Uso de kits comerciales para ensayos de hormona

Uso de kits comerciales para ensayos de
hormona luteinizante y de progesterona en el
manejo reproductivo canino (Last Updated: 24-May-2001 )
M. V. Root Kustritz
Department of Small Animal Clinical Sciences, College of Veterinary
Medicine, University of Minnesota, St. Paul, MN, USA.
Traducido por: Y. A. Corrada y C. Gobello, Instituto de Teriogenologa,
Facultad de Ciencias Veterinarias, Universidad Nacional de La Plata, La
Plata, Argentina. (12-Feb-2002).
Resumen
La determinación precisa del momento de la ovulación permite el óptimo
manejo reproductivo en las perras. La correlación entre los cambios físicos
y de comportamiento durante el estro y el tiempo de ovulación es pobre.
La determinación de la concentración de la progesterona sérica es la
técnica preferida para evaluar el día de ovulación en las perras en estro;
se describe el uso de los ensayos cualitativos y comerciales.
Endocrinología de la ovulación en las perras
El ciclo estral de las perras consiste de cuatro etapas: proestro, estro o
celo, diestro, y anestro. En proestro, la concentración de los estrógenos
séricos está elevada. Los estrógenos aumentados causan cambios físicos
evidentes característicos de celo en las perras, incluyendo edema vulvar y
exudación de una descarga serosanguinolenta a través de la vagina, y
aumentada cornificación del epitelio vaginal. La concentración sérica de
estrógenos cae abruptamente en el proestro tardío, estimulando un pico
en la concentración de hormona luteinizante (LH) sérica y la subsecuente
ovulación [1]. La concentración del pico de LH en suero, de 7 a 50 ng/ml,
dura 24 a 40 horas antes de retornar a niveles basales [1-3]. La ovulación
ocurre 2.0 +/- 0.1 días después del pico de LH [4,5].
La concentración sérica de progesterona comienza a aumentar desde
niveles basales coincidiendo con el descenso de la concentración de los
estrógenos séricos y el pico de LH, debido a luteinización preovulatoria de
las células foliculares [1,6]. La concentración sérica de progesterona en el
día del pico de LH, aproximadamente 2 días antes de la ovulación, es de
2.0 a 2.9 ng/ml [2,3,7]. La concentración sérica de progesterona en el día
de la ovulación es de 4 a 10 ng/ml [1,7].
El descenso de la concentración sérica de estrógenos y el aumento en la
concentración sérica de progesterona marca el comienzo del
comportamiento de estro, del celo, en las perras [1,3]. En promedio una
perra puede ovular en cualquier momento desde 2 días antes hasta 6 días
después del comienzo del comportamiento de estro [3,8]. El estro se
caracteriza citológicamente por una cornificación completa de las células
epiteliales vaginales donde más del 50% de estas células aparentemente
son anucleadas.
Seis días después de la ovulación (8.0 +/- 0.3 días después del pico de
LH), la perra entra en diestro citológico, caracterizado por un
comportamiento de cesación del celo y citológicamente por un retorno
abrupto al epitelio no-cornificado [9].
Momento de ovulación en las perras
Los métodos para determinar el momento de ovulación en las perras
incluye la evaluación del comportamiento o cambios físicos en la perra,
cambios en el fluido vaginal, la evaluación citológica o vaginoscópica de
los cambios en el epitelio vaginal, y ensayos hormonales.
Comportamiento o cambios físicos en las perras - las perras pueden
ovular en cualquier momento desde 2 días antes hasta 6 días después del
comienzo del celo [3,8]. Es posible que las perras dominantes nunca
exhiban celo, y las perras sumisas pueden permitir las montas por el
macho incluso cuando no están en estro. Los cambios físicos descritos en
las perras incluyen una disminuida turgidez vulvar al comienzo del estro,
disminuido del ancho vulvar en el momento del pico de LH, y un cambio
en el color de la descarga vaginal de serosanguinolenta a color pajizo al
comienzo del celo [10,11]. El comportamiento y los cambios físicos en las
perras durante el estro son variables, y pobremente correlacionadas con la
ovulación.
Cambios en el fluido vaginal - Se intentado medir la concentración de
progesterona en el fluido vaginal. Aunque la concentración de
progesterona si se eleva en el fluido vaginal, coincidiendo con la elevación
de la concentración de progesterona sérica, la correlación es pobre
[12,13]. Se ha reportado que el pH del fluido vaginal se encuentra
disminuido al comienzo del estro, lo mismo pasa con la resistencia
eléctrica de las secreciones vaginales, y la concentración de glucosa en el
fluido vaginal se ha reportado que se incrementa al momento del
comienzo del estro, pero la utilidad clínica de estos cambios es limitada
[11,13]. La arborización (helecho) del fluido vaginal cuando se le permite
secarse al aire sobre un porta objeto es máxima 2.3 +/- 1.2 días después
del pico de LH en los perros; en un estudio, con servicios a tiempo fijo (10
y 12 días después del comienzo del estro) produjo una tasa de gestación
de solamente el 78%, mientras que el servicio en el momento de la
máxima arborización del fluido vaginal produjo una tasa de gestación del
92% [14].
Citología vaginal y vaginoscopía - La cornificación vaginal aumenta
gradualmente en el proestro. La cornificación completa generalmente
ocurre antes del pico de LH [15]. El estro, o el celo, se define
citológicamente como la cornificación completa con más del 50% de las
células anucleadas. Hay una pobre correlación entre el comienzo del estro
citológico y la ovulación. El comienzo del diestro citológico, caracterizado
por un abrupto retorno a la completa no-cornificación, ocurre 6 días
después de la ovulación, permitiendo una evaluación retrospectiva del día
de la ovulación [9]. La vaginoscopía se puede usar para diferenciar la
mucosa vaginal edematosa, acolchonada, rosada de proestro de la
mucosa vaginal deshidratada de bordes cortantes y pálida de estro [11].
Otra vez, la correlación entre el comienzo del estro y la ovulación es
variable.
Ensayo hormonal - el ensayo hormonal es la medición más exacta del
momento de ovulación en las perras. Las dos hormonas analizadas
comúnmente para manejo de servicio son la LH y la progesterona. La
hormona luteinizante es una hormona proteíca que se puede medir con un
ensayo cualitativo comercial (Status-LH, Synbiotics, San Diego CA). El kit
se guarda a temperatura ambiente y tiene un duración relativamente corta.
El kit puede no ser exacto si es utilizado más allá de la fecha de
vencimiento, o si el paquete metalizado que contiene el dispositivo del kit y
la pipeta se abre mucho tiempo antes de que la prueba sea realizada. La
muestra preferida es suero. La muestra no debe ser lipémica ni
hemolizada. La prueba se debe ejecutar el mismo día en que se colecta el
suero. Si eso no es posible, el suero debe ser refrigerado, no congelado,
hasta que la prueba pueda ser ejecutada. (Fig. 1, Fig. 2 y Fig. 3).
Figura 1. Kit Status-LH para la medición de hormona luteinizante en suero
canino (Synbiotics, San Diego CA). - Para ver una magnificación oprima la figura
-
Figura 2. Componentes del kit Status-LH para la medición de hormona
luteinizante en suero canino (Synbiotics, San Diego CA). El paquete metalizado
que contiene el dispositivo del kit y la pipeta no debe ser abierto sino hasta
momentos antes de ejecutar la prueba. - Para ver una magnificación oprima la
figura -
Figura 3. Resultado final de la prueba para hormona luteinizante usando el kit
Status-LH (Synbiotics, San Diego CA). La línea rosada es el control, indicando
que el test está terminado y fue ejecutado correctamente. La ausencia de una
línea rosada similar debajo del marcador control, al lado de la letra T en el
dispositivo del kit, es indicativa de una concentración de LH en la muestra de
menos de 1 ng/ml. - Para ver una magnificación oprima la figura -
El ensayo semi-cuantitativo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA)
para determinar el pico de LH da un resultado de bajo (menos de 1 ng/ml)
o alto (mayor a 1 ng/ml). La prueba de ELISA ha mostrado dar resultados
consistentes con un radioinmunoanálisis preciso (RIA) [16]. Debido a que
la duración del pico de LH promedia aproximadamente en un día en las
perras, las muestras se deben tomar diariamente, aproximadamente a la
misma hora. El fabricante recomienda que la determinación del pico de LH
con esta prueba sea verificada por la medición de progesterona sérica,
descrita abajo. Debido a la vida corta del kit, la necesidad de pruebas
diarias, y el requisito de evaluar progesterona para verificar la exactitud, la
autora raramente utiliza este ensayo en la práctica.
La determinación de la progesterona por ensayos cuantitativos, tales
como RIA o quimioluminiscencia, permite la predicción de la ovulación
usando el esquema siguiente (Tabla 1). El tiempo para obtener los
resultados del ensayo puede ser tan corto como 24 horas en algunos
laboratorios de diagnóstico veterinario.
Tabla 1. Correlación de la concentración de progesterona sérica suero con
eventos reproductivos significativos en la perra. El margen de error se
estimó ser aproximadamente +/- 1 día.
Progesterona Sérica (ng/ml) Eventos
Menos de 1.0
Anestro o proestro
1.0 - 1.9
Ovulación menos de 3 días - se recomienda rechequeo
2.0 - 2.9
Ovulación menos 2 días
3.0 - 3.9
Ovulación menos 1 día
4.0 - 10.0 Día de Ovulación
Ovulación más 2 días es el día óptimo para servicio
Mayor de 10.0 con epitelio vaginal cornificado
Ovulación más 1 a 5
días
La medición de progesterona por ensayos semi-cuantitativos de ELISA,
también se pueden utilizar para estimar el momento de ovulación en la
perra. La ventaja primaria de los ensayos semi-cuantitativos de
progesterona es su tiempo corto de análisis; los resultados pueden estar
disponibles tan rápidamente como 20 minutos después de que se toma la
muestra de sangre. Las desventajas principales son el incremento del
trabajo y disminuida exactitud [17]. Como planear el tiempo de muestreo y
los intervalos, varía basado en si las muestras tienen que ser enviadas a
un laboratorio para RIA comercial o si son ensayadas por ELISA semicuantitativo en el laboratorio (Tabla 2).
Tabla 2. Esquema clínico para la predicción de la ovulación en la perra
con ensayo de concentración de progesterona sérica usando métodos
cuantitativos y semicuantitativos.
Tipo de ensayo de progesterona usado
Manejo clínico para momento de ovulación
Ensayo comercial (radioinmunoensayo [RIA] o quimioluminiscencia) Resultado cuantitativo La sangre debe tomarse para medición de la
concentración de progesterona sérica en principio cuando la perra tiene
cerca de 70% de las células epiteliales vaginales cornificadas. Las
muestras se toman y re-evalúan cada 3 - 4 días hasta que se alcanza la
concentración en el rango predecible (2 - 10 ng/ml; ver Tabla 1).
Ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas [ELISA] - Resultado Semicuantitativo La sangre debe tomarse para medir la concentración de
progesterona sérica comenzando alrededor del cuarto día del comienzo
del proestro. Las muestras se toman y evalúan diariamente hasta que se
alcanza una alta concentración (mayor de 4 a 10 ng/ml). El primer día que
el ensayo detecta valores en el rango alto se considera como el día de
ovulación (ver Tabla 1).
Varios ensayos semi-cualitativos para medir progesterona en suero canino
están disponibles comercialmente. Se describen tres ensayos disponibles
comercialmente.
El kit K9 Proges-Check es un ELISA semi-cuantitativo (Endocrine
Technologies, Inc., Newark CA). El kit se guarda a temperatura de
refrigerador, y se pone a temperatura ambiente antes de usar. Tanto suero
como plasma heparinizado se puede utilizar para analizar muestras, pero
las muestras no deben estar hemolizadas, lipémicas, o ictéricas. El suero
se puede refrigerar o congelar, en caso de necesidad, antes de ejecutar la
prueba pero la muestra debe estar a temperatura ambiente cuando se
realiza la prueba. Los tres controles dan colores de azul marino, indicativo
de 0 ng/ml de progesterona; azul claro, indicativo de 2 ng/ml de
progesterona; y azul más claro, indicativo de más de 10 ng/ml de
progesterona. El color de las muestras probadas se compara con el del
control y se lee como 2 ng/ml o menos de progesterona si la intensidad
está cerca o igual al color azul marino del control, entre 2 y 10 ng/ml de
progesterona, la intensidad es menor o igual que el control azul claro, y
más de 10 ng/ml de progesterona, la intensidad de la muestra es más
clara que el control azul más claro. El fabricante no hace ninguna
recomendación con respecto a la al momento de apareamiento basándose
en estas concentraciones variadas (Fig. 4, Fig. 5 y Fig. 6).
Figura 4. Kit K9 Proges-Check para medición de progesterona en suero canino
(Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). - Para ver una magnificación oprima
la figura -
Figura 5. Componentes del kit K9 Proges-Check para medición de progesterona
en suero canino (Endocrine Technologies, Inc., Newark CA). El kit se ejecuta en
pocillos transparentes con tres controles. - Para ver una magnificación oprima la
figura -
Figura 6. Resultado final del test para progesterona en suero canino usando el
kit K9 Proges-Check para medición de progesterona en suero canino (Endocrine
Technologies, Inc., Newark CA). El pocillo a la izquierda (el azul oscuro) es
equivalente con 0 ng/ml de progesterona, el segundo pocillo (azul claro) con 2
ng/ml, y el tercer pocillo (el azul más claro) con 10 ng/ml. La muestra
desconocida, a la derecha, no contiene progesterona. - Para ver una
magnificación oprima la figura -
La prueba PreMate es un kit de ELISA semi-cuantitativo (Camelot Farms,
College Station TX). El kit se guarda a temperatura del refrigerador, y se
lleva a temperatura ambiente antes del uso. Uno de los componentes de
la prueba se debe congelar si el kit va a ser mantenido por más de tres
meses, y también debe estar a temperatura ambiente antes de ejecutar la
prueba. Se pueden utilizar tanto suero como plasma heparinizado para
analizar las muestras. Los dos controles dan colores de rosa oscuro, al
parecer indicativo de menos de 4 ng/ml de la progesterona ("antes de la
ovulación", según el fabricante), y de rosa claro al parecer indicativo de
más de 4 ng/ml de progesterona ("día de ovulación o más tarde", según el
fabricante). El color de la muestra a analizar se compara con el de los
controles y se lee como "antes de la ovulación" si el color es más oscuro
que la muestra rosa claro, y de "día de ovulación o más tarde" si el color
es igual a o más claro que el control rosa claro. El fabricante recomienda
que las perras con muestras indicativas de "antes de ovulación" sean
revisadas otra vez en dos días, y que las perras con muestras indicativas
de "día de ovulación o más tarde" sean apareadas inmediatamente (Fig. 7,
Fig. 8 y Fig. 9).
Figura 7. Kit PreMate para medición de progesterona en suero canino (Camelot
Farms, College Station, TX). - Para ver una magnificación oprima la figura -
Figura 8. Componentes del kit PreMate para medición de progesterona en suero
canino (Camelot Farms, College Station, TX). La prueba se ejecuta en pocillos
transparentes con dos controles. - Para ver una magnificación oprima la figura -
Figura 9. Resultado final del test para progesterona en suero canino usando el
kit PreMate PreMate para medición de progesterona en suero canino (Camelot
Farms, College Station, TX). El pocillo de la izquierda (color rosa oscuro) es
equivalente a menos de 4 ng/ml de progesterona, y el pocillo del centro (rosa
claro) a más de 4 ng/ml de progesterona. La muestra desconocida, a la derecha,
no contiene progesterona. - Para ver una magnificación oprima la figura -
Status-Pro es un kit de ELISA semi-cuantitativo (Synbiotics, San Diego
CA). El kit se guarda a la temperatura del refrigerador, y se lleva a
temperatura ambiente antes del uso. El suero es la muestra preferida para
usarse con el kit; las muestras no deben estar hemolizadas o lipémicas. El
suero se puede refrigerar o congelar, en caso de necesidad, antes de
ejecutar la prueba pero debe estar a temperatura ambiente cuando se
realice la prueba. La prueba se realiza en una taza conteniendo tres
pocillos de papel que aparecen como puntos dentro de la taza. La
presencia de los tres puntos es indicativa de menos de 2 ng/ml de
progesterona, la presencia de dos puntos indica 2 a 7 ng/ml, y la
presencia de un punto indica más de 7 ng/ml. Siempre debe haber por lo
menos un punto presente; éste es el punto control que se utiliza para
confirmar el funcionamiento apropiado del kit. El fabricante recomienda
que los apareamientos se realicen varias veces, cada dos o tres días,
comenzando cuando la concentración de progesterona sérica alcanza la
etapa de los "dos puntos" (2 a 7 ng/ml de progesterona); si se utiliza
semen enfriado o congelado, el fabricante recomienda enfáticamente las
pruebas simultáneas con los kits de Status-LH y Status-Pro. El kit de
Status-Pro está bajo revisión en el momento de esta escritura.
Momento de servicio
Las hembras ovulan ovocitos inmaduros que requiere cerca de dos días
para madurar antes de que puedan ser fertilizados. El día óptimo de
apareamiento con servicio natural, inseminación artificial (IA) con semen
fresco, o IA con semen enfriado es de dos días después de la ovulación.
Para la inseminación con espermatozoides congelados/descongelados,
quienes han disminuido su viabilidad y longevidad, el día óptimo de
servicio es 3 a 4 días después de la ovulación para un sólo servicio. La
tasa de gestación se incrementa en todas las técnicas si la hembra es
servida más de una vez en el periodo fértil [18].
BIBLIOGRAFIA: Oprima el número entre paréntesis [1] en el texto. Oprima
aquí para ver la lista completa de referencias.
IMPRIMIR: Oprima aquí para imprimir este manuscrito y la lista completa
de referencias (al cargar un fichero en formato PDF que se puede
imprimir). Para más información sobre el formato PDF, visite el sitio web
de Adobe.
Oprima sobre el nombre del autor para ver la lista sus publicaciones: M. V.
Root Kustritz