evaluacion de la eficiencia de dos vacunas comerciales para el

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EVALUACION DE LA EFICIENCIA DE DOS VACUNAS COMERCIALES
PARA EL CONTROL DE LA COLONIZACION DE ESCHERICHIA COLI Y
STAPHLYLOCOCCUS AUREUS.
MVZ., PhD., Pablo Hernández Jáuregui. Dirección Técnica Ciencia y Tecnología
Aplicada, S.A. de C.V.
Antecedentes Científicos.
La infección de la glándula mamaria por bacterias, (E. coli, Staphylococcus aureus,
Streptococcus agalactiae) continua siendo uno de los principales problemas de los
productores y de los veterinarios. El reconocimiento clínico que representa las mastitis
por colibacilosis, cobra nuevo interés, después de conocerse la gravedad a la que la
liberación de toxinas generadas localmente en la glándula mamaria, puede tener a nivel
sistémico en el animal (Schultze, W.D.). Así, durante un episodio de colibacilosis
entérica, se inducen diferentes alteraciones a los sistemas cardio-pulmonar y nervioso
(Holland, E.R.), de igual forma, la multiplicación de E.coli a nivel de la glándula
mamaria inducen cambios semejantes. La diferencia estriba en que la susceptibilidad a
las infecciones entéricas, está en los animales recién nacidos, y la glándula mamaria, en
animales adultos. Las implicaciones sistémicas al aparato reproductor vía la liberación
de prostaglandinas y aminas vaso-activas, son de gran importancia para el reproductor,
ya que se inducen fallas reproductivas por ampliación de los días del ciclo estral así
como de abortos tempranos (Giri, S.N, Gilbert, R.O.). Indiscutiblemente, la producción
láctea se disminuye, durante un episodio inflamatorio local, de cualquier origen.
Particularmente las infecciones por colibacilosis, muchas veces, pasan desapercibidas,
produciendo pérdidas en la producción.
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Las medidas de higiene pre, durante y post ordeña, en cualquier establo, no pueden ser
sustituidas. Con buenos métodos de manejo es posible bajar la frecuencia de mastitis
clínica a niveles del 1 al 3%. Sin embargo, queda la prioritaria función de controlar a la
mastitis subclínicas de origen por E.coli. Por lo anterior, existen varios grupos en el
mundo, desarrollando productos con la capacidad de apoyar inmunológicamente al
control de las infecciones mamarias. Uno de ellos se ubica en la Universidad de Davis,
California, con la modificación estructural de una cepa de E.coli, denominada J5, vía
plásmidos (Cullor S.J). Ciencia y Tecnología Aplicada, S.A. de C.V. participa en la
producción de bacterinas para el control de mastitis adoptando la línea de investigación
de protección de la infección mediante la producción de anticuerpos contra adhesinas de
fijación expresadas por E.coli así como la obtención de dos proteínas de virulencia de
Staphylococcus aureus por tecnología recombinante y su expresión en Lactococcus
lactis.
Staphylococcus aureus
S. aureus coloniza permanentemente el epitelio húmedo escamoso de las fosas nasales
anteriores de aproximadamente 20% de la población humana, y esporádicamente en otro
60% (Peacock 2001). Se desconoce si los bovinos son portadores asintomáticos en
lavías respiratorias. En esa ubicación, no es causa de problemas en el hospedero, sin
embargo cuando la bacteria logra rebasar las barreras de las mucosas, ocurren una serie
de patologías. Se conocen numerosos tipos de infecciones por S. aureus, como
infecciones neonatales, abscesos en glándula mamaria o mastitis, infecciones post
operatorias, forúnculos y carbunclos, neumonía, bacteremia, endocarditis, osteomielitis
y enterocolitis. Algunos signos en los pacientes humanos infectados por S aureus son
causadas por toxinas más que por la infección per se: la intoxicación por alimentos con
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S. aureus es causada por la ingestión de enterotoxinas preformadas termoresistentes de
S. aureus. El síndrome de choque tóxico es causada por una exotoxina, que puede
resultar de una complicación post quirúrgica, y el síndrome de piel escaldada por S.
aureus (staphylococcal scalded skin syndrome, SSSS), una dermatitis frecuente en
niños, es causada por la toxina exfoliatina (Götz, 2004).
Aunque S. aureus solía ser considerado un patógeno no invasivo, se sabe ahora que la
bacteria puede invadir diversos tipos de células con la ayuda de un mecanismo que
involucra la formación de un puente de fibronectina entre las proteínas de adherencia a
la fibronectina de la bacteria y las 51 integrina del hospedero que activan el proceso
de internalización de la bacteria (Schwarz-Linek 2004, Schwarz-Linek 2003, Peacock
1999). El organismo puede sobrevivir al interior de la célula en estado semi-activo
generalmente referido como variantes de colonias pequeñas (Small colony variants, von
Eiff 2000)
El uso extensivo de antibióticos se señala como una de las posibles causas del
incremento del número de cepas bacterianas resistentes a antibióticos (Goossens 2005),
no existe un número exacto, pero se calcula que aproximadamente 1 500 toneladas de
antibióticos son usadas en humanos anualmente (Mellon 2001). La mayoría se
administra fuera del ambiente hospitalario, y se estima que la mitad de éstos son autoprescripciones (Gonzales 1997, Nyquist 1998). Cuando se añade el hecho de que la
cantidad de antibióticos administrados a animales para consumo humano es diez veces
mayor (Mellon 2001), el resultado es la creación de un ambiente propicio para el
surgimiento de bacterias resistentes.
Actualmente en animales de interés comercial alimentado con antibióticos promotores
de crecimiento se han aislado cepas que presentan resistencia a meticilina, por lo que la
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aparición de resistencia a Vancomicina en animales de interés comercial ya no es una
posibilidad remota (Lee 2003).
La tendencia en los países con alto grado de desarrollo es la producción de alimentos
libres de contaminantes químicos y antibióticos. En México en el caso de la leche
comercializada por las grandes empresas, se cuida con esmero la calidad de la misma.
Ya existe entonces la cultura entre los ganaderos productores de leche de no contaminar
leche y subproductos de la misma con antimicrobianos. Por lo anterior la medicina
preventiva para el control de las infecciones a las que la glándula mamaria está
expuesta, adquiere en nuestro tiempo un importante lugar.
Evasión de la respuesta inmune de S. aureus
La defensa primaria contra la infección por S. aureus es la inmunidad innata por los
leucocitos polimorfonucleares neutrófilos (LPN). Aparentemente S. aureus cuenta con
mecanismos para desactivar la respuesta de los LPN, lo que logra principalmente
mediante la secreción de diferentes factores que alteran la respuesta inmune celular y
humoral. De esta forma la respuesta inmune del hospedero es insuficiente para combatir
y evitar infecciones subsecuentes (Foster 2005).
S. aureus tiene una gran variedad de factores de virulencia secretados y asociados a la
pared celular, incluyendo proteínas de superficie que promueven la adherencia a tejidos
dañados y a la superficie de las células del hospedero (Foster 1998), que se adhieren a
proteínas de la sangre que le permiten evadir la respuesta inmune y promover la
absorción de hierro (Skaar 2004). Las proteínas de membrana están asociadas en forma
covalente a la pared celular por medio de la enzima sortasa, una enzima asociada a la
membrana que reconoce y corta la secuencia LPXTG en el extremo carbonilo de la
proteína de superficie, o también pueden ser retenidas en la pared celular por medio de
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interacciones iónicas (Foster 1998, Mazmanian 2001). Adicionalmente la mayoría de las
cepas expresan una cápsula de polisacáridos (O’Riordan 2004). Como factores de
virulencia S. aureus puede secretar una gama de enzimas extracelulares como proteasas,
hialuronidasas, lipasas y nucleasas que facilitan la destrucción del tejido y la expansión
en el hospedero, toxinas que dañan membranas que causan efectos citolíticos, y
superantígenos que contribuyen al síndrome de choque tóxico (Bohach 1999, Dinges
2000).
Cuando S. aureus ha atravesado las barreras físicas de la piel y mucosas, se enfrenta a la
respuesta inmune del hospedero. La infección ocasiona una respuesta inflamatoria que
resulta en la migración al sitio de infección de macrófagos y LPN, los que inician la
fagocitosis de las bacterias con la ayuda de anticuerpos y complemento del suero. En el
suero de un individuo expuesto con antelación a S. aureus, se encuentran anticuerpos
contra antígenos de S. aureus, y se sabe que éstos se elevan después de una infección
(Roche 2003, Etz 2002, Dryla 2005). Sin embargo, estos anticuerpos y la memoria
inmunológica asociada parecen no ser suficientes para prevenir infecciones
subsecuentes.
Otra forma de evadir la fagocitosis consiste en la utilización de factores de superficie de
la bacteria que modifican la composición externa, modificando su composición final y
evadiendo la opsonofagocitosis. Entre los factores de superficie mejor estudiados están
la Proteína A, el factor de aglutinamiento A (ClfA) y la cápsula de polisacáridos;
adicionalmente, secreta otros factores entre los que se encuentran la proteína
extracelular acopladora de fibrinógeno (Efb) y la estafiloquinasa. Muchos de estos
factores desarrollan más de una función, como es el caso de la Proteina A y de Map.
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El Factor de Aglutinamiento A (Clumping factor A ClfA) es la proteína de adherencia a
fibrinógeno mas abundante y presente en la superficie de S. aureus en la fase
estacionaria de crecimiento (O’Brien 2002, Bischoff 2004).
La mayoría de las cepas de S. auerus presentan una delgada microcápsula compuesta de
polisacáridos de diferente composición, que resulta en diferentes serotipos, los mas
comúnes son el tipo 5, 8 y 336 (O’Riordan 2004, Roghmann 2005). La expresión de los
tipos 5 y 8 se asocia a mayor virulencia en modelos animales de infección (Luong 2002,
Thakker 1998, Nilsson 1997, Baddour 1992), la presencia de la cápsula disminuye la
capacidad de fagocitosis de la bacteria por parte de los neutrófilos en presencia de
opsoninas en ensayos in vitro, por lo que se presume que la cápsula es anti opsónica
(Thakker 1998, Nilsson 1997). En contraste, altos niveles de anticuerpos anti capsulares
promueven la opsonofagocitosis y protegen contra la infección (O’Riordan 2004, Lee
1997).
Los biofilms se definen como comunidades de microorganismos que crecen embebidos
en una matriz de exopolisacáridos y adheridos a una superficie inerte o un tejido vivo
(Costerton 1995). El crecimiento en biofilms representa la forma habitual de
crecimiento de las bacterias en la naturaleza. La capacidad de formación de biofilm no
parece estar restringida a ningún grupo específico de microorganismos y hoy se
considera que bajo condiciones ambientales adecuadas todos los microorganismos son
capaces de formar biofilms. Además de agua y de las células bacterianas, la matriz del
biofilm es un complejo formado principalmente por exopolisacáridos (Sutherland
2001). En menor cantidad se encuentran otras macromoléculas como proteínas, DNA y
productos diversos procedentes de la lisis de las bacterias (Branda 2001).
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Desarrollo de vacunas.
A pesar de que individuo que ha sufrido una infección de S. aureus normalmente no
está protegido de una infección subsiguiente, hay evidencia de que es posible montar
una respuesta de anticuerpos robusta a componentes de la superficie de la bacteria
altamente purificados, como la cápsula de polisacáridos (Lee 1997), la proteína
acopladora a colágeno Cna y la proteína acopladora a Fibrinógeno ClfA (Josefsson
2001, Nilsson 1998). En cada caso, la inmunización activa ha demostrado proteger a
animales de laboratorio de la infección. Adicionalmente, la inmunización pasiva de
ratones con inmunoglobulinas obtenidas de donadores humanos con títulos altos de
anticuerpos anti-ClfA protegieron contra dosis letales intravenosas de la bacteria
(Josefsson 2001, Vernachio 2003), y el mismo resultado se obtuvo al utilizar una
versión de anticuerpo monoclonal humanizado dirigido contra ClfA (Patti 2004, Hall
2003), la cual está siendo actualmente probada en fase clínica II en pacientes para tratar
bacteremia.
Vacunación: una estrategia para el control de la infección.
El bloqueo de las primeras etapas de infección, es decir el acoplamiento de la bacteria a
los receptores celulares del hospedero y la colonización de las superficies de la mucosa,
puede ser una estrategia muy efectiva para prevenir infecciones bacteriales. Estudios
recientes han demostrado que la vacunación profiláctica utilizando la adhesina FimH de
E. coli uropatogénica puede bloquear la infección de la bacteria (Wizemann 1999). Los
avances recientes en la identificación de posibles adhesinas y otras proteínas de
superficie de diversas bacterias patógenas permiten el desarrollo de estrategias de
vacunación similares para prevenir enfermedades.
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Vacuna con antígenos de ClfA y FnbpA.
ClfA y FnbpA, dos adhesinas presentes en la pared celular de S. aureus participan en la
invasión celular por puentes de fibronectina. Promueven en parte la activación de
plaquetas, y se adhieren a fibronectina y fibrinógeno, lo que al mismo tiempo recubre a
la bacteria y además promueve el anclaje de la bacteria a las superficies del hospedero y
a biomateriales que han estado por largo tiempo en contacto con el hospedero. (Luk
1989; Sun 1997, Dziewanowska 1999, 2000; Flock 1987; Sinha 1999; Peacock 1999;
Fowler 2000; Miyamoto 2001). Ambas adhesinas poseen dominios de adherencia a
fibrinógeno y fibronectina, pero la afinidad por los sustratos es diferente: FnbpA se
adhiere al fibrinógeno, aunque con menor afinidad que a la fibronectina (Wann 2000).
La región responsable de la adhesión a la fibronectina se localiza cerca de la región de
la proteína que atraviesa la pared celular de la bacteria. Esta región esta compuesta de 3
regiones repetidas de un dominio de ~38 aminoácidos (regiones D1-D3), y cada una de
ellas muestra capacidad de adherencia a la fibronectina in vitro. (Signas et al, 1989;
Schennings et al, 1993; Flock et al, 1987; Ciborowski, 1992; Penkett et al, 1997, 1998,
2000).
En el caso de ClfA, la región responsable de la adherencia al fibrinógeno se denomina
Región A, compuesta por ~500 aminoácidos (residuos 44-542 en la proteína), con una
similitud del 26% entre ClfA y ClfB, aunque se unen al fibrinógeno en sitios distintos
(O'Connell 1998; Ni Eidhin 1998, McDevitt 1997). ClfA es expresada en la etapa
estacionaria de crecimiento, mientras que ClfB se expresa en la etapa de crecimiento
exponencial (Ni Eidhin 1998).
Material y Método
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Los animales
Se utilizarán 1,200 bovinos clínicamente sanos de la raza Holstein Friesián, próximos a
la etapa de secado de segunda o tercera lactancia. Como criterio de inclusión se
determinará la ausencia de infección después de estudios de microbiología de cada
cuarto de la glándula mamaria. Los animales serán divididos en dos grupos de igual
número.
Los biológicos
La mitad de ellos será inmunizado con la bacterina Eco Staph PM+3, con 4ml en la
región crural, a la altura de los ganglios linfáticos supra-mamarios. La aplicación de
biológico se realizará al inducir el secado de la glándula mamaria y 30-35 días después
de la primera aplicación. Eco Staph PM+3, es un producto inactivado con adyuvante a
base de saponinas integradas, debe agitarse antes de su aplicación.
El otro grupo será vacunado con la bacterina J5 de acuerdo a las instrucciones del
fabricante.
Las pruebas
En las vacas de ambos grupos, se valorará el índice de mastitis subclínica, mediante el
examen de células somáticas. En caso de encontrarse infección en cualquiera de los
grupos, se procederá a la obtención de una muestra representativa de leche, y al análisis
bacteriológico, capturando toda la información correspondiente en la bitácora.
La producción de leche individual y por grupo será medida.
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Hipótesis.
La inmunización con la bacterina Eco Staph PM+3, inducirá la producción de
anticuerpos de la clase IgG contra E.coli, la opsonización de las bacterias que ocurran
como reto natural durante la etapa de evaluación de la prueba y la resolución temprana
de la infección.
La inmunización con la bacterina Eco Staph PM+3, inducirá la producción de
anticuerpos de la clase IgG contra los factores de virulencia Clumping factor y
Fibronecting binding protein y evitará la adhesión de Staphylococcus aureus y
presentación de casos clínicos.
Los bovinos inmunizados con Eco Staph PM+3 se mantendrán con conteo de células
somáticas entre 200 y 250 mil, producirán mayor número de litros de leche que los
inmunizados con la bacterina J-5.
Los becerros nacidos de vacas inmunizadas con Eco Staph PM+3 tendrán menor
número de episodios de infección entérica por colibacilos.
Objetivos.
Evaluar la producción de leche, la concentración de células somáticas, la presencia de
mastitis clínica en dos grupos de vacas vacunadas con dos biológicos diferentes.
Obtener el control inmunológico para las infecciones por E.coli y Staphylococcus
aureus en la glándula mamaria.
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