1. introducción - Tesis

UNIVERSIDAD DE CHILE
FACULTAD DE CIENCIAS QUÍMICAS Y FARMACÉUTICAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA Y BIOLOGÍA MOLECULAR
REGULACIÓN DEL ESTRÉS OXIDATIVO, INFLAMACIÓN,
REMODELAMIENTO CARDIOVASCULAR Y FUNCIÓN
ENDOTELIAL POR ATORVASTATINA Y ALOPURINOL
EN LA INSUFICIENCIA CARDÍACA
MEMORIA PARA OPTAR AL TÍTULO DE QUÍMICO FARMACÉUTICO
CARLOS ANDRÉS BUSTOS CONTRERAS
Profesor patrocinante:
Dr. Sergio Lavandero G.
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular.
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas.
Universidad de Chile.
Directores de memoria
Dr. Guillermo Diaz-Araya
Dr. Sergio Lavandero G.
Depto Química Farmacológica y Toxicológica
Depto Bioquímica y Biología Molecular
Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas
Universidad de Chile
SANTIAGO, 2007
1
Esta memoria se desarrolló en el Laboratorio de
Transducción
de
Señales
Moleculares
del
Departamento de Bioquímica y Biología Molecular
de
la
Facultad
de
Ciencias
Químicas
y
Farmacéuticas de la Universidad de Chile y fue
financiada por el proyecto FONDECYT 15010006
del Dr. Pablo Castro G.
2
ÍNDICE
página
ÍNDICE…………………………………………………………………………………......3
ÍNDICE DE TABLAS……………………………………………………………………...6
ÍNDICE DE FIGURAS…………………………………………………………………….7
ABREVIATURAS………………………………………………………………………….9
RESUMEN………………………………………………………………………………..11
ABSTRACT……………………………………………………………………………….13
1. INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………......15
1.1. Insuficiencia cardíaca……………………………………………………………... 15
1.2. Remodelado cardiovascular en IC…………….………………………………….16
1.3. Estrés oxidativo en IC………………………………………………………………17
1.4. Inflamación en IC…………………………………………………………………...19
1.5. Función y disfunción endotelial…………………………………………………...20
1.6. Estatinas en IC……………………………………………………………………...21
1.7. Alopurinol en IC………………...…………………………………………….…….22
2. HIPÓTESIS…………………………………………………………………………... 24
3. OBJETIVO GENERAL……………………………………………………………….24
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS………………………………………………………...24
5. MATERIALES YMÉTODOS…………………………………………………………25
5.1. MATERIALES……………………………………………………………………....25
5.1.1.Equipos…………………………………………………………………….25
5.1.2. Reactivos………….………………………………………………………25
5.2. MÉTODOS…………………………………………………………………………. 25
5.2.1.Pacientes………………………………………………………………..….25
5.2.2. Evaluación del estado de estrés oxidativo plasmático, eritrocitario y
endotelial…………………………………………………………………...27
3
5.2.2.1. Determinación de malondialdehido (MDA)……….……………...27
5.2.2.2. Hemólisis de elementos figurados……………….………………..28
5.2.2.3. Determinación dela actividad de catalasa eritrocitaria (CAT)….28
5.2.2.4. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa
eritrocitaria (SOD)……………………………………………….…...29
5.2.2.5.Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa
endotelial (SODec)………………………………………….…........31
5.2.3.Evaluación del estado de remodelado cardiovascular……...…..……..32
5.2.3.1.Determinación de la actividad en plasma de metaloproteinasas
de la matriz MMP-2 y MMP-9…………………………………… .....32
5.2.4. Determinación de la función endotelial…………………………….…..34
5.2.5. Determinación de los niveles de proBNP……………………………...34
5.2.6. Determinación de losniveles de hs-CRP……………………………....34
5.2.7. Análisis estadístico……………….……………………………………...35
6. RESULTADOS………………………………………………..……………….……...36
6.1. Características clínicas de la población estudiada…………………………......36
6.2. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles de MDA
plasmáticos……………………………………………………………..................37
6.3. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la actividad de SOD
y CAT eritrocitaria……………………………………………………...................38
6.4. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la actividad de SOD
endotelial………………………………………………………………..................40
6.5. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la actividad de MMP2 y 9……………………………………………………………………..................41
6.6. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles de
proBNP plasmático…………………………………………………………..........43
6.7. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles de hsCRP………………………………………………………………………...............45
6.8. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la función
endotelial……………………………………………………………………..........46
4
6.8.1. Vasodilatación dependiente de endotelio……………………...............46
6.8.2. Vasodilatación independiente de endotelio…………………................46
7. DISCUSIÓN……………………………………………………………………….......48
7.1. Estatinas y estrés oxidativo en IC………………………………………………...48
7.2. Estatinas y remodelado cardiovascular en IC…………………………………...49
7.3. Estatinas y función endotelial en IC……………………...……………………....50
7.4. Estatinas e inflamación en IC……………………………………………………..51
7.5. Efectos de alopurinol sobre la IC…………………………………………………52
8. CONCLUSIONES …………………………………………………………………..54
9. BIBLIOGRAFÍA..................................................................................................55
5
ÍNDICE DE TABLAS
página
Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para la determinación de MDA
plasmático................................................................................................28
Tabla 2. Características clínicas de la población cardiópata estudiada.................36
Tabla 3. Características del grupo control estudiado………………………………..37
6
ÍNDICE DE FIGURAS
página
Figura 1. Resumen estrés oxidativo.....................................................................18
Figura 2. Descripción de los tratamientos y de los análisis de las muestras
realizados a los pacientes...................................................................27
Figura 3. Determinación de la actividad catalasa.................................................29
Figura 4. Determinación de la actividad de SOD..................................................30
Figura 5. Curva dosis respuesta de la enzima SOD.............................................31
Figura 6. Relación entre la actividad de SOD y porcentaje de inhibición de la
autoxidación de adrenalina..................................................................31
Figura 7. Relación entre actividad gelatinásica de MMP-2 y MMP-9 y el volumen
de plasma empleado en la zimografía.................................................33
Figura 8. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en los niveles
plasmáticos de MDA en pacientes con ICC........................................38
Figura 9. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la actividad de la
SOD eritrocitaria en pacientes con ICC...............................................39
Figura 10. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la actividad de
la CAT eritrocitaria en pacientes con ICC............................................40
Figura 11. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la actividad de
SOD endotelial en pacientes con ICC.................................................41
Figura 12. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la actividad
plasmática de MMP-2 en pacientes con ICC.......................................42
Figura 13. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la actividad
plasmática de MMP-9 en pacientes con ICC.......................................43
Figura 14. Efecto de atorvastatina y alopurinol en los niveles de proBNP
plasmáticos..........................................................................................44
Figura 15. Efecto de atorvastatina y alopurinol en los niveles de hs-CRP............45
7
Figura 16. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la determinación
de la VDE en pacientes con ICC...........................................................47
Figura 17. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la determinación
de la VIE en pacientes con ICC…………………………………………….47
8
ABREVIATURAS
Ang
: Angiotensina
ATOR
: Atorvastatina
ATOR+ALO
: Atorvastatina más alopurinol
BNP
: Péptido natriurético cerebral
CAT
: Catalasa
DS
: Desviación estándar
DM
: Diabetes mellitus
EAC
: Enfermedad arterial coronaria
ECV
: Enfermedad cardiovascular
ELISA
: Enzyme-linked immunosorbent assay
eNOS
: Oxido nítrico sintasa endotelial
FEVI
: Fracción de eyección del ventrículo izquierdo
GPX
: Glutatión peroxidasa
HA
: Hipertensión arterial
H2O2
: Peróxido de hidrógeno
Hs-CRP
: Proteína C reactiva ultrasensible
HMG-CoA
: 3-Hidroxi-3 metilglutaril coenzima A
IM
: Infarto al miocardio
IL
: Interleuquina
IC
: Insuficiencia cardíaca
ICC
: Insuficiencia cardíaca crónica
IECA
: Inhibidor de enzima convertidora de angiotensina I
MEC
: Matriz extracelular
MDA
: Malondialdehido
mg
: Milígramos
MMPs
: Metaloproteinasas de la matriz
NADPH
: Nicotinamida dinucleótido fosfato reducido
NYHA
: New York Heart Asociation
NO
: Óxido nítrico
NOS
: Óxido nítrico sintasa
9
O2-
: Anión superóxido
OH-
: Radical
ONOO-
: Peroxinitrito
proBNP
: pro péptido natriurético cerebral N-terminal
Rho, Ras y Rac
: Proteínas G pequeña
ROS
: Especies reactivas del oxígeno
SDS
: Dodecil sulfato de sodio
SDS-PAGE
: Gel de poliacrilamida-SDS
SOD
: Superóxido dismutasa
eSOD
: Superóxido dismutasa endotelial
TBA
: Ácido tiobarbitúrico
TBARS
: Sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico
TCA
: Ácido tricloroacético
TIMPs
: Inhibidores tisulares de metaloproteinasas de la matriz
TTO
: Tratamiento
TGF-
: Factor transformante 
TNF-
: Factor de necrosis tumoral 
VDE
: Vasodilatación dependiente del endotelio
VIE
: Vasodilatación independiente del endotelio
VI
: Ventrículo izquierdo
XO
: Xantino oxidasa
hidroxilo
10
RESUMEN
La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome clínico complejo que se
caracteriza por una disfunción del ventrículo, ya que impide que el corazón se
llene y expulse la sangre necesaria para suplir los requerimientos metabólicos de
los distintos órganos. Existen varios procesos que se generan y tienen
consecuencias negativas en el curso de la IC o que son consecuencia del
desarrollo de la IC, principalmente procesos de remodelado cardiovascular, de
desbalance entre las especies reactivas del oxígeno (ROS) llamado también
estrés oxidativo, de inflamación y de disfunción endotelial.
Los inhibidores de la 3-hidroxi-3 metilglutaril coenzima A (HMG CoA)
reductasa, llamados Estatinas, reducen potentemente los niveles de colesterol
LDL, además poseen otros efectos distintos llamados Efectos Pleiotrópicos de las
Estatinas, entre los que se encuentran efectos beneficiosos en la función
endotelial, en inhibición de procesos tales como inflamación, estrés oxidativo,
formación de trombos, hipertrofia miocárdica y en disminución de la actividad
simpática, del sistema renina-angiotensina-aldosterona y de la apoptosis. El
alopurinol es un medicamento que se utiliza en el tratamiento de la gota, se
caracteriza por inhibir la acción de la XO y tiene la capacidad de atrapar radicales
hidroxilo, reduciendo así el estrés oxidativo, por lo tanto tiene efectos favorables
sobre la función endotelial y sobre la eficiencia miocárdica, ya que disminuye el
consumo miocárdico de oxígeno, conservando su contractilidad.
Se analizaron muestras de sangre de pacientes con IC estable y capacidad
funcional II - III de la New York heart asociation (NYHA). Los pacientes ingresados
al protocolo se trataron con placebo durante cuatro semanas y luego se
ramdomizaron en forma ciega a atorvastatina 20 mg 1 vez al día o atorvastatina 20
mg más alopurinol 300 mg, una vez al día, durante 8 semanas para los dos
grupos. Se tomaron muestras de sangre al inicio del protocolo, 4 semanas y a las
8 semanas de tratamiento con atorvastatina o atorvastatina más alopurinol,
11
además se evaluó a un grupo de sujetos sanos pareados por edad y sexo con las
mismas mediciones que los cardiópatas. Para evaluar el estado de estrés
oxidativo,
se
realizaron
las
determinaciones
espectrofotométricas
de
malondialdehido (MDA) plasmático, las actividades enzimáticas eritrocitarias de
superóxido dismutasa (SOD) y catalasa (CAT), y SOD endotelial (eSOD). Para
evaluar el estado de remodelado cardiovascular se realizó la determinación de las
actividades enzimáticas de metaloproteinasas de la matriz (MMPs) 2 y 9 mediante
zimografía. La función endotelial dependiente e independiente de endotelio se
determinó midiendo el diámetro de la arteria braquial mediante pletismografía. La
determinación de los niveles de proBNP
se realizó por la técnica de
electroquimioluminicencia y la hs-CRP se cuantificó en plasma mediante ELISA.
Los resultados mostraron que ambas terapias a las 8 semanas de
tratamiento modificaron los niveles de MDA plasmático, que tienden a disminuir.
No afectaron la actividad enzimática eritrocitaria de SOD y CAT, aumentaron la
actividad de SOD endotelial, no afectaron la actividad de MMP-2 plasmática,
disminuyeron la actividad de MMP-9 plasmática, no modificaron los niveles
plasmáticos de pro BNP y tampoco los de hs-CRP, modificaron la VDE, que tiende
a aumentar y la VIE no varió.
Atorvastatina y atorvastatina más alopurinol disminuyeron parámetros de
estrés oxidativo, inflamación y remodelado cardiovascular en pacientes con
insuficiencia cardíaca.
12
ABSTRACT
Regulation of oxidative stress, inflammation, cardiovascular remodeling and
endothelial function by atorvastatin and allopurinol in patients with heart
failure.
Heart failure (HF) is a complex clinical syndrome characterized by
ventricular dysfunction where the heart does not satisfies the metabolic needs of
the different organs. There are several process involve in the course of heart
failure and also generated during this pathology, mainly process of cardiovascular
remodeling, imbalance between reactive oxygen species (ROS) or oxidative stress,
inflammation and endothelial dysfunction.
The 3-hydroxy-3 methylglutaryl co-enzyme A (HMG Co-A) reductase
inhibitors (statins) powerfully reduce LDL cholesterol levels, furthermore have other
effects named pleiotropic effects of statins like beneficial effects in endothelial
function, in process inhibition such as inflammation, oxidative stress, thrombosis
and myocardial hypertrophy, in sympathetic and renin-angiotensin-aldosterone
system activity and on apoptosis. Allopurinol is used in gout treatment,
characterized for XO inhibition and hydroxyl radical scavenger capacity reducing
oxidative stress, therefore it has positive effects on endothelial function and
myocardial efficiency, since it reduces the oxygen myocardial consumption,
preserving contractility.
We analyzed blood samples of stable chronic heart failure patients with
NYHA class III-IV functional capacity. The patients were treated with placebo
during 4 weeks, then they were blindly randomized to 20 mg atorvastatin once a
day or 20 mg atorvastatin plus 300 mg allopurinol once a day during eight weeks
for both groups. Also, a group of healthy subjects, matched for age and sex, was
evaluated with the same measurements done to the HF patients. The oxidative
stress state was evaluated through the spectrophotometric determination of
malondialdehyde (MDA) plasma levels, superoxide dismutase (SOD) and catalase
13
(CAT)
erythrocyte
Cardiovascular
enzymatic
remodeling
activities,
was
and
evaluated
by
endothelial
SOD
determination
(eSOD).
of
matrix
metalloproteinases (MMPs) 2 and 9 enzymatic activities by zymography.
Endothelial-dependent and independent vasodilation was determined measuring
the diameter of the brachial artery by plethysmography. proBNP levels were
evaluated through immunoradiometric assay and hs-CRP levels were measured
through ELISA.
The results showed that both therapies at 8 weeks of treatment modified the
plasmatic MDA levels, that tend to diminish. Additionally, both therapies
significantly increased eSOD activity, compared with their respective basal.
However, erythrocyte SOD and CAT activities did not change with both treatments.
The MMP-9 but not MMP-2 activities decreased with both therapies compared with
their respective placebo. The proBNP and hs-CRP levels did not change with
therapies. The ATOR and ATOR + ALO treatments did not affect the endothelial
function, reflected by the brachial artery diameter.
According to these results, atorvastatin and atorvastatin plus allopurinol
decrease oxidative stress and cardiovascular remodeling in heart failure patients.
14
1. INTRODUCCIÓN
1.1. Insuficiencia cardiaca
La insuficiencia cardíaca (IC) es un síndrome clínico complejo, que se
caracteriza por una disfunción del ventrículo, lo cual altera su capacidad de
llenarse y expulsar la sangre necesaria que suple los requerimientos metabólicos
de los distintos órganos (1). Generalmente, esta alteración se produce por una
falla en la contracción del músculo cardíaco (2).
La IC es una condición que presenta diversos factores de riesgo, dentro de
los cuales se destacan la hipertensión arterial (HA), la hipertrofia del ventrículo
izquierdo (VI), la enfermedad arterial coronaria (EAC), particularmente el infarto al
miocardio
(IM),
y
la
cardiovasculares (ECV)
Diabetes
Mellitus
(DM)
(3).
Estas
enfermedades
generan un remodelado cardíaco patológico o
descompensado, que difiere del remodelado cardíaco fisiológico, debido a que
este último ocurre en respuesta al ejercicio cotidiano o de alto rendimiento (4).
Otros factores importantes son la edad, el sexo (predominio en los hombres) la
obesidad y el tabaquismo (5).
La prevalencia de esta patología se presenta entre el 0.4% y el 2% de la
población, y aumenta progresivamente con la edad, alcanzando el 10% entre los
80 y 90 años. La edad promedio de la población que presenta IC esta alrededor de
los 75 años, y aproximadamente el 80% de los pacientes que son hospitalizados
tiene 65 años o más (1).
Existen varios procesos considerados importantes que se generan y tienen
consecuencias negativas en el curso de la IC o que son consecuencia del
desarrollo de la IC, principalmente procesos de remodelado cardiovascular (6), de
desbalance entre las especies reactivas del oxígeno (ROS) llamado también
estrés oxidativo (7), de inflamación y de disfunción endotelial (8).
15
1.2. Remodelado cardiovascular en IC
La matriz extracelular (MEC) cardíaca forma una red de fibras,
principalmente colágenos tipo I y III, fibronectina y elastina, que junto a los
fibroblastos conforman el llamado intersticio cardíaco, que le da soporte e
integridad estructural al corazón (9).
La base estructural para el desarrollo de la IC es el remodelado cardíaco
patológico de esta matriz, que ocurre en las cardiomiopatías, en la hipertrofia
hipertensiva o
secundario a un IAM. El factor principal involucrado en este
proceso de remodelado es una familia de enzimas que degradan la matriz
extracelular cardíaca, las metaloproteinasas de la matriz (MMPs) y sus inhibidores
tisulares (TIMPs) (10).
Las MMPs son una familia de 20 isoformas distintas de enzimas
dependientes de zinc que pueden ser expresadas en condiciones basales por
fibroblastos y cardiomiocitos o en respuesta a procesos inflamatorios por
macrófagos y linfocitos. Según el tipo de sustrato estas enzimas se clasifican en:
colagenasas (MMP-1, MMP-8, MMP-13) que degradan fragmentos insolubles de
colágeno en fragmentos solubles, gelatinasas (MMP-2 constitutiva, MMP-9
inducible) que reprocesan estos nuevos fragmentos para seguir con su
degradación, y el tercer grupo (MMP-3) que no solo degrada componentes de la
MEC, sino también inicia la activación de MMPs inactivas (pro-MMPs) (9).
La regulación de la síntesis y activación de MMPs está influenciada por
múltiples citokinas como interleukinas (ILs), factor de necrosis tumoral  (TNF-),
neurohormonas, factor transformante tipo  (TGF-) e inhibidores tisulares de las
MMPs (TIMPs) (9). Se ha demostrado que en pacientes con IC los niveles
plasmáticos de MMP-2 y MMP-9 están aumentados (11).
16
1.3. Estrés oxidativo en la IC
El estrés oxidativo se define como un desbalance redox en donde los
compuestos pro-oxidantes sobrepasan
la
capacidad
de
los
compuestos
antioxidantes, resultando en un incremento en la producción de ROS (12). Bajos
niveles de ROS son indispensables en muchos procesos bioquímicos como
señalización intracelular, defensa contra microorganismos y función celular. Al
contrario, niveles elevados de ROS están implicados en la patogénesis de varias
enfermedades cardiovasculares incluyendo hipercolesterolemia, aterosclerosis,
hipertensión, diabetes e insuficiencia cardíaca (13).
Las ROS corresponden a radicales libres tales como anión superóxido
(O2-), radical hidroxilo (OH-) y peróxido de hidrógeno (H2O2). El O2- se forma
intracelularmente por activación la nicotinamida-adenina dinucleotido fosfato
(NADPH) oxidasa, xantino oxidasa (XO), óxido nítrico sintasa (NOS) desacoplada
del endotelio y en la mitocondria por fosforilación oxidativa de la cadena
transportadora de electrones. En condiciones patológicas el H2O2 mediante la
reacción de Fenton puede generar el altamente reactivo radical hidroxilo (14).
El estrés oxidativo deteriora la función cardíaca en forma aguda al modificar
por oxidación lípidos de membrana, DNA y diversas proteínas celulares;
produciendo disfunción celular o muerte por apoptosis y/o necrosis (15). Existe
evidencia que sugiere un aumento de ROS en pacientes con IC (16), ya que los
diferentes sistemas generadores de ROS mencionados anteriormente están
sobreactivados (14). La oxidación no enzimática producida por ROS en los lípidos
de membrana origina compuestos que sirven como marcadores de esta
lipoperoxidación, destacando el malondialdehido (MDA) que es un fragmento de
ácido graso poliinsaturado de baja masa molecular originado por daño oxidativo, y
los isoprostanos, los cuales derivan de la oxidación de ácido araquidónico y serían
más específicos como marcadores que el MDA (17). Los niveles plasmáticos de
MDA se encuentran elevados en IC de etiología tanto isquémica como no
isquémica (17).
17
La célula cuenta con sistemas antioxidantes intrínsecos que modulan la
acumulación de ROS, estos incluyen enzimas como catalasa (CAT) y glutatión
peroxidasa (GPX) que degradan H2O2 formando agua, superóxido dismutasa
(SOD) que dismuta O2- formando H2O2 (Figura 1), y antioxidantes no enzimáticos
como vitamina E y C, beta carotenos, ubiquinona y urato, los cuales actúan como
atrapadores de radicales (14).
Respiración
Mitocondrial
Isquemia
reperfusión
Microvascular
Estiramiento
Citoquina
O2
*-
s
+ NO
Xantina-oxidasa
Endotelial
ONOO-
SOD
Fe3+ + Fe2+
OH*
Angiotensina II
H2O2
Glutatión
Peroxidasa
Catalasa
a
Figura 1. Mecanismos generadores de estrés oxidativo. Este esquema muestra
las diversas fuentes de ROS defensas enzimáticas contra el estrés oxidativo.
La SOD endotelial (eSOD) es una de las tres isoformas de SOD existentes
(las otras son SOD citosólica y SOD mitocondrial), que se sintetiza en la célula
muscular lisa de vasos sanos y posteriormente se une al endotelio, y corresponde
al principal sistema antioxidante enzimático del organismo. Se ha visto que la
expresión y actividad de la eSOD están disminuidas en enfermedades
cardiovasculares (13). Un estudio previo de nuestro laboratorio, encontró que
niveles de diferentes sustancias presentes en el fluido pericárdico correlacionan
18
con su nivel en el intersticio cardíaco, y que existe una notable correlación entre
plasma (ej. MDA) y fluido pericárdico, por lo tanto es posible sugerir que lo
encontrado en plasma refleja lo que sucede en el miocardio (18).
1.4. Inflamación en la IC
La inflamación es un proceso mediado por citoquinas proinflamatorias, las
cuales tienen un rol fundamental en la regulación de la función y de la estructura
cardíaca y particularmente en la progresión de la enfermedad cardíaca (19). Estos
mediadores proinflamatorios se expresan en todas las células nucleadas que
residen en el miocardio, y corresponden principalmente a TNF-α e IL. Estas
citoquinas producen efectos deletéreos en la IC. Sus efectos negativos en la
función del VI se deben a que disminuyen la fracción de eyección del VI (FEVI),
estimulan el remodelado cardíaco causando hipertrofia y apoptosis del
cardiomiocito, y altera la función endotelial, induciendo apoptosis de las células
endoteliales y disminuyendo la expresión de la NOS endotelial constitutiva (19,
20).
La IC progresa como resultado de estos efectos tóxicos ejercidos por las
citoquinas inflamatorias endógenas en el corazón y la circulación periférica. Sin
embargo estos eventos no implican necesariamente que las citoquinas originen la
IC per se, pero su sobrexpresión contribuye a la progresión de la enfermedad (19).
La inflamación vascular sistémica es un proceso integral presente también
en patologías cardiovasculares como la aterosclerosis, desde el daño inicial
endotelial mediado por lípidos hasta la evolución de la placa aterosclerótica (21),
y también juega un importante papel en la patogénesis de la IC (22).
La inflamación se puede medir mediante la determinación de los niveles
plasmáticos o en orina de marcadores de inflamación, tales como TNF-, IL-6, el
péptido natriurético tipo-B (BNP) o la proteína C reactiva ultrasensible (hs-CRP),
los cuales están elevados en IC (21). El BNP es un péptido sintetizado en la
aurícula como un pro-precursor que se transforma en el N-terminal proBNP
19
(proBNP) y luego en BNP en respuesta al estiramiento que sufre el corazón en
circunstancias patológicas. El BNP tiene efectos benéficos tales como disminuir el
tono vascular (relajación del músculo liso) y la proliferación del músculo liso y
fibroblastos. BNP y proBNP se encuentran elevados en IC. Diversos estudios han
demostrado ser útiles y exactos en el diagnóstico de esta patología, por lo cual se
le clasifica como un marcador de la severidad de IC (23). Por otro lado, la hs-CRP
es una proteína de fase aguda producida en el hígado por acción de las citoquinas
proinflamatorias, la cual se eleva en síndromes coronarios agudos, y por ello se
usa como un marcador de inflamación, que ayuda a establecer el pronóstico de las
enfermedades cardíacas (24).
1.5. Función y disfunción endotelial en la IC
El endotelio vascular es una monocapa de células que cumple un papel
muy importante en la fisiología cardiovascular. Estas células responden a señales
físicas y químicas para regular el tono vascular, adhesión celular, trombogénesis,
proliferación de células musculares lisas e inflamación de la pared del vaso
sanguíneo. El endotelio sano y, por lo tanto, una función endotelial normal, regula
el tono vascular mediante la producción y liberación de moléculas vasoactivas que
lo relajan o contraen, controlando de esta forma el diámetro, el aporte de oxígeno
e incluso el remodelado de la estructura vascular (25).
El endotelio juega un rol fundamental en la homeostasis vascular, en donde
el óxido nítrico (NO), un factor relajante producido por la NOS endotelial, cumple
una función primordial en esta
regulación (26). En pacientes con IC se ha
determinado mediante pletismografía y vasodilatación dependiente del endotelio,
que existe una función endotelial anormal en pequeños y grandes vasos
sanguíneos (27). Una característica importante de la disfunción endotelial es una
disminución en la síntesis, liberación y actividad de NO derivado del endotelio. El
NO endotelial media varios componentes del proceso aterogénico, por ejemplo,
media la relajación vascular e inhibe la agregación plaquetaria, la proliferación
20
muscular lisa vascular y la interacción endotelio-leucocito (28). Por este motivo, se
lo ha sugerido como un marcador de la función endotelial (29).
En circunstancias patológicas, como la IC, cuando la producción de ROS
sobrepasa la capacidad antioxidante celular se produce daño vascular y activación
del endotelio (25), debido a que el NO reacciona con O2- formando peroxinitrito
(ONOO-), un compuesto oxidante altamente reactivo que oxida lípidos, oxida y
nitra proteínas y activa MMPs, contribuyendo con el proceso de remodelado (14).
Esto limita la biodisponibilidad del NO originando vasoconstricción e hipertensión
(28). En resumen, la disfunción endotelial es un desbalance entre la producción de
agentes vasodilatadores y vasoconstrictores a favor de los segundos y que tendría
un factor pronóstico independiente en la IC (30).
1.6. Estatinas en IC.
Los inhibidores de la 3-hidroxi-3 metilglutaril coenzima A (HMG CoA)
reductasa, llamados estatinas, son fármacos que reducen potentemente los
niveles de colesterol LDL, y son ampliamente usados en clínica
para la
prevención primaria y secundaria de enfermedades cardíacas coronarias (31).
Las estatinas además poseen otros efectos distintos a la disminución del
colesterol LDL, llamados efectos pleiotrópicos de las estatinas, que las hacen
tener efectos benéficos potenciales en pacientes con IC
de etiologías tanto
isquémicas como no isquémicas (32). Distintos estudios randomizados han
mostrado su efectividad en la disminución de enfermedades cardíacas y
prevención de muerte (31).
Los efectos pleiotrópicos de las estatinas incluyen efectos beneficiosos en
la función endotelial, en inhibición de procesos tales como inflamación, estrés
oxidativo, formación de trombos, hipertrofia miocárdica y en disminución de la
actividad simpática, del sistema renina-angiotensina-aldosterona y de la apoptosis,
entre otras (31).
21
Para evaluar los pro y los contra del uso de estatinas en pacientes con IC
son necesarios más estudios prospectivos randomizados, aunque la evidencia
experimental clínica existente muestra que las estatinas tienen efectos benéficos
en IC, mejorando la sobrevida de pacientes con IC (32, 33). A pesar de esto, estas
observaciones son consideras con escepticismo ante la ausencia de más estudios
de este tipo (31).
1.7. Alopurinol en IC.
El alopurinol es un medicamento que se utiliza habitualmente en el
tratamiento de la gota, se caracteriza por inhibir la acción de la XO y tiene la
capacidad de atrapar radicales hidroxilo, reduciendo así el estrés oxidativo, por lo
tanto tiene efectos favorables en la eficiencia miocárdica, ya que disminuye el
consumo miocárdico de oxígeno, conservando su contractilidad (34, 35).
En pacientes con IC se ha visto un incremento de los niveles plasmáticos
de ácido úrico (AU), lo que sugiere que en estos pacientes existe una mayor
actividad de la enzima XO, la cual es una fuente de superóxido y su actividad se
ha detectado también en el miocardio humano (36, 37).
Las evidencias sugieren que la administración de alopurinol a pacientes con
IC mejoran la función endotelial, reducen marcadores de estrés oxidativo y mejora
la sobrevida. Los inhibidores de XO tienen un papel terapéutico benéfico en
pacientes con disfunción aguda y crónica del VI post-infarto y en pacientes con IC
debido a causas no isquémicas, en consecuencia la inhibición de XO mejora la
función vascular y la función mecanoenergética del miocardio (5, 6, 38).
Es importante evaluar si el uso de alopurinol en conjunto con la
atorvastatina, representa una modalidad terapéutica en pacientes con IC ya que
no existen reportes de este tipo. Ante los ya conocidos y demostrados efectos
pleiotrópicos de las estatinas, el alopurinol podría beneficiar aún más la terapia en
este tipo de pacientes, por lo cual evaluar los procesos de estrés oxidativo,
inflamación, remodelado cardiovascular y función endotelial en IC bajo ambos
22
tratamientos (atorvastatina y atorvastatina más alopurinol) serviría para dilucidar el
aporte de cada uno.
23
2. HIPÓTESIS
En pacientes con insuficiencia cardíaca, el uso de atorvastatina y
atorvastatina más alopurinol atenúan el estrés oxidativo, la inflamación y el
remodelamiento cardiovascular y mejoran la función endotelial.
3. OBJETIVO GENERAL
Estudiar si el uso de atorvastatina o atorvastatina más alopurinol mejoran
los parámetros de estrés oxidativo, remodelamiento cardiovascular y disfunción
endotelial que se encuentran alterados en individuos con insuficiencia cardíaca.
4. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
a) Determinar el efecto de la atorvastatina y atorvastatina más alopurinol en el
estado de estrés oxidativo en pacientes con IC.
b) Estudiar el efecto de la atorvastatina y atorvastatina más alopurinol en el
proceso de remodelado cardiovascular en pacientes con IC.
c) Determinar el efecto de la atorvastatina y atorvastatina más alopurinol en el
proceso inflamatorio en pacientes con IC.
d) Investigar el efecto de la atorvastatina y atorvastatina más alopurinol en la
función endotelial en pacientes con IC.
24
5. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1. MATERIALES
5.1.1. Equipos
Cell-Dyn 1700, para la determinación de hemoglobina, UNICAM  modelo
UV-2, centrífuga Heraus Suprafuge, cámaras de geles de poliacrilamida BioRad.
5.1.2. Reactivos
La enzima eritrocitaria humana SOD, MDA estándar, ácido tiobarbitúrico
(TBA),
glicina,
adrenalina,
sales
de
fosfato,
MMP-2
estándar
humana
recombinante, MMP-9 estándar humana recombinante se obtuvieron de Sigma
Chemicals Co.
Acido tricloroacético (TCA), ácido clorhídrico (HCl), ácido acético, azul de
coomassie R-250, cloruro de calcio (CaCl2), cloruro de zinc (ZnCl2), cloroformo,
etanol, n-butanol, metanol, peróxido de hidrógeno (H2O2), gelatina porcina,
hidróxido de sodio (NaOH), y tritón X-100 se obtuvieron de Merck Química
Chilena.
Todos los otros reactivos químicos fueron de grado pro-análisis.
5.2. MÉTODOS
5.2.1. Pacientes
Todos los pacientes se reclutaron en el Hospital Clínico de la P. Universidad
Católica de Chile y firmaron un consentimiento informado que contó con
aprobación previa del Comité de Ética del Hospital Clínico. Estos pacientes tenían
IC estable y capacidad funcional III - IV de la NYHA.
Los criterios de inclusión fueron: a) fracción de eyección del ventrículo
izquierdo (FVEI) determinada por ventriculografía isotópica < 40%; b) tratamiento
médico convencional con digitálicos, diuréticos, -bloqueadores e inhibidores de la
25
enzima convertidora o antagonistas del receptor de angiotensina; c) situación
clínica estable durante las últimas 4 semanas; d) colesterol plasmático < 240
mg/dL y e) presencia de disfunción endotelial.
Los criterios de exclusión fueron: a) angina estable o inestable e infarto
agudo al miocardio dentro de los últimos 6 meses; b) cirugía o angioplastía
coronaria en los últimos 6 meses; c) hipertensión arterial no controlada definida
como presión arterial sistólica > 160 mm Hg o presión arterial diastólica > 100 mm
Hg; d) miocardiopatía hipertrófica o cardiopatía congénita; e) tratamiento crónico
con estatinas o alopurinol en los últimos 2 meses; f) enfermedades sistémicas
concomitantes que afecten las determinaciones de parámetros oxidativos,
inflamatorios, endoteliales y cardiovasculares como creatinina > 2,5 mg/dL,
enfermedades auto-inmunes, neoplasias, enfermedades hepáticas, enfermedad
pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y situaciones de inflamación aguda y crónica
y g) cuadro inflamatorio o infeccioso intercurrente.
Los pacientes ingresados al protocolo se trataron con placebo durante
cuatro semanas y luego se ramdomizaron en forma ciega a atorvastatina 20 mg
una vez al día o atorvastatina 20 mg más alopurinol 300 mg, una vez al día,
durante 8 semanas para los dos grupos. Las muestras de sangre se tomaron al
inicio del protocolo (BASAL), 4 semanas (PLACEBO) y a las 8 semanas de
tratamiento (TTO) con atorvastatina (ATOR) o atorvastatina más alopurinol
(ATOR+ALO) (Figura 2).
Además, se evaluó a un grupo de sujetos sanos (CONTROL) pareados por
edad y sexo con las mismas mediciones que los cardiópatas. A todos se les
realizó perfil bioquímico completo, hemograma y adicionalmente, un examen
médico completo.
26
4 semanas
placebo
8 semanas
atorvastatina
PLACEBO
TTO
ATOR
MDA
CAT y SOD erit
eSOD
MMP-2 y 9
ProBNP y PCRus
Func. endotelial
MDA
CAT y SOD erit
eSOD
MMP-2 y 9
ProBNP y PCRus
Función
endotelial
BASAL
MDA
CAT y SOD erit
eSOD
MMP-2 y 9
ProBNP y PCRus
Función
endotelial
8 semanas
atorvastatina +
alopurinol
4 semanas
placebo
BASAL
PLACEBO
TTO
ATOR+ALO
Figura 2. Descripción de los tratamientos y de los análisis de las muestras
realizados a los pacientes.
5.2.2. Evaluación del estado de estrés oxidativo plasmático, eritrocitario y
endotelial
5.2.2.1. Determinación de malondialdehido (MDA)
Los niveles de MDA se evaluaron en plasma por el método de TBARS
descrito por Díaz-Araya y cols (39), con algunas modificaciones. Se realizó una
curva de calibración usando cantidades constantes de TCA 10%, TBA 0,67%, y
diferentes cantidades de estándar de MDA 100 M preparado en HCl 0,1N, de
acuerdo a lo descrito en la Tabla 1.
A los tubos con 300 L de muestra de plasma se les agregó 200 L de TCA
10%, con el objetivo de precipitar proteínas y disminuir el pH, y 500 L de TBA
0,67%. Los tubos se colocaron en un baño maría durante 60 min sin sobrepasar
los 90º C. Luego de enfriar los tubos, se agitó vigorosamente, con el propósito de
disgregar las proteínas. Posteriormente, se agregó 1 mL de n-butanol a los tubos y
27
nuevamente, se agitó vigorosamente durante 2 min. Luego, los tubos se
centrifugaron a 3.500 x g durante 12 min a 4ºC. La absorbancia de los
sobrenadantes se determinó a 532 nm y la concentración de MDA se expresó en
M.
Tabla 1. Preparación de la curva de calibración para la determinación de MDA
plasmático.
MDA (M)
0
0,5
1
2
3
4
6
8
Vol.
(L)
MDA
0
5
10
20
30
40
60
80
std Vol. TCA (L)
200
200
200
200
200
200
200
200
Vol. TBA (L)
HCl (L)
500
500
500
500
500
500
500
500
300
295
290
280
270
260
240
220
5.2.2.2. Hemólisis de elementos figurados
Los elementos figurados se lavaron tres veces con suero fisiológico frío
centrífugando a 1250 x g durante 15 min a 4ºC. Una vez eliminado el
sobrenadante del último lavado, se tomó una alícuota de 1 mL y se adicionó 4 mL
de agua destilada, así obteniendo el hemolizado requerido. El hemolizado final (5
mL) se homogeneizó y luego se fraccionó en alícuotas de 1 mL las que se
almacenaron a –20ºC para luego realizar los respectivos análisis enzimáticos (40).
5.2.2.3. Determinación de la actividad de catalasa eritrocitaria (CAT)
La solución de hemolizado se diluyó con agua destilada. Luego, 20 L de
esta solución se llevó a un volumen de 2 mL con tampón fosfato 50 M pH 7, en la
cubeta de cuarzo. La reacción se inició con la adición de 1 mL de H 2O2 30 M,
preparado en tampón fosfato. El método consistió en medir la degradación del
H2O2 que se evidencia mediante la disminución de la absorbancia medida a una
28
longitud de onda de 240 nm (Figura 3). El blanco se realizó en ausencia de H 2O2
(41). La actividad de CAT se expresó como U CAT/g Hb.
Absorbancia
Cinética Catalasa
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0
0
100
200
300
Tiempo (seg)
Figura 3. Determinación de la actividad catalasa. La curva muestra
la desaparición en el tiempo de H2O2 por la catalasa. La zona de
velocidades iniciales corresponde a los primeros dos minutos de la
cinética.
5.2.2.4. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa
eritrocitaria (SOD)
La SOD eritrocitaria se extrajo desde el hemolizado usando una alícuota de
1 mL de hemolizado a los que se agregó 400 L de una mezcla fría etanol:
cloroformo (3:1). Después de agitar vigorosamente por 15 min a 4ºC, la mezcla se
centrífugó a 2250 rpm durante 10 min a 4ºC. El sobrenadante, que contiene la
SOD, se almacenó a –80ºC hasta su uso. El método se basa en la inhibición de la
autooxidación en medio alcalino, de adrenalina a un compuesto coloreado o
adenocromo. Se siguió la formación de adenocromo por espectrofotometría a 480
nm y a una temperatura de 30ºC (Figura 4) (41).
29
Cinética SOD
Absorbancia
0,3
0,2
A
0,1
B
0
0
100
200
Tiempo (seg)
300
Figura 4. Determinación de la actividad de SOD. La curva A (azul) se
muestra la autooxidación basal de adrenalina. La curva B (rosado) se
muestra la autooxidación de adrenalina en presencia de 5 L de extracto
con SOD. La SOD dismuta el O2-· inhibiendo la autoxidación de la
adrenalina. Se determina la pendiente de ambas curvas en su zona lineal
(líneas negras) y la actividad de la SOD se calcula a partir del porcentaje de
inhibición de las pendientes de la autoxidación de adrenalina.
Se realizó una curva de calibración dosis-respuesta a partir de una solución
de SOD estándar 2 U/mL. Para ello, a 50 L de adrenalina (60 mM pH 2) se le
agregó 945 L de tampón glicina (50 mM pH 10,2) y 5 L de distintas diluciones
de la solución de SOD estándar 2 U/mL. Se siguió espectrofotométricamente a
480 nm la autooxidación de 50 L de adrenalina a adenocromo. Se determinaron
las pendientes de la zona lineal y se efectuó la razón pendiente A/B (ver figura 3).
El porcentaje de inhibición (%inh) se obtuvo de la fórmula 1-(A/B). Al graficar %
inhibición vs SOD (U/mL) se obtiene una curva hiperbólica (Figura 5) que se
linealiza al graficarla como doble recíprocos, es decir, 1/ (%inh) versus 1/U SOD
(Figura 6). La actividad de SOD se expresó como U SOD/g Hb.
30
% inhibición
60
50
40
30
20
10
0
0
0,2
0,4
0,6
SOD (U/mL)
Figura 5. Curva dosis respuesta de la enzima SOD. Cada punto se
obtuvo realizar cinéticas con alícuotas de 5 L, con diferentes unidades de
SOD de la solución estándar, las que se comparó con la cinética de la
autooxidación de adrenalina.
1/% inhibición
4,5
3
1,5
y = 0,1513x + 1,5184
R2 = 0,9859
0
0
5
10
15
1/SOD
Figura 6. Relación entre la actividad de SOD y porcentaje de
inhibición de la autoxidación de adrenalina. Esta curva se utilizó para la
cuantificación de la actividad de SOD presente en los hemolizados.
5.2.2.5. Determinación de la actividad de la superóxido dismutasa endotelial
(eSOD)
La eSOD se libera desde el endotelio vascular hacia la sangre mediante la
inyección de un bolus de heparina, permitiendo así su determinación sin afectar la
actividad de las otras isoformas de SOD (42). Inicialmente se obtuvo una muestra
de sangre venosa (vena antecubital) para determinar la eSOD basal.
31
Posteriormente, se inyectaron 5.000 U de heparina dentro de la arteria braquial y
se obtuvieron muestras de sangre provenientes de la vena antecubital del mismo
brazo a 3, 5, 7 y 10 min después de la inyección del bolus de heparina. Las
muestras de sangre fueron, rápidamente, centrifugadas y los plasmas se
almacenaron a –80ºC hasta posterior utilización.
La actividad de la eSOD se determinó usando la misma técnica para
determinar la SOD eritrocitaria
(41).
La actividad se expresó como U SOD por mL –1
por min-1 y se calculó como el área bajo la curva de un gráfico actividad vs tiempo
entre 0 y 10 min después de la inyección del bolus de heparina.
5.2.3. Evaluación del estado de remodelado cardiovascular
5.2.3.1. Determinación de las actividades plasmáticas de MMP-2 y MMP-9
Las actividades gelatinásicas de MMP-2 y MMP-9 se determinaron
cuantitativamente por zimografía en las condiciones descritas por Manenti y cols
(43). Esta técnica consistió en realizar un SDS-PAGE al 10% en presencia de
gelatina (1 mg/mL). Se cargaron en el gel 1 L de plasma por bolsillo y 1 L de
MMP-2 estándar. Luego de la corrida electroforética, el SDS se removió con
agitación suave por 30 min con una solución de 2,5% Tritón X-100 y el gel se
incubó por 18 h a 37ºC en 0,15 M NaCl, 10mM CaCl2 y 50 mM Tris–HCl pH 8.
Luego se tiñó con una solución de Azul de Coomassie R-250 y se destiñó con una
solución de ácido acético al 10%. La actividad proteolítica se visualizó como
bandas desteñidas sobre un fondo azul. Las actividades de las MMPs 2 y 9, se
evaluaron por densitometría y se expresaron respecto a la MMP-2 estándar.
La Figura 7 muestra la dependencia lineal positiva entre el volumen de
plasma utilizado y las actividades enzimáticas de MMP-2 y MMP-9 realizada por
zimografía. Se adicionaron diferentes volúmenes crecientes de plasma diluido que
corresponde a ciertas cantidades de plasma inicial (0,5 a 1,75 L) obtenidas de 2
sujetos controles y 2 pacientes cardiópatas. La actividad gelatinásica de MMP-2 y
32
MMP-9 se incrementó en una manera dependiente del volumen en los sujetos
participantes del estudio.
A
C+
C+
0,5
0,75
1,0
1,25
1,5
1,75
μl de plasma
72 KDa
MMP-2
C+
0,5
0,75
1,0
1,25
1,5
1,75
μl de plasma
92 KDa
MMP-9
Unidades densitométricas
B
y = 633600x + 1E+06
R2 = 0,9405
3000000
2000000
1000000
0
0
0,5
1
1,5
2
Volumen plasma (uL)
Figura 7. Relación entre actividad gelatinásica de MMP-2 y MMP-9 y el
volumen de plasma empleado en la zimografía. Los volúmenes
indicados de plasma se resolvieron por geles de poliacrilamida-SDS
(PAGE-SDS) y las MMPs se detectaron por zimografía. Se muestran geles
zimográficos con las bandas en 72 KDa correspondiente a la MMP-2 (A) y
92 KDa correspondiente a MMP-9 (B). Además, se muestran gráficos con
la cuantificación de la intensidad de la banda y el volumen de plasma para
MMP-2 (A) y MMP-9 (B) de 2 sujetos controles y 2 cardiópatas C+, control
positivo.
33
5.2.4. Determinación de la función endotelial
Esta medición se realizó en el Hospital Clínico de la Pontificia Universidad
Católica por médicos especialistas. Se utilizó la metodología descrita por
Celermajer y cols (44). El diámetro de la arteria braquial se midió en reposo con
ecografía bidimensional usando un transductor de 7,5 (3 – 11) MHz (linear array
transducer) y un equipo Sonos 5500 (Philips, Andover, USA). Se obtuvieron
imágenes a) en reposo y b) durante hiperhemia reactiva (oclusión del vaso
sanguíneo y posterior reestablecimiento de la circulación) y c) después de
nitroglicerina sublingual. Se obtuvo una imagen de la arteria antes de inflar la
manga y otra 60 seg después de desinflada. Posteriormente, se dejaron 15 min en
reposo para recuperación del vaso y se obtuvo una nueva imagen en reposo. Se
midió el diámetro del vaso por 1 observador independiente de las características
del paciente. Para la imagen durante la hiperemia reactiva las mediciones del
diámetro arterial se efectuaron 45-60 seg después de desinflar la manga. Se
midieron 3 ciclos cardíacos en cada etapa con el propósito de normalizar la
medición. Los diámetros de los vasos después de la hiperemia reactiva se
expresaron como porcentajes de la primera imagen.
5.2.5. Determinación de los niveles de proBNP
La determinación de los niveles de proBNP se realizó por la técnica de
electroquimioluminicencia en el Laboratorio de Urgencia de la Universidad
Católica.
5.2.6. Determinación de los niveles de hs-CRP
La hs-CRP se cuantificó en plasma mediante ELISA de competencia
usando anti-CRP IgG de conejo (Calbiochem-Novabiochem) y CRP biotinilado, en
el hospital clínico de la Universidad Católica.
34
5.2.7. Análisis estadístico
Los resultados se expresaron como promedio  desviación estándar (DS).
Diferencias en las características clínicas entre cardiópatas tratados con
atorvastatina y atorvastatina más alopurinol se determinaron mediante el test de
Fisher para variables categóricas y prueba t student no pareada para variables
contínuas. Las diferencias intra e intergrupo para las distintas variables continuas,
se analizaron mediante ANOVA seguido de una prueba Tukey como test post-hoc.
Se consideró un valor de p<0,05 como significativo.
35
6. RESULTADOS
6.1. Características clínicas de la población estudiada
Se reclutaron 10 sujetos controles sanos y 39 pacientes con insuficiencia
cardiaca crónica (ICC). Las características de los pacientes cardiópatas se resume
en la tabla 2.
Tabla 2.
Características clínicas de la población cardiópata estudiada.
Atorvastatina
Edad, años
Hombres, n (%)
Indice Masa Corporal, Kg/m 2
Fracción de Eyección Ventricular Izquierda, %
Capacidad funcional NYHA, n (%)
II
III
Etiología, n (%)
Isquémica
No isquémica
Factores de riesgo, n (%)
Diabetes mellitus
Hipertensión
Tabaquismo
Colesterol total, mg/dL
LDL colesterol, mg/dL
HDL colesterol, mg/dL
Trigliceridos, mg/dL
Creatinina, mg/dL
Ácido úrico, mg/dL
Presión arterial promedio, mmHg
Presión arterial sistólica, mm Hg
Presión arterial diastólica, mm Hg
Tratamiento convencional, n (%)
Inhibidores ECA o Antagonistas del Receptor de
Angiotensina tipo 1
ß-bloqueadores
Furosemida
Digoxina
Espironolactona
Aspirina o Clopidogrel
Hidralazina
Bloqueadores de Calcio
n=19
60 ± 14
16 (84)
27 ± 4
31 ± 8
Atorvastatina + p
Alopurinol
n=20
57 ± 14
ns
16 (80)
ns
26 ± 5
ns
21 ± 8
ns
9 (47)
10 (53)
6 (30)
14 (70)
ns
ns
6 (32)
13 (68)
6 (30)
14 (70)
ns
ns
5 (26)
14 (74)
4 (21)
190 ± 39
105 ± 30
44 ± 9
172 ± 39
1.1 ± 0.5
6.8 ± 2
101 ± 14
131 ± 16
72 ± 12
1 (5)
9 (45)
6 (30)
187 ± 35
109 ± 36
43 ± 8
197 ± 38
1 ± 0.2
7.4 ± 2.7
100 ± 13
125 ± 17
74 ± 8
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
18 (95)
16 (80)
ns
17 (89)
13 (68)
10 (53)
15 (79)
12 (63)
2 (10)
2 (10)
13 (65)
16 (80)
11 (55)
14 (70)
7 (35)
4 (20)
1 (5)
ns
ns
ns
ns
ns
ns
ns
DS: Desviación estándar; ECA, enzima convertidora de angiotensina I. Los valores
corresponden a promedios ± DS (desviación estándar)
36
El grupo atorvastatina (ATOR) correspondió a 19 pacientes con IC de 60 ±
14 años, 27 ± 4 Kg/m2 de índice de masa corporal y mayoritariamente hombres (16
pacientes). El origen de la IC fue 32% isquémico y 68% no isquémico. El grupo
atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO) correspondió a 20 pacientes con IC de
57 ± 14 años, 26 ± 5 Kg/m2 de índice de masa corporal y mayoritariamente
hombres (16 pacientes). El origen de la IC fue 31% isquémico y 69% no
isquémico. Todos los pacientes estaban siendo tratados con el tratamiento
convencional, manteniéndose dichas terapias durante el protocolo. Estos
incluyeron diuréticos, IECA, inhibidor del receptor de angiotensina II, digoxina, bloqueadores, antagonistas de calcio y aspirina. No hubo diferencias significativas
en
las
características
clínicas
basales
entre
los
pacientes
cardiópatas
randomizados a atorvastatina o atorvastatina más alopurinol.
Las caraterísticas del grupo control (individuos sanos) se resume en la tabla 3.
Tabla 3. Características del grupo control (CONTROL) estudiado
Grupo control
Hombres
Mujeres
Edad, años
62 ± 10
61 ± 7
n (%)
7 (70)
3 (30)
6.2. Efecto de atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles de
MDA plasmático
Los niveles basales de MDA plasmático de pacientes cardiópatas para los
grupos ATOR+ALO y ATOR fueron significativamente mayores a los niveles de
sujetos controles sanos (1,2 ± 0,5 M ATOR+ALO; 1,31 ± 0,6 M ATOR, vs 0,7 ±
0,1 M CONTROL; p < 0.01 vs CONTROL). Lo mismo sucedió luego de 4
semanas de tratamiento con placebo para ambos grupos respecto
de los
controles sanos (1,2 ± 0,4 M PLACEBO ATOR+ALO; 1,16 ± 0,5 M PLACEBO
ATOR, vs 0,7 ± 0,1 M CONTROL; p < 0.05 vs CONTROL).
Luego
de
8
37
semanas de tratamiento, los niveles de MDA plasmáticos de los grupos
ATOR+ALO y ATOR fueron semejantes a los de sujetos controles (1,0 ± 0,5 M
TTO ATOR+ALO; 1,03 ± 0,5 M TTO ATOR, vs 0,7 ± 0,1 M CONTROL; p > 0.05
vs CONTROL) sin embargo, no disminuyeron significativamente con respecto a
sus respectivos placebos (1,0 ± 0,5 M TTO ATOR+ALO; 1,03 ± 0,5 M TTO
TOR; p > 0.05 vs respectivos placebos) (figura 8).
Figura 8. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en los
niveles plasmáticos de MDA en pacientes con ICC. El MDA plasmático
se determinó por espectrofotometría en sujetos controles (CONTROL n=10)
y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo (BASAL), 4 semanas de
placebo (PLAC) y después de 8 semanas de tratamiento (TTO) con
atorvastatina 20 mg/día más alopurinol 300 mg/día (ATOR+ALO; n=20) o
atorvastatina 20 mg/día (ATOR; n=19). Los resultados están expresados
como promedio ± DS . * p<0.01 vs control y # p<0.05 vs control.
6.3. Efecto del tratamiento con atorvastatina más alopurinol y atorvastatina
en la actividad de SOD y CAT eritrocitaria
La actividad enzimática de SOD eritrocitaria basal y placebo para ambos
grupos, ATOR+ALO y ATOR, fue semejante a la actividad del grupo control (1,9 ±
1,6 U SOD/g Hb, BASAL ATOR+ALO; 2,3 ± 2,0 U SOD/g Hb, PLACEBO
ATOR+ALO y 2,0 ± 1,8 U SOD/g Hb, BASAL ATOR; 2,5 ± 2,4 U SOD/g Hb,
38
PLACEBO ATOR vs 3,9 ± 2,5 U SOD/g Hb, CONTROL; p>0,05 vs control).
Además, en ambos grupos luego de 8 semanas de tratamiento éste no modificó la
actividad enzimática (3,2 ± 2,7 U SOD/g Hb, TTO ATOR+ALO y 3,5 ± 2,9 U SOD/g
Hb, TTO ATOR; p>0,05 vs respectivos placebos) (figura 9).
Figura 9. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
actividad de la SOD eritrocitaria en pacientes con ICC. La actividad de SOD
eritrocitaria se determinó espectrofotométricamente en hemolizados de sujetos
controles (CONTROL; n=10) y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo
(BASAL), 4 semanas de placebo (PLAC) y después de 8 semanas de
tratamiento (TTO) con atorvastatina más alopurinol (ATOR; n=20) o atorvastatina
(ATOR; n=19). Los resultados están expresados como promedio ± DS.
El efecto del tratamiento sobre la actividad de CAT eritrocitaria fue similar al
efecto sobre la SOD eritrocitaria, donde la actividad basal y placebo en ambos
grupos randomizados fue semejante a la del grupo control (110,6 ± 35,5 U CAT/g
Hb, BASAL ATOR+ALO; 109,4 ± 31,3 U CAT/g Hb, PLACEBO ATOR+ALO y 99,6
± 37,7 U CAT/g Hb, BASAL ATOR; 96,6 ± 36,9 U CAT/g Hb, PLACEBO ATOR vs
71,5 ± 13,9 U CAT/g Hb, CONTROL; p>0,05 vs control). Las 8 semanas de
tratamiento no modificaron la actividad de esta enzima eritrocitaria (111,3 ± 44,7 U
CAT/g Hb, TTO ATOR y 100,7 ± 36,5 U CAT/g Hb, TTO ATOR+ALO; p>0,05 vs
respectivos placebos) (figura 10).
39
Figura 10. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
actividad de la CAT eritrocitaria en pacientes con ICC. La actividad de CAT
eritrocitaria se determinó espectrofotométricamente en los hemolizados de sujetos
controles (CONTROL; n=10) y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo
(BASAL), 4 semanas de placebo (PLAC) y después de 8 semanas de tratamiento
(TTO) con atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=20) o atorvastatina
(ATOR; n=19). Los resultados están expresados como promedio ± DS.
6.4. Efecto del tratamiento con atorvastatina más alopurinol y atorvastatina
en la actividad de SOD endotelial
La actividad de la SOD endotelial, la cual es desplazada hacia el plasma
luego de la inyección de un bolus de heparina, fue significativamente menor a nivel
basal y placebo en ambos grupos, ATOR+ALO y ATOR, con respecto al grupo
control (128,6 ± 39,4 U SOD
SOD
*
mL-1
*
*
mL-1
*
min-1, BASAL ATOR+ALO; 116,8 ± 29,4 U
min-1, BASAL ATOR vs 201,8 ± 67,5 U SOD
CONTROL; p<0,05 vs control, y 98,2 ± 56,7 U SOD
*
mL-1
*
*
mL-1
*
min-1,
min-1, PLACEBO
ATOR+ALO; 106,4 ± 64,6 U SOD * mL-1 * min-1, PLACEBO ATOR vs 201,8 ± 67,5
U SOD * mL-1 * min-1, CONTROL; p<0,01 vs control). Luego de las 8 semanas de
tratamientos, en ambos grupos randomizados los niveles de actividad de esta
enzima aumentaron significativamente con respecto a los niveles basales y
placebo (206,1 ± 75,8 U SOD * mL-1 * min-1, TTO ATOR+ALO; 173,9 ± 62,7 U SOD
40
*
mL-1 * min-1, TTO ATOR; p<0,05 vs respectivos basales; y p<0.01 vs respectivos
placebos) (figura 11).
Figura 11. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
actividad de SOD endotelial en pacientes con ICC. La actividad de eSOD,
secretada al plasma mediante la inyección de un bolus de heparina se realizó
mediante espectrofotometría en sujetos controles (CONTROL; n=10) y pacientes
con ICC, al ingreso del protocolo (BASAL), 4 semanas de placebo (PLAC) y
después de 8 semanas de tratamiento (TTO) con atorvastatina (ATOR; n=20) o
atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=19). Los resultados están
expresados como promedio ± DS. * p<0.05 vs control y # p<0.05 vs respectivos
placebos.
6.5. Efecto de la atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la actividad
de MMPs 2 y 9
La actividad enzimática de MMP-2 a nivel basal y placebo para ambos
grupos, ATOR+ALO y ATOR, fue similar a la actividad encontrada en sujetos
controles sanos (0,19 ± 0,07 U.A, BASAL ATOR+ALO; 0,21 ± 0,05 U.A, PLACEBO
ATOR+ALO y 0,22 ± 0,09 U.A, BASAL ATOR; 0,24 ± 0,09 U.A, PLACEBO ATOR
vs 0,17 ± 0,01 U.A, CONTROL; p>0,05 vs control). La actividad de esta enzima no
41
se vio afectada luego de 8 semanas de tratamiento (0,20 ± 0,07 U.A, TTO
ATOR+ALO y 0,21 ± 0,10 U.A, TTO ATOR; p>0,05 vs respectivos placebos)
(Figura 12).
Figura 12. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
actividad plasmática de MMP-2 en pacientes con ICC. La actividad de
MMP-2 plasmática se determinó mediante zimografía a sujetos controles (C;
n=10) y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo (B; BASAL), 4 semanas
de placebo (P; PLAC) y después de 8 semanas de tratamiento (T; TTO) con
atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=20) o atorvastatina (ATOR;
n=19). Se muestra una zimografía representativa del tto con ATOR+ALO
(std=estándar de MMP-2, c=control, b=basal, p=placebo, t=tratamiento). U.A,
unidades densitométricas * mL plasma-1 respecto a MPP-2 estándar. Los
resultados están expresados como promedio  DS.
En cuanto a la actividad enzimática de MMP-9, esta fue semejante a nivel
basal y placebo en ambos tratamientos, respecto de la actividad enzimática en los
grupos controles (0,51 ± 0,33 U * mL-1, BASAL ATOR+ALO; 0,48 ± 0,17 U. A,
PLACEBO ATOR+ALO y 0,41 ± 0,14 U.A, BASAL ATOR; 0,39 ± 0,11 U.A,
PLACEBO ATOR vs 0,28 ± 0,07 U. A, CONTROL. p > 0,05 v/s control). La
actividad de esta enzima disminuyó significativamente en ambos grupos luego de
42
8 semanas de tratamiento con respecto a sus respectivos niveles basales (0,35 ±
0,16 U.A, TTO ATOR+ALO; 0,29 ± 0,12 U.A, TTO ATOR, p < 0,05 v/s respectivos
basales) (figura 13).
Figura 13. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
actividad plasmática de MMP-9 en pacientes con ICC. La actividad de
MMP-9 plasmática se determinó mediante zimografía a sujetos controles
(C; CONTROL; n=10) y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo (B;
BASAL), 4 semanas de placebo (P; PLAC) y después de 8 semanas de
tratamiento (T; TTO) con atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=20)
o atorvastatina (ATOR; n=19). Se muestra una zimografía representativa
del tto con ATOR+ALO (std=estándar de MMP-2, c=control, b=basal,
p=placebo, t=tratamiento). U.A, unidades densitométricas * mL plasma-1
respecto a MPP-2 estándar.Los resultados se expresan como promedio 
DS. *p<0,05 v/s respectivos placebos.
6.6. Efecto de la atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles
de proBNP plasmático
Los niveles basales y placebo de pro BNP para los dos grupos, ATOR+ALO
y ATOR, fueron semejantes (2300,1  2347,1 pg/ml proBNP BASAL ATOR+ALO y
43
1561,0  1384,6 pg/ml proBNP BASAL ATOR vs 2301,5  2339,1 pg/ml proBNP
PLACEBO ATOR+ALO y 1287,3  1192,6 pg/ml proBNP PLACEBO ATOR;
p>0.05 vs respectivos basales). Además, el tratamiento luego de 8 semanas no
afectó los niveles de proBNP en ninguno de los grupos (1698,4  2135,1 pg/ml
proBNP TTO ATOR+ALO y 1436,3  1729,9 pg/ml proBNP TTO ATOR; p>0.05 vs
respectivos placebos) (figura 14).
Figura 14. Efecto de atorvastatina y alopurinol en los niveles de
proBNP plasmáticos. Los niveles se determinaron mediante inmunoensayo
por electroquimioluminiscencia a pacientes con ICC al ingreso del protocolo
(B; BASAL), 4 semanas de placebo (P; PLAC) y después de 8 semanas de
tratamiento (T; TTO) con atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=20) o
atorvastatina (ATOR; n=19). Los resultados están expresados como
promedio ± DS.
44
6.7. Efecto de la atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en los niveles
de hs-CRP
Los niveles basales y placebo de hs-CRP para los dos grupos, ATOR+ALO
y ATOR, fueron semejantes (3,0  2,8 mg/L hs-CRP BASAL ATOR+ALO y 3,6 
2,3 mg/L hs-CRP BASAL ATOR vs 5,0  6,0 mg/L hs-CRP PLACEBO ATOR+ALO
y 4,0  3,0 mg/L hs-CRP PLACEBO ATOR; p>0.05 vs respectivos basales). Luego
de 8 semanas de tratamiento los niveles de hs-CRP no sufrieron cambios (2,6 
4,8 mg/L hs-CRP TTO ATOR+ALO y 8,9  15,4 mg/L hs-CRP TTO ATOR; p>0.05
vs respectivos placebos) (figura 15).
Figura 15. Efecto de atorvastatina y alopurinol en los niveles de hsCRP. Los niveles se determinaron mediante inmunoensayo por ELISA a
pacientes con ICC al ingreso del protocolo (B; BASAL), 4 semanas de
placebo (P; PLAC) y después de 8 semanas de tratamiento (T; TTO) con
atorvastatina más alopurinol (ATOR+ALO; n=20) o atorvastatina (ATOR;
n=19). Los resultados están expresados como promedio ± DS.
45
6.8. Efecto de la atorvastatina más alopurinol y atorvastatina en la función
endotelial.
6.8.1. Vasodilatación dependiente de endotelio
La
vasodilatación
dependiente
de
endotelio
(VDE),
medida
por
pletismografía de la arteria radial, aumentó en ambos grupos randomizados,
ATOR+ALO y ATOR, a nivel placebo respecto del basal (4,4  1,9 % BASAL
ATOR+ALO y 3,5  1,2 % BASAL ATOR vs 6,1  2,2 % PLACEBO ATOR+ALO y
5,0  2,3 % PLACEBO ATOR; p<0.05 vs respectivos basales). Luego de 8
semanas de tratamiento, la función endotelial no se vio aumentada respecto al
placebo (6,8  2,9 % TTO ATOR+ALO y 5,6  2,6 % TTO ATOR; p>0.05 vs
respectivos placebos) (Figura 16).
6.8.2. Vasodilatación independiente de endotelio
La vasodilatación independiente de endotelio (VIE), medida luego de
administrar nitroglicerina sublingual, es similar a nivel basal y placebo para ambos
grupo randomizados (13,6  6,8 % BASAL ATOR+ALO y 14,3  7,8 % BASAL
ATOR vs 16,6  7,5 % PLACEBO ATOR+ALO y 14,8  6,4 % PLACEBO ATOR;
p>0.05 vs respectivos basales). Adicionalmente, no hubo cambios significativos
luego del tratamiento por 8 semanas en ninguno de los dos grupos (15,7  5,3 %
TTO ATOR+ALO y 15,3  6,0 % TTO ATOR; p>0.05 vs respectivos placebos)
(Figura 17).
46
Figura 16. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
determinación de la VDE en pacientes con ICC. La función endotelial se
determinó por hiperemia reactiva, expresada como % cambio de diámetro
arterial, y pletismografía en sujetos controles (CONTROL; n=10) y pacientes
con ICC, al ingreso del protocolo (BASAL), 4 semanas de placebo (PLAC) y
después de 8 semanas de tratamiento (TTO) con atorvastatina más
alopurinol (ATOR; n=20) o atorvastatina (ATOR; n=19). Los resultados
están expresados como promedio ± DS. * p<0,05 y #p<0,05 vs respectivos
basales.
Figura 17. Efecto del tratamiento con atorvastatina y alopurinol en la
determinación de la VIE en pacientes con ICC. La función endotelial se
expresó como % cambio de diámetro arterial en sujetos controles
(CONTROL; n=10) y pacientes con ICC, al ingreso del protocolo (BASAL), 4
semanas de placebo (PLAC) y después de 8 semanas de tratamiento (TTO)
con atorvastatina más alopurinol (ATOR; n=20) o atorvastatina (ATOR;
n=19). Los resultados están expresados como promedio ± DS.
47
7. DISCUSIÓN
Los principales resultados encontrados en este estudio fueron que ambos
tratamientos (atorvastatina más alopurinol y atorvastatina) en pacientes con
insuficiencia cardíaca: a) No modificaron los niveles de MDA plasmático, aunque
tiende a disminuir en ambos grupos luego de las 8 semanas de tratamiento; b) No
afectaron la actividad enzimática eritrocitaria de SOD y CAT; c) Aumentaron la
actividad de SOD endotelial en igual grado para ambos grupos; d) No afectaron la
actividad de MMP-2 plasmática; e) Disminuyeron la actividad de MMP-9
plasmática en igual grado para ambos grupos respecto al basal; f) No modificaron
los niveles plasmáticos de pro BNP y tampoco los de hs-CRP ; g) No mejoraron la
función endotelial dependiente de endotelio comparado con el efecto luego de 4
semanas de placebo; h) No mejoraron la función endotelial independiente de
endotelio; i) no existen diferencias en los resultados entre ambos tratamientos.
7.1. Estatinas y estrés oxidativo en IC
Este estudio demostró que el tratamiento a corto plazo durante 8 semanas
con atorvastatina 20 mg diarios tiene efectos beneficiosos en pacientes con
insuficiencia cardíaca. La atorvastatina disminuyó el estrés oxidativo, reflejado en
el aumento de la actividad de la enzima SOD endotelial.
Se han propuesto algunos mecanismos para el efecto antioxidante de las
estatinas. Se ha postulado que las estatinas pueden inhibir a proteínas G
pequeñas tales como
Rho, Rac y Ras, las cuales participarían en procesos
involucrados en la génesis y evolución de la IC, tales como el estrés oxidativo,
remodelado cardiovascular y disfunción endotelial (33,45), por lo tanto la inhibición
de Rac por parte de las estatinas disminuye la producción de radicales libres a
nivel vascular y miocárdico, debido a la inhibición de actividad de la NADPH
oxidasa, pues depende, en parte, de Rac-1 (47). En IC existe una mayor actividad
del sistema simpático, lo cual adquiere una gran importancia debido a que la autooxidación de catecolaminas también constituye una fuente de ROS, además la
48
activación adrenérgica promueve la hipertrofia cardíaca (64). También es conocido
que Ang II estimula la activación de NADPH oxidasa a nivel endotelial, la cual
produce ROS (42). Las estatinas disminuyen la actividad simpática, y atenúan la
producción de radicales inducida por Ang II en las células musculares lisas,
mediante la inhibición de Rac-1 y regulando negativamente la expresión del
receptor de angiotensina (28).
Por lo anterior, se esperaba que al disminuir la producción de radicales
libres por efecto de la atorvastatina disminuyesen los niveles de MDA, el cual es
una marcador de estrés oxidativo originado por daño oxidativo (lipoperoxidación)
(17).
Por otro lado, se ha postulado que las estatinas modularían positivamente
la actividad de la eSOD, la cual se constituye como el principal sistema
antioxidante vascular (48). Un estudio reportó que el uso de simvastatina, durante
12 semanas en pacientes con IC congestiva, generó un aumento significativo en la
actividad de eSOD comparado con su actividad al ingreso del protocolo (49). En
nuestro trabajo se observó este efecto en la actividad de esta enzima con el uso
de atorvastatina, sin embargo la actividad de SOD eritrocitaria no sufrió ningún
cambio, lo cual se repitió en la actividad eritrocitaria de la enzima CATALASA,
sugieriendo que estos tratamientos no afectarían al estrés oxidativo a nivel
eritrocitario.
7.2. Estatinas y remodelado cardiovascular en IC.
El remodelado cardiovascular se modifica por una disminución en la
actividad de MMP-9, sin embargo la actividad de MMP-2 no varió. Está descrito
que las estatinas previenen el remodelado cardíaco ya que disminuyen la
expresión de MMP-9
(33)
y en un estudio reciente, así como en otros, la actividad
de MMP-9 en pacientes con IC estaba aumentada comparada con la actividad en
sujetos normales, y la actividad de MMP-2 fue la misma en cardiópatas y sanos
49
(52). Otro estudio también descubrió que no existieron diferencias en los niveles
de MMP-2 entre pacientes con IC e individuos sanos (6).
Las MMPs vasculares y miocárdicas, principalmente la MMP-9, se
encuentran elevadas en IC (6). Esta MMP sería fundamental en la regulación del
remodelado cardiovascular (51). Algunos tipos de células como cardiomiocitos y
células endoteliales expresan constitutivamente bajos niveles de MMP-2 y esta
expresión es débilmente alterada por estímulos fisiológicos y/o patológicos (52,
53). En nuestro estudio, el nivel de actividad de MMP-9 tuvo una disminución al
término del tratamiento con atorvastatina respecto del nivel basal, pero no
significativo respecto al placebo. Los cambios sobre actividad de MMP-9 y no
sobre MMP-2 podrían explicarse debido a que la MMP-2 es constitutiva y siempre
se encuentra activa en un nivel basal constante y es difícil que varíe con el
tratamiento, en cambio la MMP-9 se induce por patologías, como por ejemplo la
IC, donde juega un rol importante en los procesos de remodelado y de
inflamación.
7.3. Estatinas y función endotelial en IC
Atorvastatina no mejoró la función endotelial, ya que luego del tratamiento,
VDE y VIE no experimentaron cambios respecto al placebo. Este resultado difiere
de estudios previos donde se afirma que atorvastatina mejora la función endotelial
en pacientes con insuficiencia cardíaca (54).
La importancia del endotelio radica, entre otras cosas, por sus efectos en el
tono vascular, que se logra mediante la producción y liberación de varias
moléculas que relajan (NO, bradiquinina) o contraen (endotelina, Ang II) el vaso
sanguíneo (55). En la IC, los factores que relajan están disminuidos,
fundamentalmente NO, y por el contrario, existe un incremento en los factores
vasoconstrictores (56). Las estatinas mejoran la función endotelial de forma
independiente a los cambios en los niveles de colesterol, y se postula que esta
mejoría es secundaria a reducciones en el estrés oxidativo, aumento de la
50
actividad de eSOD e incremento en la producción de NO (33). Las estatinas
aumentan la biodisponibilidad de NO induciendo la transcripción génica de NOS
endotelial (eNOS), induciendo su fosforilación e inhibiendo a la proteína Rho, lo
que se traduce en mayor producción de NO y una menor expresión de endotelina1 (33, 57). El tratamiento con atorvastatina de nuestro estudio mejoró la función
endotelial dependiente de endotelio comparado con el grupo basal, pero no
respecto al placebo. La función endotelial independiente de endotelio no se vio
afectó.
7.4. Estatinas e inflamación en IC.
El efecto benéfico de las estatinas sobre el proceso inflamatorio está
ampliamente demostrado. Las estatinas reducen la expresión de la hs-CRP y de
moléculas de adhesión, y reduce los niveles de citoquinas proinflamatorias (33).
Esto no se vio reflejó en nuestro estudio, en donde los niveles de hs-CRP no
cambiaron luego de los tratamientos. Sin embargo, en otro estudio previo similar
en pacientes con IC, luego de 12 semanas de tratamiento con fluvastatina no hubo
cambios en los niveles de hs-CRP, debido a los bajos niveles basales de CRP o a
que el grupo estudiado es relativamente estable en su condición (21).
El proBNP es un marcador de inflamación que se encuentra elevado en IC
(21). Sin embargo en diversos estudios han demostrado su utilidad diagnóstica y
pronóstica, como predictor independiente de morbilidad y mortalidad en pacientes
con IC, por lo cual se le clasifica como un marcador de la severidad de IC (23). En
nuestro trabajo, luego de los tratamientos, los niveles de proBNP no
experimentaron cambios significativos, debido muy probablemente a que se trata
de pacientes estables en su patología y al bajo número incluido en el estudio.
51
7.5. Efectos de alopurinol sobre la IC.
Los resultados obtenidos con el tratamiento de atorvastatina se repitieron
en el tratamiento con atorvastatina y alopurinol. Ambos tratamientos disminuyeron
los procesos de estrés oxidativo (disminución MDA y aumento eSOD),
disminuyeron el remodelado cardiovascular (disminución actividad MMP-9) y no
mejoraron la función endotelial (aumento en la vasodilatación) comparado con el
efecto luego de 4 semanas de placebo.
No existen trabajos del uso conjunto de estatinas y alopurinol en IC. Sí
existen estudios previos de inhibidores de XO solos, como alopurinol, el cual
disminuye el consumo miocárdico de oxígeno y aumenta la eficiencia cardíaca
(58), así como también disminuye los volúmenes finales sistólicos y diastólicos
luego de una infusión de oxipurinol (59), también mejora la función endotelial y
disminuye el estrés oxidativo, reflejado por la disminución de niveles de MDA
plasmático (60, 61). La suma de todos estos efectos de alopurinol, como aumento
en la contractilidad del miocardio, aumento de la función endotelial, aumento de la
fracción de eyección, disminución de requerimientos de oxígeno en el miocardio y
disminución de los volúmenes finales diastólicos y sistólicos, constituyen un
proceso llamado “remodelado inverso” (59). En trabajos publicados previamente
se indica una asociación positiva entre el estado de estrés oxidativo y la actividad
de MMPs (62), por lo que alopurinol tiene efectos directos en remodelado
cardiovascular y función endotelial (63).
La mayoría de estos estudios con alopurinol en pacientes con IC muestran
que los efectos beneficiosos se relacionan a pacientes con hiperuricemia, por lo
que se plantea que alopurinol tendría más efectos benéficos en este tipo de
pacientes que en pacientes normouricémicos (63).
Debido a que se utilizó conjuntamente alopurinol y atorvastatina, y los
resultados obtenidos son semejantes a los observados para atorvastatina sola,
debemos tener cuidado en las conclusiones sobre el efecto del alopurinol sobre
los parámetros estudiados, y tener en cuenta algunas consideraciones.
52
Se ha propuesto que existe una activación de XO endotelial mediante Ang
II. Ang II origina una activación de NADPH oxidasa vía el receptor AT 1 lo cual
aumenta la producción de superóxido por parte de XO contribuyendo así al estrés
oxidativo en el endotelio (46). Un estudio reciente en donde se vio que el aumento
en VDE fue más pronunciado al utilizar un antagonista del receptor de Ang II que
con alopurinol, postula que no sólo la inhibición de XO se traduce en una mayor
VDE, si no que también estarían involucrados procesos en donde se previene la
producción de superóxido dependiente de NADPH oxidasa (46). Este motivo
podría explicar que el tratamiento conjunto de atorvastatina y alopurinol no fue
significativamente mayor que con atorvastatina sola, porque la terapia que reciben
estos pacientes, que incluye antagonistas de Ang II, atenuaría el efecto positivo
del uso de alopurinol.
53
8. CONCLUSIONES
No existieron diferencias entre los resultados de los tratamientos con
atorvastatina y atorvastatina más alopurinol, sugiriendo que el alopurinol no ejerce
un efecto benéfico adicional al de la atorvastatina.
Los tratamientos con atorvastatina más alopurinol y atorvastatina sola
tuvieron efectos
benéficos sobre algunos de los parámetros fisiológicos y
bioquímicos que se presentan y que también son causa de la IC. Ambos
tratamientos aumentaron la capacidad antioxidante en el endotelio, disminuyeron
los niveles de estrés oxidativo y redujeron el remodelado cardiovascular.
A pesar de que existió una mejoría en la función endotelial luego de los
tratamientos comparado con la función endotelial al ingresar al protocolo, esta
mejoría no fue significativa comparada con el efecto de 4 semanas de placebo. El
proceso inflamatorio que sufren estos pacientes con IC tampoco fue modificado
por ninguno de los tratamientos.
Los efectos nulos de ambos tratamientos sobre algunos parámetros
analizados se deben muy probablemente a la estabilidad del estado de estos
pacientes gracias al tratamiento que reciben, por lo que el aporte que pueden
generar la atorvastatina y el alopurinol es poco significativo.
54
9. BIBLIOGRAFÍA
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