermentativos inoculados con
las cepas de Saccharomyces cerevisiae a una densidad celular del orden de 108 UFC/ml
sincronizadas en medio YEPD (Yarrow, 1998). Los microvinificadores en los cuales se
han realizado las fermentaciones han variado en función del volumen de medio utilizado
62
III. Materiales y métodos
y de los análisis a realizar para cada ensayo. Todos ellos con un volumen de operación
equivalente al 70% de su capacidad.
En los ensayos para determinar únicamente el grado alcohólico y azúcares residuales se
han utilizado microvinificadores de 10 ml, mientras que para realizar los análisis antes
mencionados además de glicerina, acidez volátil, parámetros colorimétricos y
compuestos volátiles, se han utilizado microvinificadores de 60 ml. Todos ellos sellados
con el fin de mantener las condiciones amicróbicas y tan sólo permitir la salida de CO2,
como se muestra en la Figura III.1. Los microvinificadores de 60 ml se han sellado con
válvulas Müller llenas con H2SO4 al 98 % (Panreac, Barcelona, España).
10 ml
60 ml
Figura III.1. Microvinificadores utilizados en las fermentaciones.
En la mayoría de los experimentos la temperatura se ha mantenido constante, en torno a
22 ºC, excepto en la prueba donde se estudió el efecto de diferentes temperaturas en la
inhibición de la fermentación alcohólica por el furfural, a 18 y 25 ºC. Los viales se han
pesado diariamente con el fin de determinar gravimétricamente el final de la
63
III. Materiales y métodos
fermentación, tras lo cual se ha procedido a realizar los diferentes análisis descritos a
continuación.
III.5. Análisis realizados tras las fermentaciones
III.5.1. Determinación del grado alcohólico
El grado alcohólico final alcanzado en las diferentes fermentaciones se ha determinado
mediante cromatografía líquida de alta resolución con detección por índice de refracción
(HPLC-RI), para lo cual se ha utilizado un cromatógrafo Waters e2695 Alliance
(Waters, EE.UU.) acoplado a un detector RI 2412 (Figura III.2). La separación se ha
realizado utilizando una columna PhenoSphere-Next 5u C18 de tamaño 150 x 4,6 mm
(Phenomenex, EE.UU.). Previo al análisis cromatográfico se ha realizado un calibrado
con soluciones de 5, 10, 15 y 20 % de etanol grado HPLC al 99,5% (Panreac, España).
Aproximadamente 1 ml de muestra fue filtrada en membrana de 0,45 μm (Teknokroma,
Barcelona, España) y añadido en viales de vidrio de 2 ml con tapa de PTFE/silicona.
III.5.2. Determinación de azúcares residuales y glicerina
En base a los métodos oficiales de la Organización Internacional de la Viña y el Vino
(OIV) para azúcares residuales (OIV-MA-AS311–02) y para glicerina (OIV-MAAS312-05). Con este propósito se ha utilizado un equipo automático de análisis
mediante test enzimático Biosystems Y15 (Biosystems S.L., España) (Figura III.2).
64
III. Materiales y métodos
A
B
Figura III.2. A: Equipo HPLC-RI (Waters) para determinar el grado
alcohólico. B: Analizador automático (Biosystems Y15) para determinar
azúcares residuales y glicerina.
III.5.3. Parámetros colorimétricos
Las variables de color se han determinado por absorbancia utilizando un
espectrofotómetro Agilent 8453 UV-visible System, a 420, 520 y 620 nm utilizando una
cubeta de cuarzo de 1 mm de longitud de paso de luz, en base a la metodología
propuesta por Glories (1984a; 1984b). Se han calculado la intensidad colorante (IC),
tonalidad (T) y los porcentajes de rojo, amarillo y azul.
III.5.4. Determinación de la acidez volátil
La acidez volátil se ha determinado mediante el Método Oficial de la Organización
Internacional de la Viña y el Vino para acidez volátil (OIV-MA-AS313–02), el cual
consiste en una valoración ácido–base de los ácidos volátiles, los cuales se han separado
65
III. Materiales y métodos
haciendo uso de un destilador automático DEE Gibertini conectado a una unidad
generadora de vapor VADE 3 Gibertini (Gibertini Electrónica SRL, Novate, Italia).
III.5.5. Análisis de compuestos volátiles de origen fermentativo
El análisis de los compuestos volátiles de origen fermentativo se ha realizado por
cromatografía de gases con detector de ionización de llama (GC-FID), empleando el
cromatógrafo Agilent Technologies 6850 (Network GC System) equipado con un
detector de ionización de llama integrado (Figura III.3). Se ha empleado una columna
DB-624 (60 m x 250 μm x 1,4 μm nominal). La temperatura del inyector fue de 250 ºC
y la del detector 300 ºC. La temperatura de la columna fue de 40 ºC durante los 5
primeros minutos y linealmente programada a 10 ºC/min hasta 250 ºC, manteniendo a
esa temperatura final durante 5 minutos. El gas de arrastre fue hidrógeno, suministrado
mediante el generador LNI Schmidlin SA, con un flujo de 22,1 l/min. La inyección fue
de tipo split, con un split ratio de 1:10. El límite de detección fue de 0,1 mg/l. Se ha
utilizado 4-metil-2-pentanol como estándar interno y como patrones de referencia
externos: acetaldehído, metanol, 1-propanol, 1-butanol, 2-butanol, isobutanol, 2-metil-1butanol, 3-metil-1-butanol, 2-feniletanol, hexanol, 2,3-butanodiol, diacetilo, acetoína,
acetato de etilo, lactato de etilo, acetato de isoamilo y acetato de 2-feniletilo (Fluka,
Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza).
1 ml de muestra - filtrado en membrana de 0,45 μm (Teknokroma, Barcelona, España) fue añadido y mezclado con 100 μl del estándar interno (4-metil-2-pentanol,
concentración de 500 mg/l) en viales de vidrio de 2 ml con tapa de PTFE/silicona.
66
III. Materiales y métodos
A
B
Figura III.3. Equipos (Agilent) para análisis cromatográfico. A: GC-FID para analizar
compuestos volátiles fermentativos. B: GC-MS para analizar el contenido residual de los
bloqueadores metabólicos y sus derivados.
III.5.6. Análisis de los bloqueadores metabólicos y sus derivados tras las
fermentaciones
La metodología descrita a continuación se ha desarrollado para determinar el contenido
residual de los diferentes bloqueadores metabólicos y/o sus derivados una vez finalizada
la fermentación alcohólica.
Dichos compuestos fueron separados del vino por extracción líquido-líquido con
diclorometano (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Alemania) y luego identificados
y cuantificados por cromatografía de gases con detección por espectrometría de masas
(GC-MS), para lo cual se utilizó un espectrómetro de masas Agilent 5973 Network
acoplado a un cromatógrafo de gases Agilent 6890 N (Figura III.3). Empleando una
columna Agilent 122-7032 DB-WAX (30 m x 250 μm x 0,25 μm nominal), calibrada
con los siguientes patrones externos: alcohol vainíllico, o-vainillina y ácido transcinámico (Fluka, Sigma-Aldrich Corp., Buchs SG, Suiza), vainillina, furfural, alcohol
furfurílico y 3,4-dimetilfenol como estándar interno (Merck Schuchardt OHG,
Hohenbrunn, Alemania). Utilizando un inyector Agilent 7683 Series con una
temperatura de trabajo de 200 ºC y un volumen de inyección de 1 μl. La temperatura del
67
III. Materiales y métodos
detector fue de 280 ºC. El gas de arrastre fue helio, con un flujo de 24,4 ml/min. La
inyección fue de tipo split, con un ratio de 1:20. Trabajando en modo SCAN, e
identificando los iones en modo SIM.
Para lo cual se tomaron 10 ml del vino y se colocaron en tubos tipo Falcon de 15 ml,
agregando a cada tubo 100 μl de estándar interno (3,4-dimetilfenol de 1000 mg/l en
etanol), además de 1,5 g de cloruro sódico (Panreac, Barcelona, España) y 1 ml de
diclorometano. Procediendo a agitar durante 5 minutos para facilitar la extracción,
centrifugando luego 7 minutos a 7000 rpm y 4 ºC. Tras lo cual la fase orgánica se separó
colocándola en viales de 2 ml y midiendo por GC-MS. El programa de temperatura
utilizado se muestra en la Tabla III.1.
Tabla III.1. Programa de temperaturas utilizado para análizar las cantidades
residuales de los bloqueadores metabólicos y sus derivados por GC-MS.
ºC/min
Inicio
Rampa
10
Temperatura
(ºC)
50
240
Mantenimiento
(min)
1
10
Tiempo total
(min)
1
30
30
III.6. Análisis estadístico
El análisis estadístico se ha realizado con el software para PC Statgraphics v.5 (Graphics
Software Systems, Rockville, MD, USA), con un nivel de significancia del 95% (p <
0.05) utilizando el Test de Rangos Múltiples de Tukey (HSD) para determinar las
diferencias significativas así como otros análisis que se describen en los apartados
correspondientes.
68
IV. Resultados y discusión
CAPÍTULO IV: RESULTADOS Y DISCUSIÓN
IV.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre el grado alcohólico
IV.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros
colorimétricos, producción de glicerina y producción de
compuestos volátiles de origen fermentativo
69
IV. Resultados y discusión
IV.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos sobre el grado
alcohólico
-
Efecto inhibitorio del furfural
-
Efecto inhibitorio de la o-vainillina
-
Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico
-
Efecto inhibitorio del glicolaldehído
-
Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona
-
Efecto inhibitorio del cobre
70
IV. Resultados y discusión
IV.1.1. Efecto inhibitorio del furfural
A continuación se describen los experimentos llevados a cabo con adición de furfural a
diferentes dosis, con diferentes levaduras, en diferentes momentos de dosificación y en
diferentes condiciones ambientales. Las concentraciones se han elegido de tal manera
que sean equiparables a los diferentes compuestos volátiles del vino, y considerando las
concentraciones máximas en las que el furfural se encuentra en muchos alimentos.
Los primeros ensayos se han realizado con dosis de furfural de hasta 50 mg/l, con el fin
de determinar la concentración a la que se obtiene un efecto inhibitorio considerable
sobre la producción de etanol, incrementando posteriormente hasta 200 mg/l, con el fin
de comprobar si a mayores dosis el efecto inhibitorio es mayor.
IV.1.1.1. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en
un medio sintético con 12,5 % de GAP
Se ha utilizado la levadura 7VA, a temperatura constante de 22 ºC en un medio sintético
con 12,5 % v/v de grado alcohólico probable (GAP) (115 g/l de glucosa y 115 g/l de
fructosa). Las concentraciones añadidas de furfural han sido de 1, 5, 10, 20 y 50 mg/l,
dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición
del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.1.1.1. Grado alcohólico
La Figura IV.1 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico tras las
fermentaciones. Se observa como la adición de furfural ejerce un efecto inhibitorio sobre
71
IV. Resultados y discusión
el metabolismo fermentativo de la levadura. Esta reducción es de 0,11 y 0,21 % v/v con
respecto al control para los tratamientos de 1 y 5 mg/l de furfural respectivamente, y
posteriormente se amplía hasta 0,37 % v/v al adicionar 10 mg/l de furfural. Dosis
superiores no parecen propiciar reducciones de grado alcohólico relevantes (Apéndice
B.1), pues tan sólo se logra reducir el grado alcohólico en 0,39 y 0,41 % v/v a las dosis
de 20 y 50 mg/l de furfural añadido respectivamente.
Considerando las cuestiones con respecto al uso de altas concentraciones de furfural
como aditivo en la industria alimentaria, y teniendo en cuenta los resultados obtenidos,
las dosis de 10 y 50 mg/l de furfural presentan una aplicabilidad interesante de evaluar
bajo otras condiciones de trabajo, lo cual se desarrolla en los ensayos posteriores.
12,5
Grado alcohólico % v/v
12,3
12,1
11,9
11,7
11,5
0
1
5
10
20
50
Furfural (mg/l)
Figura IV.1. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con la levadura 7VA en
un medio sintético con 12,5 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
IV.1.1.1.2. Azúcares residuales
Se analizó la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones (Tabla IV.1), y
en base a los resultados obtenidos se puede concluir que el furfural no reduce la
72
IV. Resultados y discusión
utilización de los azúcares por parte de la levadura, ya que las concentraciones
residuales son muy bajas o nulas, independientemente del tipo de azúcar utilizado.
Tabla IV.1. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural
con la levadura 7VA en un medio sintético con 12,5 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
1
5
10
20
50
Azúcares residuales (g/l)
Glucosa
Fructosa
0,00 ± 0,00 a
0,09 ± 0,03 a
0,01 ± 0,01 a
0,09 ± 0,10 a
0,01 ± 0,01 a
0,02 ± 0,02 a
0,00 ± 0,00 a
0,04 ± 0,02 a
0,01 ± 0,01 a
0,08 ± 0,07 a
0,00 ± 0,00 a
0,06 ± 0,08 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas en el contenido de azúcares residuales (p < 0,05).
IV.1.1.2. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de furfural sobre
diferentes cepas de Saccharomyces cerevisiae en un medio sintético con
alto contenido de azúcar
Se ha trabajado con las levaduras 7VA, Distinction y AWRI796; a temperatura
constante de 22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los
tratamientos con furfural han sido de 10 y 50 mg/l dosificados al inicio de las
fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los
ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.1.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV.2 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico, los cuales
varían en función de la cepa de levadura utilizada, tal como se ha reportado previamente
(Lu et al, 2007). La cepa Distinction es la que muestra una diferencia más acusada al
73
IV. Resultados y discusión
reducir el grado alcohólico en 0,69 % v/v con respecto al control a la dosis de 50 mg/l de
furfural. La cepa AWRI796 reduce a esa concentración de furfural el grado alcohólico
en 0,45 % v/v, mientras que la cepa 7VA reduce tan sólo en 0,17 % v/v el grado
alcohólico con respecto al control.
Estos resultados muestran además que el efecto del furfural varía en función de la
concentración de azúcar en el medio fermentativo (Lu et al, 2007), pues a diferencia del
ensayo anterior, en el cual la concentración de azúcar fue menor, en este ensayo la dosis
de 10 mg/l de furfural parece no tener un efecto considerable en el grado alcohólico,
pues se obtuvieron reducciones de tan sólo 0,10 y 0,25 % v/v para las cepas 7VA y
AWRI796 respectivamente, mientras que en el caso de la cepa Distinction se observa un
comportamiento opuesto, pues el grado alcohólico incrementa con respecto al control.
Grado alcohólico % v/v
15,5
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
7VA
Distinction
Furfural (mg/l)
0
AWRI 796
10
50
Figura IV.2. Grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas
dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
74
IV. Resultados y discusión
IV.1.1.2.2. Acidez volátil
La Tabla IV.2 muestra los resultados obtenidos en la valoración de la acidez volátil,
observándose variabilidad con respecto a la levadura utilizada. La cepa 7VA muestra un
aumento en la acidez volátil a medida que la dosis de furfural se incrementa. En las
cepas Distinction y AWRI796 no se puede establecer una correlación lineal entre la
acidez volátil y la dosis de furfural añadida, llegando incluso a disminuir ligeramente la
acidez volátil en el caso de la segunda.
Tabla IV.2. Acidez volátil con diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis
iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
10
50
7VA
0,70 ± 0,04 a
0,87 ± 0,12 b
0,91 ± 0,10 b
Acidez volátil (g/l)
Distinction
0,88 ± 0,09 a
0,91 ± 0,03 a
0,87 ± 0,00 a
AWRI796
0,84 ± 0,04 a
0,79 ± 0,09 a
0,81 ± 0,10 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas
en el contenido de acidez volátil (p < 0,05).
Una posible explicación a la reducción de la acidez volátil en la cepa AWRI796 es que
el furfural estaría inhibiendo la formación de ácido acético, favoreciendo la producción
de ácido furoico (Villa et al, 1992) mediante un mecanismo de inhibición competitiva
sobre la enzima AlDH (Horváth et al, 2003; Modig et al, 2002), proceso que se ilustra en la
Figura I.5. Si bien la oxidación del furfural a ácido furoico es menos favorecida que su
reducción a alcohol furfurílico, su utilización podría constituir una interesante
alternativa para disminuir la acidez volátil (Taherzadeh et al, 1999), pues dichos autores
lograron ralentizar la tasa de producción de ácido acético por S. cerevisiae
inmediatamente después de dosificar furfural en las primeras etapas de la fermentación,
aunque hacia el final la producción de acetato se recuperó hasta alcanzar 0,35 g/l.
75
IV. Resultados y discusión
Otro trabajo con resultados similares es el realizado por Palmqvist et al (1999), en el cual
se retrasó la producción de ácido acético por S. cerevisiae al dosificar furfural al inicio
de la fermentación. Sin embargo, lo más destacable de ese estudio fue el incremento de
la producción de ácido pirúvico, alcanzando niveles casi cinco veces superiores al
control (88 mg/l con furfural añadido y 18 mg/l en el control). Fenómeno que estaría
directamente relacionado con la disminución de la capacidad para convertir el piruvato a
acetaldehído debido a la acumulación de este último en presencia de furfural, mientras
que el ácido acético se convierte en acetil-CoA (Figura I.5); aunque también podría estar
involucrado un efecto inhibitorio sobre la enzima piruvato descarboxilasa mientras el
furfural añadido no es completamente metabolizado.
En este contexto, se podría aprovechar la acumulación temporal de piruvato, el cual
puede condensarse químicamente con la malvidina-3-glucósido de la uva para formar el
pigmento piranoantociánico vitisina A (Morata et al, 2007; Súarez-Lepe y Morata, 2012),
como interesante alternativa para mejorar la estabilidad del color en vinos tintos.
IV.1.1.2.3. Compuestos volátiles de origen fermentativo
Durante la fermentación alcohólica se genera una gran variedad de compuestos volátiles
que tienen un importante impacto sensorial en el vino. Desde un punto de vista
cuantitativo estos compuestos son los más abundantes en la fracción aromática del vino,
proporción que depende del tipo de levadura utilizada, condiciones de fermentación,
variedad de uva y composición del mosto.
76
IV. Resultados y discusión
Las Tablas IV.3 y IV.4 y las Figuras IV.3 - IV.5 muestran la producción de compuestos
volátiles fermentativos, los cuales varían en función de la cepa de S. cerevisiae utilizada,
aunque todas las concentraciones determinadas se encuentran dentro de los rangos
habituales en vinificación. En cuanto al análisis por grupos de compuestos, no se han
encontrado diferencias en la producción de alcoholes, ésteres y cetonas por las diferentes
levaduras a las dosis de furfural añadidas, mientras que para el acetaldehído sí se
obtienen diferencias, como se puede apreciar en la Tabla IV.3.
Con las levaduras Distinction y AWRI796 no se aprecia un efecto significativo del
furfural en la producción acetaldehído, mientras que en la cepa 7VA se incrementa su
producción en torno al 20 % con respecto al control a medida que se incrementa la dosis
de furfural hasta 10 mg/l, una dosis superior de furfural no parece propiciar un
incremento significativo.
Tabla IV.3. Producción de acetaldehído por diferentes cepas de S. cerevisiae a
distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
10
50
Acetaldehído (mg/l)
7VA
Distinction
AWRI 796
53,95 ± 1,83 a 30,48 ± 11,06 a
34,65 ± 7,78 a
64,72 ± 9,30 b
34,61 ± 7,01 a
36,77 ± 4,03 a
65,05 ± 2,04 b
27,98 ± 4,71 a
33,92 ± 4,71 a
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05).
Estos resultados concuerdan con trabajos previos (Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002)
en los cuales se observó un incremento en la producción de acetaldehído. Aunque en el
trabajo de Palmqvist et al (1999) la concentración de glucosa del medio fue mucho menor
(30 g/l) y la concentración inicial de furfural dosificada fue mucho más alta (2,8 g/l), se
obtuvieron en las primeras etapas de la fermentación una producción de hasta 92 mg/l de
77
IV. Resultados y discusión
acetaldehído, la cual fue disminuyendo en el transcurso del tiempo. Al finalizar el
proceso fermentativo siguió siendo superior con respecto al control (la producción
máxima del control fue de 4,4 mg/l). Lo cual podría ser explicado en base a otros
trabajos (Liu et al, 2005; Nilsson et al, 2005), quienes propusieron que el furfural es
convertido en alcohol furfurílico (Figura I.5), menos perjudicial para S. cerevisiae,
utilizando para ello la enzima ADH (Modig et al, 2002) en detrimento de la conversión de
acetaldehído a etanol (inhibición competitiva) (Azhar et al, 1981; Navarro et al, 1994),
acumulándose por tanto el acetaldehído en el medio.
Este incremento temporal en la producción de acetaldehído podría ser de utilidad en
vinificación debido a su capacidad para condensarse químicamente con la malvidina-3glucósido de la uva y formar el pigmento piranoantociánico vitisina B (Morata et al,
2007; Súarez-Lepe y Morata, 2012) así como favorecer la formación de nuevos pigmentos
actuando como puente en la condensación entre la (-)-epicatequina y la malvidina-3glucósido (Sun et al, 2008). Interesante alternativa para mejorar la estabilidad del color en
vinos tintos.
En los demás compuestos volátiles fermentativos no se aprecia un efecto considerable
sobre su producción, lo cual indica que las dosis de furfural añadidas serían las
adecuadas con el fin de no afectar su síntesis por la levadura y alterar la composición del
vino.
78
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.4. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por diferentes cepas de S. cerevisiae a distintas dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15
% de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Furfural
(mg/L)
1-Propanol
Diacetilo
Acetato de
etilo
2-Butanol
Isobutanol
1-Butanol
2-Metil-1-
3-Metil-1-
Butirato
Lactato
Acetato de
butanol
butanol
de etilo
de etilo
isoamilo
2-Feniletanol
Levadura 7VA
0
10,10 ± 0,98
12,33 ± 3,81
21,92 ± 2,72
0,74 ± 0,13
11,04 ± 0,31
2,85 ± 1,04
47,40 ± 1,30
21,53 ± 0,76
14,55 ± 2,62
13,61 ± 15,88
5,29 ± 4,17
11,19 ± 1,19
10
11,65 ± 1,33
4,91 ± 4,22
27,70 ± 1,52
0,76 ± 0,08
11,89 ± 0,44
6,02 ± 1,24
51,76 ± 1,91
23,58 ± 1,50
3,19 ± 5,52
16,31 ± 13,88
1,52 ± 2,64
11,41 ± 2,24
50
10,72 ± 1,40
6,06 ± 2,48
24,92 ± 2,03
0,71 ± 0,06
11,30 ± 0,50
4,48 ± 2,86
49,26 ± 3,90
20,36 ± 3,09
9,14 ± 8,97
8,66 ± 6,68
1,87 ± 3,25
13,11 ± 1,61
Levadura Distinction
0
30,75 ± 8,06
18,07 ± 9,75
33,09 ± 7,24
0,67 ± 0,03
27,71 ± 4,04
1,47 ± 2,08
75,96 ± 2,29
30,09 ± 6,54
25,55 ± 13,74
16,59 ± 19,67
6,48 ± 9,16
13,58 ± 2,98
10
29,97 ± 3,97
18,34 ± 6,59
42,69 ± 3,99
0,68 ± 0,09
26,38 ± 1,68
3,03 ± 2,90
77,59 ± 1,66
28,91 ± 4,23
21,56 ± 8,84
13,34 ± 8,63
2,00 ± 3,47
17,52 ± 1,33
50
26,23 ± 4,08
18,79 ± 5,75
38,97 ± 4,45
0,57 ± 0,11
26,48 ± 2,34
3,36 ± 0,69
74,26 ± 4,68
26,35 ± 4,03
24,50 ± 6,09
15,59 ± 14,94
7,51 ± 4,63
16,93 ± 0,86
Levadura AWRI796
0
19,95 ± 5,54
18,79 ± 11,58
30,12 ± 1,56
0,71 ± 0,03
21,33 ± 3,04
4,53 ± 2,57
66,22 ± 9,06
27,35 ± 3,46
24,03 ± 7,82
10,03 ± 4,79
6,93 ± 3,78
6,77 ± 7,18
10
19,45 ± 6,73
14,52 ± 9,20
32,82 ± 6,16
0,80 ± 0,18
21,41 ± 2,53
2,65 ± 3,55
65,96 ± 10,97
26,86 ± 4,45
27,55 ± 10,32
12,84 ± 10,11
4,10 ± 3,91
11,06 ± 7,63
50
16,63 ± 3,14
16,67 ± 3,60
30,03 ± 3,60
0,69 ± 0,09
19,31 ± 1,05
3,34 ± 1,79
58,67 ± 5,07
23,04 ± 0,58
15,20 ± 13,96
5,62 ± 3,53
5,76 ± 5,80
9,99 ± 2,17
79
IV. Resultados y discusión
Levadura 7VA
80
70
mg/L
60
50
40
30
20
10
Ac
e
ta
ld
eh
íd
o
M
et
an
ol
1Pr
op
an
ol
Di
ac
et
ilo
Ac
et
.e
t il
o
2Bu
ta
no
l
Is
ob
ut
an
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1bu
ta
no
l
2M
-1
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.
3M
-1
-B
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Bu
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ilo
La
ct
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et
Ac
ilo
et
.i
so
am
Al
c.
ilo
2fe
ni
let
ilo
0
Furfural (mg/l)
0
10
50
Figura IV.3. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a
diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
Levadura Distinction
80
70
mg/L
60
50
40
30
20
10
Ac
e
ta
ld
eh
íd
o
M
et
an
ol
1Pr
op
an
ol
Di
ac
et
ilo
Ac
et
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o
2Bu
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l
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ob
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1bu
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no
2l
M
-1
-B
ut
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3M
-1
-B
ut
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ilo
La
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Ac
ilo
et
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so
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Al
c.
ilo
2fe
ni
let
ilo
0
Furfural (mg/l)
0
10
50
Figura IV.4. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura Distinction
a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
80
IV. Resultados y discusión
Levadura AWRI 796
80
70
mg/L
60
50
40
30
20
10
A
ce
ta
ld
eh
íd
o
M
et
an
ol
1Pr
op
an
ol
D
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til
o
A
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2B
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1bu
ta
no
l
2M
-1
-B
ut
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3M
-1
-B
ut
.
B
ut
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L
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A
ilo
ce
t.
iso
am
A
lc
ilo
.2
-fe
ni
le
t il
o
0
Furfural (mg/l)
0
10
50
Figura IV.5. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
IV.1.1.3. Efecto inhibitorio del furfural sobre diferentes cepas de
Saccharomyces cerevisiae y evaluación del momento óptimo de adición
en un medio sintético con alto contenido de azúcar
Se ha trabajado con las cepas 7VA, Distinction y AWRI796; a temperatura constante de
22 ºC en medio sintético con 14,5 % v/v de GAP (250 g/l de glucosa). Los tratamientos
de furfural han sido: 10 mg/l añadidos al alcanzar un poder fermentativo de 8 (PF = 8) y
50 mg/l de furfural adicionados periódicamente desde el inicio y cada tres días (10 mg/l
en cada adición hasta alcanzar 50 mg/l), además de un tratamiento control sin adición
del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.1.3.1. Grado alcohólico
La Figura IV.6 muestra el grado alcohólico obtenido con las diferentes levaduras,
obteniéndose la mayor reducción con la cepa comercial Distinction cuando la adición de
81
IV. Resultados y discusión
furfural fue de 10 mg/l al alcanzar PF = 8, reduciéndose con respecto al control en 0,43
% v/v. Sin embargo, la adición de manera periódica hasta alcanzar 50 mg/l de furfural
originó un efecto inhibitorio menor, pues tan sólo se logró una reducción del 0,28 % v/v.
Se deduce de estos resultados que para esta cepa, la etapa fermentativa en que se añade
el bloqueador es un factor clave que puede determinar la intensidad de su efecto.
En la cepa 7VA se obtuvo el mayor efecto en el grado alcohólico a 50 mg/l de furfural
añadido de manera periódica, con una reducción de 0,28 % v/v. Mientras que a la dosis
de 10 mg/l añadida a PF = 8 no se observó un efecto inhibitorio significativo con
respecto al control (Apéndice B.3). Mientras que el comportamiento de la cepa
AWRI796 es opuesto al de la cepa Distinction, pues incrementa su producción de etanol
tras la adición de 10 mg/l de furfural a PF = 8, y la reduce tras la adición de 50 mg/l de
manera periódica. Lo cual demuestra que el efecto inhibitorio es variable en función de
la cepa de levadura utilizada, como se ha reportado previamente (Lu et al, 2007).
14,5
Grado alcohólico % v/v
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
7VA
Distinction
Furfural (mg/l)
0
AWRI 796
10
50
Figura IV.6. Grado alcohólico en un medio sintético con 14,5 % de GAP con diferentes
cepas de S. cerevisiae. “10”: adición de 10 mg/l a PF = 8; “50”: adición de 10 mg/l cada tres
días desde el inicio hasta alcanzar 50 mg/l de furfural. Media ± desviación estándar (n = 4).
82
IV. Resultados y discusión
IV.1.1.4. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto inhibitorio
del furfural en un medio sintético con altas concentraciones de azúcar
Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperaturas constantes de 18 y 25 ºC y a valores
de pH de 3,2 y 3,8. El GAP del medio sintético ha sido de 14,5 % v/v (250 g/l de
glucosa). Se han mantenido los ritmos de adición de furfural de la prueba anterior,
aunque en este caso, tanto la adición a PF = 8 como la de manera periódica, se han
realizado hasta alcanzar una concentración de 50 mg/l; además de un control sin adición
del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice
A (Figura A.1) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa.
IV.1.1.4.1. Grado alcohólico
Las diferencias en el grado alcohólico son variables dependiendo de las condiciones
ambientales. La Tabla IV.5 muestra que el tratamiento con pH 3,2 es el que menor grado
alcohólico presenta con respecto a los otros, incluso en el control. Con respecto al
momento de dosificación de furfural en estas condiciones, no se aprecia una reducción
importante en la producción de etanol y el efecto se debe más al pH y la temperatura.
Tabla IV.5. Incidencia del pH y la temperatura sobre el efecto del furfural en el
grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
pH / ºC
Control
PF
X3
Grado alcohólico (% v/v)
3,2/18
3,8/18
14,10 ± 0,00 a
14,35 ± 0,00 b
14,00 ± 0,09 a
14,10 ± 0,00 a
14,02 ± 0,09 a
14,10 ± 0,00 ab
3,8/25
14,30 ± 0,07 b
14,22 ± 0,00 b
14,19 ± 0,06 b
Letras diferentes en la misma fila indican que existen diferencias significativas
con respecto a la variación del pH y temperatura (p < 0,05).
83
IV. Resultados y discusión
En los tratamientos con pH 3,8 (Figura IV.7), se logran reducciones del grado alcohólico
similares a los ensayos anteriores, especialmente al dosificar 50 mg/l de furfural de
manera periódica a razón de 10 mg/l cada tres días (X3), pues tanto a 18 como a 25 ºC,
se logra reducir el grado alcohólico en un 0,25 y 0,12 % respectivamente con respecto al
control, aunque estos resultados no muestran diferencias significativas (Apéndice B.4)
con el tratamiento en el cual se dosificó el furfural a PF = 8.
Grado alcohólico % v/v
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
3,2/18
3,8/18
0
PF
3,8/25
X3
Figura IV.7. Incidencia del pH y la temperatura sobre el grado alcohólico obtenido con la
levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 % de GAP. “PF”: adición de 50 mg/L a PF = 8;
“X3”: adición de 10 mg/L de furfural cada tres días desde el inicio hasta alcanzar 50 mg/L.
Media ± desviación estándar (n = 4).
Dado que cualquier reacción enzimática puede verse influenciada por el pH y/o la
temperatura, resulta interesante constatar que la inhibición que ejerce el furfural no se ve
significativamente alterada por estos factores en los rangos habituales en vinificación.
IV.1.1.4.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.6 muestra la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones,
en base a las cuales se puede concluir de manera favorable que en los rangos habituales
84
IV. Resultados y discusión
de pH y temperatura en la industria enológica, el furfural no reduce la utilización de los
azúcares por parte de la levadura, ya que las concentraciones residuales son bajas.
Tabla IV.6. Azúcares residuales tras fermentar a diferentes valores de pH y
temperatura con la levadura 7VA en un medio sintético con 14,5 % de GAP.
Media ± desviación estándar (n = 4).
Tratamiento
0
PF
X3
Azúcares residuales – glucosa (g/l)
pH 3,2/18 ºC
pH 3,8/18 ºC
pH 3,8/25 ºC
1,71 ± 0,31 a
1,05 ± 0,22 a
0,50 ± 0,14 ab
2,50 ± 0,40 b
0,83 ± 0,51 a
0,32 ± 0,28 a
1,24 ± 0,43 a
0,82 ± 0,32 a
1,11 ± 0,56 b
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas en el contenido de azúcar residual (p < 0,05).
IV.1.1.5. Efecto inhibitorio de altas dosis iniciales de furfural y
conversión en alcohol furfurílico en un medio sintético
Se ha trabajado con las cepas 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un
medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos de furfural
han sido de 50, 100 y 200 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de
un control sin adición del bloqueador. Al finalizar las fermentaciones se ha determinado
el furfural residual y el alcohol furfurílico producido mediante el análisis cromatográfico
descrito en la sección III.5.6. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.1.5.1. Grado alcohólico
En la Figura IV.8 se puede apreciar el efecto de las diferentes concentraciones de furfural
sobre ambas levaduras. En la levadura 7VA se logró la mayor reducción del grado
alcohólico de 0,26 % v/v a la dosis de 50 mg/l de furfural, sin embargo a mayores dosis
85
IV. Resultados y discusión
parece que el efecto no es muy significativo (Apéndice B.5), pues tan sólo se reduce el
grado alcohólico en 0,24 y 0,15 % v/v a 100 y 200 mg/l de furfural respectivamente con
respecto al control. Una posible explicación de este fenómeno sería que el furfural en
altas concentraciones ralentiza la producción de etanol al inicio de la fermentación
(Boyer et al, 1992), estimulando la glicólisis como fuente de poder reductor en forma de
NADH (generado en la conversión de gliceraldehido-3-fosfato a 1,3-difosfoglicerato)
que la levadura utiliza para reducirlo a alcohol furfurílico como método de
detoxificación, por lo cual la demanda de azúcares se vería incrementada (Modig et al,
2002) sin afectar el grado alcohólico final, y a medida que se incrementas las dosis de
furfural, la levadura puede activar mecanismos alternativos para generar poder reductor
extra, a través del Ciclo de Krebs (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002) y por
activación de la vía de las pentosa fosfato, generando NADPH (Petersson et al, 2006; Liu
et al, 2008; Heer et al, 2009).
La levadura AWRI796, glicolíticamente ineficiente (Loira et al, 2012), mostró una
producción de etanol mucho menor que la levadura 7VA, incluso en el control.
Posiblemente esta levadura utilice parte del azúcar para producir biomasa y otros
metabolitos secundarios en detrimento de la producción de etanol, lo cual demuestra que
el efecto inhibitorio es variable en función de la cepa de levadura utilizada, como se ha
descrito en trabajos previos (Lu et al, 2007). En cuanto al grado alcohólico obtenido se
aprecia una reducción del 0,41 % v/v a la dosis de 50 mg/l de furfural, mientras que a
mayores dosis no se aprecia un efecto importante, pues tan sólo se reduce 0,36 y 0,21 %
v/v a las dosis de 100 y 200 mg/l de furfural respectivamente. Comportamiento similar a
la levadura 7VA, aunque el análisis estadístico no muestra diferencias significativas
(Apéndice B.5).
86
IV. Resultados y discusión
15,0
Grado alcohólico % v/v
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
50
100
7VA
200
Furfural
(mg/L)
AWRI 796
Figura IV.8. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y
AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
En base a estos resultados se puede concluir que la dosis de 50 mg/l sería la más
adecuada, ya que el efecto no incrementa a mayores concentraciones de furfural.
IV.1.1.5.2. Azúcares residuales
Se analizó la concentración de azúcares residuales tras las fermentaciones (Tabla IV.7),
encontrándose diferencias en función de la levadura utilizada. En la cepa 7VA, al igual
que en los ensayos anteriores, con las cantidades obtenidas se puede concluir de manera
favorable que el furfural no reduce la utilización de los azúcares, ya que las
concentraciones residuales son bajas.
Con la levadura AWRI796 se obtuvieron cantidades de glucosa más altas, que
representan un grado alcohólico en torno a 0,35 - 0,40 % v/v, ya que aproximadamente
se requieren de 17 g/l de glucosa para incrementar el contenido de alcohol en 1 %.
87
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.7. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural con
las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media
± desviación estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
50
100
200
Azúcares residuales (g/l)
7VA
0,92 ± 0,28 a
1,98 ± 1,36 a
3,16 ± 0,65 a
2,19 ± 1,82 a
AWRI796
6,10 ± 0,28 a
5,82 ± 0,81 a
6,95 ± 0,85 a
6,54 ± 0,59 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
IV.1.1.5.3. Furfural residual y alcohol furfurílico producido por las levaduras
La Tabla IV.8 muestra las concentraciones de furfural residual al finalizar las
fermentaciones, así como la cantidad de alcohol furfurílico producido por las levaduras.
Tabla IV.8. Furfural residual y alcohol furfurílico (GC-MS) producido tras las fermentaciones con las
levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % v/v
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Furfural
(mg/L)
7VA
0
50
100
200
AWRI796
0
50
100
200
Levadura
Residual (mg/L)
Furfural
Alc. furfurílico
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,26 ± 0,01
37,47 ± 1,4
0,29 ± 0,13
75,19 ± 1,14
0,23 ± 0,01
159,5 ± 2,58
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,06 ± 0,00
35,57 ± 1,21
0,12 ± 0,01
74,74 ± 1,73
0,19 ± 0,00
158,31 ± 5,38
Furfural residual
(%) *
0,52
0,29
0,12
0,14
0,13
0,10
Conversión
(%) **
74,95
75,19
79,75
71,14
74,74
79,16
* Cantidad residual en base al furfural añadido al medio.
** Alcohol furfurílico producido a partir del furfural añadido.
Como puede apreciarse las cantidades de furfural residual son prácticamente
despreciables, con valores máximos de 0,52 y 0,14 % para las levaduras 7VA y
AWRI796 respectivamente a la dosis de 50 mg/l de furfural añadido, lo que indica que
88
IV. Resultados y discusión
prácticamente todo ha sido metabolizado y a medida que se incrementa la dosis de
furfural añadido la concentración de furfural residual es menor en ambas levaduras.
En cuanto a la cantidad de alcohol furfurílico producido a partir de la conversión
enzimática del furfural (Liu et al, 2005; Nilsson et al, 2005), se puede apreciar que
aumenta a medida que se incrementa la dosis de furfural con ambas levaduras (Figura
IV.9), llegando a valores de conversión en torno al 79 % a 200 mg/l de furfural añadido,
mientras que la menor conversión se obtuvo a la dosis de 50 mg/l, con valores de 75 y
71 % para las levaduras 7VA y AWRI796 respectivamente. Valores comparables a otro
estudio en el que se determinaron porcentajes de producción de alcohol furfurílico por S.
cerevisiae en torno al 70 % a partir del furfural añadido (Díaz de Villegas et al, 1992).
0,6
0,5
78
0,4
76
0,3
74
0,2
72
Furfural residual (%)
Alcohol furfurílico (%)
80
0,1
70
0,0
0
50
100
150
200
250
Furfural añadido (mg/l)
7VA
AWRI 796
7VA
AWRI 796
Figura IV.9. Furfural residual (líneas discontinuas) y alcohol furfurílico producido
(líneas continuas) tras las fermentaciones con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes
dosis iniciales de furfural en un medio sintético con 15 % v/v de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
Otro aspecto a resaltar es que la conversión de furfural en alcohol furfurílico aumenta a
medida que se incrementa la dosis de furfural añadido al medio (Figura IV.9). Una
89
IV. Resultados y discusión
posible explicación sería que la levadura aumenta su capacidad metabólica para
detoxificar el medio en presencia de cantidades altas de furfural, activando otros
mecanismos además de la habitual producción de NADH, como por ejemplo el Ciclo de
Krebs (Taherzadeh et al, 1999; Modig et al, 2002) y la vía de las pentosa fosfato para
generar NADPH (Petersson et al, 2006; Liu et al, 2008; Heer et al, 2009).
IV.1.1.6. Efecto inhibitorio de altas concentraciones de furfural
dosificadas en fase de crecimiento exponencial y conversión en alcohol
furfurílico en un medio sintético
Se ha trabajado con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796; a temperatura constante de
22 ºC en un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos
de furfural han sido de 50 y 200 mg/l, dosificados en fase de crecimiento exponencial
(PF = 8), y un tratamiento control sin adición del bloqueador. Al finalizar las
fermentaciones se ha determinado el furfural residual y el alcohol furfurílico producido
mediante el análisis cromatográfico descrito en la sección III.5.6. Todos los ensayos se
han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.2) pueden apreciarse las
curvas de cinética fermentativa.
IV.1.1.6.1. Grado alcohólico
La Figura IV.10 muestra el grado alcohólico a distintas dosis de furfural, cuyo efecto
inhibitorio es variable para todas las cepas evaluadas. Un mayor efecto se observa en la
levadura CM15 al reducir en 0,53 % v/v la producción de etanol a una dosis de 200
mg/l, mientras que a 50 mg/l de furfural tan sólo se logra reducir el grado alcohólico en
90
IV. Resultados y discusión
0,29 % v/v, reducciones que son significativamente diferentes en ambas dosis de
furfural con respecto al control (Apéndice B.6).
En las levaduras 7VA y AWRI796 no se aprecian reducciones del grado alcohólico que
sean relevantes con respecto al control (Apéndice B.6), lo que indica que estas cepas
podrían no ser sensibles al efecto inhibitorio del furfural en la fase de crecimiento
exponencial, en la que existe una mayor densidad celular, de modo que su resistencia al
efecto inhibitorio podría ser mayor, tal como se menciona en otros trabajos (Chung y
Lee, 1985; Boyer et al, 1992; Navarro, 1994). No obstante se mantiene la diferencia de
producción de etanol entre las levaduras 7VA y AWRI796 mostrada en ensayos
anteriores, incluso en el control, lo que indica la naturaleza de la levadura AWRI796
como glicolíticamente ineficiente (Loira et al, 2012).
Grado alcohólico % v/v
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
50
7VA
AWRI 796
200
CM15
Furfural
(mg/L)
Figura IV.10. Grado alcohólico obtenido con las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar
furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
91
IV. Resultados y discusión
IV.1.1.6.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.9 muestra las concentraciones de azúcares residuales en las
microvinificaciones, encontrándose diferencias en función de la levadura utilizada. En la
cepa 7VA, con las cantidades obtenidas se puede concluir de manera favorable que el
furfural no afecta el consumo de azúcares, como en los ensayos anteriores.
Con las cepas AWRI796 y CM15 se obtienen concentraciones de azúcar residual mucho
más altas. Esto indica que estas levaduras podrían ser sensibles a las altas
concentraciones sacarimétricas del medio. Siendo de especial relevancia la cepa CM15 a
200 mg/l de furfural, con un mayor contenido de azúcar residual (12,72 g/l), que
equivale a 0,75 % v/v de grado alcohólico probable, lo cual concuerda con el grado
alcohólico obtenido (Figura IV.10), que fue el menor en comparación a los otros
tratamientos.
Tabla IV.9. Azúcares residuales tras las fermentaciones con las levaduras
7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con
15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
50
200
Azúcares residuales (g/l)
7VA
AWRI 796
0,71 ± 0,75 a
8,94 ± 2,95 a
1,34 ± 0,96 a
7,71 ± 2,85 a
0,54 ± 0,68 a
8,67 ± 1,91 a
CM15
7,15 ± 1,33 a
6,83 ± 0,78 a
12,72 ± 0,91 b
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas en el contenido de azúcar residual (p < 0,05).
En base a estos resultados se puede concluir que la dosificación en fase de crecimiento
exponencial no muestra un efecto inhibitorio considerable sobre la síntesis de etanol,
92
IV. Resultados y discusión
con respecto al obtenido en las dosificaciones al inicio de las fermentaciones de los
ensayos anteriores.
IV.1.1.6.3. Furfural residual y alcohol furfurílico producido por las levaduras
La Tabla IV.10 resume las cantidades de furfural residual que son prácticamente
despreciables, con valores máximos de 0,36; 0,29 y 0,25 % para las levaduras 7VA,
AWRI796 y CM15 respectivamente a la dosis de 50 mg/l de furfural añadido, lo que
indica que prácticamente todo ha sido metabolizado.
Con respecto al alcohol furfurílico producido, se puede apreciar que aumenta a medida
que se incrementa la dosis de furfural con todas las levaduras, llegando a valores de
conversión en torno al 71, 74 y 67 % para las levaduras 7VA, AWRI796 y CM15
respectivamente a la dosis de 200 mg/l de furfural añadido, mientras que a 50 mg/l se
obtuvieron concentraciones de 69, 71 y 65 % respectivamente (Tabla IV.10 y Figura
IV.11). Valores comparables a los obtenidos en el ensayo anterior (Tabla IV.8) y en torno
al 70 %, obtenido por Díaz de Villegas et al (1992).
93
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.10. Furfural residual y alcohol furfurílico producido tras las fermentaciones con las
levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural a PF = 8 en un medio sintético con 15 % v/v
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Levadura
7VA
AWRI796
CM15
Furfural
(mg/L)
0
50
200
0
50
200
0
50
200
Residual (mg/L)
Furfural
Alc. furfurílico
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,18 ± 0,01
34,63 ± 1,45
0,20 ± 0,01
142,50 ± 3,16
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,14 ± 0,03
35,56 ± 3,14
0,26 ± 0,05
148,83 ± 2,96
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
0,12 ± 0,02
32,58 ± 2,62
0,32 ± 0,01
133,96 ± 4,23
Furf. residual
(%) *
0,36
0,10
0,29
0,12
0,25
0,16
Conversión
(%) **
69,28
71,25
71,13
74,42
65,17
66,98
* Cantidad residual en base al furfural añadido al medio.
** Alcohol furfurílico producido a partir del furfural añadido.
0,6
0,5
72
0,4
69
0,3
66
0,2
63
Furfural residual (%)
Alcohol furfurílico (%)
75
0,1
60
0,0
0
50
100
150
200
250
Furfural añadido (mg/l)
7VA
AWRI 796
CM15
7VA
AWRI 796
CM15
Figura IV.11. Furfural residual (líneas discontinuas) y alcohol furfurílico producido (líneas
continuas) al dosificar furfural a PF = 8 con las levaduras 7VA, AWRI796 y CM15 en un medio
sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
94
IV. Resultados y discusión
IV.1.1.7. Efecto inhibitorio de diferentes dosis iniciales de furfural en
un medio a base de mosto concentrado
Se ha trabajado con las cepas 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en un
medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo
hasta 15 % v/v de GAP. Los tratamientos con furfural han sido de 50 y 100 mg/l,
dosificados al inicio de las fermentaciones, y un tratamiento control sin adición del
bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
En el Apéndice A (Figura A.3) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa.
IV.1.1.7.1. Grado alcohólico
La Figura IV.12 muestra el grado alcohólico a las distintas dosis de furfural. Un mayor
efecto se observa en la levadura AWRI796 al reducir en 0,71 % v/v el grado alcohólico
con respecto al control a 100 mg/l de furfural, mientras que a la dosis de 50 mg/l tan
sólo se logra reducir el grado alcohólico en 0,64 % v/v. Valores de grado alcohólico que
son significativamente menores al control en ambas dosis de furfural (Apéndice B.7).
En la levadura 7VA no se aprecia una reducción del grado alcohólico que sea
estadísticamente significativa a la dosis de 50 mg/l (Apéndice B.7), ya que sólo se
consigue reducir en 0,13 % v/v con respecto al control, contrario a lo observado a la
dosis más alta de furfural (100 mg/l), en la que el grado alcohólico incluso incrementa.
Se mantiene la diferencia de producción de etanol entre las levaduras 7VA y AWRI796
mostrada en los ensayos anteriores, incluso en el control, aunque dicha diferencia es
95
IV. Resultados y discusión
menor, lo que pone de manifiesto nuevamente la naturaleza de la levadura AWRI796
como glicolíticamente ineficiente.
Otro aspecto a tener en cuenta es la naturaleza del medio, pues en este ensayo se ha
utilizado un medio a base de mosto concentrado, cuya composición es más compleja que
el medio sintético, lo cual podría influir en la levadura; incluso algunos de los
componentes del mosto podrían interactuar con el inhibidor, disminuyendo su
disponibilidad, tal como se menciona en otro trabajo de temática similar en el que se
evalúa el efecto inhibitorio del cobre en la fermentación alcohólica (Azenha et al, 2000).
15,5
Grado alcohólico % v/v
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
0
50
7VA
100
Furfural
(mg/l)
AWRI 796
Figura IV.12. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de furfural con las levaduras 7VA y
AWRI796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
IV.1.1.7.2. Azúcares residuales
En la Tabla IV.11 se pueden observar las cantidades de glucosa residual, que fueron bajas
o nulas con ambas levaduras, mientras que las cantidades de fructosa fueron superiores.
Posiblemente las levaduras hayan tenido dificultades para consumir completamente los
96
IV. Resultados y discusión
azúcares debido a la naturaleza del medio, preparado a partir de un mosto concentrado,
el cual no tuviese los suficientes nutrientes requeridos. Con la levadura AWRI796 las
cantidades residuales de fructosa son más altas, lo cual indicaría una mayor sensibilidad
de esta levadura a altas concentraciones de azúcar del medio.
Tabla IV.11. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de furfural con las
levaduras 7VA y AWRI796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP.
Media ± desviación estándar (n = 4).
Furfural
(mg/l)
0
50
100
Azúcares residuales (g/l)
7VA
AWRI 796
Glucosa
Fructosa
Glucosa
Fructosa
0,39 ± 0,78 a
6,70 ± 2,18 a
0,00 ± 0,00
10,67 ± 0,33 a
0,51 ± 0,67 a
6,78 ± 3,39 a
0,00 ± 0,00
13,74 ± 3,98 a
0,00 ± 0,00 a
4,16 ± 3,37 a
0,00 ± 0,00
15,51 ± 2,73 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas en el
contenido de azúcares residuales (p < 0,05).
IV.1.1.7.3. Producción de glicerina
La glicerina se forma para mantener el equilibrio redox intracelular, mediante la
producción de NAD+ a partir del NADH citosólico. El NADH es el cofactor requerido
para reducir el acetaldehído a etanol, pero además es utilizado como poder reductor por
la levadura para convertir el furfural en alcohol furfurílico (Modig et al, 2002). Al
respecto, Palmqvist et al (1999), observaron una mayor afinidad hacia el NADH por la
enzima ADH (responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico) que por la enzima
GPDH (responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato y producir glicerina),
generándose una inhibición de tipo competitiva. Con lo cual podría esperarse que la
producción de glicerina sea menor en presencia de furfural.
97
IV. Resultados y discusión
La Tabla IV.12 muestra la producción de glicerina por ambas levaduras, la cual no es
afectada a las diferentes dosis de furfural añadidas, aunque si se observan diferencias en
función de la cepa, mostrando la levadura AWRI796 menor producción, lo cual no era
lo esperado pues en base a la información brindada por la firma que la comercializa, se
trata de una cepa con una producción de glicerina mayor a las usuales (Maurivin, 2013).
Sin embargo en un estudio previo (Loira et al, 2012), se obtuvieron con esta levadura
producciones de glicerina en torno a los valores mostrados en la Tabla IV.12, aunque en
dicho estudio se utilizó un medio sintético pero con un contenido de azúcares similar al
medio preparado en nuestro ensayo.
Otros estudios han demostrado que la producción de glicerina podría incrementar en
presencia de furfural en el medio (Taherzadeh et al, 1999), lo cual indicaría otras fuentes
de NADH para la enzima GPDH, por ejemplo el Ciclo de Krebs (Taherzadeh et al, 1999;
Modig et al, 2002), principalmente en las etapas iniciales del proceso fermentativo
(Horváth et al, 2003), incrementándose además la producción de otros metabolitos como
el ácido succínico (Taherzadeh et al, 1999), de especial interés en cuanto a la mejora de la
acidez (Coulter et al, 2004) y del perfil aromático del vino (Hidalgo, 2010).
Tabla IV.12. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de furfural en un medio a base de mosto
concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Furfural (mg/l)
0
50
100
Glicerina (g/l)
7VA
7,09 ± 0,26 a
7,06 ± 0,08 a
7,39 ± 0,36 a
AWRI 796
6,01 ± 0,26 a
5,92 ± 0,28 a
5,89 ± 0,13 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
98
IV. Resultados y discusión
IV.1.2. Efecto inhibitorio de la o-vainillina
En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de ovainillina a diferentes dosis, con diferentes levaduras, a diferentes concentraciones de
azúcar en el medio y en combinación con furfural a fin de evaluar el posible efecto
sinérgico de ambos bloqueadores metabólicos.
La elección de la o-vainillina para estos ensayos se basa en la información disponible en
la literatura consultada con respecto al efecto inhibitorio de los compuestos vainíllicos
(Mikulásová et al, 1990; Larsson et al, 2000), en donde se destaca que dicho efecto es
mayor que sus isómeros isovainillina y p-vainillina (vainillina) (Figura I.6).
Por otro lado, no se ha considerado en los ensayos con o-vainillina su dosificación en
diferentes etapas de la fermentación, pues en base a los resultados obtenidos para el
furfural, la etapa en la cual se añade el inhibidor no parece ser relevante a altas
concentraciones de azúcar en el medio, ya que la levadura es más resistente al poseer
una mayor densidad celular, tal como lo demostraron trabajos previos (Chung y Lee,
1985; Boyer et al, 1992; Navarro, 1994).
99
IV. Resultados y discusión
IV.1.2.1. Efecto inhibitorio a diferentes dosis iniciales de o-vainillina en
un medio sintético con alto contenido de azúcares
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
un medio sintético con 15 % v/v de GAP (260 g/l de glucosa). Los tratamientos con ovainillina han sido de 20, 50, 200 y 500 mg/l, dosificados al inicio de las
fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los
ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.2.1.1. Grado alcohólico
La Figura IV.13 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido con ambas
levaduras. Observándose el mayor efecto inhibitorio en la levadura AWRI796 con una
reducción del 0,53 % v/v a la dosis de 50 mg/l de o-vainillina, mientras que a 20 mg/l
tan sólo se obtuvo una reducción del 0,25 % v/v con respecto al control. El análisis
estadístico (Apéndice C.1), indica una diferencia significativa en el grado alcohólico a la
dosis de 50 mg/l de o-vainillina, aunque al finalizar las fermentaciones las cantidades de
azúcares residuales fueron altas (Tabla IV.13).
Con la levadura 7VA se obtuvo la mayor reducción del grado alcohólico a la dosis de 20
mg/l de o-vainillina, aunque a la dosis de 50 mg/l la reducción no fue significativamente
diferente, obteniéndose valores de 0,34 y 0,24 % v/v respectivamente para ambas dosis
con respecto al control.
A las dosis de 200 y 500 mg/l de o-vainillina ambas levaduras fueron inhibidas
totalmente, resultados que concuerdan con lo descrito por Larsson et al (2000), quienes a
100
IV. Resultados y discusión
200 mg/l observaron una inhibición total del crecimiento celular y de la producción de
etanol por S. cerevisiae, aunque el medio que utilizaron solamente contenía 20 g/l de
glucosa y la inhibición a menores dosis de o-vainillina fue mayor en el crecimiento
celular que en la producción de etanol.
Grado alcohólico % v/v
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
20
7VA
AWRI 796
50
o -vainillina
(mg/L)
Figura IV.13. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de o-vainillina con las levaduras
7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
IV.1.2.1.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.13 muestra las concentraciones de azúcares residuales tras las
fermentaciones para ambas levaduras, observándose que en el caso de la levadura 7VA
las cantidades obtenidas fueron bajas, lo que indicaría que este inhibidor no afecta el
consumo de azúcares por esta levadura, al igual que en el caso del furfural. Un
comportamiento diferente al observado con la levadura AWRI796, con la cual el
contenido de azúcares residuales fue alto. Resultados comparables a los obtenidos con el
101
IV. Resultados y discusión
furfural al mismo GAP (Tabla IV.11), lo que podría evidenciar que esta levadura es
sensible a altas concentraciones de azúcares en el medio fermentativo.
Tabla IV.13. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ovainillina con las levaduras 7VA y AWRI796 en un medio sintético con 15 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales (g/l)
o-Vainillina (mg/l)
7VA
2,40 ± 1,45 a
0
3,18 ± 1,59 a
20
4,71 ± 0,76 a
50
*
200
*
500


AWRI 796
13,72 ± 1,48 a
13,50 ± 1,82 a
11,55 ± 1,49 a
*
*
(*) La inhibición fue total.
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
IV.1.2.2. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural
dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio sintético
Se ha trabajado con la levadura 7VA, a temperatura constante de 22 ºC en un medio
sintético con 12,5 % v/v de GAP (220 g/l de glucosa). Las concentraciones añadidas de
o-vainillina han sido de 20, 50, 100 y 200 mg/l, dosificados al inicio de las
fermentaciones, además de un tratamiento combinado de o-vainillina y furfural (V+F)
de 50 mg/l cada uno, y un control sin adición de bloqueador. Se ha utilizado un medio
de menor GAP con el objetivo de verificar el efecto inhibitorio en función de la
concentración de azúcares en el medio. Todos los ensayos se han realizado por
cuadruplicado.
102
IV. Resultados y discusión
IV.1.2.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV.14 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico. Se observa
como la adición de o-vainillina ejerce un efecto inhibitorio sobre el metabolismo
fermentativo de la levadura a medida que se incrementa la dosis. Esta reducción es
mayor a 50 mg/l, con una disminución del grado alcohólico de 0,31 % v/v, mientras que
a 20 mg/l tan sólo se reduce en un 0,18 % v/v con respecto al control. A las dosis de 100
y 200 mg/l la inhibición fue total, lo que concuerda con el ensayo anterior.
En el tratamiento en el cual se evaluó el efecto combinado de la o-vainillina y furfural a
50 mg/l cada uno, se logra reducir el grado alcohólico en 0,38 % v/v con respecto al
control. De acuerdo al análisis estadístico no se obtiene una diferencia significativa en el
grado alcohólico, tanto a las diferentes dosis de o-vainillina como al evaluar la posible
sinergia entre o-vainillina y furfural (Apéndice C.2), al menos con esta cepa de S.
cerevisiae a la concentración de azúcares y el tipo de medio fermentativo utilizados.
Grado alcohólico % v/v
13,0
12,6
12,2
11,8
11,4
11,0
0
20
50
V50+F50
o -vainillina (mg/L)
Figura IV.14. Grado alcohólico tras las fermentaciones en un medio sintético con 12,5 %
de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con
furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno. Media ± desviación estándar (n = 4).
103
IV. Resultados y discusión
IV.1.2.2.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.14 muestra los azúcares residuales a las diferentes dosis de o-vainillina, las
cuales son bajas, lo que indicaría que este inhibidor no afecta el consumo de azúcares
por la levadura 7VA, al igual que en el ensayo anterior y en los ensayos con furfural.
Tabla IV.14. Azúcares residuales en un medio sintético con 12,5
% de GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de ovainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno.
Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales (g/l)
o-Vainillina (mg/l)
Glucosa
1,59 ± 0,31 a
0
3,04 ± 0,47 b
20
4,27 ± 1,08 b
50
*
100
*
200
2,98 ± 0,40 b
V50+F50


(*) La inhibición fue total.
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias
significativas (p < 0,05).
IV.1.2.3. Efecto sinérgico de la combinación de o-vainillina y furfural
dosificados al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto
concentrado con alto contenido de azúcares
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796, a temperatura constante de 22 ºC en
un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe,
diluyendo a 15 % v/v de GAP. Las concentraciones añadidas de o-vainillina han sido de
20, 50 y 100 mg/l al inicio de las fermentaciones, un tratamiento control sin adición del
bloqueador y un tratamiento combinado de o-vainillina y furfural a 50 mg/l cada uno
con el fin de verificar el efecto sinérgico de ambos bloqueadores. Todos los ensayos se
104
IV. Resultados y discusión
han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.4) pueden apreciarse las
curvas de cinética fermentativa.
IV.1.2.3.1. Grado alcohólico
La Figura IV.15 muestra el grado alcohólico a distintas dosis de o-vainillina. Un mayor
efecto se observa en la levadura AWRI796 al reducir el grado alcohólico en 0,46 % v/v
con respecto al control a la dosis de 50 mg/l de o-vainillina, mientras que a 20 mg/l se
logra reducir en 0,37 % v/v. Reducciones que sin embargo no son significativamente
diferentes al control (Apéndice C.3), mientras que al combinar o-vainillina y furfural a
50 mg/l cada uno, se logra reducir el grado alcohólico en 0,63 % v/v, lo que indicaría
que con esta levadura el efecto sinérgico de ambos bloqueadores puede constituir una
interesante alternativa para reducir el grado alcohólico. No obstante, como en ensayos
anteriores con esta levadura, se siguen obteniendo altos contenidos de azúcares
residuales (Tabla IV.15).
En la levadura 7VA no se aprecia una reducción del grado alcohólico a las dosis de 20 y
50 mg/l de o-vainillina, incluso se observa un incremento a medida que aumenta la
concentración de o-vainillina en el medio. En cuanto a la combinación de la o-vainillina
y furfural, no se observa un efecto sinérgico en la reducción del grado alcohólico,
resultado que concuerda con el ensayo anterior.
En lo que se refiere al tratamiento con 100 mg/l de o-vainillina, se obtienen reducciones
de 1,12 % v/v con la levadura 7VA y 1,13 % v/v con la levadura AWRI796 con respecto
al control. Sin embargo las cantidades de azúcares residuales son muy altas (Tabla
105
IV. Resultados y discusión
IV.15), lo que indicaría que a partir de determinadas concentraciones la o-vainillina
inhibe el consumo de azúcares por S. cerevisiae.
El comportamiento no lineal en la reducción del grado alcohólico a medida que se
incrementa la dosis de o-vainillina con la levadura 7VA es comparable al observado con
el furfural (Figura IV.8), en el cual a dosis superiores a 50 mg/l el efecto inhibitorio
disminuye. Este fenómeno observado con la o-vainillina podría explicarse en base a lo
ya mencionado para el furfural, pues al tratarse de aldehídos, sus modos de acción serían
similares y su presencia en el medio fermentativo a altas concentraciones podría
ralentizar la producción de etanol en las primeras etapas de la fermentación, estimulando
la glicólisis como fuente de poder reductor en forma de NADH que la levadura utiliza
para reducir la o-vainillina a alcohol o-vainíllico (Larsson et al, 2000), pero además se
activarían otros mecanismos para generar poder reductor extra en forma de NADPH a
través de la vía de las pentosa fosfato como en el caso del furfural (Petersson et al, 2006;
Liu et al, 2008; Heer et al, 2009) así como la generación de otros cofactores como FADH2
o FMN (De Wulf et al, 1986), adaptándose así la levadura con la consiguiente conversión
del inhibidor sin afectar el grado alcohólico final.
106
IV. Resultados y discusión
15,5
7VA
AWRI 796
Grado alcohólico % v/v
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
0
20
50
100
V50+F50
o -Vainillina (mg/l)
Figura IV.15. Grado alcohólico obtenido con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis
iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno, en un medio a base de
mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Tabla IV.15. Azúcares residuales con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis
iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno, en un medio a
base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
o-Vainillina
mg/l
0
20
50
100
V50+F50
Azúcares residuales (g/l)
7VA
AWRI 796
Glucosa
Fructosa
Glucosa
Fructosa
0,39 ± 0,78 a
6,70 ± 2,18 a
0,00 ± 0,00 a
10,67 ± 0,33 a
0,00 ± 0,00 a
4,04 ± 4,01 a
0,00 ± 0,00 a
12,77 ± 4,26 a
0,00 ± 0,00 a
2,93 ± 1,17 a
0,00 ± 0,00 a
16,96 ± 1,56 ab
5,23 ± 1,32 b
23,51 ± 3,70 b
0,27 ± 0,46 a
22,76 ± 3,38 b
0,00 ± 0,00 a
4,84 ± 0,60 a
0,00 ± 0,00 a
13,48 ± 2,58 a
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.2.3.2. Producción de glicerina
La Tabla IV.16 muestra la producción de glicerina, la cual no es afectada a las diferentes
dosis de o-vainillina añadida al medio, aunque si se observa una diferencia en función de
la cepa utilizada, mostrando la levadura comercial AWRI796 menor producción, lo cual
107
IV. Resultados y discusión
concuerda con los resultados obtenidos con el furfural (Tabla IV.12) y con un estudio
previo con la misma levadura (Loira et al, 2012).
Tabla IV.16. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación con furfural (V+F) a 50
mg/l cada uno, en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP.
Media ± desviación estándar (n = 4).
o-Vainillina (mg/l)
0
20
50
100
V50+F50
Glicerina (g/l)
7VA
7,09 ± 0,26 a
7,30 ± 0,22 a
7,46 ± 0,58 a
6,95 ± 0,29 a
7,25 ± 0,23 a
AWRI 796
6,01 ± 0,26 a
6,13 ± 0,25 a
6,04 ± 0,39 a
5,84 ± 0,31 a
5,56 ± 0,31 a
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas en el
contenido de glicerina (p < 0,05).
IV.1.2.4. Conversión enzimática de la o-vainillina y el furfural en sus
respectivos derivados por la levadura Saccharomyces cerevisiae a
diferentes momentos de dosificación en mosto tinto
Se han dosificado furfural y o-vainillina en un mosto tinto de uva variedad Tempranillo
con un GAP de 14,6 % v/v utilizando la levadura 7VA. Las dosis han sido de 50 y 100
mg/l, añadidas en dos etapas fermentativas diferentes:
-
Un lote de microfermentadores se han dosificado al inicio de las fermentaciones,
tomando muestras a las 20, 30 y 48 horas de fermentación.
-
Otro lote de microfermentadores se han dosificado al alcanzar las fermentaciones
el final de la fase de crecimiento exponencial (aproximadamente a un PF = 10),
tomando muestras a las 48 y 72 horas a partir de la dosificación.
108
IV. Resultados y discusión
Todas las muestras se han analizado por cromatografía de gases (GC-MS), siguiendo el
procedimiento descrito en la sección III.5.6, con el fin de verificar el momento en el cual
la levadura metaboliza por completo los bloqueadores añadidos.
Previamente se ha reportado la conversión de la o-vainillina en alcohol o-vainíllico por
S. cerevisiae (Larsson et al, 2000) como un proceso análogo al mostrado en la Figura I.7,
mediante el cual su isómero vainillina es convertida en alcohol vainíllico (Chatonnet et
al, 1992; Humphries et al, 1992; Fitzgerald et al, 2003). Aunque la enzima involucrada en
este proceso de bioconversión no está claramente dilucidada, se trataría de una enzima
oxidoreductasa diferente a la ADH (De Wulf et al, 1986).
En el Apéndice J se muestran los cromatogramas en los cuales en base al tiempo de
retención (TR) obtenido con un patrón externo se ha identificado el alcohol furfurílico
(TR = 11,56 min.). Además al analizar todos los picos cromatográficos se ha
identificado el alcohol o-vainíllico a un TR de 21,80 minutos; ambos alcoholes, como
productos derivados del furfural y la o-vainillina, respectivamente. El alcohol furfurílico
se ha identificado al comparar su espectro de masas (m/z = 98/97/81) con el espectro del
patrón de referencia externo, mientras que en el caso del alcohol o-vainíllico, al no
contar con un patrón de referencia externo, se ha identificado en base a su espectro de
masas (m/z = 65/136/154), el cual coincidió con el obtenido de la base de datos NIST
MS Search 2.0. Para cuantificar el alcohol o-vainíllico, se ha utilizado como referencia
la relación de producción de alcohol vainíllico a partir de la vainillina, de modo que los
resultados mostrados en las figuras y tabla siguientes para la cantidad de alcohol ovainíllico producido, están calculados en base al alcohol vainíllico producido en
109
IV. Resultados y discusión
fermentaciones paralelas en las cuales se ha dosificado vainillina en las mismas
condiciones que las utilizadas para la o-vainillina.
IV.1.2.4.1. Dosificaciones al inicio de las fermentaciones
La Figura IV.16 muestra las cantidades residuales de furfural y o-vainillina así como sus
alcoholes derivados al dosificar los bloqueadores al inicio de las fermentaciones. En la
Tabla IV.17 se resumen las cantidades determinadas a diferentes tiempos.
En el caso del furfural, la tasa de producción de alcohol furfurílico (calculado a partir
del furfural añadido), está en torno al 84 % para la dosis de 50 mg/l, mientras que a la
dosis de 100 mg/l, está en torno a 68 % (Tabla IV.17). Valores parecidos a los obtenidos
en el medio sintético fermentado con la misma cepa de levadura ( Tabla IV.8), y
comparables a los obtenidos en otro trabajo previo (Díaz de Villegas et al, 1992), en el
cual se obtuvo una conversión en torno al 70 %.
En cuanto al tiempo que la levadura necesita para eliminar los bloqueadores del medio,
el furfural fue metabolizado antes de las 20 horas, como puede apreciarse en la Figura
IV.16. Al analizar nuevamente a las 30 horas no se obtuvieron cambios considerables en
las cantidades de alcohol furfurílico a ambas dosis de furfural, mientras que la ovainillina fue eliminada del mosto después de 30 horas de fermentación, con
producciones de alcohol o-vainíllico en torno al 32 y 25 % con respecto a la o-vainillina
añadida a las dosis de 50 y 100 mg/l respectivamente (Tabla IV.17).
110
IV. Resultados y discusión
100
Furfural - inicio
mg/l
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
Horas
F (50 mg/l)
AF
F (100mg/l)
100
AF
o -Vainillina - inicio
mg/l
80
60
40
20
0
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Horas
OV (50 mg/l)
AOV
OV (100mg/l)
AOV
Figura IV.16. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción
de sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a partir de su
dosificación en mosto tinto al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA.
IV.1.2.4.2. Dosificaciones al finalizar la fase de crecimiento exponencial
La Figura IV.17 muestra las cantidades de furfural y o-vainillina residuales así como sus
alcoholes derivados al dosificar estos bloqueadores en el mosto al finalizar la fase de
crecimiento exponencial. En la Tabla IV.17 se resumen las cantidades determinadas a los
diferentes tiempos de fermentación.
111
IV. Resultados y discusión
En el caso del furfural, la tasa de producción de alcohol furfurílico está en torno al 76 %
para la dosis de 50 mg/l, y en torno al 71 % a la dosis de 100 mg/l (Tabla IV.17). Valores
parecidos a los obtenidos en el medio sintético fermentado con la misma cepa de
levadura y dosificado con furfural en fase de crecimiento exponencial (Tabla IV.10), y
comparables a los obtenidos por Díaz de Villegas et al (1992), en torno al 70 %.
En cuanto al tiempo que la levadura necesita para eliminar los bloqueadores del medio,
el furfural fue metabolizado antes de las 48 horas de fermentación, como puede
apreciarse en la Figura IV.17. La o-vainillina también fue metabolizada antes de las 48
horas, con producciones de alcohol o-vainíllico en torno al 30 % con respecto a la ovainillina añadida a ambas dosis (Tabla IV.17).
Si bien no se tienen referencias bibliográficas sobre la tasa de conversión de la ovainillina en alcohol o-vainíllico, existen estudios previos que reportan la producción de
alcohol vainíllico en torno a un 95 % con respecto a la vainillina adicionada a una dosis
de 500 mg/l tras 48 horas de fermentación con S. cerevisiae (De Wulf et al, 1986),
bioconversión que es óptima a 30 ºC y a un pH de 3 (aunque entre pHs de 2,5 y 5,0 los
efectos no fueron muy diferentes), trabajando con una concentración de glucosa de 20
g/l y la vainillina añadida en fase de crecimiento exponencial.
En otro estudio con S. cerevisiae se obtuvo una completa bioconversión en alcohol
vainíllico a una dosis de 150 mg/l de vainillina tras 24 horas de fermentación (Fitzgerald
et al, 2003), mientras que esta conversión era menor a medida que se incrementaban las
concentraciones de vainillina, así, a concentraciones de 750, 1500 y 2250 mg/l, la
producción de alcohol vainíllico fue del 69, 41 y 2%, respectivamente. Destacando
112
IV. Resultados y discusión
además en dicho estudio y tras la comparación con las curvas de crecimiento, que la
bioconversión podría sólo llevarse a cabo durante el crecimiento celular, pues al
dosificar la vainillina en la fase estacionaria la bioconversión fue mucho más baja para
todas las concentraciones utilizadas.
100
Furfural - log
mg/l
80
60
40
20
0
0
10
20
F (50 mg/l)
30
40
AF
50
60
70
F (100mg/l)
100
80
Horas
AF
o -Vainillina - log
mg/l
80
60
40
20
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Horas
OV (50 mg/l)
AOV
OV (100mg/l)
AOV
Figura IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción de
sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a partir de su dosificación en
mosto tinto al finalizar la fase de crecimiento exponencial (fase log) con la levadura 7VA.
113
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.17. Conversión enzimática del furfural (F) y o-vainillina (OV) y producción de sus alcoholes derivados a diferentes tiempos de fermentación a
partir de su dosificación en mosto tinto con la levadura 7VA.
Dosificación 
Al inicio de las fermentaciones
20 horas
F 50
F 100
OV 50
OV 100
30 horas
Al finalizar la fase exponencial
48 horas
mg/l
%
mg/l
%
n.d.
0,00
n.d.
%
mg/l
%
0,00
n.d.
0,00
n.d.
0,00
42,40 ± 1,82
84,80
41,86 ± 1,80
83,73
36,40 ± 0,40
72,80
38,30 ± 0,87
76,60
n.d.
0,00
n.d.
0,00
n.d.
0,00
n.d.
0,00
Alcohol furfurílico
67,70 ± 1,35
67,70
63,66 ± 4,34
63,67
71,56 ± 1,86
71,57
71,63 ± 1,02
71,63
o-Vainillina
11,03 ± 1,84
22,07
1,10 ± 0,43
2,20
n.d.
0,00
n.d.
0,00
n.d.
0,00
Alcohol o-vainíllico
12,78 ± 2,16
25,57
16,20 ± 2,15
32,40
15,88 ± 1,54
31,76
14,47 ± 2,31
28,95
16,27 ± 3,83
32,55
o-Vainillina
*
*
11,53 ± 2,17
11,53
n.d.
0,00
n.d.
0,00
n.d.
0,00
Alcohol o-vainíllico
*
*
21,97 ± 2,56
21,98
25,52 ± 2,26
25,52
29,67 ± 1,62
29,68
30,70 ± 1,00
30,70
Alcohol furfurílico
Furfural residual
n.d.: No detectado.
(*) Inhibición total de la fermentación.
114
%
72 horas
mg/l
Furfural residual
mg/l
48 horas
IV. Resultados y discusión
IV.1.3. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico
En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de ácido
cinámico (isómero trans) a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes
concentraciones de azúcar en el medio. Dadas las diferencias mostradas en los ensayos
con furfural y o-vainillina con respecto a la composición del medio fermentativo, en el
caso del ácido trans-cinámico sólo se han utilizado medios preparados a partir de mosto
concentrado o con mosto fresco.
La elección de éste ácido como posible bloqueador metabólico para reducir el grado
alcohólico en vinos se hizo en base a la literatura consultada, al mostrar mayores
propiedades inhibitorias sobre la actividad celular en comparación con otros derivados
fenilpropanos como el ácido p-cumárico, ácido 3-metoxi-cinámico, ácido 4-metoxicinámico, ácido ferúlico, etc. Ello debido a su estructura molecular, al tratarse de un
compuesto bencílico con menos sustituyentes laterales (Figura I.12), tal como se ha
demostrado en un estudio previo (Larsson et al, 2000), y cuyo efecto inhibitorio es mayor
a menores concentraciones que otros ácidos orgánicos como el benzoico, fórmico,
acético, propiónico o butanoico (Huang et al, 2011).
115
IV. Resultados y discusión
IV.1.3.1. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico en mosto tinto con
diferentes concentraciones de azúcar y análisis del estireno producido
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
mosto tinto de uva Tempranillo con 11,5 y 14,4 % v/v de GAP. Las dosis de ácido
trans-cinámico han sido de 100, 200 y 500 mg/l, dosificados al inicio de las
fermentaciones, además de un tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los
ensayos se han realizado por cuadruplicado. En el Apéndice A (Figura A.5) pueden
apreciarse las curvas de cinética fermentativa.
IV.1.3.1.1. Grado alcohólico
En un trabajo previo (Larsson et al, 2000), a una dosis de 1000 mg/l de ácido cinámico
(aunque no se informa el isómero con el que se trabaja), se inhibió en un 58 % la
producción de etanol por S. cerevisiae. En nuestros resultados, se puede apreciar que las
levaduras 7VA y AWRI796 fueron inhibidas totalmente a la dosis de 500 mg/l (Figura
A.5) y a la dosis de 200 mg/l apenas se pudo observar actividad fermentativa. A la dosis
de 100 mg/l se produjo un retraso en el inicio de la fermentación, tardando para ambas
levaduras 6 y 8 días en iniciar en los medios de 11,5 y 14,4 % de GAP respectivamente,
sin embargo el final de la fermentación no fue afectado.
La Figura IV.18 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido a las diferentes
concentraciones de azúcar. En el mosto con una GAP de 11,5 %, el mayor efecto se
obtuvo con la levadura AWRI796, con una reducción del grado alcohólico de 0,30 %
v/v a la dosis de 100 mg/l, mientras que con la levadura 7VA prácticamente no hubo un
efecto apreciable con respecto al control.
116
IV. Resultados y discusión
Similar comportamiento se observó en el mosto con una GAP de 14,4 % v/v, en el cual
con la levadura AWRI796 se logró una reducción del grado alcohólico de 0,41 % v/v a
la dosis de 100 mg/l, mientras que la levadura 7VA no se vio afectada, incluso se
observó un incremento del grado alcohólico con respecto al control.
El análisis estadístico (Apéndice D.1), muestra una diferencia significativa en el grado
alcohólico para la levadura AWRI796 con respecto al control a la dosis de 100 mg/l de
ácido trans-cinámico en el medio con 11,5 % de GAP, mientras que para el medio con
14,4 % de GAP la diferencia no es significativa. Lo cual pone de manifiesto que el
efecto inhibitorio de este ácido sobre esta cepa de levadura podría verse influenciado por
la concentración de azúcar en el medio fermentativo, análogamente a lo observado en
los ensayos con o-vainillina y furfural.
Con la levadura 7VA no se obtienen diferencias significativas con respecto al control en
ninguno de los medios a las diferentes dosis de ácido cinámico, lo que permitiría asumir
que en esta levadura la fermentación alcohólica no es inhibida por este bloqueador,
poniendo de manifiesto la variación de la sensibilidad a los bloqueadores metabólicos
cuando se utilizan diferentes levaduras (Lu et al, 2007). Además cabe mencionar lo
reportado por Larsson et al (2000), quienes en su trabajo observaron que a 200 mg/l
únicamente se veía afectado el crecimiento celular, pero no la producción de etanol, para
lo cual se requerirían mayores dosis de ácido cinámico. Considerando lo expuesto
anteriormente sobre la total inhibición de las levaduras 7VA y AWRI796 a la dosis de
200 mg/l, la utilización de 100 mg/l constituye una interesante alternativa a evaluar.
117
IV. Resultados y discusión
Grado alcohólico % v/v
12,0
11,5 % GAP
7VA
11,5
AWRI 796
11,0
10,5
10,0
9,5
9,0
0
100
Ácido cinámico (mg/l)
Grado alcohólico % v/v
15,0
14,4 % GAP
7VA
14,5
AWRI 796
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
100
Ácido cinámico (mg/l)
Figura IV.18. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico
con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
IV.1.3.1.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.18 muestra las cantidades de azúcares residuales obtenidos con ambas
levaduras. En el mosto con 11,5 % de GAP, el ácido trans-cinámico no afecta el
consumo de azúcares por S. cerevisiae al obtener bajas concentraciones residuales,
mientras que en los fermentados con 14,4 % de GAP, el ácido trans-cinámico afecta el
118
IV. Resultados y discusión
consumo de azúcares al contener mayores cantidades residuales, sobre todo con la
levadura AWRI796.
Tabla IV.18. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con
las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
Ácido trans-cinámico
mg/l
0
100
200
500


Azúcares residuales (g/l)
11,5 % GAP
14,4 % GAP
7VA
AWRI 796
7VA
AWRI 796
1,99 ± 0,42 a 1,70 ± 0,05 a 3,60 ± 0,13 a 4,28 ± 0,25 a
1,96 ± 0,20 a 2,35 ± 0,29 b 3,39 ± 0,14 a 6,13 ± 1,28 b
*
*
*
*
*
*
*
*
(*) La inhibición fue total.
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.3.1.3. Análisis cromatográfico del ácido trans-cinámico residual y del estireno
producido
Diferentes trabajos previos mencionan la conversión del ácido cinámico en estireno por
la levadura S. cerevisiae. Al respecto Chen y Peppler (1956), propusieron de que dicha
conversión se llevaría a cabo mediante la descarboxilación del ácido ( Figura I.13a),
teoría posteriormente respaldada por otros estudios (Gramatica et al, 1981; Stratford et al,
2007; Mukai et al, 2010; Schwarz et al, 2012a), proceso que involucraría a la enzima ácido
fenilacrílico descarboxilasa (PAD) (Clausen et al, 1994; Larsson et al, 2001). No obstante,
Shimada et al (1992), propusieron otro mecanismo de conversión del ácido cinámico en
estireno, el cual involucraría primero la conversión de ácido cinámico a ácido pcumárico, posteriormente a ácido cafeico y finalmente a estireno (Figura I.14), lo que
podría ocurrir simultáneamente con lo propuesto por Chen y Peppler (1956). Con lo cual,
la levadura eliminaría del medio fermentativo el ácido cinámico y su efecto inhibitorio
sería menor.
119
IV. Resultados y discusión
En el Apéndice K se puede observar el cromatograma en el cual se identificó el estireno
a un TR = 6,46 min. y cuyo espectro de masas (m/z = 104/103/78) coincidió con el
obtenido de la base de datos NIST MS Search 2.0, sin embargo con el método utilizado
para analizar el furfural y la o-vainillina, no se han podido obtener picos
cromatográficos con buena resolución que permitan identificar y cuantificar las
cantidades residuales del ácido trans-cinámico, aunque en los cromatogramas se han
identificado algunos picos (TR = 24,80 min.) cuyo espectro de masas (m/z =
147/148/103) coincidió con el del patrón externo y con el espectro de la base de datos
NIST MS Search 2.0. Dichos picos corresponden a la dosis de 100 mg/l, tal como puede
apreciarse en el Apéndice K, y se han detectado a las 48 y 72 horas a partir de su
dosificación en el mosto, con lo cual, podría considerarse que a diferencia del furfural y
la o-vainillina, los cuales tras 48 horas de fermentación desde su dosificación son
metabolizados completamente (Figuras IV.16 y IV.17), la levadura necesitaría un mayor
tiempo para eliminar totalmente el ácido trans-cinámico del medio fermentativo.
IV.1.3.2. Efecto inhibitorio del ácido trans-cinámico a diferentes
concentraciones de azúcar en un medio a base de mosto concentrado
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
medios a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo
hasta 12 y 15 % v/v de GAP. Las dosis de ácido trans-cinámico han sido de 50 y 100
mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un tratamiento control sin
adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
120
IV. Resultados y discusión
IV.1.3.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV.19 muestra los resultados para el grado alcohólico obtenido. Al igual que en
el ensayo anterior, la levadura AWRI796 es la que más sensibilidad muestra al efecto
inhibitorio, pues a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico logra reducir el grado
alcohólico en 0,18 y 0, 27 % v/v con respecto al control en los medios fermentativos con
12 y 15 % de GAP respectivamente.
A diferencia del ensayo anterior con mosto tinto, en el presente ensayo la dosis de 100
mg/l inhibe totalmente a la levadura AWRI796, mientras que a la misma dosis en la
levadura 7VA causa un retraso del inicio de la fermentación de manera similar al ensayo
anterior, además en la levadura 7VA no se observa inhibición en la producción de
etanol, lo que indicaría que esta levadura activa de manera más eficiente mecanismos
para metabolizar el ácido trans-cinámico y detoxificar el medio, principalmente
mediante su conversión en estireno, como se ha mencionado en diferentes trabajos
previos (Chen y Peppler, 1956; Gramatica et al, 1981; Stratford et al, 2007; Mukai et al, 2010;
Schwarz et al, 2012a; Shimada et al, 1992), lo cual concuerda con los resultados obtenidos
en el análisis anterior cuyos cromatogramas se muestran en el Apéndice K.
Finalmente, considerando lo observado con la levadura AWRI796, la cual fue inhibida
totalmente a la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico, posiblemente la naturaleza
del medio fermentativo haya causado algún efecto, pues las dosis añadidas son las
mismas que en el ensayo anterior y las concentraciones de azúcar de los medios son
similares. Además, en este ensayo se obtienen concentraciones de azúcares residuales
altas, como se muestra en la Tabla IV.19, lo cual indicaría una escasez de nutrientes
121
IV. Resultados y discusión
requeridos por las levaduras al tratarse de medios a base de mosto concentrado, como ya
se ha observado en los ensayos con o-vainillina y furfural.
Grado alcohólico % v/v
12,0
12 % GAP
7VA
11,5
AWRI 796
11,0
10,5
10,0
9,5
9,0
0
50
100
Ácido cinámico (mg/l)
Grado alcohólico % v/v
15,5
15 % GAP
7VA
AWRI 796
15,0
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
0
50
Ácido cinámico (mg/l)
100
Figura IV.19. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico
con las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado de 12 y 15
% de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
122
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.19. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de ácido trans-cinámico con
las levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado de 12 y 15 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Ácido trans-cinámico
mg/l
0
50
100
Azúcares residuales totales (g/l)
12 % GAP
15 % GAP
7VA
AWRI 796
7VA
AWRI 796
7,04 ± 0,49 a 6,60 ± 0,12 a 7,98 ± 0,09 a 8,42 ± 0,23 a
6,57 ± 0,10 a 6,76 ± 0,18 a 7,97 ± 0,09 a 8,65 ± 0,20 a
6,65 ± 0,18 a
*
8,43 ± 0,40 a
*
 (*) La inhibición fue total.
 Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.3.2.2. Compuestos volátiles de origen fermentativo
Todas las concentraciones de compuestos volátiles fermentativos se encuentran dentro
de los rangos habituales en vinificación, observándose para ambas levaduras un efecto
en las producciones de 1-propanol y 2,3-butanodiol en los medios con 12 y 15 % de
GAP, del 2-metil-1-butanol en los medios con 15 % de GAP y del acetato de etilo en los
medios con 12 % de GAP.
El 1-propanol incrementa con ambas levaduras. Con la levadura 7VA a 100 mg/l de
ácido trans-cinámico incrementa su producción en 23 y 36% en los medios con 12 y
15% de GAP respectivamente (Tabla IV.20), mientras que con la dosis de 50 mg/l no se
observa un efecto en su producción. Con levadura AWRI796 se observa a la dosis de 50
mg/l un incremento del 11 y 18% en los medios con 12 y 15% de GAP respectivamente
con respecto al control (Tabla IV.21).
Comportamiento similar se observa con el 2,3-butanodiol, que a 50 mg/l de ácido transcinámico no se observa ningún efecto con la levadura 7VA, mientras que a la dosis de
123
IV. Resultados y discusión
100 mg/l se incrementa su producción en 40 y 41% con respecto al control en los
medios con 12 y 15% de GAP respectivamente. Con la levadura AWRI796 se
incrementa su producción en 14 y 16% en los medios con 12 y 15% de GAP
respectivamente (Tabla IV.21).
Como se ha indicado en estudios previos, la síntesis del 2,3-butanodiol sería un
mecanismo de producción de metabolitos neutros para contrarrestar los altos niveles de
acidez y prevenir la acidificación celular (Nakashimada et al, 2000), activando enzimas
involucradas en su síntesis (Bryn et al, 1973). Además otra importante función de la
producción del 2,3-butanodiol es la regeneración del exceso de poder reductor asociado
a la glicolisis, regulando el ratio NADH/NAD+ (Celińska y Grajek, 2009). Lo cual podría
explicar el incremento en su producción con ambas cepas de levaduras.
En cuanto al 2-metil-1-butanol, el cual solamente varía en los medios con 15 % de GAP,
a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico incrementa su producción en un 19% con
la levadura AWRI796 (Tabla IV.21) y con la levadura 7VA disminuye un 10% con
respecto al control, mientras se produce un incremento del 24% a 100 mg/l de ácido
trans-cinámico con la última levadura (Tabla IV.20).
Con respecto al acetato de etilo, cuya producción sólo fue afectada en el medio con 12
% de GAP, con la levadura 7VA disminuye en 41% con respecto al control a 100 mg/l
de ácido trans-cinámico, mientras que a 50 mg/l no se aprecia un efecto importante
(Tabla IV.20). Con la levadura AWRI796 (Tabla IV.21), a 50 mg/l de ácido transcinámico, se incrementa su producción en un 13% con respecto al control.
124
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.20. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por la levadura 7VA a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico (mg/l) en
medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
(mg/L)
Metanol
1-Propanol
Diacetilo
Acetato de etilo
Isobutanol
1-Butanol
Acetoína
2-Metil-1-butanol
3-Metil-1-butanol
Lactato de etilo
2,3-Butanodiol
Acetato de isoamilo
Hexanol
2-Feniletanol
Acetato de 2-feniletilo
Control
3,67 ± 0,15 a
28,36 ± 3,24 a
2,37 ± 0,30 a
44,89 ± 12,63 a
13,48 ± 0,74 a
4,16 ± 0,26 a
13,25 ± 1,75 a
70,35 ± 7,02 a
15,83 ± 0,96 a
6,23 ± 0,32 a
618,10 ± 60,56 a
2,24 ± 0,25 a
0,93 ± 1,87 a
19,95 ± 2,08 a
7,63 ± 0,15 a
12 % GAP
50
3,76 ± 0,11 a
30,66 ± 1,75 ab
2,34 ± 0,15 a
47,05 ± 3,86 a
11,86 ± 0,63 b
4,09 ± 0,08 a
12,91 ± 4,81 a
71,73 ± 3,81 a
14,45 ± 0,54 b
6,37 ± 0,32 a
588,36 ± 17,21 a
2,16 ± 0,11 a
0,94 ± 1,88 a
21,01 ± 1,37 a
7,82 ± 0,23 a
100
3,58 ± 0,15 a
34,94 ± 1,01 b
2,43 ± 0,17 a
26,58 ± 2,17 b
11,45 ± 0,22 b
4,13 ± 0,04 a
12,71 ± 0,75 a
63,54 ± 4,85 a
16,36 ± 0,32 a
5,87 ± 0,02 a
867,10 ± 53,36 b
2,00 ± 0,00 a
0,00 ± 0,00 a
18,30 ± 0,92 a
7,57 ± 0,19 a
Control
35,87 ± 3,00 a
40,75 ± 4,06 a
2,25 ± 0,11 a
57,31 ± 9,75 a
11,33 ± 0,82 a
4,82 ± 0,28 a
10,17 ± 0,41 a
101,44 ± 6,74 a
18,44 ± 1,51 a
6,28 ± 0,22 a
1086,55 ± 50,66 a
2,68 ± 0,44 a
4,70 ± 0,19 a
24,37 ± 1,17 ab
7,98 ± 0,42 a
Letras diferentes en la misma fila para cada GAP indican que existen diferencias significativas (p < 0,05).
125
15 % GAP
50
35,23 ± 1,66 a
41,21 ± 0,85 a
2,48 ± 0,11 a
54,50 ± 2,71 a
9,54 ± 0,40 b
4,95 ± 0,21 a
9,94 ± 1,94 a
90,64 ± 2,85 b
15,89 ± 0,60 b
8,19 ± 2,41 a
1153,77 ± 16,99 a
2,61 ± 0,15 a
4,82 ± 0,26 ab
25,32 ± 2,35 a
9,91 ± 0,56 b
100
40,13 ± 1,06 b
55,28 ± 2,55 b
2,79 ± 0,13 b
55,07 ± 8,68 a
11,89 ± 0,41 a
5,22 ± 0,19 a
13,94 ± 1,00 b
125,06 ± 5,33 c
21,42 ± 1,00 c
6,54 ± 0,16 a
1536,74 ± 143,40 b
2,55 ± 0,48 a
5,20 ± 0,12 b
21,97 ± 0,62 b
8,28 ± 0,75 a
IV. Resultados y discusión
100
7VA - 12 % GAP
mg/l
80
60
40
20
Ac
e
ta
ld
eh
íd
o
M
et
an
ol
1Pr
op
an
ol
Di
ac
et
Ac
ilo
et
at
o
de
et
ilo
Is
ob
ut
an
ol
1Bu
ta
no
l
Ac
et
2oi
M
na
et
il1b
ut
3an
M
et
ol
il1bu
ta
La
no
ct
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tíl
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ico
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2fe
ni
let
ilo
0
Ácido trans -cinámico (mg/l)
0
50
100
Figura IV.20. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
140
7VA - 15 % GAP
120
mg/l
100
80
60
40
20
Ac
e
ta
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íd
o
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3an
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lic
o
de
o
2fe
ni
let
ilo
0
Ácido trans -cinámico (mg/l)
0
50
100
Figura IV.21. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura 7VA a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
126
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.21. Producción de compuestos volátiles fermentativos (mg/l) por la levadura AWRI796 a distintas dosis iniciales
de ácido trans-cinámico (mg/l) en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
(mg/L)
Metanol
1-Propanol
Diacetilo
Acetato de etilo
Isobutanol
1-Butanol
Acetoína
2-Metil-1-butanol
3-Metil-1-butanol
Lactato de etilo
2,3-Butanodiol
Acetato de isoamilo
Hexanol
2-Feniletanol
Acetato de 2-feniletilo
12 % GAP
15 % GAP
Control
50
Control
50
3,89 ± 0,14 a
65,17 ± 4,02 a
2,16 ± 0,27 a
45,98 ± 3,22 a
17,19 ± 0,30 a
4,16 ± 0,08 a
9,33 ± 1,18 a
77,41 ± 2,53 a
18,66 ± 2,29 a
6,78 ± 0,17 a
532,48 ± 29,76 a
2,37 ± 0,24 a
0,93 ± 1,86 a
20,11 ± 1,02 a
7,39 ± 0,31 a
4,02 ± 0,14 a
72,47 ± 1,99 b
2,17 ± 0,08 a
51,79 ± 3,35 b
16,81 ± 0,24 a
4,57 ± 0,23 a
10,01 ± 1,02 a
84,63 ± 1,12 a
21,83 ± 1,33 a
6,20 ± 0,12 b
605,33 ± 45,87 b
2,41 ± 0,22 a
0,00 ± 0,00 a
20,86 ± 0,95 a
7,45 ± 0,27 a
31,65 ± 4,41 a
66,17 ± 0,16 a
2,29 ± 0,27 a
46,27 ± 1,51 a
14,63 ± 0,28 a
4,30 ± 0,30 a
9,61 ± 0,98 a
85,55 ± 0,58 a
20,71 ± 2,60 a
6,46 ± 0,06 a
923,01 ± 28,48 a
2,66 ± 1,17 a
4,93 ± 0,21 a
21,99 ± 0,39 a
8,57 ± 0,68 a
31,86 ± 4,32 a
77,94 ± 2,83 b
2,11 ± 0,15 a
48,22 ± 8,37 a
16,19 ± 2,66 a
4,69 ± 0,44 a
8,73 ± 0,91 a
102,12 ± 8,99 b
21,11 ± 0,87 a
7,16 ± 1,34 a
1073,56 ± 49,01 b
2,16 ± 0,26 a
4,99 ± 0,14 a
24,09 ± 1,52 b
9,59 ± 0,08 b
Letras diferentes en la misma fila para cada GAP indican que existen diferencias significativas (p < 0,05).
127
IV. Resultados y discusión
100
AWRI796 - 12 % GAP
mg/l
80
60
40
20
M
et
an
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1Pr
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Di
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o
0
Ácido trans -cinámico (mg/l)
0
50
Figura IV.22. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 12 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
120
AWRI796 - 15 % GAP
100
mg/l
80
60
40
20
Ac
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2fe
ni
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0
Ácido trans -cinámico (mg/l)
0
50
Figura IV.23. Compuestos volátiles fermentativos (GC-FID) producidos por la levadura AWRI796 a
distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en un medio a base de mosto concentrado con 15 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
128
IV. Resultados y discusión
IV.1.3.2.3. Producción de acetaldehído
La Tabla IV.22 muestra las producciones de acetaldehído. Con la levadura AWRI796 en
ambos medios a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico se observa un incremento
en la producción de acetaldehído, aunque estadísticamente dicho incremento no es
significativo con respecto al control. Mientras que a la misma dosis de ácido transcinámico con la levadura 7VA en el medio con 12 % de GAP se aprecia un incremento
de 65 % con respecto al control, mientras que en el medio con 15 % de GAP el
incremento es del 37 %, aunque no es significativamente diferente al control.
A la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico como previamente ya se ha mencionado,
la levadura AWRI796 fue inhibida completamente. Con la levadura 7VA a esta dosis, la
producción de acetaldehído aumenta considerablemente con respecto al control,
alcanzando incrementos superiores al 100% en ambos medios.
Tabla IV.22. Producción de acetaldehído a distintas dosis iniciales de ácido trans-cinámico en medios
a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Ác. trans-cinámico
(mg/l)
0
50
100
Acetaldehído (mg/l)
12 % GAP
15 % GAP
7VA
AWRI 796
7VA
AWRI 796
40,46 ± 9,13 a
27,44 ± 1,65 a
48,85 ± 17,54 a
37,28 ± 2,41 a
66,90 ± 7,01 b
29,65 ± 2,83 a
66,86 ± 7,29 ab
42,21 ± 4,35 a
82,72 ± 12,17 b
*
102,06 ± 22,75 b
*
 (*): La inhibición fue total.
 Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05).
Con la levadura 7VA, los resultados concuerdan con los obtenidos para el furfural
(Tabla IV.3) en los cuales también se observa un incremento del acetaldehído.
129
IV. Resultados y discusión
130
IV. Resultados y discusión
IV.1.4. Efecto inhibitorio del glicolaldehído
En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de
glicolaldehído a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones
de azúcar en el medio.
IV.1.4.1. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en un medio a base de
mosto concentrado con alto contenido de azúcar
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe,
diluyendo hasta 15 % v/v de GAP. Las dosis de glicolaldehído han sido de 100 y 200
mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición del
bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
En el Apéndice A (Figura A.6) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa.
IV.1.4.1.1. Grado alcohólico
La Figura IV. 24 muestra el grado alcohólico obtenido. En ambas levaduras a 100 mg/l
de glicolaldehído no se apreció un efecto inhibitorio significativo, mientras que a la
dosis de 200 mg/l se logró reducir el grado alcohólico con la levadura 7VA en 0,31 %
v/v con respecto al control, mientras que con la levadura AWRI796 la reducción fue de
0,76 % v/v. Resultados considerablemente diferentes a los obtenidos por Jayakody et al
(2011), quienes a una dosis de 240 mg/l de glicolaldehído obtuvieron una reducción del
131
IV. Resultados y discusión
grado alcohólico aproximada del 51% con respecto al control, mientras que a 120 mg/l
obtuvieron una reducción del 43%, aunque en dicho estudio utilizaron un medio con una
concentración de glucosa de 100 g/l.
El análisis estadístico indica que la reducción más significativa del grado alcohólico fue
la obtenida con la levadura AWRI796 a la dosis de 200 mg/l (Apéndice E.1), lo cual
constituye una interesante alternativa a considerar, dado que a dosis superiores a 240
mg/l, el glicolaldehído podría disminuir considerablemente el consumo de azúcares por
la levadura (Jayakody et al, 2011).
15,0
7VA
AWRI 796
Grado alcohólico % v/v
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
100
200
Glicolaldehído (mg/l)
Figura IV.24. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicoladehído con las levaduras 7VA
y AWRI 796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
IV.1.4.1.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.23, muestra los azúcares residuales con ambas levaduras, las cuales indican
que estas dosis de glicolaldehído constituyen una interesante alternativa a evaluar en
132
IV. Resultados y discusión
otras condiciones de fermentación con el fin de reducir el grado alcohólico sin afectar el
consumo de azúcares por S. cerevisiae.
Tabla IV.23. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de glicoladehído con las
levaduras 7VA y AWRI 796 en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP.
Media ± desviación estándar (n = 4).
Glicolaldehído
mg/l
0
100
200
Azúcares residuales (g/l)
7VA
AWRI 796
Glucosa
Fructosa
Glucosa
Fructosa
0,25 ± 0,51 a 4,87 ± 2,64 a 0,21 ± 0,42 a
6,10 ± 3,98 a
0,88 ± 1,77 a 5,07 ± 4,69 a 0,00 ± 0,00 a
6,46 ± 3,78 a
1,14 ± 1,35 a 5,39 ± 4,05 a 0,27 ± 0,54 a
3,91 ± 4,84 a
Letras diferentes en la misma columna indican diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.4.1.3. Producción de glicerina
La Tabla IV.24 muestra la producción de glicerina, la cual no es afectada a las diferentes
dosis de glicolaldehído añadidas con ambas levaduras, valores que concuerdan con los
obtenidos para el furfural (Tabla IV.12) y la o-vainillina (Tabla IV.16), lo cual pone de
manifiesto que el glicolaldehído no afecta la producción de glicerina por S. cerevisiae.
Tabla IV.24. Producción de glicerina por las levaduras 7VA y AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de glicoladehído en un medio a base de mosto
concentrado con 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Glicolaldehído (mg/l)
0
100
200
Glicerina (g/l)
7VA
7,76 ± 0,57 a
7,21 ± 0,53 a
7,32 ± 0,51 a
AWRI 796
7,73 ± 0,43 a
7,70 ± 0,04 a
7,58 ± 0,11 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
133
IV. Resultados y discusión
IV.1.4.2. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 14,3 %
de grado alcohólico probable
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
mosto de uva tinta variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP. La dosis de glicolaldehído
ha sido de 200 mg/l, dosificada al inicio de las fermentaciones, además de un control sin
adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.4.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV.25 muestra el grado alcohólico obtenido. Con ambas levaduras se observa
que la adición de glicolaldehído a 200 mg/l no causa ningún efecto inhibitorio sobre la
producción de etanol, al contrario de lo observado en el ensayo anterior (Figura IV.24).
En presencia de glicolaldehído en el medio, la levadura lo convierte en sustancias menos
perjudiciales, principalmente en etilenglicol (Jayakody et al, 2012) como se muestra en la
Figura I.9, y al parecer en dicho proceso estaría involucrada la enzima ADH utilizando
NADH como cofactor, análogamente a la conversión del furfural (Liu et al, 2005) y la ovainillina (Larsson et al, 2000), de modo que cabría esperar que la producción de etanol a
partir de la reducción del acetaldehído sea menor, al utilizar la levadura la ADH para
reducir el glicolaldehído a etilenglicol (inhibición competitiva). Sin embargo en este
ensayo no se observa dicho fenómeno, pues la producción de etanol no se ve afectada,
incluso se incrementa, lo cual podría deberse a que la levadura utiliza otros mecanismos
para detoxificar el medio, como la activación de vías alternativas para generar poder
reductor en forma de NADPH, FADH2 o FMN (De Wulf et al, 1986; Petersson et al, 2006;
134
IV. Resultados y discusión
Liu et al, 2008; Heer et al, 2009), sin afectar la producción de etanol ni el consumo de
azúcares, los cuales son bajos (Tabla IV.25).
15,0
7VA
AWRI 796
Grado alcohólico % v/v
14,5
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
200
Glicolaldehído (mg/l)
Figura IV.25. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído con las levaduras
7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Tabla IV.25. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de
glicolaldehído con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales totales (g/l)
Glicolaldehído (mg/l)
7VA
AWRI 796
2,84
±
0,08
a
2,69
± 0,33 a
0
2,86 ± 0,09 a
2,76 ± 0,11 a
200
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
Finalmente, el cambio en el comportamiento de las levaduras en la producción de etanol
podría deberse al medio fermentativo utilizado, pues en el ensayo anterior el medio fue
preparado a base de mosto concentrado, mientras que este ensayo se ha hecho con un
mosto fresco, y la disponibilidad de nutrientes pudo haber sido diferente en ambos
medios a pesar de contener cantidades similares de azúcares.
135
IV. Resultados y discusión
IV.1.4.3. Efecto inhibitorio del glicolaldehído en mosto tinto con 12 %
de grado alcohólico probable
Se ha trabajado con la levadura 7VA; a temperatura constante de 22 ºC en mosto de uva
tinta variedad Tempranillo con 12 % v/v de GAP. La dosis de glicolaldehído utilizada
ha sido de 200 mg/l, dosificada al inicio de las fermentaciones, además de un
tratamiento control sin adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por
cuadruplicado.
IV.1.4.3.1. Grado alcohólico
La Figura IV.26 muestra el grado alcohólico obtenido. Al igual que en el ensayo anterior
(Figura IV.25) se observa que en mosto tinto fresco el glicolaldehído no inhibe la
producción de etanol, ni siquiera a un menor contenido de azúcares.
Grado alcohólico % v/v
12,0
11,5
11,0
10,5
10,0
9,5
9,0
0
200
Glicolaldehído (mg/l)
Figura IV.26. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído con la
levadura 7VA en mosto tinto con 12 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
136
IV. Resultados y discusión
En cuanto a los azúcares residuales, al igual que en los ensayos anteriores, se observa
que su consumo no es afectado a la dosis de glicolaldehído utilizada, así como tampoco
es afectada la producción de glicerina (Tabla IV.26).
Tabla IV.26. Azúcares residuales y producción de glicerina por la levadura
7VA a diferentes dosis iniciales de glicolaldehído en mosto tinto con 12 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Glicolaldehído
(mg/l)
0
200
Glicerina
(g/l)
6,36 ± 0,19 a
5,83 ± 0,24 a
Azúcares residuales
totales (g/L)
0,00 ± 0,00
0,00 ± 0,00
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
137
IV. Resultados y discusión
138
IV. Resultados y discusión
IV.1.5. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona
En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de pbenzoquinona a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a diferentes concentraciones
de azúcar en el medio. Se ha elegido la p-benzoquinona en base a la literatura consultada
con respecto a su efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica por Saccharomyces
cerevisiae (Larsson et al, 2000), además, a diferencia de otras quinonas, su naturaleza
química y su mecanismo de acción le confieren un mayor efecto inhibitorio a bajas dosis
en condiciones de anaerobiosis (Rodriguez et al, 2004).
IV.1.5.1. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en medios a base de
mosto concentrado con diferentes concentraciones de azúcar
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
un medio a base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe,
diluyendo hasta 12 y 15 % v/v de GAP. Las dosis de p-benzoquinona han sido de 20 y
100 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin adición
del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.5.1.1. Grado alcohólico
La Figura IV.27 muestra los resultados obtenidos para el grado alcohólico a las
diferentes dosis de p-benzoquinona.
139
IV. Resultados y discusión
En el medio con menor contenido de azúcares (12 % de GAP), el mayor efecto sobre el
grado alcohólico se observa con la levadura 7VA, en la cual a 20 mg/l de pbenzoquinona se logra una reducción de 0,52 % v/v con respecto al control, mientras
que a 100 mg/l se reduce el grado alcohólico en 0,71 % v/v. No obstante, el análisis
estadístico (Apéndice F.1) no muestra diferencias significativas con respecto al control.
En un trabajo previo (Larsson et al, 2000), se observó que una dosis de 20 mg/l de pbenzoquinona inhibía totalmente tanto el crecimiento celular como la producción de
etanol en S. cerevisiae, aunque en dicho estudio la concentración de azúcar en el medio
fue mucho menor (100 g/l de glucosa).
Con la levadura AWRI796, se observa un comportamiento opuesto, pues el grado
alcohólico incrementa en presencia de ambas dosis de p-benzoquinona, lo que
demuestra que el efecto varía en función de la cepa de levadura, como se ha observado
con otros bloqueadores utilizados en ensayos anteriores.
Con respecto al medio con mayor concentración de azúcares (15 % de GAP), la
reducción del grado alcohólico es menor, corroborando la influencia de la concentración
azucarada en el efecto inhibitorio, pues con la levadura 7VA a la dosis de 20 mg/l de pbenzoquinona tan sólo se reduce el grado alcohólico un 0,37 % v/v con respecto al
control, mientras que a la dosis de 100 mg/l apenas se observa el efecto. El análisis
estadístico no muestra diferencias significativas en la reducción del grado alcohólico a
las diferentes dosis de p-benzoquinona con respecto al control (Apéndice F.1).
Con la levadura AWRI796 a 15 % de GAP aparentemente se consigue una mayor
reducción del grado alcohólico a las dosis de 20 y 100 mg/l de p-benzoquinona (0,78 y
140
IV. Resultados y discusión
1,29 % v/v respectivamente con respecto al control), sin embargo en la Tabla IV.27 se
puede apreciar altas cantidades de azúcares residuales, de modo que no se puede
establecer que la p-benzoquinona en este medio inhiba considerablemente la producción
de etanol con esta levadura.
Grado alcohólico % v/v
12,0
12 % GAP
7VA
AWRI 796
11,0
10,0
9,0
8,0
0
20
100
p -Benzoquinona (mg/L)
Grado alcohólico % v/v
15,0
15 % GAP
7VA
AWRI 796
14,0
13,0
12,0
11,0
0
20
100
p -Benzoquinona (mg/L)
Figura IV.27. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las
levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
141
IV. Resultados y discusión
IV.1.5.1.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.27 muestra las cantidades de azúcares residuales para ambas levaduras, que
en todos los casos son altas, lo que indicaría que el medio fermentativo no ha tenido los
nutrientes necesarios, afectando la actividad de ambas levaduras, más notorio en la
levadura AWRI796.
Tabla IV.27. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las
levaduras 7VA y AWRI796 en medios a base de mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP.
Media ± desviación estándar (n = 4).
p-Benzoquinona
mg/l
0
20
100
Azúcares residuales totales (g/l)
12 % GAP
15 % GAP
7VA
AWRI 796
7VA
AWRI 796
14,39 ± 0,33 a 21,64 ± 1,02 a 18,80 ± 0,44 a 21,73 ± 4,30 a
15,05 ± 0,62 a 15,59 ± 1,27 b 19,41 ± 0,83 a 29,75 ± 4,42 a
14,85 ± 0,26 a 15,91 ± 1,12 b 18,97 ± 1,10 a 41,6 ± 14,11 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.5.2. Efecto inhibitorio de la p-benzoquinona en mosto tinto con
14,3 % de grado alcohólico probable
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
mosto de uva tinta Syrah con 14,3 % v/v de GAP. Las dosis de p-benzoquinona han sido
de 20 y 50 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin
adición de bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.5.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV. 28 muestra el grado alcohólico obtenido con ambas levaduras. El único
caso en el que se observa un efecto inhibitorio es a 50 mg/l de p-benzoquinona con la
142
IV. Resultados y discusión
levadura 7VA, con la cual se reduce el grado alcohólico en 0,19 % v/v con respecto al
control. Mientras que la dosis de 20 mg/l no se observa un efecto inhibitorio apreciable
sobre la producción de etanol. Con la levadura AWRI796, la producción de etanol
incrementa con ambas dosis de p-benzoquinona, comportamiento similar al observado
en el ensayo anterior con el medio a 12 % de GAP (Figura IV.27).
Estos comportamientos en las levaduras podrían deberse a la influencia del medio
fermentativo utilizado en este ensayo, pues al tratarse de un mosto fresco, la
disponibilidad de nutrientes es diferente que con el medio a base de mosto concentrado,
como se ha observado en el caso del glicolaldehído (Figuras IV.26 y IV.27).
14,5
Grado alcohólico % v/v
7VA
AWRI 796
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
20
50
p -Benzoquinona (mg/l)
Figura IV.28. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de p-benzoquinona con las
levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar
(n = 4).
143
IV. Resultados y discusión
IV.1.5.2.2. Azúcares residuales
La Tabla IV.28 muestra los azúcares residuales determinados después de las
fermentaciones, los cuales a diferencia del ensayo anterior son bajos, razón por la cual
se podría concluir en este caso que la p-benzoquinona a las dosis utilizadas no afecta
negativamente el consumo de azúcares por S. cerevisiae.
Tabla IV.28. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de pbenzoquinona con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3
% de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales totales (g/l)
p-Benzoquinona (mg/l)
7VA
2,84 ± 0,08 a
0
2,80 ± 0,07 a
20
2,73 ± 0,03 a
50
AWRI 796
2,69 ± 0,33 a
2,78 ± 0,11 a
2,89 ± 0,07 a
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
144
IV. Resultados y discusión
IV.1.6. Efecto inhibitorio del cobre
En esta sección se describen los experimentos llevados a cabo con la adición de cobre
(como sulfato de cobre: CuSO4.5H20) a diferentes dosis, con diferentes levaduras y a
diferentes concentraciones de azúcar en el medio. Igualmente se ha realizado un ensayo
combinando del cobre con furfural a fin de evaluar el posible efecto sinérgico. Cabe
destacar que de todos los bloqueadores evaluados, únicamente el cobre ha sido utilizado
en fermentaciones con mostos de uva en estudios previos.
La elección del cobre como bloqueador metabólico se ha basado en la literatura
consultada, el cual tiene un efecto superior a otros metales sobre S. cerevisiae (Avery et
al, 1996; Howlett y Avery, 1997), afectando tanto el crecimiento celular como la
fermentación alcohólica (Zoecklein et al, 1999; Azenha et al, 2000; Brandolini et al, 2002;
Shanmuganathan et al, 2004). Si bien los mecanismos de acción no están del todo claros,
se considera entre otros que actúa bloqueando grupos funcionales, desplazando iones
esenciales (Gadd, 1993), interactuando con los ácidos nucleicos y sitios activos de las
enzimas, y principalmente se considera de relevancia la disrupción de la membrana
plasmática (Ohsumi et al, 1988; Cervantes y Gutierrez-Corona, 1994; Avery et al, 1996) y la
peroxidación lipídica de la membrana (Mehlhorn, 1986; Halliwell y Gutteridge, 1999; Stohs
y Bagchi, 1995). En cuanto a la fermentación alcohólica, afecta a varias enzimas
glicolíticas (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004),
produciendo un efecto inhibitorio sobre la síntesis de etanol (Pons y Chanel, 1991; Azenha
et al, 2000; Brandolini et al, 2002), de allí su posible aplicación como bloqueador
metabólico.
145
IV. Resultados y discusión
Las dosis utilizadas se han elegido en base a las concentraciones en las cuales puede
encontrarse en los mostos, pudiendo llegar hasta 6,4 mg/l (Curvelo-Garcia, 1988), aunque
se ha informado que presenta un efecto inhibitorio sobre la fermentación alcohólica a
concentraciones superiores a 9 mg/l (Zoecklein et al, 1999), razón por la cual se han
incluido en los ensayos dosis superiores a dicha cantidad, tal como se ha utilizado en
otros trabajos (Pons y Chanel, 1991; Azenha et al, 2000; Brandolini et al, 2002).
IV.1.6.1. Efecto inhibitorio del cobre en un medio sintético con
diferentes concentraciones de azúcar
Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperatura constante de 22 ºC en un medio
sintético con 12 y 14 % v/v GAP (220 y 240 g/l de glucosa respectivamente). Las dosis
de cobre han sido de 5, 10 y 50 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones y un
control sin adición de cobre. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado. En
el Apéndice A (Figura A.7) pueden apreciarse las curvas de cinética fermentativa.
IV.1.6.1.1. Grado alcohólico
A la dosis de 50 mg/l la levadura fue inhibida totalmente en ambos medios, mientras que
a 10 mg/l se observó una actividad muy baja en el medio con 12 % de GAP (Figura A.7),
en el cual no finalizó la fermentación. Resultados que difieren a lo referido por otros
autores, quienes señalan que S. cerevisiae puede tolerar concentraciones superiores de
cobre, como por ejemplo 64 mg/l (Azenha et al, 2000), 320 mg/l si se trata de una cepa
146
IV. Resultados y discusión
resistente (Brandolini et al, 2002), o incluso hasta 500 mg/l, aunque sólo se menciona su
efecto en el crecimiento celular (Shanmuganathan et al, 2004).
La Figura IV.29 muestra el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA a diferentes
concentraciones de azúcar en los medios fermentativos. En el medio con 12 % de GAP,
se incrementa el grado alcohólico a la dosis de 5 mg/l de cobre, aunque dicho
incremento no es estadísticamente diferente con respecto al control (Apéndice G.1). Este
resultado concuerda con el obtenido por Azenha et al (2000), quienes estudiaron el efecto
del cobre sobre S. cerevisiae en dos medios diferentes: mosto de uva blanca de mesa (no
mencionado por los autores, pero al ser uva de mesa se asume entre 8,0 – 9,0 % de
GAP) y medio sintético YNB con 100 g/l de glucosa (en torno a 5,8 % de GAP). Para lo
cual utilizaron 32 y 64 mg/l de cobre, observando en ambos medios que a pesar de que
el crecimiento celular puede verse afectado, no se altera la producción final de etanol,
pues en el medio YNB el grado alcohólico incrementó a ambas dosis de cobre,
alcanzando 4,3 y 4,1 % v/v respectivamente, mientras que el control alcanzó 2 % v/v.
En el mosto de uva de mesa, el grado alcohólico alcanzado también incrementó a 32
mg/l de cobre, alcanzando 7,5 % v/v (el control alcanzó 7 % v/v), mientras que a 64
mg/l de cobre el grado alcohólico fue menor que en el control (6,5 % v/v).
En el medio con 14 % de GAP (Figura IV.29), se observa que el grado alcohólico
disminuye a la dosis de 5 mg/l de cobre hasta en 1 % v/v con respecto al control,
diferencia que es estadísticamente significativa (Apéndice G.1). Resultado que concuerda
con otros trabajos (Pons y Chanel, 1991; Brandolini et al, 2002) en los cuales la
fermentación alcohólica fue inhibida, aunque en el trabajo de Brandolini et al (2002) no
se menciona la cantidad de etanol producida, se evaluó el efecto sobre el poder
147
IV. Resultados y discusión
fermentativo de dos cepas de S. cerevisiae, una sensible y una resistente, utilizando un
mosto tinto con 19 % de azúcares. En la cepa sensible a 32 mg/l de cobre el poder
fermentativo fue reducido hasta en un 80% con respecto al control, mientras que a 320
mg/l la levadura fue inhibida totalmente. En la cepa resistente, el poder fermentativo tan
sólo fue inhibido en 8 y 39% a las dosis de 32 y 320 mg/l de cobre respectivamente.
14,0
Grado alcohólico % v/v
12 % GAP
14 % GAP
13,0
12,0
11,0
10,0
9,0
0
Cobre (mg/L)
5
Figura IV.29. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre con la levadura 7VA en un
medio sintético con 12 y 14 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
En ninguno de los trabajos referidos se menciona si el cobre afecta el consumo de
azúcares, pero de acuerdo a lo mostrado en la Tabla IV.29, se puede considerar en base a
nuestros resultados que el cobre afectaría el consumo de azúcares por la levadura,
aunque en el control también se obtuvieron cantidades altas de azúcares residuales, lo
cual podría estar relacionado con la escasez de nutrientes en el medio fermentativo.
148
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.29. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de
cobre con la levadura 7VA en un medio sintético con 12 y 14 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales totales (g/l)
GAP % v/v
Cobre (mg/l)
12
14
16,02 ± 0,58 a
20,34 ± 2,31 a
0
14,96 ± 0,96 a
19,95 ± 2,20 a
5
*
*
10
*
*
50


(*) La levadura fue inhibida a estas dosis de cobre.
Letras diferentes en la misma columna indican que existen
diferencias significativas (p < 0,05).
IV.1.6.2. Efecto inhibitorio del cobre y efecto sinérgico en
combinaciones con furfural en medios a base de mosto concentrado
Se ha trabajado con la levadura 7VA a temperatura constante de 22 ºC en un medio a
base de mosto concentrado de uva blanca variedad Airen de 36 ºBe, diluyendo hasta 12
y 15 % v/v de GAP. Las dosis de cobre han sido de 5, 7, y 10 mg/l, dosificados al inicio
de las fermentaciones, además de dos tratamientos de 5 mg/l de cobre en combinación
con 50 y 100 mg/l de furfural con el fin de evaluar la posible sinergia de ambos
bloqueadores. Se elige la dosis de 5 mg/l de cobre por ser con la que mejores resultados
se obtuvieron en el ensayo anterior. Todos los ensayos se han realizado por
cuadruplicado.
Es de especial interés el efecto del cobre sobre las enzimas de la vía glicolítica como la
alcohol deshidrogenasa, enolasa, aldolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa,
hexoquinasa, piruvato decarboxilasa, fosfoglicerato quinasa, entre otras (Costa et al,
149
IV. Resultados y discusión
2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004), enzimas que también son
inhibidas por el furfural, especialmente la alcohol deshidrogenasa, involucrada
directamente en la síntesis de etanol a partir de acetaldehído (Palmqvist et al, 1999; Modig
et al, 2002). De allí que un posible efecto sinérgico entre el cobre y el furfural podría
constituir una alternativa para reducir la producción de etanol.
IV.1.6.2.1. Grado alcohólico
La Figura IV.30 muestra el grado alcohólico obtenido a las diferentes dosis de cobre y
con las combinaciones de cobre y furfural. En el medio con 12 % de GAP, se logra
reducir el grado alcohólico en 1,03 y 1,47 % v/v con respecto al control a las dosis de 5
y 7 mg/l de cobre respectivamente. Aunque estadísticamente es más significativa la
diferencia de la dosis de 7 mg/l con respecto al control (Apéndice G.2). Mientras que a la
dosis de 10 mg/l si bien se logra reducir el grado alcohólico en 0,52 % v/v con respecto
al control, no constituye una reducción significativa. Con respecto a similar
composición en el medio fermentativo, en un trabajo previo con mosto de uva tinta en
torno a 10 % de GAP (Pons y Chanel, 1991), no obtuvieron un efecto inhibitorio sobre la
fermentación alcohólica a una dosis de 14 mg/l de cobre, mientras que a 25 mg/l
consiguieron reducir la producción de etanol en un 35% y a 95 mg/l la inhibición fue del
86% con respecto al control, afectando además de manera considerable la producción de
metabolitos secundarios como acetaldehído, acetato de etilo, isobutanol y 3-metil-1butanol, además de observar que el tiempo total de fermentación aumentaba a medida
que se incrementaba la concentración de cobre en el mosto. Aunque en dicho trabajo las
condiciones a las cuales se llevaron a cabo los experimentos fueron las aplicadas en la
producción de biocombustibles, a una temperatura de fermentación de 30 ºC.
150
IV. Resultados y discusión
En los tratamientos con combinación entre cobre (5 mg/l) y las dosis de 50 y 100 mg/l
de furfural se logra una reducción del 0,49 y 0,19 % v/v respectivamente con respecto al
control. Sin embargo estas reducciones no muestran una diferencia estadísticamente
significativa, por lo que en estas condiciones no sería relevante el efecto sinérgico
cobre-furfural.
En el medio con 15 % de GAP, a la dosis de 5 mg/l el grado alcohólico reduce en 0,29
% v/v con respecto al control, resultado comparable al obtenido en el ensayo anterior en
el medio con 14 % de GAP (Figura IV.29), aunque dicha reducción fue mayor. Mientras
que a dosis superiores no se observa un efecto en la producción de etanol,
incrementando el grado alcohólico incluso en los tratamientos con adición de furfural, lo
cual a diferencia de lo observado entre el furfural y la o-vainillina (Figuras IV.15-IV.17),
nos permitiría concluir que no existe un efecto inhibitorio sinérgico entre el cobre y el
furfural.
Como puede observarse, existe una variación en cuanto al comportamiento mostrado por
la levadura a las mismas dosis de cobre utilizadas en el ensayo anterior en medios con
diferentes concentraciones de azúcar. Esto podría explicarse por las diferencias en
cuanto a la naturaleza del medio fermentativo, que en el presente ensayo fue preparado a
base de mosto concentrado. Al respecto se ha reportado que la composición del medio
podría influir en las posibles interacciones del cobre con otras moléculas del mosto, de
naturaleza más compleja que el medio sintético, de modo que el cobre disponible para
interactuar con la levadura sería menor (Azenha et al, 2000).
151
IV. Resultados y discusión
12,0
Grado alcohólico % v/v
12 % GAP
11,0
10,0
9,0
8,0
0
5
7
10
5+F50
5+F100
5+F50
5+F100
Cobre (mg/L)
15,0
Grado alcohólico % v/v
15 % GAP
14,0
13,0
12,0
11,0
0
5
7
10
Cobre (mg/L)
Figura IV.30. Grado alcohólico con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de cobre y
evaluación de la sinergia entre el cobre (5 mg/l) y el furfural (F) en medios a base de mosto
concentrado con 12 y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
En cuanto a los azúcares residuales, en la Tabla IV.30 se observa que al igual que en el
ensayo anterior las cantidades determinadas son altas (Tabla IV.29).
152
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.30. Azúcares residuales con la levadura 7VA a diferentes
dosis iniciales de cobre y evaluación de la sinergia entre el cobre (5
mg/l) y el furfural (F) en medios a base de mosto concentrado con 12
y 15 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales totales (g/l)
GAP % v/v
Cobre (mg/l)
12
15
14,52 ± 0,29 a
18,57 ± 0,74 a
0
14,78 ± 0,14 a
18,92 ± 0,54 a
5
15,19 ± 0,90 a
19,41 ± 1,34 a
7
15,77 ± 0,95 a
19,16 ± 0,52 a
10
15,04 ± 0,81 a
19,21 ± 1,02 a
5-F50
15,37 ± 0,47 a
19,07 ± 0,95 a
5-F100
Letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias
significativas (p < 0,05).
IV.1.6.3. Efecto inhibitorio del cobre en mosto tinto con 14,3 % de
grado alcohólico probable
Se ha trabajado con las levaduras 7VA y AWRI796; a temperatura constante de 22 ºC en
mosto de uva tinta variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP. Las dosis de cobre han sido
de 5, 7, y 10 mg/l, dosificados al inicio de las fermentaciones, además de un control sin
adición del bloqueador. Todos los ensayos se han realizado por cuadruplicado.
IV.1.6.3.1. Grado alcohólico
La Figura IV.31 muestra el grado alcohólico obtenido para ambas levaduras. Con la
levadura 7VA se logran reducciones de 0,10; 0,15 y 0,28 % v/v con respecto al control,
a las dosis de 5, 7 y 10 mg/l de cobre respectivamente. Al respecto, en el trabajo ya
referido de Brandolini et al (2002) se obtuvo similar comportamiento con S. cerevisiae al
disminuir su poder fermentativo a medida que se incrementaba la concentración de
cobre en mosto tinto, aunque con un menor contenido de azúcares (19%), destacando
153
IV. Resultados y discusión
además en dicho trabajo que la naturaleza de la cepa de levadura es determinante en
cuanto al efecto inhibitorio del cobre, lo cual podría explicar el incremento en la
producción de etanol por la levadura AWRI796, incremento del grado alcohólico que
también fue observado previamente con S. cerevisiae (Azenha et al, 2000).
14,5
Grado alcohólico % v/v
7VA
AWRI 796
14,0
13,5
13,0
12,5
12,0
0
5
7
10
Cobre (mg/l)
Figura IV.31. Grado alcohólico a diferentes dosis iniciales de cobre con las levaduras
7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
En cuanto al consumo de azúcares, a diferencia de los ensayos anteriores, en el presente
ensayo (Tabla IV.31) los azucares residuales son bajos, lo cual podría ser explicado por
la naturaleza del medio fermentativo, que posiblemente en los casos anteriores no hayan
contado con los nutrientes necesarios requeridos por las levaduras.
Tabla IV.31. Azúcares residuales a diferentes dosis iniciales de
cobre con las levaduras 7VA y AWRI796 en mosto tinto con 14,3 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Azúcares residuales totales (g/l)
Cobre (mg/l)
7VA
AWRI 796
2,84 ± 0,08 a
2,69 ± 0,33 a
0
2,84 ± 0,10 a
3,05 ± 0,15 ab
5
2,93 ± 0,09 a
2,87 ± 0,15 ab
7
2,85
±
0,05
a
3,30 ± 0,21 b
10
Letras diferentes en la misma columna indican que existen
diferencias significativas (p < 0,05).
154
IV. Resultados y discusión
155
IV. Resultados y discusión
156
IV. Resultados y discusión
IV.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los
parámetros colorimétricos y en la producción de metabolitos
secundarios en vinificaciones en tinto
IV.2.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros
colorimétricos en vino tinto
Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre los parámetros
colorimétricos de un vino tinto producido a partir de mosto de uva variedad Tempranillo
con 14,1 % v/v de GAP, utilizando las cepas 7VA y AWRI796, para lo cual se han
determinado la Intensidad Colorante (IC), Tonalidad (T) y porcentajes de color.
La Tabla IV.32 resume los principales parámetros colorimétricos determinados tras las
fermentaciones así como las diferencias estadísticamente significativas.
157
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.32. Intensidad colorante (IC), tonalidad (T) y porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones con las levaduras 7VA y AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4).
Levadura
Bloqueador
(mg/L)
IC
Control
0
0,55 ± 0,01 bcd
0,46 ± 0,01 bcd
28,11 ± 0,15 ab
60,91 ± 0,85 abc
10,97 ± 0,69 de
Furfural
50
0,56 ± 0,01 bcd
0,45 ± 0,01 abcd
27,95 ± 0,26 ab
60,99 ± 0,97 abc
11,04 ± 0,73 e
100
0,56 ± 0,02 bcd
0,47 ± 0,01 cd
28,43 ± 0,21 abc
60,22 ± 0,60 ab
11,34 ± 0,48 e
50
0,57 ± 0,01 cd
0,47 ± 0,01 cd
28,63 ± 0,19 bc
59,73 ± 0,24 a
11,63 ± 0,06 e
100
0,54 ± 0,00 bc
0,47 ± 0,01 cd
28,75 ± 0,19 bc
60,59 ± 0,32 abc
10,65 ± 0,44 cde
100
0,55 ± 0,01 bcd
0,47 ± 0,01 cd
28,67 ± 0,21 bc
60,69 ± 0,14 abc
10,62 ± 0,30 bcde
200
0,55 ± 0,01 bcd
0,47 ± 0,01 d
28,99 ± 0,30 c
60,51 ± 0,62 abc
10,48 ± 0,34 bcde
20
0,47 ± 0,02 a
0,45 ± 0,02 abcd
28,31 ± 0,51 abc
62,51 ± 2,03 bcde
9,16 ± 1,51 abc
50
0,53 ± 0,01 b
0,43 ± 0,00 a
27,67 ± 0,19 a
64,19 ± 0,35 e
8,13 ± 0,15 a
5
0,56 ± 0,00 bcd
0,44 ± 0,00 ab
28,11 ± 0,31 ab
63,56 ± 0,27 de
8,32 ± 0,12 a
7
0,58 ± 0,01 de
0,45 ± 0,01 abc
28,28 ± 0,44 abc
62,75 ± 0,56 cde
8,96 ± 0,14 ab
10
0,62 ± 0,01 e
0,47 ± 0,01 bcd
29,05 ± 0,31 c
61,55 ± 0,81 abcd
9,39 ± 0,55 abcd
Control
0
0,58 ± 0,01 bc
0,48 ± 0,01 c
29,09 ± 0,34 b
59,78 ± 0,45 a
11,11 ± 0,15 c
Furfural
50
0,57 ± 0,03 bc
0,45 ± 0,01 ab
28,05 ± 0,15 ab
61,56 ± 0,41 bcde
10,38 ± 0,26 bc
100
0,49 ± 0,02 a
0,46 ± 0,01 abc
28,42 ± 0,23 ab
61,29 ± 0,77 abcd
10,28 ± 0,58 abc
50
0,54 ± 0,00 abc
0,47 ± 0,01 bc
28,65 ± 0,13 ab
60,50 ± 0,22 abc
10,84 ± 0,15 c
100
0,52 ± 0,01 abc
0,47 ± 0,01 bc
28,75 ± 0,18 ab
60,32 ± 0,37 ab
10,91 ± 0,20 c
Glicolaldehído
100
0,50 ± 0,00 ab
0,43 ± 0,01 a
27,61 ± 0,42 a
63,01 ± 0,22 e
9,36 ± 0,21 a
p-Benzoquinona
20
0,54 ± 0,03 abc
0,46 ± 0,01 abc
28,76 ± 0,71 b
61,53 ± 1,09 bcde
9,69 ± 0,39 ab
50
0,54 ± 0,01 abc
0,44 ± 0,01 ab
28,03 ± 0,56 ab
62,45 ± 0,83 de
9,51 ± 0,27 ab
5
0,57 ± 0,00 bc
0,46 ± 0,01 abc
28,58 ± 0,40 ab
62,04 ± 0,31 cde
9,36 ± 0,24 a
7
0,58 ± 0,00 c
0,45 ± 0,01 ab
28,29 ± 0,15 ab
62,17 ± 0,43 cde
9,53 ± 0,31 ab
0,60 ± 0,08 c
0,47 ± 0,01 bc
28,90 ± 0,76 b
60,54 ± 1,00 abc
10
Para cada levadura, letras diferentes en la misma columna indican que existen diferencias significativas (p < 0,05).
10,54 ± 0,77 bc
o-Vainillina
7VA
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
o-Vainillina
AWRI 796
Cobre
158
Tonalidad
% Amarillo
% Rojo
% Azul
IV. Resultados y discusión
La Figura IV.32 muestra los valores de Intensidad colorante (IC) y Tonalidad (T)
obtenidos con la levadura 7VA. En la mayoría de los tratamientos no se observó una
diferencia significativa con respecto al control, cuya IC fue de 0,55. Las únicas
diferencias fueron observadas con 20 mg/l de p-benzoquinona con un valor de 0,47 y
con el cobre a 10 mg/l con un valor de 0,62.
En los valores de Tonalidad, en el control se obtuvo un valor de 0,46, siendo el único
tratamiento significativamente diferente la p-benzoquinona a 50 mg/l, con un valor de
0,43. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas como puede
comprobarse en la respectiva columna de la Tabla IV.32.
Con respecto a los porcentajes de color obtenidos en las fermentaciones con la levadura
7VA (Figura IV.33), se observa un mayor efecto de los bloqueadores en el porcentaje de
color azul, el cual disminuyó en los tratamientos con 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y
con 5 y 7 mg/l de cobre. Mientras que en el porcentaje de color rojo se obtuvo un
incremento en los tratamientos con 50 mg/l de p-benzoquinona y 5 mg/l de cobre. Los
demás tratamientos no mostraron diferencias significativas con respecto al control,
como puede comprobarse en la Tabla IV.32.
159
IV. Resultados y discusión
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
C
10
7
C
5
C
50
Q
20
Q
20
0
G
G
10
0
10
0
V
50
V
F1
00
F5
0
C
on
t
ro
l
0,0
IC
Tonalidad
Figura IV.32. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones con la levadura 7VA. Media ± desviación estándar (n = 4).
70
60
50
40
30
20
10
10
C
7
C
5
C
50
Q
20
Q
20
0
G
10
0
G
10
0
V
50
V
F1
00
F5
0
C
on
t
ro
l
0
Amarillo
Rojo
Azul
Figura IV.33. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones con la levadura 7VA. Media ± desviación estándar (n = 4).
Con respecto a las fermentaciones con la levadura AWRI796, la Figura IV.34 muestra
los valores obtenidos de Intensidad colorante (IC) y Tonalidad (T). En la mayoría de los
tratamientos no se observó diferencias significativas con respecto al control, cuya IC fue
de 0,58, mostrando una mayor homogeneidad entre tratamientos, excepto en el
tratamiento con 100 mg/l de furfural, cuya IC fue de 0,49. En los valores de Tonalidad,
en el control se obtuvo un valor de 0,48, siendo los tratamientos significativamente
160
IV. Resultados y discusión
diferentes el furfural a 50 mg/l con una T de 0,45, el glicolaldehído a 100 mg/l con una
T de 0,43, la p-benzoquinona a 50 mg/l con un valor de 0,44 y el cobre a 7 mg/l con una
T de 0,45. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas (Tabla IV.32)
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
C
10
7
C
5
C
50
Q
20
Q
G
10
0
10
0
V
50
V
F1
00
F5
0
C
on
t
ro
l
0,0
IC
Tonalidad
Figura IV.34. Intensidad colorante (IC) y tonalidad (T) al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones con la levadura AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4).
70
60
50
40
30
20
10
10
C
7
C
5
C
50
Q
20
Q
10
0
G
10
0
V
50
V
F1
00
F5
0
C
on
t
ro
l
0
Amarillo
Rojo
Azul
Figura IV.35. Porcentajes de color al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones con la levadura AWRI796. Media ± desviación estándar (n = 4).
Con respecto a los porcentajes de color obtenidos con la levadura AWRI796 (Figura
IV.35), se observa un efecto de los bloqueadores en los porcentajes de color azul y rojo.
161
IV. Resultados y discusión
En el porcentaje de color azul se obtuvo una disminución en los tratamientos con 100
mg/l de glicolaldehído, 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y con 5 y 7 mg/l de cobre.
Mientras que en el porcentaje de color rojo se obtuvo un incremento en los tratamientos
con 50 mg/l de furfural, 100 mg/l de glicolaldehído, 20 y 50 mg/l de p-benzoquinona y
con 5 y 7 mg/l de cobre. Los demás tratamientos no mostraron diferencias significativas
como puede comprobarse en la Tabla IV.32.
Comparando los resultados obtenidos para ambas levaduras, se podría concluir que la pbenzoquinona y el cobre pueden ejercer un efecto mediante la modificación de los
parámetros colorimétricos en vinos tintos, principalmente en el porcentaje de color azul,
el cual lo disminuyen y en el porcentaje de color rojo, el cual se incrementa, sobre todo
con la levadura AWRI796.
162
IV. Resultados y discusión
IV.2.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la
producción de glicerina en vino tinto
Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de
glicerina en vinos tintos producidos a partir de mostos de uva variedad Tempranillo con
10 y 14,1 % v/v de GAP, utilizando la levadura 7VA.
La glicerina es un metabolito de importante impacto en el vino ya que aporta “dulzor” y
su viscosidad incrementa la suavidad, estructura y cuerpo (Hidalgo, 2010; Suárez–Lepe y
Morata, 2012). Desempeña diferentes funciones durante el desarrollo de la levadura,
como por ejemplo en la biosíntesis de la membrana lipídica (Pretorius, 2000), donde un
intermediario esencial es su precursor glicerol-3-fosfato (Figura IV.36). Además durante
la fermentación, la síntesis de glicerina está vinculada entre otras funciones, a la
resistencia al estrés osmótico y oxidativo y a mantener el equilibrio redox intracelular
mediante la producción de NAD+ a partir de la reoxidación del NADH citosólico
generado durante la producción de biomasa (Scanes et al, 1998).
En presencia de furfural se ha observado una mayor afinidad hacia el NADH por la
enzima ADH -responsable de reducir el furfural a alcohol furfurílico- que por la enzima
GPDH -responsable de reducir el dihidroxiacetona fosfato a glicerol-3-fosfato, precursor
de la glicerina-, generándose una inhibición competitiva (Palmqvist et al, 1999). Se podría
esperar por tanto que la producción de glicerina sea menor en estas condiciones, pues el
furfural requiere NADH cuando es convertido por S. cerevisiae en alcohol furfurílico
(Figura I.5), del mismo modo como la vainillina y la o-vainillina son convertidas en los
163
IV. Resultados y discusión
alcoholes vainíllico y o-vainíllico respectivamente (Figura I.7) o el glicolaldehído en
etilenglicol (Figura I.9).
D-glucosa
D-glucosa
D-fructosa
D-fructosa
2 ATP
2 ADP + 2 Pi
Fructosa 1,61,6-difosfato
Dihidroxiacetona
fosfato
Gliceraldehído-3-fosfato
NADH + H+
Glicerol 3-fosfato
deshidrogenasa
GAPDH
NAD+
1,3-difosfoglicerato
Glicerol-3-fosfato
Piruvato
Glicerina
Otros
metabolitos
Glicerina
Acetaldehído
NADH + H+
ADH
NAD+
Etanol
Etanol
Figura IV.36. Fermentación gliceropirúvica en Saccharomyces cerevisiae.
Sin embargo, otros estudios han demostrado que la producción de glicerina podría
incrementarse en presencia de bloqueadores metabólicos (Taherzadeh et al, 1999), lo cual
indicaría otras fuentes de poder reductor en forma de NADH para la enzima GPDH. Se
ha sugerido como fuente alternativa al Ciclo de Krebs (Modig et al, 2002), principalmente
en las etapas iniciales del proceso fermentativo (Horváth et al, 2003), incrementándose
además la producción de otros intermediarios metabólicos como el ácido succínico
(Taherzadeh et al, 1999), de especial interés en cuanto a la mejora de la acidez (Coulter et
al, 2004) y del perfil aromático del vino (Hidalgo, 2010).
164
IV. Resultados y discusión
La Figura IV.37 muestra la producción de glicerina en el mosto con 10 % de GAP,
obteniéndose una mayor producción de glicerina en presencia de p-benzoquinona y
cobre, aunque el análisis estadístico mostró diferencias significativas solamente con el
cobre a 10 mg/l, con un incremento de 0,48 g/l con respecto al control. Por el contrario,
en presencia de ácido trans-cinámico a 50 y 100 mg/l disminuye la producción de
glicerina en 0,62 y 0,67 g/l respectivamente, diferencias estadísticamente significativas
con respecto al control (Apéndice H1). Los otros bloqueadores no muestran un efecto
significativo sobre la producción de glicerina.
5
Glicerina (g/l)
4
3
2
1
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Cn50
Cn100
10 % GAP
Figura IV.37. Producción de glicerina por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al
inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
En el medio con 14,1 % de GAP, el efecto es más variable en función del bloqueador
utilizado como se puede apreciar en la Figura IV.38. El furfural parece no afectar la
producción de glicerina, resultados que concuerdan con los obtenidos con la levadura
7VA en un ensayo anterior (Tabla IV.12). Concentraciones de glicerina que no muestran
diferencias significativas con respecto al control, al igual que en presencia de
glicolaldehído, cobre y p-benzoquinona a la dosis de 50 mg/l. A la dosis de 20 mg/l de
p-benzoquinona, la producción de glicerina incrementa en 0,54 g/l, producción que es
significativamente diferente al control (Apéndice H2).
165
IV. Resultados y discusión
En el caso de la o-vainillina a las dosis de 50 y 100 mg/l, se reduce la producción de
glicerina en 0,71 y 0,57 g/l respectivamente con respecto al control, efecto que no se
observó en el ensayo de la sección IV.1.2.3 (Tabla IV.16). Igualmente ocurre con el
ácido trans-cinámico, el cual a las dosis de 50 y 100 mg/l, disminuye la producción de
glicerina en 0,77 y 1,23 g/l respectivamente, producciones que son significativamente
diferentes al control (Apéndice H2), lo cual concuerda con los resultados obtenidos con
el medio a 10 % de GAP del ensayo anterior (Figura IV.37).
8
Glicerina (g/l)
7
6
5
4
3
2
1
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Cn50
Cn100
14,3 % GAP
Figura IV.38. Producción de glicerina por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Comparando los resultados obtenidos para ambas concentraciones de azúcar en el
mosto, se podría concluir que el ácido trans-cinámico además de inhibir la producción
de etanol por la levadura 7VA, puede reducir la producción de glicerina, mientras que la
p-benzoquinona y el cobre podrían incrementar su producción. Los demás bloqueadores
parecen no tener un efecto considerable en su producción, al mostrar comportamientos
diferentes en función del medio fermentativo.
166
IV. Resultados y discusión
IV.2.3. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de
compuestos volátiles fermentativos en vino tinto
Durante la fermentación alcohólica se genera una amplia variedad de compuestos
volátiles que tienen un importante impacto sensorial en el vino. Desde un punto de vista
cuantitativo estos compuestos son los más abundantes en la fracción aromática y su
presencia en determinadas concentraciones podría indicar algún tipo de desviación como
consecuencia del efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos.
IV.2.3.1. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de
compuestos volátiles fermentativos en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP
Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de
compuestos volátiles de origen fermentativo en vinos tintos producidos a partir de mosto
de uva variedad Syrah con 14,3 % v/v de GAP utilizando la levadura 7VA.
IV.2.3.1.1. Producción de acetaldehído
Se considera importante la producción de acetaldehído por ser el metabolito precursor
en la síntesis de etanol y su presencia en concentraciones no habituales puede indicar el
efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la levadura, especialmente porque algunos
de estos bloqueadores actúan directamente sobre la enzima ADH.
La Figura IV.39 muestra la producción de acetaldehído, la cual incrementa en presencia
de furfural y o-vainillina a medida que aumentan las dosis de estos bloqueadores,
aunque dicha producción es significativamente superior solamente con la o-vainillina a
167
IV. Resultados y discusión
100 mg/l. Con los demás bloqueadores no se obtienen producciones de acetaldehído que
sean significativamente diferentes al control (Apéndice I.1).
En el caso del furfural el incremento en la producción de acetaldehído muestra un
comportamiento similar al obtenido en el ensayo de la sección IV.1.1.2 (Tabla IV.3) con
la misma cepa de levadura. Resultados similares a los obtenidos en trabajos previos
(Palmqvist et al, 1999; Modig et al, 2002), donde la acumulación del acetaldehído estaría
relacionada a la inhibición de la enzima ADH.
60
Acetaldehído (mg/l)
50
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.39. Producción de acetaldehído por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
IV.2.3.1.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas
La Tabla IV.33 muestra la producción de acetaldehído, ésteres y cetonas y la Tabla IV.34
muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de bloqueadores metabólicos,
observándose variabilidad en los resultados, aunque todas las concentraciones obtenidas
se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación.
168
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.33. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
35,62 ± 2,65
8,57 ± 1,21
9,95 ± 0,44
Acetato de
etilo
94,61 ± 5,22
Furfural
50
38,61 ± 3,20
7,67 ± 2,18
9,55 ± 0,98
97,84 ± 8,75
6,81 ± 0,55
5,80 ± 1,24
8,78 ± 1,26
100
42,64 ± 2,61
8,28 ± 1,60
10,31 ± 1,48
93,20 ± 6,27
8,39 ± 1,54
5,17 ± 0,38
8,72 ± 0,38
50
42,96 ± 5,66
10,07 ± 2,05
9,58 ± 1,36
99,31 ± 10,83
4,86 ± 4,24
6,03 ± 1,40
8,67 ± 1,19
100
50,74 ± 5,52
11,18 ± 0,70
10,36 ± 0,90
113,75 ± 21,01
7,59 ± 0,23
6,44 ± 1,36
10,21 ± 0,47
100
38,85 ± 0,34
10,07 ± 0,94
8,78 ± 1,77
85,12 ± 4,31
4,73 ± 4,10
5,52 ± 1,02
9,14 ± 0,87
200
36,26 ± 2,61
9,13 ± 0,76
8,65 ± 0,15
93,54 ± 3,29
5,57 ± 3,71
4,91 ± 0,20
9,56 ± 0,40
20
36,51 ± 3,32
8,81 ± 0,94
9,00 ± 0,45
92,98 ± 3,11
7,06 ± 0,14
5,13 ± 0,41
9,13 ± 0,36
50
33,59 ± 1,46
8,68 ± 1,14
8,47 ± 0,49
88,81 ± 10,26
7,24 ± 0,22
5,18 ± 0,60
9,58 ± 0,11
5
32,69 ± 1,64
8,30 ± 1,67
9,35 ± 2,07
91,63 ± 8,05
12,62 ± 5,00
6,40 ± 1,56
8,65 ± 0,79
10
40,89 ± 4,92
9,05 ± 2,37
6,65 ± 1,88
107,39 ± 10,39
5,24 ± 3,54
7,43 ± 1,17
9,02 ± 0,22
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Acetaldehído
Acetoina
Diacetilo
169
Lactato de
etilo
4,82 ± 4,18
Acetato de
isoamilo
6,89 ± 1,03
Acetato de
2-feniletilo
8,29 ± 0,56
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.34. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
30,61 ± 4,31
35,79 ± 1,49
17,70 ± 1,01
4,43 ± 0,10
2-Metil-1butanol
148,23 ± 9,19
Furfural
50
27,84 ± 0,82
38,80 ± 1,08
17,26 ± 0,88
4,40 ± 0,21
151,54 ± 5,24
34,41 ± 5,21
100
27,67 ± 0,87
41,50 ± 1,28
16,31 ± 1,41
4,51 ± 0,05
149,28 ± 11,36
33,86 ± 6,01
1313,43 ± 45,61
5,31 ± 0,58
37,65 ± 3,63
50
28,27 ± 2,10
39,49 ± 3,81
17,65 ± 1,72
4,84 ± 0,25
144,95 ± 15,06
33,61 ± 3,71
1375,63 ± 164,11
5,13 ± 0,92
45,31 ± 4,49
100
29,86 ± 2,01
48,95 ± 3,20
20,47 ± 1,69
5,06 ± 0,13
151,41 ± 16,62
33,83 ± 4,10
1652,01 ± 89,05
5,56 ± 0,30
44,13 ± 4,28
100
28,53 ± 1,01
38,11 ± 2,11
17,99 ± 0,96
4,28 ± 0,15
149,91 ± 10,35
35,14 ± 4,92
1218,14 ± 135,14
5,12 ± 0,15
39,38 ± 2,77
200
28,85 ± 0,89
38,75 ± 1,62
18,18 ± 1,00
4,26 ± 0,04
151,69 ± 10,49
35,72 ± 3,81
1304,12 ± 60,64
5,51 ± 0,30
41,23 ± 1,50
20
27,68 ± 3,08
38,91 ± 1,93
18,23 ± 1,36
4,24 ± 0,05
154,93 ± 11,22
35,45 ± 5,84
1220,39 ± 68,42
5,34 ± 0,58
42,21 ± 0,38
50
28,96 ± 0,39
40,70 ± 0,46
19,10 ± 0,69
4,31 ± 0,08
162,76 ± 7,91
37,87 ± 4,34
1314,13 ± 35,06
4,72 ± 0,84
46,51 ± 3,53
5
28,56 ± 1,72
45,12 ± 2,53
16,94 ± 0,67
4,29 ± 0,13
150,20 ± 5,39
32,87 ± 4,55
1292,56 ± 112,36
5,31 ± 0,37
40,60 ± 4,96
10
27,70 ± 1,32
57,22 ± 4,81
18,46 ± 0,97
4,31 ± 0,08
156,15 ± 9,86
31,50 ± 4,50
1712,52 ± 131,46
4,94 ± 0,27
40,32 ± 4,34
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Metanol
1-Propanol
Isobutanol
1-Butanol
170
3-Metil-1butanol
35,74 ± 2,97
2,3-Butanodiol
Hexanol
2-Feniletanol
1060,34 ± 60,55
6,63 ± 0,98
40,45 ± 3,13
1154,94 ± 45,39
5,85 ± 0,16
37,51 ± 1,98
IV. Resultados y discusión
Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya
producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han
representado gráficamente los compuestos en cuya producción existen diferencias
significativas con respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado
mediante el Test de Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.1). Dichas variaciones
han sido más notables en el diacetilo, lactato de etilo, 1-propanol y 2,3-butanodiol.
La Figura IV.40 muestra la producción de diacetilo, la cual es menor en presencia de 10
mg/l de cobre, mostrando una diferencia significativa con respecto al control (Apéndice
I.1), mientras que los demás bloqueadores al parecer no afectan su producción.
12
Diacetilo (mg/l)
10
8
6
4
2
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.40. Producción de diacetilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
Con respecto al lactato de etilo (Figura IV.41) la única diferencia significativa se observa
en presencia de 5 mg/l de cobre, el cual incrementa su producción. Los demás
bloqueadores al parecer no afectan su producción (Apéndice I.1).
171
IV. Resultados y discusión
18
Lactato de etilo (mg/l)
15
12
9
6
3
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.41. Producción de lactato de etilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
La Figura IV.42 muestra la producción de 1-propanol, que incrementa a medida que la
dosis de los bloqueadores aumenta, siendo mayor el incremento en presencia de ambas
dosis de cobre y de furfural y o-vainillina, estos últimos a 100 mg/l, con producciones
significativamente diferentes al control (Apéndice I.1).
1-Propanol (mg/l)
80
60
40
20
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.42. Producción de 1-propanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos
al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación estándar (n
= 4).
La Figura IV.43 muestra la producción de 2,3-butanodiol, compuesto que puede
contribuir al equilibrio aromático del vino, con un umbral de percepción en torno a los
172
IV. Resultados y discusión
120 mg/l (Gomez et al, 2007). En base a los resultados obtenidos, en presencia de todos
los bloqueadores metabólicos la concentración de este polialcohol es superior a su
umbral de percepción, mostrando un incremento en su producción en presencia de ovainillina y cobre, así como a las dosis más altas de furfural, glicolaldehído y pbenzoquinona, resultados que muestran diferencias estadísticamente significativas con
respecto al control (Apéndice I.1).
El 2,3-butanodiol es sintetizado a partir de la reducción de la acetoína, la cual tiene
como una de sus fuentes la reducción del diacetilo (Chuang y Collins, 1968), de modo que
una disminución en la producción del diacetilo, podría traducirse en un incremento del
2,3-butanodiol, lo cual se observa en presencia de 10 mg/l de cobre (Figura IV.40), al
mismo tiempo que el 2,3-butanodiol incrementa considerablemente su producción
(Figura IV.43). Con los demás bloqueadores no se observa dicho comportamiento.
2,3-Butanodiol (mg/l)
2000
1600
1200
800
400
0
Control
F50
F100
V50
V100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.43. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP. Media ± desviación
estándar (n = 4).
En base a los resultados obtenidos, se observa que el efecto de los bloqueadores
metabólicos sobre la producción de compuestos volátiles fermentativos es variable en
173
IV. Resultados y discusión
función de su naturaleza química, lo cual se refleja en el análisis discriminante mostrado
en la Figura IV.44, donde el cobre y la o-vainillina afectan considerablemente el perfil
volátil del vino, diferenciándose del control y de los demás bloqueadores.
Figura IV.44. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos por la
levadura 7VA en mosto tinto Syrah con 14,3 % de GAP a diferentes dosis de furfural (F), o-vainillina
(V), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q) y cobre (C). Media ± desviación estándar (n = 4).
174
IV. Resultados y discusión
IV.2.3.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de
compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 10 %
de GAP
Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de
compuestos volátiles fermentativos en un vino tinto producido con la levadura 7VA a
partir de mosto de uva variedad Tempranillo con 10 % de GAP.
IV.2.3.2.1. Producción de acetaldehído
La Figura IV.45 muestra la producción de acetaldehído, la cual es variable en función de
la naturaleza química de cada bloqueador. En presencia de o-vainillina y glicolaldehído,
la producción de acetaldehído disminuye a medida que se incrementan las dosis, al igual
que con la p-benzoquinona a 50 mg/l, mientras que con el furfural, el ácido transcinámico y el cobre, no se puede establecer una correlación lineal entre la producción de
acetaldehído y las dosis de bloqueador. Resultados que difieren de los obtenidos en el
ensayo con mosto a 14,3 % de GAP (Figura IV.39), lo que indica que el efecto de los
bloqueadores estaría influenciado por la concentración de azúcares en el mosto, además
de otros factores como la composición propia del mosto, pues son de diferentes
variedades de uva.
Con respecto al cobre, Pons y Chanel (1991) evaluaron su efecto sobre la fermentación
alcohólica en un mosto tinto con similar GAP (10 % v/v), observando que en presencia
de dosis altas (95 mg/l de cobre), se incrementa la producción de acetaldehído,
alcanzando su máxima acumulación al finalizar la fermentación. Mientras que a
175
IV. Resultados y discusión
menores dosis, la máxima producción ocurre en las primeras etapas, y a medida que
transcurre el proceso fermentativo es reducido a etanol. Ello indicaría que altas
concentraciones de cobre afectan entre otras enzimas a la ADH, como se ha demostrado
en estudios previos (Costa et al, 2002; Shenton y Grant, 2003; Shanmuganathan et al, 2004),
principalmente mediante su oxidación.
140
Acetaldehído (mg/l)
120
100
80
60
40
20
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.45. Producción de acetaldehído (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
IV.2.3.2.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas
La Tabla IV.35 muestra la producción de acetaldehído, cetonas y ésteres, y la Tabla IV.36
muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de los bloqueadores
metabólicos, observándose variabilidad en los resultados, aunque todas las
concentraciones obtenidas se encuentran dentro de los rangos habituales en vinificación.
176
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.35. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las
fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
92,83 ± 11,95
12,19 ± 1,05
2,42 ± 0,41
Acetato de
etilo
52,03 ± 10,33
Furfural
50
70,12 ± 8,81
11,64 ± 0,52
2,23 ± 0,27
52,38 ± 5,81
6,47 ± 0,42
2,64 ± 0,24
7,35 ± 0,21
100
89,84 ± 14,73
12,26 ± 1,72
2,66 ± 0,17
52,97 ± 11,31
6,38 ± 0,46
2,66 ± 0,25
7,63 ± 0,08
50
75,74 ± 16,24
11,01 ± 0,21
2,07 ± 0,03
64,35 ± 4,57
6,07 ± 0,13
2,72 ± 0,12
7,00 ± 0,09
100
62,17 ± 13,74
10,67 ± 1,13
1,99 ± 0,21
49,65 ± 8,16
5,96 ± 0,07
2,47 ± 0,26
7,12 ± 0,15
50
76,90 ± 13,88
10,67 ± 0,25
1,94 ± 0,10
51,21 ± 7,43
6,15 ± 0,29
2,48 ± 0,27
6,80 ± 0,11
100
94,14 ± 11,19
10,36 ± 1,04
2,11 ± 0,21
37,48 ± 4,93
6,02 ± 0,06
2,35 ± 0,16
6,87 ± 0,14
100
88,26 ± 11,48
10,11 ± 1,56
2,46 ± 0,38
47,27 ± 8,21
7,53 ± 0,81
2,76 ± 0,31
7,65 ± 0,25
200
57,78 ± 9,27
11,35 ± 0,19
2,15 ± 0,23
39,11 ± 2,32
6,01 ± 0,04
2,38 ± 0,05
7,12 ± 0,18
20
99,89 ± 8,81
12,18 ± 0,54
2,10 ± 0,05
31,78 ± 3,81
5,99 ± 0,12
2,25 ± 0,13
7,04 ± 0,10
50
71,04 ± 17,16
11,02 ± 1,10
2,13 ± 0,08
40,48 ± 4,71
6,04 ± 0,15
2,42 ± 0,14
7,03 ± 0,14
5
101,88 ± 29,58
12,87 ± 1,67
2,35 ± 0,33
46,57 ± 5,75
6,11 ± 0,11
2,54 ± 0,28
7,21 ± 0,01
10
88,10 ± 30,13
13,17 ± 2,45
2,20 ± 0,21
44,93 ± 3,30
6,08 ± 0,04
2,45 ± 0,13
7,42 ± 0,05
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Ácido trans-cinámico
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Acetaldehído
Acetoína
Diacetilo
177
Lactato de
etilo
6,03 ± 0,07
Acetato de
isoamilo
2,59 ± 0,39
Acetato de
2-feniletilo
7,10 ± 0,21
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.36. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo
con 10 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
4,26 ± 0,18
28,70 ± 0,24
30,67 ± 1,71
4,18 ± 0,05
2-Metil-1butanol
109,98 ± 2,84
Furfural
50
4,12 ± 0,11
27,42 ± 2,58
26,25 ± 2,41
4,21 ± 0,05
101,98 ± 8,03
26,75 ± 2,21
100
4,53 ± 0,20
32,37 ± 1,15
34,28 ± 4,04
4,31 ± 0,19
127,58 ± 5,66
33,19 ± 1,56
512,58 ± 8,83
3,89 ± 0,10
25,77 ± 1,02
50
4,75 ± 0,35
35,42 ± 2,56
14,71 ± 2,06
4,27 ± 0,12
81,82 ± 8,49
19,87 ± 2,06
564,41 ± 45,36
3,98 ± 0,05
21,81 ± 1,77
100
4,61 ± 0,19
31,27 ± 0,96
18,43 ± 3,18
4,09 ± 0,10
82,32 ± 7,57
20,86 ± 2,34
497,60 ± 22,98
4,00 ± 0,16
23,73 ± 1,11
50
4,69 ± 0,16
38,29 ± 0,49
17,59 ± 1,61
3,98 ± 0,04
79,05 ± 0,96
17,94 ± 1,11
447,87 ± 29,86
4,04 ± 0,03
17,82 ± 0,44
100
4,83 ± 0,17
35,68 ± 4,48
16,63 ± 3,94
3,96 ± 0,08
73,30 ± 4,99
18,65 ± 3,06
645,75 ± 41,59
3,78 ± 0,11
18,54 ± 0,64
100
4,62 ± 0,41
28,70 ± 4,47
36,75 ± 8,21
4,09 ± 0,13
122,98 ± 20,75
31,66 ± 4,34
470,08 ± 56,79
4,02 ± 0,10
27,80 ± 5,02
200
4,16 ± 0,04
23,12 ± 0,43
25,66 ± 1,16
3,98 ± 0,06
88,86 ± 4,66
24,11 ± 1,28
422,32 ± 10,27
3,94 ± 0,13
20,43 ± 0,69
20
4,32 ± 0,20
21,84 ± 0,56
29,65 ± 3,47
4,20 ± 0,05
102,93 ± 4,59
26,05 ± 1,79
393,55 ± 11,93
3,92 ± 0,09
24,58 ± 1,22
50
4,70 ± 0,20
24,22 ± 2,47
28,06 ± 6,35
4,19 ± 0,08
100,49 ± 15,63
26,03 ± 3,46
444,40 ± 40,52
3,97 ± 0,09
27,91 ± 5,05
5
4,69 ± 0,21
29,75 ± 0,77
29,85 ± 2,89
4,30 ± 0,10
116,48 ± 3,51
28,27 ± 0,36
475,95 ± 19,12
3,96 ± 0,14
28,22 ± 1,32
10
5,05 ± 0,19
32,65 ± 1,54
25,64 ± 2,82
4,12 ± 0,07
102,90 ± 9,88
25,68 ± 1,65
518,43 ± 17,24
3,89 ± 0,16
25,54 ± 4,32
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Ácido trans-cinámico
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Metanol
1-Propanol
Isobutanol
1-Butanol
178
3-Metil-1butanol
29,52 ± 0,75
2,3Butanodiol
454,88 ± 19,01
Hexanol
2-Feniletanol
4,25 ± 0,17
23,72 ± 1,18
457,91 ± 30,93
3,97 ± 0,16
21,55 ± 1,63
IV. Resultados y discusión
Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya
producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han
representado gráficamente los compuestos en cuya producción existen diferencias
significativas con respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado
mediante el Test de Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.2). Dichas variaciones
han sido más notables en el acetato de etilo, 1-propanol, isobutanol, 2-metil-1-butanol,
3-metil-1-butanol y 2,3-butanodiol.
La Figura IV.46 muestra la producción de acetato de etilo, la cual no se ve afectada en
presencia de furfural, resultados similares a los obtenidos con la levadura 7VA en el
ensayo de la sección IV.1.1.2. (Tabla IV.4), al igual que con el cobre, que a pesar de
presentar concentraciones más bajas de acetato de etilo, no muestran una diferencia
estadística significativa con respecto al control (Apéndice I.2). Con respecto a la
presencia de cobre en el medio fermentativo, en el estudio de Pons y Chanel (1991)
lograron reducir la producción de acetato de etilo hasta en un 94% a concentraciones de
95 mg/l de cobre, a 25 mg/l la producción fue reducida en un 30%, mientras que a 14
mg/l de cobre no se inhibió la síntesis del acetato de etilo.
En presencia de glicolaldehído y ácido trans-cinámico la producción de acetato de etilo
disminuye a medida que se incrementan la dosis de estos bloqueadores, aunque dichas
diferencias no son estadísticamente significativas con respecto al control. Con el ácido
trans-cinámico, se obtuvieron resultados similares al ensayo de la sección IV.1.3.2 a
bajas concentraciones de azúcar en el mosto (Tabla IV.20), logrando la mayor reducción
en la producción de acetato de etilo a la dosis de 100 mg/l de ácido trans-cinámico, al
igual que en el tratamiento con 20 mg/l de p-benzoquinona. Por el contrario, en
179
IV. Resultados y discusión
presencia de 50 mg/l de o-vainillina la producción de acetato de etilo incrementa con
respecto al control.
Acetato de etilo (mg/l)
80
60
40
20
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.46. Producción de acetato de etilo por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.47 muestra la producción de 1-propanol e isobutanol (2-metil-1-propanol).
El 1-propanol incrementa su producción en presencia de ácido trans-cinámico,
resultados similares a los obtenidos con la misma cepa de levadura en el ensayo de la
sección IV.1.3.2 en el medio con bajo contenido de azúcares (Tabla IV.20). Del mismo
modo que se obtuvo un incremento en presencia de o-vainillina, sobre todo a la dosis de
50 mg/l, y en menor medida con el furfural a 100 mg/l y el cobre a 10 mg/l. Por el
contrario, el glicolaldehído a 200 mg/l y la p-benzoquinona a 20 mg/l disminuyen la
producción de éste alcohol superior. Los demás bloqueadores parecen no alterar
considerablemente la producción del 1-propanol, tal como lo muestra el análisis
estadístico (Apéndice I.2). Resultados que en el caso del furfural, o-vainillina y cobre
concuerdan con el ensayo anterior (Figura IV.42), en el cual a una mayor concentración
de azúcares en el mosto se observó un incremento en la producción de 1-propanol.
180
IV. Resultados y discusión
En lo que respecta a la producción de isobutanol, en presencia de o-vainillina y ácido
trans-cinámico disminuyó considerablemente su producción con respecto al control,
mientras que con los demás bloqueadores no se obtuvo una variación significativa
(Apéndice I.2). Con respecto al cobre, se ha reportado que altas dosis (95 mg/l) pueden
inhibir totalmente la síntesis de isobutanol (Pons y Chanel, 1991).
50
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
Propanol
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Isobutanol
Figura IV.47. Producción de 1-propanol e isobutanol (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los
bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.48 muestra la producción de 2-metil-1-butanol (alcohol amílico), el cual
disminuye considerablemente en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico,
mientras que con los demás bloqueadores no se aprecia una diferencia significativa en
su producción con respecto al control (Apéndice I.2).
181
IV. Resultados y discusión
2-Metil-1-butanol (mg/l)
160
120
80
40
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.48. Producción de 2-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.49 muestra la producción de 3-metil-1-butanol (alcohol isoamílico), el cual
disminuye considerablemente en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico. Con
los demás bloqueadores la producción no es significativamente diferente al control
(Apéndice I.2).
Con respecto al cobre, se ha reportado que en su presencia Saccharomyces cerevisiae
disminuye la producción del 3-metil-1-butanol (Pons y Chanel, 1991), llegando a ser nula
a 95 mg/l de cobre, mientras que a 14 mg/l puede disminuirla hasta en 23%, lo cual
podría estar relacionado con la inhibición del cobre sobre la síntesis del acetil-CoA
(Bramlett et al, 2003), involucrado directamente en la síntesis del alcohol isoamílico (Web
y Ingraham, 1963; Panda, 2011). Lo cual no se observa en los resultados del presente
ensayo, pues la dosis más próxima, 10 mg/l de Cu, no presenta ningún efecto.
Otro aspecto a destacar es que las concentraciones en las que se encuentra este alcohol
en presencia de casi todos los bloqueadores, están en torno a su umbral de percepción,
182
IV. Resultados y discusión
30 mg/l (Ehsani et al, 2009), con lo cual su presencia no alteraría el perfil aromático, ya
que a mayores concentraciones puede aportar aroma a queso.
3-Metil-1-butanol (mg/l)
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.49. Producción de 3-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.50 muestra la producción de 2,3-butanodiol, el cual incrementa en
presencia de furfural, o-vainillina, cobre y ácido trans-cinámico. Siendo más notable el
incremento con la o-vainillina a 50 mg/l y con el ácido trans-cinámico a 100 mg/l, con
producciones que son significativamente mayores al control (Apéndice I.2). En el caso
del ácido trans-cinámico, se observa un comportamiento similar en su efecto al obtenido
en el ensayo de la sección IV.1.3.2 (Tablas IV.20 y IV.21), lo cual puede ser explicado en
base a las funciones que cumpliría la síntesis de este polialcohol en la regulación de la
acidez y del equilibrio NADH/NAD+ en el interior celular (Nakashimada et al, 2000;
Celińska y Grajek, 2009), como se ha descrito anteriormente.
Por el contrario, la producción de 2,3-butanodiol disminuye con 20 mg/l de pbenzoquinona y con 200 mg/l de glicolaldehído, aunque el análisis estadístico no
muestra diferencias significativas con respecto al control (Apéndice I.2).
183
IV. Resultados y discusión
2,3-Butanodiol (mg/l)
700
600
500
400
300
200
100
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.50. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
Tal como se ha descrito en los apartados anteriores el efecto de los bloqueadores
metabólicos en la fermentación alcohólica es variable en función de la naturaleza
química de cada bloqueador, lo cual puede comprobarse con el análisis discriminante
mostrado en la Figura IV.51 para todos los compuestos volátiles producidos, donde se
observa claramente como algunos bloqueadores pueden afectar considerablemente la
producción de los compuestos volátiles por la levadura, diferenciándose del control y de
otros bloqueadores, como es el caso del ácido trans-cinámico a ambas dosis utilizadas,
al igual que la o-vainillina y el cobre.
En el caso de la o-vainillina y el cobre, los resultados concuerdan con los obtenidos en
el ensayo anterior con el mosto con mayor contenido de azúcares (Figura IV.44). Los
demás bloqueadores al parecer no muestran un efecto considerable sobre el perfil de
compuestos volátiles a esta concentración de azúcares en el medio.
184
IV. Resultados y discusión
Figura IV.51. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles
fermentativos por la levadura 7VA en mosto tinto Tempranillo con 10 % de GAP a diferentes
dosis de furfural (F), o-vainillina (V), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q), cobre (C) y
ácido trans-cinámico (Cn). Media ± desviación estándar (n = 4).
185
IV. Resultados y discusión
186
IV. Resultados y discusión
IV.2.3.3 Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de
compuestos volátiles fermentativos en un mosto tinto Tempranillo con 14,1
% de GAP
Se ha evaluado el efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la producción de
compuestos volátiles fermentativos en vinos tintos producidos a partir de mosto de uva
variedad Tempranillo con 14,1 % v/v de GAP utilizando la levadura 7VA.
IV.2.3.3.1. Producción de acetaldehído
La Figura IV.52 muestra la producción de acetaldehído, la cual disminuye en presencia
de todos los bloqueadores metabólicos, aunque la diferencia solamente es significativa
en presencia de 100 mg/l de o-vainillina y con ambas dosis de ácido trans-cinámico, tal
como lo muestra el análisis estadístico (Apéndice I.3).
160
Acetaldehído (mg/l)
140
120
100
80
60
40
20
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.52. Producción de acetaldehído por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
187
IV. Resultados y discusión
En el caso de la o-vainillina estos resultados concuerdan con los obtenidos en el ensayo
con el mosto de la misma variedad de uva a menor concentración de azúcares (Figura
IV.45), aunque difieren de los resultados con el mosto de variedad Syrah a similar
concentración de azúcares, pues en dicho ensayo (Figura IV.39) la producción de
acetaldehído incrementó en presencia de 100 mg/l de o-vainillina.
IV.2.3.3.2. Producción de alcoholes, ésteres y cetonas
La Tabla IV.37 muestra la producción de acetaldehído, ésteres y cetonas y la Tabla IV.38
muestra la producción de alcoholes, a las diferentes dosis de los bloqueadores,
observándose variabilidad en las concentraciones obtenidas, aunque todas se encuentran
dentro de los rangos habituales en vinificación.
188
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.37. Producción de acetaldehído, ésteres y cetonas por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de
las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
136,35 ± 2,62
13,92 ± 0,51
2,31 ± 0,17
Acetato de
etilo
33,79 ± 2,29
Furfural
50
125,75 ± 16,28
13,27 ± 0,51
2,55 ± 0,36
33,14 ± 0,74
5,95 ± 0,02
2,91 ± 0,40
7,04 ± 0,05
100
120,54 ± 4,16
13,12 ± 0,29
2,63 ± 0,14
32,68 ± 0,32
5,91 ± 0,01
2,54 ± 0,26
7,17 ± 0,10
50
112,68 ± 14,36
12,16 ± 0,23
2,47 ± 0,13
51,45 ± 0,84
6,09 ± 0,04
2,87 ± 0,31
6,94 ± 0,13
100
77,36 ± 2,91
12,68 ± 1,87
2,53 ± 0,24
65,31 ± 1,80
5,99 ± 0,08
3,66 ± 0,34
6,72 ± 0,37
50
68,28 ± 7,31
11,44 ± 0,57
2,41 ± 0,34
64,96 ± 1,57
5,95 ± 0,02
3,12 ± 0,10
6,29 ± 0,18
100
39,47 ± 9,39
11,88 ± 0,46
2,40 ± 0,15
58,06 ± 2,06
6,06 ± 0,14
3,66 ± 0,08
6,28 ± 0,12
100
115,12 ± 9,31
12,37 ± 0,19
2,54 ± 0,36
33,27 ± 2,87
5,99 ± 0,07
2,67 ± 0,11
6,66 ± 0,17
200
119,63 ± 5,71
12,58 ± 0,17
2,33 ± 0,23
33,98 ± 1,28
6,06 ± 0,05
2,66 ± 0,16
6,98 ± 0,14
20
116,15 ± 16,19
11,88 ± 0,27
2,15 ± 0,16
33,92 ± 3,05
5,96 ± 0,06
2,75 ± 0,40
7,14 ± 0,15
50
113,17 ± 5,75
12,48 ± 0,35
2,23 ± 0,18
33,07 ± 0,73
5,97 ± 0,07
2,67 ± 0,29
7,04 ± 0,05
5
115,79 ± 24,66
12,29 ± 0,11
2,32 ± 0,22
34,47 ± 1,63
6,05 ± 0,03
2,76 ± 0,28
7,09 ± 0,11
10
127,45 ± 12,34
12,72 ± 0,40
2,22 ± 0,15
33,85 ± 2,16
5,92 ± 0,02
2,50 ± 0,15
6,83 ± 0,15
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Ácido trans-cinámico
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Acetaldehído
Acetoina
Diacetilo
189
Lactato de
etilo
5,95 ± 0,04
Acetato de
isoamilo
2,73 ± 0,34
Acetato de 2feniletilo
6,82 ± 0,69
IV. Resultados y discusión
Tabla IV.38. Producción de alcoholes por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo
con 14,1 % de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
Control
0
7,61 ± 0,31
24,87 ± 0,86
27,92 ± 1,99
4,17 ± 0,05
2-Metil-1butanol
138,79 ± 1,80
5,19 ± 0,40
52,48 ± 3,46
Furfural
50
7,64 ± 0,49
26,61 ± 0,57
29,13 ± 0,56
4,25 ± 0,10
139,21 ± 3,04
43,29 ± 1,53
839,20 ± 28,71
4,90 ± 0,25
47,89 ± 1,63
100
7,93 ± 0,30
27,56 ± 0,40
29,25 ± 0,52
4,20 ± 0,09
140,55 ± 2,50
44,29 ± 0,93
878,77 ± 10,25
5,17 ± 0,18
49,14 ± 1,63
50
7,52 ± 0,27
27,86 ± 0,94
14,55 ± 0,41
4,83 ± 0,11
118,52 ± 2,72
28,20 ± 0,49
1034,05 ± 31,48 5,33 ± 0,32
40,45 ± 0,68
100
7,40 ± 0,46
34,96 ± 0,51
16,83 ± 0,31
4,45 ± 0,13
132,24 ± 3,49
29,21 ± 1,20
1226,43 ± 30,34 5,18 ± 0,10
33,20 ± 1,72
50
7,76 ± 0,33
41,42 ± 2,29
13,17 ± 0,51
4,38 ± 0,10
121,10 ± 3,41
23,73 ± 2,41
1165,03 ± 90,77 4,96 ± 0,21
24,26 ± 1,56
100
7,74 ± 0,45
47,26 ± 0,92
11,94 ± 0,15
4,78 ± 0,17
129,53 ± 3,22
21,66 ± 0,99
1291,14 ± 48,01 4,97 ± 0,24
22,11 ± 0,89
100
7,18 ± 1,10
25,97 ± 0,22
29,85 ± 2,31
4,22 ± 0,06
142,77 ± 2,05
45,51 ± 0,84
853,23 ± 35,07
5,44 ± 0,12
51,28 ± 2,94
200
7,04 ± 0,85
25,67 ± 0,89
30,03 ± 2,00
4,19 ± 0,03
144,10 ± 4,89
45,07 ± 1,97
852,17 ± 24,74
5,39 ± 0,07
51,27 ± 2,82
20
6,29 ± 0,27
23,90 ± 1,56
27,67 ± 3,83
4,27 ± 0,07
148,31 ± 2,69
45,11 ± 3,29
800,00 ± 31,95
5,06 ± 0,19
58,66 ± 5,43
50
6,92 ± 0,30
25,36 ± 0,70
27,77 ± 0,67
4,22 ± 0,04
140,76 ± 3,82
44,17 ± 1,73
889,70 ± 14,15
5,04 ± 0,22
58,92 ± 1,83
5
7,24 ± 0,27
26,52 ± 0,55
25,84 ± 1,05
4,19 ± 0,08
137,29 ± 5,17
41,48 ± 2,22
906,50 ± 35,10
4,92 ± 0,14
50,82 ± 4,64
10
6,83 ± 0,33
27,80 ± 0,37
26,15 ± 0,68
4,24 ± 0,08
140,01 ± 5,50
41,53 ± 2,20
908,61 ± 45,56
5,03 ± 0,29
48,62 ± 2,29
Bloqueador (mg/l)
o-Vainillina
Ácido trans-cinámico
Glicolaldehído
p-Benzoquinona
Cobre
Metanol
1-Propanol
Isobutanol
1-Butanol
190
3-Metil-1butanol
43,05 ± 1,60
2,3Butanodiol
819,37 ± 37,91
Hexanol
2-Feniletanol
IV. Resultados y discusión
Las siguientes figuras muestran los resultados para los compuestos volátiles cuya
producción se ha visto modificada por los bloqueadores metabólicos. Sólo se han
representado los compuestos en cuya producción existen diferencias significativas con
respecto al control, en base a los resultados del análisis realizado mediante el Test de
Rangos Múltiples HSD de Tukey (Apéndice I.3). Dichas variaciones han sido más
notables en la acetoína, acetato de etilo, acetato de isoamilo, 1-propanol, 1-butanol,
isobutanol, 2-metil-1-butanol, 3-metil-1-butanol, 2-feniletanol y 2,3-butanodiol.
La Figura IV.53 muestra la producción de acetoína, la cual disminuye con respecto al
control en presencia de ambas dosis de ácido trans-cinámico, así como con 50 mg/l de
o-vainillina, 20 mg/l de p-benzoquinona y 5 mg/l de cobre. Los demás bloqueadores al
parecer no afectan la producción de esta cetona (Apéndice I.3).
Acetoína (mg/l)
15
12
9
6
3
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.53. Producción de acetoína (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.54 muestra la producción de acetato de etilo, la cual incrementa en
presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico. Con los demás bloqueadores no se
observa ningún efecto significativo en su producción (Apéndice I.3).
191
IV. Resultados y discusión
En el caso de la o-vainillina a la dosis de 50 mg/l, los resultados concuerdan con los
obtenidos en el ensayo con el mosto de la misma variedad de uva con menor contenido
de azúcares (Figura IV.46), en el cual se observó un incremento en la producción de
acetato de etilo, mientras que con el ácido trans-cinámico se obtuvieron resultados
opuestos a dicho ensayo, lo que indicaría que su efecto sobre la producción de este éster
es afectado por la concentración de azúcares en el mosto.
Acetato de etilo (mg/l)
80
60
40
20
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.54. Producción de acetato de etilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los
bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.55 muestra la producción de acetato de isoamilo, la cual incrementa con las
dosis más altas de o-vainillina y ácido trans-cinámico (100 mg/l), mientras que los
demás bloqueadores no afectan su producción (Apéndice I.3). El acetato de isoamilo es
un éster importante en el vino dada su contribución a la fracción volátil, aportando
aroma a plátano, con un umbral de percepción de 30 μg/l (Ferreira et al, 2002), de modo
que un incremento en su producción, dentro de los rangos habituales en vinificación,
podría contribuir a mejorar el perfil aromático del vino.
192
IV. Resultados y discusión
Acetato de isoamilo (mg/l)
4
3
2
1
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.55. Producción de acetato de isoamilo (mg/l) por la levadura 7VA al dosificar los
bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de
GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.56 muestra la producción de 1-propanol e isobutanol (2-metil-1-propanol).
El 1-propanol incrementa su producción en presencia de ácido trans-cinámico,
resultados que corroboran los resultados obtenidos con el mosto de la misma variedad
de uva y con menor contenido de azúcares (Figura IV.47). Del mismo modo la
producción de 1-propanol incrementó en presencia de 100 mg/l de furfural, 10 mg/l de
cobre y con ambas dosis de o-vainillina, siendo mayor el incremento a la dosis de 100
mg/l, al igual que en el mosto de Syrah con similar contenido de azúcares (Figura IV.42).
Los demás bloqueadores no afectan la producción del 1-propanol (Apéndice I.3).
Con respecto al isobutanol, en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico
disminuyó considerablemente su producción con respecto al control, al igual que en el
caso del mosto con menor contenido de azúcares (Figura IV.47), mientras que con los
demás bloqueadores metabólicos no se obtuvo una variación significativa en su
producción (Apéndice I.2).
193
IV. Resultados y discusión
50
Propanol
Isobutanol
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.56. Producción de 1-propanol e isobutanol por la levadura 7VA al dosificar los
bloqueadores metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 %
de GAP. Media ± desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.57 muestra la producción de 1-butanol, el cual incrementó con respecto al
control en presencia de ambas dosis de o-vainillina y con 100 mg/l de ácido transcinámico. Los demás bloqueadores al parecer no afectan la producción de este alcohol
superior, cuyas concentraciones se encuentran por debajo de su umbral de percepción,
de aproximadamente 150 mg/l (Cullere et al, 2004).
1-Butanol (mg/l)
5
4
3
2
1
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.57. Producción de 1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
194
IV. Resultados y discusión
La Figura IV.58 muestra la producción de 2-metil-1-butanol, el cual disminuye en
presencia de 50 mg/l de o-vainillina y 50 mg/l de ácido trans-cinámico, mientras que
con los demás bloqueadores no se aprecia una diferencia significativa en su producción
con respecto al control (Apéndice I.3). Resultados que concuerdan con los obtenidos en
el mosto de la misma variedad de uva con menor contenido de azúcares ( Figura IV.48),
así como con el ensayo de la sección IV.1.3.2 en un medio a base de mosto concentrado
de uva blanca con 15 % de GAP (Tabla IV.20), en el cual con la misma cepa de
levadura, a la dosis de 50 mg/l de ácido trans-cinámico, la producción del 2-metil-1butanol fue menor con respecto al control.
2-Metil-1-butanol (mg/l)
160
120
80
40
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.58. Producción de 2-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
Al igual que en el caso del 2-metil-1-butanol, la producción de 3-metil-1-butanol
disminuye en presencia de o-vainillina y ácido trans-cinámico (Figura IV.59).
Resultados que concuerdan con los obtenidos en el mosto con menor contenido de
azúcares (Figura IV.49). Con los demás bloqueadores no se observa ningún efecto en su
producción con respecto al control (Apéndice I.3).
195
IV. Resultados y discusión
El 3-metil-1-butanol o alcohol isoamílico, es un alcohol superior cuyo umbral de
percepción está en torno a 30 mg/l (Ehsani et al, 2009). En la Figura IV.59, las
concentraciones de este alcohol superior están por debajo de ese valor en el caso de la ovainillina y el ácido trans-cinámico, lo cual podría ser interesante de considerar dado
que este alcohol podría no ser agradable a partir de determinadas concentraciones en el
vino ya que aporta aroma a queso.
3-Metil-1-butanol (mg/l)
50
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.59. Producción de 3-metil-1-butanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.60 muestra la producción de 2-feniletanol. Este alcohol superior es un
compuesto deseable con un importante efecto sobre el perfil aromático del vino, en el
cual aporta aromas florales y cuyo umbral de percepción está en torno a 14 mg/l (Campo
et al, 2006).
De acuerdo a los resultados mostrados en la Figura IV.60, la producción de 2-feniletanol
disminuye a medida que se incrementa la dosis de o-vainillina y ácido trans-cinámico,
siendo mayor la reducción en presencia del último, efecto que no se observó en los
ensayos anteriores utilizando este bloqueador. Con los demás bloqueadores no se
196
IV. Resultados y discusión
obtuvieron variaciones importantes en la producción del 2-feniletanol (Apéndice I.3),
siendo en todos los casos su concentración superior a su umbral de percepción.
70
2-feniletanol (mg/l)
60
50
40
30
20
10
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100
G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.60. Producción de 2-feniletanol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
La Figura IV.61 muestra la producción de 2,3-butanodiol. Dicho alcohol al igual que en
ensayos anteriores, incrementa su producción en presencia de o-vainillina y ácido transcinámico, incremento que es mayor a medida que aumenta la concentración de ambos
bloqueadores. Con los demás bloqueadores no se obtienen diferencias significativas con
respecto al control (Apéndice I.3).
Resultados similares se obtuvieron con ambas dosis de o-vainillina en el mosto de Syrah
con similar contenido de azúcares (14,3 % de GAP) (Figura IV.43), así como con el
mosto de Tempranillo con 10 % de GAP (Figura IV.50) aunque en este último caso el
incremento fue significativo sólo con la dosis de 50 mg/l de o-vainillina. Mientras que
en el caso del ácido trans-cinámico los resultados obtenidos en este ensayo corroboran
lo obtenido en los ensayos anteriores, tanto en medios a base de mosto concentrado de
uva blanca Airen (Tablas IV.20 y IV.21) así como con el mosto de Tempranillo con
197
IV. Resultados y discusión
menor contenido de azúcares (Figura IV.50), lo cual indicaría que la producción del 2,3butanodiol cumple una importante función en la regulación de la acidez y del equilibrio
NADH/NAD+ en el interior celular (Nakashimada et al, 2000; Celińska y Grajek, 2009)
como respuesta de la levadura ante altas concentraciones de ácidos en el medio
fermentativo, en este caso el ácido trans-cinámico.
2,3-Butanodiol (mg/l)
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
Control
F50
F100
V50
V100
Cn50
Cn100 G100
G200
Q20
Q50
C5
C10
Figura IV.61. Producción de 2,3-butanodiol por la levadura 7VA al dosificar los bloqueadores
metabólicos al inicio de las fermentaciones en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP. Media ±
desviación estándar (n = 4).
Por otro lado, la producción de 2,3-butanodiol podría incrementarse con algunas cepas
de S. cerevisiae que tienen como principal característica la síntesis de altas cantidades
de glicerina, en detrimento de la producción de etanol, además de reducir
considerablemente los niveles de acetoína (Michnick et al, 1997; Remize et al, 1999;
Ehsani et al, 2009), lo cual en nuestro caso concuerda con la producción de acetoína
mostrada en la Figura IV.53, la cual disminuye en presencia de o-vainillina y ácido
trans-cinámico a medida que se incrementa la producción de 2,3-butanodiol. Con los
demás bloqueadores no se observa dicho comportamiento.
198
IV. Resultados y discusión
Con respecto a lo mencionado en el párrafo anterior sobre el incremento del 2,3butanodiol a medida que la producción de glicerina aumenta, los resultados obtenidos
no concuerdan con dichos estudios, pues en los mostos de Tempranillo con 10 y 14,1 %
de GAP (Figuras IV.50 y IV.61 respectivamente) la producción de 2,3-butanodiol
aumenta en presencia de ácido trans-cinámico, mientras que la producción de glicerina
disminuye significativamente (Figuras IV.37 y IV.38 respectivamente) con respecto al
control. Además en el mosto con 14,1 % de GAP se observa un efecto similar en
presencia de la o-vainillina. Este comportamiento pondría en evidencia una competencia
por el poder reductor en forma de NADH entre las enzimas GPDH y la acetoína
reductasa (Remize et al, 1999), claves en la formación de glicerina y 2,3-butanodiol
respectivamente.
Finalmente, en base a los resultados obtenidos, se comprueba nuevamente que el efecto
de los bloqueadores metabólicos utilizados es variable en función de su naturaleza
química, lo cual se refleja en el análisis discriminante mostrado en la Figura IV.62 para
todos los compuestos volátiles fermentativos, donde se observa claramente como
algunos bloqueadores pueden afectar considerablemente la producción de estos
compuestos por la levadura, diferenciándose del control y de otros bloqueadores, como
es el caso del ácido trans-cinámico y la o-vainillina, resultados que concuerdan con los
obtenidos en el ensayo anterior en el mosto de Tempranillo con menor contenido de
azúcares (Figura IV.51), y en el caso de la o-vainillina concuerdan con el ensayo en el
mosto de Syrah con similar contenido de azúcares (Figura IV.44). Los demás
bloqueadores al parecer no muestran un efecto considerable sobre el perfil de
compuestos volátiles.
199
IV. Resultados y discusión
Figura IV.62. Análisis discriminante para la producción de compuestos volátiles fermentativos
por la levadura 7VA en mosto tinto Tempranillo con 14,1 % de GAP a diferentes dosis de furfural
(F), o-vainillina (V), ácido trans-cinámico (Cn), glicolaldehído (G), p-benzoquinona (Q) y cobre
(C). Media ± desviación estándar (n = 4).
200
IV. Resultados y discusión
201
IV. Resultados y discusión
202
V. Conclusiones
CAPÍTULO V: CONCLUSIONES
203
V. Conclusiones
204
V. Conclusiones
V.1. Reducción del grado alcohólico
-
El efecto inhibitorio de los bloqueadores metabólicos como estrategia para
reducir el grado alcohólico, muestra una amplia variabilidad en función de la
naturaleza química de cada bloqueador, de la composición del medio
fermentativo y de la cepa de levadura utilizada.
-
El furfural es el bloqueador metabólico que mejores resultados en cuanto a la
reducción del grado alcohólico ha permitido obtener, sin afectar el consumo de
azúcares por la levadura.
-
La o-vainillina, el glicolaldehído, el ácido trans-cinámico, la p-benzoquinona y
el cobre muestran comportamientos variables en su efecto inhibitorio sobre la
fermentación alcohólica en función de la composición del medio fermentativo.
V.2. Efecto de los bloqueadores metabólicos en los parámetros
colorimétricos y producción de metabolitos secundarios
-
Los bloqueadores metabólicos estudiados no afectan considerablemente los
parámetros colorimétricos en vinos tintos.
-
En función de la composición del medio fermentativo, la producción de glicerina
puede disminuir en presencia de ácido trans-cinámico y o-vainillina, mientras
que puede incrementar en presencia de p-benzoquinona y cobre. Los demás
bloqueadores no afectan su producción.
205
V. Conclusiones
-
El efecto de los bloqueadores metabólicos sobre la síntesis de compuestos
volátiles fermentativos es variable, afectando considerablemente su producción
el ácido trans-cinámico, la o-vainillina y el cobre.
-
En la mayoría de los casos, la utilización de bloqueadores metabólicos ha
mejorado la producción de acetaldehído, 2,3-butanodiol y 1-propanol. Con otros
metabolitos como el acetato de etilo, en casos puntuales, ha disminuido su
producción.
-
En presencia de ácido trans-cinámico y o-vainillina, la síntesis de alcoholes
superiores puede verse considerablemente afectada.
Finalmente, para dosificar estos bloqueadores metabólicos en los mostos a fermentar,
deben tenerse en cuenta dos consideraciones importantes: La primera, referida a las
concentraciones a partir de las cuales estos compuestos y/o sus derivados pueden
presentar algún efecto no deseable, sin obviar que algunos de ellos forman parte del
grupo de aditivos alimentarios y están sometidos a una legislación que los regula. La
otra consideración, es que su utilización debe hacerse dentro de las concentraciones
usuales presentes en alimentos, y si fuera el caso a concentraciones menores, para no
alterar parámetros importantes como la composición y el equilibrio fisicoquímico y
sensorial del vino.
206
V. Conclusiones
207
V. Conclusiones
208
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224
Apéndices
APÉNDICES
225
Apéndices
226
Apéndices
APÉNDICE A. Cinética fermentativa de diferentes ensayos experimentales
1,6
Pérdida de peso (g)
1,4
pH 3,2/18 ºC
pH 3,2/18 ºC (PF)
pH 3,2/18 ºC (X3)
pH 3,8/18 ºC
pH 3,8/18 ºC (PF)
pH 3,8/18 ºC (X3)
pH 3,8/25 ºC
pH 3,8/25 ºC (PF)
pH 3,8/25 ºC (X3)
1,2
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
30
Día
Figura A.1. Cinética fermentativa de la levadura 7VA en el medio sintético con 14,5% de GAP.
“PF”: adición de 50 mg/L a PF 8. “X3”: adición de 10 mg/L de furfural cada tres días hasta
alcanzar 50 mg/L (n = 4).
Furfural (mg/l)
1,2
Pérdida de peso (g)
1,0
7VA (0)
7VA (50)
7VA (200)
AWRI (0)
AWRI (50)
AWRI (200)
CM15 (0)
CM15 (50)
CM15 (200)
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
0
4
8
12
16
20
24
28
32
36
40
44
48
52
Día
Figura A.2. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA, CM15 y AWRI796 al dosificar furfural
(mg/l) al alcanzar PF = 8 en el medio sintético con 15% de GAP (n = 4).
227
Apéndices
2,0
Furfural (mg/l)
Pérdida de peso (g)
1,6
7VA-0
7VA-50
7VA-100
AWRI-0
AWRI-50
AWRI-100
1,2
0,8
0,4
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Día
Figura A.3. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar furfural al inicio
de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con 15% de GAP (n = 4).
o -Vainillina (mg/l)
2,0
7VA-(0)
7VA-(20)
1,6
7VA-(50)
Pérdida de peso (g)
7VA-(100)
1,2
7VA-(50F+V)
AWRI-(0)
AWRI-(20)
0,8
AWRI-(50)
AWRI-(100)
0,4
AWRI-(50F+V)
0,0
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
24
26
28
Día
Figura A.4. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales
de o-vainillina y a una dosis combinada de 50 mg/l de o-vainillina y 50 mg/l de furfural (50F+V),
en un medio a base de mosto concentrado con 15% de GAP (n = 4).
228
Apéndices
0,25
Ácido cinámico (mg/l) - 11,5 % GAP
7VA-(0)
AWRI-(0)
Pérdida de peso (g)
0,20
7VA-(100)
AWRI-(100)
7VA-(200)
AWRI-(200)
0,15
0,10
0,05
0,00
0
4
8
12
16
20
24
28
32
Día
0,20
Ácido cinámico (mg/l) - 14,4 % GAP
7VA-(0)
AWRI-(0)
Pérdida de peso (g)
0,15
7VA-(100)
AWRI-(100)
7VA-(200)
AWRI-(200)
0,10
0,05
0,00
0
4
8
12
16
20
24
28
32
Día
36
Figura A.5. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796, a diferentes dosis de ácido
trans-cinámico en mosto tinto con 11,5 y 14,4 % GAP (n = 4).
Glicolaldehído (mg/l)
Pérdida de peso (g)
0,5
0,4
7VA-0
7VA-100
7VA-200
AWRI-0
AWRI-100
AWRI-200
0,3
0,2
0,1
0,0
0
4
8
12
16
20
24
28
Día
Figura A.6. Cinética fermentativa de las levaduras 7VA y AWRI796 al dosificar glicolaldehído al
inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto concentrado con 15 % de GAP (n = 4).
229
Apéndices
Cobre (mg/l)
0,4
Pérdida de peso (g)
12%-(0)
12%-(5)
0,3
12%-(10)
12%-(50)
0,2
0,1
0,0
0
4
8
12
16
20
24
28
Día
Cobre (mg/l)
0,4
14%-(0)
Pérdida de peso (g)
14%-(5)
0,3
14%-(10)
14%-(50)
0,2
0,1
0,0
0
4
8
12
16
20
24
28
Día
Figura A.7. Cinética fermentativa de la levadura 7VA a diferentes dosis de cobre (mg/l) en
medios a base de mosto concentrado con 12 y 14 % GAP (n = 4).
230
Apéndices
APÉNDICE B. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con furfural
B.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 12,5 % v/v de
GAP con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de furfural
---------------------------------------------------------------------------------------------------Existen diferencias estadísticamente significativas con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------Furf_50
Furf_20
Furf_10
Furf_5
Furf_1
Furf_0
4
4
4
4
4
4
11,8
11,8250
11,8375
12,0
12,1
12,2125
X
X
X
X
X
X
-------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s)
12,3
Mean
12,2
12,1
12
11,9
11,8
11,7
Furf_0
Furf_1
Furf_5
Furf_10 Furf_20 Furf_50
B.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con diferentes cepas de S. cerevisiae a
distintas dosis iniciales de furfural en el medio sintético con 15 % de GAP
---------------------------------------------------------------------------------------------------No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
de furfural para las levaduras 7VA, Distinction y AWRI796 con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
Means and Standard Errors (internal s)
15
15,2
14,5
Mean
15
14
13,5
13
14,9
12,5
12
14,8
VA7_0
VA7 10
DIST_0
VA7 50
Means and Standard Errors (internal s)
15
14,6
Mean
Mean
15,1
14,2
13,8
13,4
13
AWRI_0
AWRI 10
231
AWRI 50
DIST 10
DIST 50
Apéndices
B.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 14,5 % de
GAP con diferentes cepas de S. cerevisiae. 10 mg/l se adicionó a PF = 8, y 50 mg/l se
adicionó a razón de 10 mg/l cada tres días hasta alcanzar los 50 mg/l.
Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de
adición de furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------50
4
13.9
X
10
4
14.125
X
0
4
14.175
X
-------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s)
14.2
Etanol %
14.15
14.1
14.05
14
13.95
13.9
0
10
50
Levadura Distinction
Col_7
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de
adición de furfural para la levadura Distinction, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------10
4
13.77
X
50
4
13.82
X
0
4
14.1
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14.2
Etanol %
14.1
14
13.9
13.8
13.7
13.6
0
10
50
Col_7
Levadura AWRI796
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes momentos de
adición de furfural con la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%.
232
Apéndices
Means and Standard Errors (internal s)
14.2
Etanol %
14
13.8
13.6
13.4
13.2
0
10
50
Col_7
B.4. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 14,5 % de
GAP a diferentes pHs y temperaturas con la levadura 7VA. “PF”: 50 mg/l de furfural a PF = 8. “X3”:
10 mg/l de furfural cada tres días hasta alcanzar 50 mg/l.
18 ºC y pH 3,2
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 18 ºC y pH 3,2 con la
levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Mean s and S tand ard Errors (i nterna l s)
14, 14
Me a n
14, 1
14, 06
14, 02
13, 98
13, 94
13, 9
_32_0
_32_PF
_32_X3
18 ºC y pH 3,8
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 18 ºC y pH 3,8 con la levadura
7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------_38_PF
4
14,1
X
_38_X3
4
14,1
X
_38_0
4
14,35
X
--------------------------------------------------------------------------------
Mean s and Stand ard Errors (i nterna l s)
14, 4
Me a n
14, 3
14, 2
14, 1
14
_38_0
_38_PF
233
_38_X3
Apéndices
25 ºC y pH 3,8
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a 25 ºC y pH: 3,8 para la
levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------_38X3
4
14,19
X
_38PF
4
14,22
X
_380
4
14,3025
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14, 34
Me a n
14, 3
14, 26
14, 22
14, 18
14, 14
14, 1
_380
_38PF
_38X3
B.5. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar furfural al inicio de las fermentaciones en el medio sintético con 15 % de GAP
Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------_7VA_50
4
14,5667
X
_7VA_100
4
14,5875
X
_7VA_200
4
14,675
X
_7VA_0
4
14,825
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14,9
Mean
14,8
14,7
14,6
14,5
14,4
_7VA_0
_7VA_50
_7VA_100
_7VA_200
Levadura AWRI 796
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
de furfural para la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%.
234
Apéndices
Means and Standard Errors (internal s)
13,3
Mean
13,1
12,9
12,7
12,5
AWRI_0
AWRI_50
AWRI_100
AWRI_200
B.6. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico tras las fermentar el medio sintético con 15
% de GAP con diferentes concentraciones de furfural dosificado a PF = 8.
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
de furfural para las levaduras 7VA y AWRI796, mientras que para la levadura CM15 si existen diferencias
significativas, con un nivel de confianza del 95%.
Levaduras 7VA y AWRI796
Means and Standard Errors (internal s)
Means and Standard Errors (internal s)
13,6
14,9
13,5
Mean
14,7
14,6
13,4
13,3
13,2
13,1
13
14,5
VA7_0
VA7_50
AWRI796_0
VA7_200
AWRI796_50
Levadura CM15
---------------------------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------CM15_200
4
12,8
X
CM15_50
4
13,0375
X
CM15_0
4
13,3267
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
13,5
13,3
Mean
Mean
14,8
13,1
12,9
12,7
CM15_0
CM15_50
235
CM15_200
AWRI796_200
Apéndices
B.7. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico tras las fermentar el medio a base de
mosto concentrado con 15 % de GAP a diferentes dosis iniciales de furfural.
Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
furfural para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------50
4
14.5933
X
0
4
14.72
X
100
4
15.045
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
15.3
Col_2
15.1
14.9
14.7
14.5
0
50
100
Col_1
Levadura AWRI796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
furfural para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------100
4
13.615
X
50
4
13.6833
X
0
4
14.3233
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14.4
Col_2
14.2
14
13.8
13.6
13.4
0
50
Col_1
236
100
Apéndices
APÉNDICE C. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con o-vainillina
C.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar o-vainillina al inicio de las fermentaciones en medio sintético con 15 % de GAP
Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina
para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
14,8
Mean
14,6
14,4
14,2
14
VA7_0
VA7_20
VA7_50
Levadura AWRI796
Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina
para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------AWRI796_50 4
12,7333
X
AWRI796_20 4
13,0167
XX
AWRI796_0
4
13,2667
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
13,4
Mean
13,2
13
12,8
12,6
AWRI796_0
AWRI796_20
237
AWRI796_50
Apéndices
C.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en el medio sintético con 12,5 % de GAP
con la levadura 7VA a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y combinación de o-vainillina y
furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno
Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina
para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
Etanol %
12.8
12.6
12.4
12.2
12
0
20
50
5050
o Vainillina
C.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico en un medio a base de mosto concentrado
con 15 % de GAP con las levaduras 7VA y AWRI796 a diferentes dosis iniciales de o-vainillina y
combinación de o-vainillina y furfural (V+F) a 50 mg/l cada uno
Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina
para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------100
4
13.605
X
0
4
14.72
X
50
4
14.9625
X
5050
4
14.98
X
20
4
15.0333
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
15.4
Col_2
15
14.6
14.2
13.8
13.4
13
0
20
50
Col_1
238
100
5050
Apéndices
Levadura AWRI796
Existen diferencias estadísticamente significativas a diferentes concentraciones iniciales de o-vainillina
para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------100
4
13.1967
X
5050
4
13.6975
XX
50
4
13.8675
XX
20
4
13.9533
XX
0
4
14.3233
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14.5
Col_2
14.2
13.9
13.6
13.3
13
0
20
50
Col_1
239
100
5050
Apéndices
APÉNDICE D. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con ácido trans-cinámico
D.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796
al dosificar ácido trans-cinámico en mosto tinto a 11,5 y 14,4 % de GAP
11,5 % GAP: Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
de ácido trans-cinámico para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
11.15
Alcohol
11.12
11.09
11.06
11.03
11
_7VA12-0
_7VA12-100
_12 GAP
11,5 % GAP: Levadura AWRI 796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------AWRI12-100 4
10.92
X
AWRI12-0
4
11.2233
X
-------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s)
11.3
Alcohol
11.2
11.1
11
10.9
10.8
AWRI12-0
AWRI12-100
14.3
14.1
14.2
13.9
Alcohol
% Alcohol
_12 GAP
14,4 % GAP: Levaduras 7VA y AWRI 796
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
de ácido trans-cinámico para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
Means and Standard Errors (internal s)
14.1
14
13.7
13.5
13.9
13.3
13.8
_7VA15-0
AWRI15-0
_7VA15-100
AWRI15-100
_15 GAP
_15 GAP
240
Apéndices
D.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796
al dosificar ácido trans-cinámico al inicio de las fermentaciones en medios a base de
mosto concentrado con 12 y 15 % de GAP
12 % GAP: Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
ácido trans-cinámico con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------_7VA12-0
4
11.052
X
_7VA12-100 4
11.2227
XX
_7VA12-50 4
11.2875
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
Alcohol
11.4
11.3
11.2
11.1
11
_7VA12-0
_7VA12-100
_7VA12-50
_10 Baume
12 % GAP: Levadura AWRI 796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------AWRI12-50 4
11.3238
X
AWRI12-0
4
11.5
X
-------------------------------------------------------------------------------Means and Standard Errors (internal s)
Alcohol
11.6
11.5
11.4
11.3
11.2
AWRI12-0
AWRI12-50
_10 Baume
15 % GAP: Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
ácido trans-cinámico con la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------_7VA15-0
4
14.6255
X
_7VA15-50
4
14.6772
X
_7VA15-100 4
14.977
X
--------------------------------------------------------------------------------
241
Apéndices
Means and Standard Errors (internal s)
15.1
% Alcohol
15
14.9
14.8
14.7
14.6
14.5
_7VA15-0
_7VA15-100
_7VA15-50
_14 Baume
15 % GAP: Levadura AWRI 796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones de
ácido trans-cinámico para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------AWRI15-50 4
14.3545
X
AWRI15-0
4
14.6268
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
% Alcohol
14.7
14.6
14.5
14.4
14.3
14.2
AWRI15-0
AWRI15-50
_14 Baume
242
Apéndices
APÉNDICE E. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con glicolaldehído
E.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto
concentrado
Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de glicolaldehído para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
%v/v etanol
14.1
13.9
13.7
13.5
13.3
13.1
12.9
7VA-0
7VA-100
7VA-200
Glicolaldehído (g/L)
Levadura AWRI796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de glicolaldehído para la levadura AWRI796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------200
4
13.1167
X
100
4
13.7833
XX
0
4
13.88
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
14.2
Etanol
14
13.8
13.6
13.4
13.2
13
0
100
Col_1
243
200
Apéndices
E.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 14,3 % de GAP
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de glicolaldehído para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
14.2
14
14.1
13.9
Etanol
14
13.9
13.8
13.8
13.7
13.6
13.7
13.5
13.6
0
0
100
7VA
Col_1
100
Col_1
AWRI796
E.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con la levadura 7VA al dosificar
glicolaldehído al inicio de las fermentaciones en mosto tinto con 12 % de GAP
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de glicolaldehído para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
11.8
11.7
Etanol
Etanol
Means and Standard Errors (internal s)
11.6
11.5
11.4
11.3
11.2
0
100
Col_1
244
Apéndices
APÉNDICE F. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con p-benzoquinona
F.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar p-benzoquinona al inicio de las fermentaciones en un medio a base de mosto
concentrado
12 % GAP
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de p-benzoquinona para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
11
10.8
10.7
Etanol
11.1
10.5
10.2
10.4
10.1
9.8
9.9
9.5
9.6
0
20
0
100
7VA
Col_1
20
100
AWRI796
Col_1
15 % GAP: Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de p-benzoquinona para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
13.7
13.5
Etanol
Ethanol
Means and Standard Errors (internal s)
13.3
13.1
12.9
0
20
100
Col_1
15 % GAP: Levadura AWRI 796
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de p-benzoquinona para la levadura AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------100
4
11.7033
X
20
4
12.2175
XX
0
4
12.9967
X
--------------------------------------------------------------------------------
245
Apéndices
Means and Standard Errors (internal s)
13.4
Etanol
13
12.6
12.2
11.8
11.4
11
0
20
100
Col_1
F.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 al
dosificar p-benzoquinona al inicio de las fermentaciones en mosto tinto
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de p-benzoquinona para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
14.1
14
14
13.9
Etanol
Etanol
Means and Standard Errors (internal s)
13.9
13.8
13.8
13.7
13.6
13.7
13.5
13.6
0
20
0
50
20
Col_1
AWRI796
Col_1
7VA
246
50
Apéndices
APÉNDICE G. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
los ensayos con cobre
G.1. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico obtenido con la levadura 7VA al
dosificar cobre al inicio de las fermentaciones en el medio sintético
12 % v/v GAP: Levadura 7VA
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de cobre para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
11.1
Etanol
10.9
10.7
10.5
10.3
10.1
0
5
Col_1
14% v/v GAP: Levadura 7VA
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de cobre para la levadura 7VA, con un nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------5
4
11.794
X
0
4
12.7927
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
13
Etanol
12.6
12.2
11.8
11.4
11
0
5
Col_1
247
Apéndices
G.2. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con la levadura 7VA en medios a
base de mosto concentrado a diferentes dosis iniciales de cobre y combinación de cobre
(5 mg/l) y furfural (50 y 100 mg/l)
12 % v/v GAP
Existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico para la levadura 7VA, con un
nivel de confianza del 95%.
-------------------------------------------------------------------------------Method: 95,0 percent Tukey HSD
Count Mean
Homogeneous Groups
-------------------------------------------------------------------------------7
4
9.525
X
5
4
9.9675
XX
10
4
10.47
XX
5+F50 4
10.5033
XX
5+F100 4
10.8
XX
0
4
10.995
X
--------------------------------------------------------------------------------
Means and Standard Errors (internal s)
11.4
Etanol
11
10.6
10.2
9.8
9.4
9
+F100
+F50
0
10
5
7
Col_1
14% v/v GAP
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico para la levadura 7VA, con un
nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
13.4
Etanol
13
12.6
12.2
11.8
11.4
11
+F100
+F50
0
10
Col_1
248
5
7
Apéndices
G.3. Test de Rangos Múltiples para el grado alcohólico con las levaduras 7VA y AWRI796 a
diferentes dosis iniciales de cobre en mosto tinto
No existen diferencias estadísticamente significativas en el grado alcohólico a diferentes concentraciones
iniciales de cobre para las levaduras 7VA y AWRI 796, con un nivel de confianza del 95%.
Means and Standard Errors (internal s)
14.1
Etanol
14
13.9
13.8
13.7
13.6
13.5
0
10
5
7
7VA
Col_1
Means and Standard Errors (internal s)
Etanol %
14.3
14.1
13.9
13.7
13.5
0
5
7
AWRI796
Col_1
249
10
Apéndices
250
Apéndices
APÉNDICE H. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
la producción de glicerina
Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de glicerina por la levadura 7VA en
fermentaciones de mosto tinto de variedad Tempranillo con 10 y 14,1 % de GAP. Los bloqueadores
utilizados fueron:
 F
: Furfural
 V
: o-Vainillina
 G
: Glicolaldehído
 Q
: p-Benzoquinona
 C
: Cobre
 Cn
: Ácido trans-cinámico
H.1 Producción de glicerina en mosto tinto con 10 % GAP
Existen diferencias estadísticamente significativas en la producción de glicerina con la levadura 7VA, con
un nivel de confianza del 95%.
4.7
4.4
4.1
3.8
251
V50
V100
Q50
Q20
G200
G100
F50
F100
Control
Cn50
Cn100
3.2
C5
3.5
C10
Glicerina 10% GAP
Means and Standard Errors (internal s)
Apéndices
H.2. Producción de glicerina en mosto tinto con 14,1 % GAP
Existen diferencias estadísticamente significativas en la producción de glicerina con la levadura 7VA, con
un nivel de confianza del 95,0 %.
7.3
6.9
6.5
6.1
252
V50
V100
Q50
Q20
G200
G100
F50
F100
Control
Cn50
Cn100
5.3
C5
5.7
C10
Glicerina 14% GAP
Means and Standard Errors (internal s)
Apéndices
APÉNDICE I. Análisis estadístico mediante el Test de Rangos Múltiples para
la producción de compuestos volátiles fermentativos
Efecto de los bloqueadores metabólicos en la producción de compuestos volátiles fermentativos por la
levadura 7VA en fermentaciones de mosto tinto de la variedad Syrah con 14,3 % de GAP y en mosto tinto
de la variedad Tempranillo con 10 y 14,1 % de GAP. Los bloqueadores utilizados fueron:
 F
: Furfural
 V
: o-Vainillina
 G
: Glicolaldehído
 Q
: p-Benzoquinona
 C
: Cobre
 Cn
: Ácido trans-cinámico
I.1. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Syrah con 14,3 % GAP
253
Apéndices
254
Apéndices
I.2. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Tempranillo con 10 %
GAP
255
Apéndices
256
Apéndices
I.3. Producción de compuestos volátiles fermentativos en el mosto tinto Tempranillo con 14,1 %
GAP
257
Apéndices
258
Apéndices
APÉNDICE J. Cromatogramas de los análisis realizados para estudiar la
conversión enzimática del furfural y o-vainillina
Alcohol vainíllico
o-Vainillina
3,4-DMF
Alcohol furfurílico
Furfural
Vainillina
J.1. Análisis realizado a las 30 horas (furfural) y 48 horas (o-vainillina) de fermentación a
partir de la dosificación al inicio de las fermentaciones
Patrones externos
400000
Furfural: 50 mg/l
200000
Furfural: 100 mg/l
14
16
18
20
Vainillina
3,4-DMF
Alcohol furfurílico
Furfural
22
24
Alcohol vainíllico
12
o-Vainillina
10
Alcohol o-vainíllico
Min.
Patrones externos
300000
200000
o-Vainillina: 50 mg/l
100000
o-Vainillina: 100 mg/l
Min.
10
12
14
16
259
18
20
22
24
Apéndices
Alcohol vainíllico
Vainillina
3,4-DMF
Furfural
Alcohol furfurílico
o-Vainillina
J.2. Análisis cromatográfico realizado a las 48 horas a partir de la dosificación de furfural y
o-vainillina al finalizar la fase de crecimiento estacionario
Patrones externos
400000
Furfural: 50 mg/l
200000
Furfural: 100 mg/l
14
16
18
20
18
20
Vainillina
3,4-DMF
Alcohol furfurílico
Furfural
22
24
Alcohol vainíllico
12
o-Vainillina
10
Alcohol o-vainíllico
Min.
Patrones externos
300000
o-Vainillina: 50 mg/l
200000
o-Vainillina: 100 mg/l
100000
Min.
10
12
14
16
260
22
24
Apéndices
APÉNDICE K. Cromatogramas de los análisis realizados para estudiar la
conversión enzimática del ácido trans-cinámico
Alcohol vainíllico
Ácido trans-cinámico
Vainillina
3,4-DMF
Estireno
Alcohol furfurílico
Furfural
o-Vainillina
Análisis cromatográfico realizado a las 48 y 72 horas a partir de la dosificación de 100 mg/l de
ácido trans-cinámico en mosto tinto con 14,4 % de GAP con la levadura 7VA
Patrones externos
72 horas
400000
200000
48 horas
Min. 4
6
8
10
12
14
261
16
18
20
22
24
26