MÓDULO OPTATIVO: - centro de microscopia electronica

Métodos de estudio de las células y sus componentes
MÓDULO OPTATIVO:
“INTRODUCCIÓN A LA INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA EN EL ÁREA BIOMÉDICA”
MICROSCOPÍA
- Procesamiento de materiales biológicos
Microscopía óptica
1- Fijación: Formol 4%
2- Deshidratación: Series de etanol de concentración creciente
3- Aclaramiento: xilol
4- Inclusión en parafina
5- Preparación del taco
6- Corte
7- Desparafinización
8- Coloración: Hematoxilina/Eosina
9- Deshidratación
10- Aclaramiento
11- Colocación de cubreobjeto
Microscopía electrónica de transmisión
1- Fijación: Karnovsky 1,5%
2- Deshidratación: Series de acetonas
3- Inclusión en resinas: araldita
4- Preparación del taco
5- Corte
6- Montaje en grillas de níquel
7- Coloración: Sales de metales pesados: citrato de plomo y acetato de uranilo
Utilidades de la Microscopía Electrónica de Transmisión en la patología médica:
Patología renal
Patología neuromuscular
Patología tumoral
Probable contribución de la Microscopía Electrónica al diagnóstico diferencial de:
-Carcinoma, melanoma y sarcoma.
- Adenocarcinoma y mesotelioma.
- Tumores de mediastino anterior: timoma, carcinoide tímico, linfoma y seminoma.
- Tumores de células pequeñas y redondas: sarcoma de Ewing, rabdomiosarcoma embrionario,
linfoma, tumores neuroectodérmicos.
- Tumores de células fusadas de partes blandas.
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
- Tumores endocrinos y no-endocrinos.
INMUNOCITOQUÍMICA
Permite localizar componentes celulares específicos,
mediante una reacción antígeno- anticuerpo.
Componentes esenciales

Antígeno: sustancia de cualquier constitución química, que introducida a un
organismo por cualquier vía, no es reconocida como propia e induce una respuesta
con formación de anticuerpos.
 Anticuerpo (Inmunoglobulina): molécula proteica producida por las células
plasmáticas en respuesta a un antígeno.
Cada anticuerpo tiene una porción que se une específicamente a un antígeno.
Para llevar a cabo esta técnica los anticuerpos están unidos a moléculas trazadoras, que permiten
visualizar el lugar de la reacción antígeno-anticuerpo.
Las moléculas trazadoras pueden ser:
- Fluorocromos (microscopía de fluorescencia)
- Enzimas (microscopía fotónica)
- Metales, como el oro coloidal (microscopía electrónica)
enzimas
Metales
Marcador
fluorocromos
Inmunoglobulina
Ag
Ag
La inmunocitoquímica se puede realizar tanto para microscopía óptica como para microscopía
electrónica de transmisión.
A continuación se mencionan dos de las técnicas de immunohistoquímica más utilizadas en
microscopía fotónica:
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
1- Técnica de immunoperoxidasa. El trazador enzimático es la enzima peroxidasa. Puede
emplearse en técnica con anticuerpos marcados (técnica directa o indirecta) o con
anticuerpos sin marcar (técnica peroxidasa/anti-peroxidasa: PAP).
2- Método de avidina-biotina.
Entre las aplicaciones de la inmunocitoquímica se encuentra:
- Identificación celular.
- Inmunotipificación tumoral y pronóstico.
- Morfometría.
CITOMETRÍA DE FLUJO (CMF)
FUNDAMENTOS
Técnica de análisis celular multiparamétrico basada en hacer pasar una suspensión de
partículas (generalmente células) alineadas y de una en una por delante de un haz de láser
focalizado
Los citómetros de flujo analizan células en suspensión que interfieren de forma individual
con una fuente de luz. La intersección de cada célula con la luz láser provoca la emisión de una
serie de señales luminosas que permite diferenciar poblaciones celulares dentro de la muestra
analizada, por su tamaño relativo, por sus granulaciones o bien por su reactividad con
fluorocromos. Es un método de lectura rápido, que permite analizar un elevado número de células
y proporciona un registro computarizado de los resultados. La citometría de flujo permite la
determinación de antígenos celulares de superficie, y por tanto, tiene utilidad en la determinacón
de inmunotipos de leucemias agudas y sindromes linfoproliferativos crónicos. Así mismo,
permite la cuantificación del ADN y la determinación de la actividad proliferativa de la población
celular. La cuantificación de ARN celular se aplica al recuento de reticulocitos. La citometría de
flujo se ha beneficiado de los avances ocurridos en los últimos años en informática, electrónica,
óptica y tecnología laser. Así mismo, la producción de nuevos anticuerpos monoclonales con
diferentes fluorocromos y los nuevos procedimientos de tinción en citoquímica han permitido
ampliar las áreas de estudio en diagnóstico clínico e investigación biomédica. Actualmente, esta
tecnología ha pasado de ser una herramienta útil en investigación básica a ser empleada en la
práctica habitual de muchos laboratorios de hematología y anatomía patológica.
¿CUANDO EMPLEAR LA CDF?



La CMF se puede emplear para estudiar características estructurales y funcionales de
células o partículas en suspensión.
Las aplicaciones fundamentales de esta técnica se dan en biología y medicina
Permite la identificación de antígenos celulares
mediante técnicas de
inmunofluorescencia y el estudio del contenido de ADN y fases del ciclo celular.
¿QUÉ ES UN CITÓMETRO DE FLUJO?
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
Es un aparato que es capaz de medir componentes y propiedades celulares (partículas biológicas)
que fluyen en suspensión.
Es esencial disponer de una suspensión de células o partículas individuales.
Las células o partículas son marcadas por colorantes fluorescentes que son capaces de excitarse
con una fuente luminosa de alta energía
EMPLEOS DE LA CDF EN BIOMEDICINA:















Recuento celular,
Fórmula leucocitaria,
Recuento reticulocitario,
Análisis de médula ósea,
Estudios de cinética celular,
Estudio de subpoblaciones linfocitarias,
Tipología tisular,
Estimulación linfocitaria,
Diagnóstico/pronóstico de procesos neoplásicos,
Monitorear tratamiento en oncología,
Diagnóstico bacteriano y vírico,
Sensibilidad a antibióticos,
Cariotipo,
Diagnóstico de portador,
Diagnóstico prenatal.
MÉTODOS DE DETECCIÓN DE APOPTOSIS
MECANISMOS DE MUERTE CELULAR (Clásicos)
Necrosis
Apoptosis
Mecanismo pasivo consecuencia
Proceso activo y organizado
de una lesión severa (hipertermia,
determinado genéticamente
hipoxia, toxinas, etc…)
Culmina con la fragmentación
Conduce a la lisis celular
celular y fagocitosis de restos
Afecta grupos celulares contiguos
celulares
Generalmente acompañada de
Afecta células aisladas
reacción inflamatoria
No se acompaña de reacción
inflamatoria
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APOPTOSIS
Eventos morfológicos y bioquímicos
Disminución del tamaño celular
Condensación del citoplasma
Fragmentación nuclear
Formación de cuerpos apoptóticos
Fagocitosis
Externalización de la fosfatidilserina
División intranucleosomal
División del ADN en 50-300 kb
Detección de Proteínas que participan en el proceso
apoptótico
Detección de actividad Enzimática
Técnicas de detección
Microscopía Electrónica
Microscopía Fotónica
Citometría de Flujo
Técnica de TUNEL
Electroforesis del ADN en gel de
agarosa
Inmunohistoquímica
Western blot
ELISA
TÉCNICA DE TUNEL (terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated d UTP nick end labeling)
TUNEL Es uno de los métodos más utilizados.
Consiste en la incorporación de nucleótidos marcados a extremos OH 3` de las cadenas
simples del ADN mediante una transferasa terminal (desoxynucleotidil transferasa
Dichos polímeros se ponen de manifiesto mediante microscopía de fluorescencia o se pueden
detectar por técnicas inmunohistoquímicas.
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Cortes histológicos
• Desparafinar
• Hidratar
Cultivos celulares
• Fijar
• Digerir
• Permeabilizar
enzimáticamente con
Proteinasa K
• Incubar con nucleótidos marcados y enzima
Transferasa Terminal
•
•
Incubar con anticuerpo conjugado con peroxidasa
•
Adicionar el substrato (DAB)
Analizar las muestras
Ventajas
Permite determinar presencia de
fragmentación del ADN en células
individuales (cuantitativa)
Desventajas
En algunos procesos de necrosis
puede haber degradación del ADN
dejando extremos 3´ libres
Se han desarrollado kits que facilitan
su utilización
ELECTROFORESIS DEL ADN
Se basa en la extracción y purificación de las moléculas de ADN, las cuales son separadas por su
tamaño, en un gel de agarosa sometido a un campo eléctrico
Extracción del ADN
Lisis y homogeneización de la muestra
Digestión con Proteinasa K
Digestión del ARN con ARNasa
Remoción de proteínas residuales por precipitación y centrifugación
Recuperación del ADN del sobrenadante por precipitación con isoproterenol
Lavado del ADN con etanol
Siembra del ADN
Corrida Electroforética (Buffer que contiene Bromuro de Etidio)
Transiluminación
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Ventajas
La degradación del ADN en patrón
de escalera ocurre en forma
específica
Método confiable
Desventajas
Aparece en un proceso tardío
Algunas estirpes celulares no
presentan este tipo de degradación
(epiteliales)
Es posible perder fragmentos
pequeños de ADN
CITOMETRÍA DE FLUJO
Método que permite medir componentes y propiedades de células que fluyen en una suspensión
celular.
Detección de moléculas involucradas en apoptosis: ( Fas, Bcl-2, citocromo c, caspasa 3
) se utilizan anticuerpos acoplados a algún fluorocromo.
Degradación del ADN: las células apoptóticas presentan menos contenido de ADN,
debido a la degradación por endonucleasas ( se utilizan fluorocromos que se intercalan en
la molécula de ADN)
Cambios en la simetría de la membrana plasmática: mediante la incorporación de
anexina (molécula con gran afinidad por la fosfatidilserina y que no difunde) . Con
yoduro de propidio puede verse la integridad de la membrana plasmática.
Ventajas
Detección de apoptosis temprana y
tardía
Cuantitativo
Conocer la integridad de las membranas
Desventajas
Requiere células íntegras
CULTIVOS CELULARES
Actualmente se entiende por cultivo celular al conjunto de técnicas que permiten el mantenimiento
de las células "in vitro", manteniendo al máximo sus propiedades fisiológicas, bioquímicas y
genéticas.
Aplicaciones del cultivo de tejido
La técnica de cultivo celular permite el estudio de múltiples fenómenos celulares:
a. Actividad intracelular
b. Flujo intracelular
c. Ecología celular
d. Interacciones celulares
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
Las técnicas de cultivo celular permiten la producción de vacunas antivirales, investigación del
cáncer, producción de proteínas como interferón, insulina, hormona de crecimiento para usos
terapéuticos, mantenimiento y producción de tejidos para transplante.
Ventajas y desventajas de los cultivos celulares
VENTAJAS
DESVENTAJAS
Control preciso y fino del medio ambiente
Homogeneidad de la muestra
Motivaciones éticas.
Sensibilidad de la técnica
Alto costo
Inestabilidad
Validez del modelo "in vitro"
Tipos de cultivos de tejidos
Dependiendo del grado de preservación de la estructura del tejido o del órgano de origen y de su
duración hablaremos de diferentes tipos de cultivos: celulares, organotípicos y explantes.
I) Cultivos celulares.
Se cultivan células aisladas, por lo que es necesario realizar una disgregación celular ya sea por medios
enzimáticos o mecánicos, para romper las uniones intercelulares y con la matriz extracelular.
Los cultivos celulares pueden ser
Primarios
Líneas celulares
Forma de crecimiento de los cultivos celulares
Una suspensión celular se puede cultivar como
monocapa
adherida a una superficie
en suspensión.
en el medio de cultivo
II) Cultivo de órganos (Organotípicos)
Implica que la arquitectura característica (con estructura tridimensional) del tejido 'in vivo' se conserva
al menos en parte. Para ello el órgano se mantiene en un medio del que obtiene los nutrientes y al que
puede liberar los desechos.
III) Explantes
Se cultivan fragmentos de tejidos o de órganos adheridos a una superficie.
Equipo necesario para un cultivo celular
1. Sistemas de esterilización
La necesidad de asepsia para el cultivo de tejidos se extiende no sólo al medio en que se realiza el
trabajo sino muy especialmente a los recipientes en que se realiza el cultivo, a los medios líquidos
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
o sólidos, y a los instrumentos que puedan entrar en contacto con éste en algún momento de su
manipulación
- Equipos de filtración.
- Autoclave
- Estufa
2. Cabina de Flujo Laminar
Su función es la de mantener un área libre de partículas, especialmente de posibles contaminantes
(bacterias, hongos) que puedan acceder al cultivo.
3. Incubador
Un incubador dispone de:
1. dispositivos de control de temperatura.
2. dispositivo de inyección de una mezcla de aire y CO2 en la proporción deseada.
3. dispositivo de control de la humedad ambiente.
4. dispositivo de recircularización de aire.
Las condiciones del cultivo: temperatura, humedad atmosférica y niveles de CO2 son
característicos de cada tipo celular.
4. Baño termostatizado
5. Microscopio invertido de contraste de fase
El control morfológico del cultivo se realiza mediante el uso de un microscopio de contraste de
fase. La fuente de iluminación y los objetivos se encuentran invertidos respecto a la platina de un
microscopio óptico convencional.
Es de gran utilidad disponer asimismo de un dispositivo de captación de imágenes, fotográfico o
de video acoplado al microscopio a fin de documentar el estado de los cultivos.
6. Otros instrumentos: centrífugas, equipo de purificación de agua, balanzas, pH-metro.
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
ELISA y WESTERN BLOT: métodos de inmunodetección de antígenos sin preservación de
la estructura del tejido
MATERIAL BIOLÓGICO
TEJIDO
CÉLULAS
HOMOGENATO
Centrifugación (eliminación de núcleos,
algunas organelas, restos celulares)
PROTEÍNAS
TOTALES
- Absorbancia UV (280 y 205 nm)
ESPECÍFICAS
ELISA
Western Blot
- Métodos colorimétricos (VIS)
Detección de la
proteína en la
muestra con
anticuerpo
específico, sin
necesidad de
separación previa.
Método
Cuantitativo
1- Separación de proteínas
en la muestra por
electroforesis.
2- Transferencia a un
soporte sólido
3- Detección de proteína
específica con anticuerpo
específico.
Método
Semicuantitativo
ESPECTROFOTÓMETRO
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
REACCIÓN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR)
Definición
La técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) es un método in vitro en el cual se
produce la síntesis enzimática de un fragmento de ADN específico, en pocas horas.
Etapas de la reacción
Las etapas de la reacción son 4:
 DESNATURALIZACION INICIAL: Esta etapa consiste de un calentamiento de la muestra a
95 C, para que se produzca la desnaturalización de todas las cadenas de ADN.
 CICLADO: Esta etapa es la reacción propiamente dicha. Consiste de 3 subetapas:
 Desnaturalización (95 C)
 separación de las cadenas de ADN
 Annealling (56-70 C)
 unión de los primers a la molécula de ADN

1 ciclo
Extensión (72 C)
 se produce mediante el agregado de dNTPs
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 EXTENSION FINAL: Esta etapa consiste de una extensión final a 72 C para que la reacción
se complete.
Reactivos




Muestra (Template DNA): Esta contiene la región del fragmento a ser amplificado
Buffer (Tris, NH4+ y/o K+): le brinda a la polimerasa un ambiente químico conveniente
Cloruro de Magnesio (Cl2Mg): Ayuda a la polimerasa en su función
Par de primers (oligonucleótidos): determinan el comienzo y el final de la región a ser
amplificada
 dNTP´s (deoxinucleótidos trifosfato): a partir de los cuales la polimerasa construye el nuevo
fragmento de ADN
 DNA Polimerasa (Usualmente Taq)
Aplicaciones





Detección de mutaciones
Screening de enfermedades hereditarias (desordenes genéticos heredados)
Diagnostico de enfermedades infecciosas
Clonación de genes
Perfil genético utilizando microsatélites
 Medicina forense
 Estudio de especies salvajes
 Test de paternidad
 Producción de gran cantidad de ADN para secuenciación o de secuencias especificas de
ADN para utilizar como sonda
Tipos de PCR
 SSCP-PCR (single strand conformational polymorphims PCR): Se utiliza para detectar
mutaciones
 Touchdown PCR: Evita, parcialmente, el annealling no especifico de los primers y por ende
la amplificación inespecífica
 RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR): Permite ver expresión de genes
 Real Time-PCR (PCR en tiempo real): Permite ver en tiempo real la acumulación de
producto
MICROARRAY ( BIOCHIPS )
FUNDAMENTO
La tecnología microarray permite el análisis comparativo y simultáneo de cómo se expresan
cientos de genes en un solo experimento
GENERALIDADES
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Métodos de estudio de las células y sus componentes

Son micromatrices (soporte de silicona, vidrio, plástico o membrana de nylon) donde existen
miles de sondas de material genético las cuales tienen una secuencia conocida.
Se fabrican a partir de:
- Cadenas de oligonucleótidos
- Una colección purificada de DNA´s
- Proteínas
- Tejidos
SECUENCIA DE EVENTOS EN UN ESTUDIO COMPARATIVO DE EXPRESIÓN
GÉNICA
1- Elección de la población celular a estudiar.
Objetivos:
A- Estudios comparativos de genes específicos
de tejidos
B- Estudios de defectos genes reguladores en el
cáncer
C- Respuestas celulares al ambiente
D- Variaciones del ciclo celular
2- Extracción del mRNA y Transcripción Reversa
- Objetivo: Comparar la cantidad de diferentes
mRNA presentes en 2 poblaciones celulares
seleccionadas.
- Se realiza una trascripción reversa de mRNA a
cDNA que es una forma más estable.
3- Marcación de los cDNA.
Empleo de moléculas fluorescentes:
Rojo: Rodamina
Verde: Fuoresceína
4- Hibridación al DNA del Biochip o Microarray.
5- Escaneo del array hibridado. Revelado mediante:
1- Escáner óptico
2- Microscopio láser confocal
6- Interpretación de la imagen escaneada.
Mediante el empleo de software comerciales y gratuitos
APLICACIONES
en biomedicina
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en la clínica
en la industria farmacéutica
en biotecnología
VENTAJAS
- Permite generar un volumen importante de datos que luego se analizan, interpretan y reúnen en
una base informática.
- Acelerar descubrimientos biológicos
- Encontrar genes con objetivos terapéuticos
- Clasificar enfermedades basándose en genes
PERSPECTIVAS DE DESARROLLO EN INDUSTRIAS FARMACÉUTICAS
Desarrollar nuevas herramientas de diagnóstico micromatriciales en las áreas siguientes:
- genotipado del VIH-1 para detectar mutaciones de resistencia,
- resecuenciación del gen p53 en el cáncer,
- predicción del riesgo de cáncer colorrectal,
- fibrosis cística,
- genotipado del virus del papiloma humano (HPV). (La infección por el HPV es la
primera causa de cáncer cervical.)
Estas micromatrices aportarán información sobre la dotación genética de una persona o revelarán
características distintivas de la enfermedad o el agente infeccioso, cuyo conocimiento influirá en
la elección y la duración del tratamiento.
HIBRIDIZACION IN SITU
Es un técnica mediante la cual se estudia la distribución y densidad de un gen o molécula de
ARNm en una célula o un tejido, utilizando una sonda de ADN o ARN de una sola cadena.
Hibridización: Es un proceso en el cual dos cadenas complementarias de ácidonucleico forman
una doble hélice durante un período de tiempo.
En general, la hibridación puede hacerse sobre soportes sólidos (filtros de nylon o nitrocelulosa),
en solución (in vitro) o en cortes de tejido o preparaciones celulares (in situ). Se pueden utilizar
sondas marcadas con elementos radioactivos, pero como se necesita protección y manipulación
especiales , no son de elección para su uso rutinario. Las técnicas no-isotópicas o colorimétricas
son más rápidas y permiten una localización más precisa de la reacción. Las sondas marcadas sin
elementos radioactivos son más estables y más baratas. La sensibilidad es igual o levemente
inferior a la de los métodos isotópicos. Se han utilizado sondas marcadas con biotina y
digoxigenina.
Tipos de técnicas de hibridación:
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•
Técnica isotópica ó radioactiva (sondas marcadas con: 32P, 35S, 3H).
•
Técnica no isotópica o no radioactiva. (sondas marcadas con: digoxigenina, peroxidasa,
biotina etc).
Tipos de sondas
•
•
•
ADN de simple cadena: Son más largas de 200-500 pb.
ADN de doble cadena: Necesitan ser desnaturalizados
hibridización.
Probes de ARN: Son más estables.
antes
de
la
La hibridación in situ se utiliza primordialmente en la detección de bajo número de copias de
virus, en particular virus como agentes infecciosos (CMV) y como agentes carcinógenos (HPV,
HBV, EBV).
Hibridación in situ Fluorescente
(FISH : Fluorescent In Situ Hybridization)
La FISH es una nueva tecnología que utiliza sondas de DNA marcadas con fluorescencia para
detectar o confirmar anomalías génicas o cromosómicas que generalmente están más allá del
poder de resolución de la citogenética de rutina. Primero, la muestra de DNA (cromosomas
metafásicos o núcleos en interfase) se desnaturaliza, proceso que separa las hebras
complementarias de la estructura en doble hélice del DNA. A la muestra desnaturalizada se le
añade entonces la sonda de interés, marcada con fluorescencia, que se hibridará al DNA de la
muestra en el sitio diana, en el proceso denominado templado, donde se vuelve a formar una
doble hélice. La señal de la sonda se observa mediante un microscopio de fluorescencia y la
muestra de DNA se clasifica según la presencia o ausencia de la señal.
FISH de Metafase
La FISH puede usarse sobre células en metafase para detectar microdeleciones específicas más
allá de la resolución de la citogenética de rutina o para identificar material extra de origen
desconocido. Puede también ser de ayuda en casos donde es difícil determinar mediante la
citogenética de rutina si un cromosoma tiene una deleción simple o está implicado en una
reorganización sutil o compleja. Además, la FISH de metafase puede detectar algunos de los
reordenamientos específicos que se observan en ciertos cánceres. El número de síndromes de
microdeleción diagnosticados por FISH está aumentando con rapidez. La sensibilidad de estos
ensayos es en todos los casos mejor que la de la citogenética de rutina, pero depende del
síndrome en concreto. En algunos, la sonda es específica para el gen defectuoso, como en el
Síndrome de Williams, donde se ha encontrado una deleción en el gen de la elastina en el 96% de
los pacientes con diagnóstico confirmado. En otros síndromes como el de PraderWilli/Angelman, la etiología es heterogénea y las microdeleciones sólo forman una parte de los
casos (60%).
Síndromes de Microdeleción Actualmente Diagnosticables mediante FISH
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
Síndrome del maullido (cri-du-chat)

Síndrome de Kallman

Síndrome de Miller-Dieker

Síndrome de Williams

Síndrome de Smith-Magenis

Síndrome de Wolf-Hirschhorn

Deficiencia de esteroide-sulfatasa

Síndrome de Prader-Willi/Angelman

Síndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen
FISH de Interfase
La FISH se puede usar sobre células en interfase para determinar el número de copias de uno o
varios cromosomas, así como para detectar algunas reorganizaciones específicas que son
características de ciertos cánceres. La ventaja principal de la FISH de interfase es que se puede
realizar muy rápidamente si es preciso, normalmente en 24 horas, porque no requiere crecimiento
de las células.
Un buen ejemplo es el ensayo de Prueba de Aneuploidía, que se realiza sobre células del fluido
amniótico cuando hay una fuerte indicación clínica de una de las trisomías más comunes. Se
desnaturalizan los núcleos de la muestra, se hibridan con sondas específicas para los cromosomas
13, 18, 21, X e Y, y los resultados se obtienen comúnmente en 24 horas. La prueba de
aneuploidía suele incluir también una citogenética de rutina para confirmar los resultados o
detectar cualquier anomalía no detectada por la FISH de interfase.
TECNOLOGIA DEL DNA RECOMBINANTE
La tecnología del DNA recombinante o ingeniería genética es un término general que engloba
todos aquellos protocolos experimentales que conducen a la transferencia de información
genética (DNA) desde un organismo a otro.
Un experimento de DNA recombinante generalmente sigue el siguiente formato:
1.- El DNA (DNA clonado, DNA insertado, DNA diana, DNA extraño) de un organismo donador
se extrae, se rompe enzimáticamente (corta, digiere) y se junta (liga, une) a otro DNA (vector de
clonación) para formar una nueva molécula de DNA recombinado
2.- Esta construcción vector de clonación-DNA insertado se transfiere y mantiene dentro de una
célula hospedadora. La introducción del DNA en la célula hospedadora se denomina
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
transformación (bacterias) o tranfección (células eucariotas).
3.- Aquellas células que han tomado la construcción de DNA (células transformadas o
transfectadas) se identifican y seleccionan (separan) de aquellas que no contienen la construcción.
ANIMALES TRANSGÉNICOS
Un animal transgénico es el resultado de insertar un gen foráneo (transgen) en su genoma, con el
fin de modificar alguna característica del animal.
Son utilizados para:
•
Estudiar enfermedades y contribuir al desarrollo de tratamientos más efectivos.
•
Producir productos biológicos útiles.
•
Conseguir órganos que puedan utilizarse en transplantes.
Primer paso:
Identificar y aislar el gen que se desea insertar en el genoma del animal con el fin que manifieste
un carácter determinado o que produzca la síntesis de una proteína.
Segundo paso:
Introducir el gen , para ello existen diferentes métodos:
•
Microinyección de ADN en el pronúcleo de un zigoto.
•
Transferencia del gen empleando retrovirus como vectores.
•
Transformación de células madre embrionarias.
Aplicación clinica:
- Esta técnica es utilizada para crear modelos de enfermedades humanas con el fin de
investigar nuevos tratamientos. Existen modelos transgénicos para el cancer, fibrosis quística,
artritis reumatoide y Alzheimer.
- Producir órganos para trasplantes, con el fin que no exista rechazo por el sistema
inmunológico del paciente. Para ello se inserta un gen que expresa una proteína humana en la
superficie de las células del animal de modo que dichas células no sean reconocidas por el
sistema inmune humano.
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Métodos de estudio de las células y sus componentes
- Animales transgénicos como biorreactores para la síntesis de proteínas de alto valor
(proteínas terapéuticas): Las "granjas farmacéuticas" o "granjas moleculares“.
Desventajas:
- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.
- Preocupación que los transplantes de animales a humanos permitan a unvirus animal
infectar al hombre.
ANIMALES KNOCKOUT
Animales "knockout" son aquellos en los que un gen normal es reemplazado por uno que produce
una proteína no funcional. La herramienta esencial para la aplicación de esta técnica deriva del
empleo de las células embrionarias troncales (células ES) o multipotentes
El primer paso del proceso de generación de un ratón knockout consiste en la eliminación de uno
de las dos copias del gen seleccionado en las células ES.
Aplicación clinica:
- Fabricar "in vivo" leche maternizada, suprimiendo mediante la técnica de Knockout, el gen
de la b -lactoglobulina de la leche de vaca para imitar a la leche humana que no la tiene.
- Se han desarrollado modelos animales (ratones) knockout deficientes en una determinada
proteasa de potencial relevancia en el cáncer.
Desventajas :
- Bajo porcentaje de animales que incorporan el transgen en el lugar correcto.
- La deficiencia en un gen puede llegar a generar anomalías importantes provocando retraso
en el crecimiento, envejecimiento acelerado y muerteprematura.
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