INTRODUCCION: - Cáncer de tiroides

TERAPIA GENICA EN TUMORES
ENDOCRINOS
Fabián Pitoia
1
INDICE.............................................................................................................. Página 2
Resumen.............................................................................................................. Página 4
Introducción........................................................................................................ Página 5
Capítulo 1: Sistemas de vectores para terapia génica......................................... Página 7
- Sistemas virales..................................................................................... Página 7
-
Retrovirus ............................................................................. Página 7
-
Adenovirus............................................................................. Página 8
-
Virus herpes simplex............................................................. Página 10
-
Vaccinia virus........................................................................ Página 11
-
Virus adenoasociados............................................................ Página 12
- Sistemas no virales............................................................................... Página 13
-
Liposomas............................................................................. Página 13
-
ADN “desnudo”.................................................................... Página 13
- Targeting transcripcional..................................................................... Página 14
Capítulo 2: Estrategias para la terapia génica.................................................... Página 15
- Terapia génica correctiva..................................................................... Página 15
- Terapia génica antiangiogénica............................................................ Página 17
- Terapia génica suicida.......................................................................... Página 19
- Terapia génica inmunomoduladora...................................................... Página 19
- Terapia génica combinada.................................................................... Página 20
Capítulo 3: Empleo actual de la terapia génica en los tumores endocrinos....... Página 21
- Empleo de la terapia génica en carcinoma tiroideo............................. Página 21
-
Reeplazo del gen supresor tumoral p53............................... Página 21
-
Terapia génica suicida......................................................... Página 22
2
-
Inmunoterapia con IL-2 en tumores tiroideos..................... Página 24
-
Terapia génica usando el simporter yoduro/sodio............... Página 25
-
Inmunización genética: calcitonina..................................... Página 26
-
Terapia antisense................................................................. Página 27
- Estrategias de terapia génica para el tratamiento de tumores hipofisarios
-
Uso de genes activantes de prodrogas................................. Página 28
-
Uso de genes supresores de tumor...................................... Página 28
-
Uso de genes que regulan el ciclo celular........................... Página 28
-
Factores de crecimiento y sus receptores involucrados en la
regulación de la angiogénesis............................................. Página 31
- Terapia génica en tumores adrenales................................................. Página 32
Conclusiones.................................................................................................... Página 34
Tabla I: Vectores virales para la terapia génica tumoral................................. Página 35
Tabla II: Estrategias para la terapia génica..................................................... Página 36
Figura 1: Ciclo de vida de los retrovirus......................................................... Página 37
Figura 2: Ciclo de vida del adenovirus........................................................... Página 38
Figura 3: Terapia génica “suicida” ................................................................ Página 39
Figura 4: Ciclo de vida de los virus adenoasociados...................................... Página 40
Figura 5: Inyección de vectores adenovirales dentro de las células tumorales
GH3 en ratones....................................................................... Página 41
Referencias..................................................................................................... Página 42
3
RESUMEN
La terapia génica puede ser definida como la introducción de ácidos nucleicos dentro de
las células con el objetivo de mejorar o curar una enfermedad. Inicialmente los
paradigmas de la terapia génica focalizaron su atención en enfermedades causadas por
alteraciones en un único gen. Con los avances recientes en la tecnología, la terapia
génica se ha transformado en realidad, con más de 2100 pacientes recibiendo esta
opción terapéutica en estudios clínicos controlados. Hasta la actualidad no hay
resultados publicados sobre resultados en pacientes con tumores endocrinos y la
totalidad de los estudios se llevaron a cabo in vitro o en animales de laboratorio.
Existen dos métodos principales para la transferencia de genes terapéuticos dentro de
células tumorales: usando vectores virales y no virales. Los vectores virales incluyen
retrovirus, virus herpes simplex tipo 1, adenovirus, virus adeno asociados y lentivirus
mientras que los vectores no virales incluyen a los liposomas y al ADN desnudo. La
mayoría de los estudios realizados han demostrado resultados alentadores con respecto
al tratamiento de tumores endocrinos, principalmente en carcinomas tiroideos, tumores
hipofisarios y carcinoma adrenal; sin embargo, esta intervención molecular todavía no
se encuentra disponible para ser considerada como una opción terapéutica en este tipo
de neoplasias.
Esta revisión remarca los principios de la terapia génica, describe en detalle los tumores
que pueden ser candidatos ideales para su uso, así como también las intervenciones
terapéuticas que han sido realizadas y las limitaciones y problemas que todavía
permanecen por resolver.
4
INTRODUCCION:
El cáncer es, básicamente, una enfermedad de los genes. La pérdida, mutación o
alteración de genes que codifican moléculas involucradas en la regulación del
crecimiento y diferenciación es el hecho inicial que determina el desarrollo de una gran
parte de las neoplasias. Ejemplos de esto lo constituyen la activación de genes
promotores del crecimiento, protooncogenes y la inactivación de genes supresores de
tumores. Hay componentes hereditarios que afectan de diversas formas según el tipo de
neoplasia. De todas maneras, la mayoría de las mutaciones relacionadas con el cáncer
son somáticas, es decir, exclusivas de uno o más tejidos, sin afectar a la línea germinal.
Por lo tanto, ciertos factores ambientales como carcinógenos químicos o radiaciones
pueden ejercer su influencia. También se ha establecido que, en la mayoría de los casos,
el cáncer es una enfermedad multigénica y que, más de un gen debe estar alterado para
que se produzca la transformación maligna y se establezca un crecimiento invasivo.
La terapia génica puede definirse como la modalidad terapéutica en la cual el
material genético es introducido dentro de las células para modificar la función de la
misma. Las enfermedades que resultan de la herencia de un solo gen mutado,
teóricamente, presentan la mayor posibilidad para una terapia génica exitosa. Pero el
cáncer resulta de una acumulación de mutaciones. Algunas pueden ser heredadas en la
línea germinal y otras son adquiridas en oncogenes y genes supresores tumorales. De
todas maneras, todavía no han sido identificadas todas las alteraciones genéticas
responsables en el desarrollo de las neoplasias, por lo tanto el reemplazo de los genes
alterados para tratar al cáncer parece ser una tarea desalentadora, por el momento.
Revisaremos las estrategias actuales en la terapia génica de los tumores
endocrinos. Estos enfoques están basados en estudios sobre modelos in vitro o modelos
5
animales. Aunque la mayoría se encuentra en fase pre-clínica, algunos ya se emplean en
ensayos clínicos.
En primera instancia, analizaremos cuáles son los vehículos que permiten la entrada de
estos genes dentro de las células tumorales, posteriormente veremos cuáles son las
diferentes estrategias para lograr una terapia génica exitosa, para finalmente detenernos
en los resultados de los diferentes ensayos, de acuerdo a las distintas neoplasias
endocrinas.
6
CAPITULO 1: SISTEMA DE VECTORES PARA TERAPIA GENICA:
En la Tabla I se describen los vehículos con las ventajas relativas y desventajas
de cada sistema. Es necesario aclarar que cada sistema puede ser elegido según el tipo
de tumor a tratar, como veremos más adelante.
SISTEMAS VIRALES
Retrovirus:
Estos vectores son virus de cadena simple de ARN incompetentes para la
replicación, que se producen mediante el reemplazo de genes críticos retrovirales para la
replicación ( gag, pol, env) por los genes terapéuticos deseados para la transferencia.
Para obtener altos títulos de vectores retrovirales para aplicaciones experimentales o
terapéuticas en humanos, el vector ha sido diseñado por ingeniería genética para
producir proteínas virales que son necesarias para impedir la formación de partículas
replicativas-defectivas virales. Como consecuencia se producen vectores que pueden
transmitir genes terapéuticos pero que no pueden replicarse en las células blanco.
Desde su primera descripción
(1),
los vectores retrovirales se han transformado
en el sistema más utilizado en protocolos de investigación.
El genoma retroviral contiene aproximadamente 10000 pares de bases ( 10 Kb) de
ADN. La integración estable de los genes transportados por el retrovirus en el genoma
de la célula huésped resulta en una expresión a largo plazo, excediendo un año en
algunas publicaciones
(2).
Los vectores retrovirales se traducen solo en células que se
encuentran en división, lo que los hace útiles para el tratamiento de las neoplasias.
7
El vector retroviral más comúnmente usado es el virus de la leucemia murina Moloney
(Mo-MLV)
(3).
Después de que el mismo se une a su receptor extracelular (Fig.1), se
produce la internalización y permite la liberación del cápside-core en el citoplasma; una
vez ahí, la cadena simple de ARN viral es transcripta en forma reversa en una doble
cadena de ADN proviral, finalmente es transportado al núcleo donde se integra de
manera aleatoria al genoma celular.
Hay que considerar algunas características antes de seleccionar a un retrovirus para
terapia génica. Primero, la integración del vector en el genoma de la célula huésped es
un proceso que sucede al azar. De acuerdo a esto, esta inserción aleatoria podría resultar
en una mutagénesis tras la inserción que pudiera producir la activación de oncogenes o
la inactivación de genes supresores de tumores. De todas maneras, hasta el momento, no
existen publicaciones de transformación maligna como consecuencia del uso de estos
vectores en humanos. Segundo, la producción a gran escala de vectores retrovirales
necesaria para el tratamiento in vivo de tumores sólidos, podría resultar en la generación
de retrovirus con capacidad de replicación o infección.
Los lentivirus son retrovirus complejos que tienen la capacidad de infectar y
expresar sus genes en células mitóticas y post-mitóticas. El más conocido es el virus de
la inmunodeficiencia humana (VIH). Luego de la extracción de las partículas infectantes
y replicativas este vector derivado es transfectado
(4).
El sistema de vectores lentivirales
tiene todas las ventajas del Mo-MLV pero además posee la habilidad de transfectar
células pos mitóticas, como es el caso de las neuronas (5,6).
Adenovirus (AV):
El uso de vectores adenovirales ha presentado un crecimiento importante en los
últimos años debido a: (i) su gran capacidad para transportar grandes cantidades de
8
ADN, (ii) la posibilidad de lograr transferencias in vivo en una amplia variedad de
células, ya sean benignas
(7-9)
o malignas
(10,11),
(iii) la habilidad del adenovirus para
infectar células que se dividen y también a las que no lo hacen y (iv) la facilidad en la
producción del vector.
Los AV son virus de doble cadena de ADN que muestran tropismo para el epitelio
respiratorio, la córnea y el tracto gastrointestinal. Luego de la transfección, la expresión
del gen decrece rápidamente, en general en no más de 4 semanas. Además, estos virus
no se integran al genoma de la célula blanco (Fig. 2). El proceso de entrada del virus a
la célula es iniciado por su unión a una proteína de membrana denominada receptor de
cocksakie y AV (CAR)
(12).
Posteriormente, se produce la internalización al citoplasma.
Una disminución progresiva en el pH del endosoma causa un cambio conformacional de
las proteínas de la cápside del virión y esto resulta en la liberación de la cápside viral en
el citoplasma. De ahí, la cápside sigue su camino hasta el núcleo en dónde comienza la
replicación.
Unas de las desventajas de los AV es que estos vectores son altamente inmunogénicos
(13),
lo que hace que su nueva administración sea menos efectiva a medida que se
desarrolla esta respuesta inmune. Actualmente, se han desarrollado nuevos vectores
adenovirales que resultan menos inmunogénicos (14).
Los AV han sido usados en forma experimental para el tratamiento de una gran variedad
de tumores endocrinos. Por ejemplo, se ha demostrado su habilidad para transfectar
células hipofisarias normales y neoplásicas
(15),
y se ha utilizado un AV expresando la
proteína Rb para el tratamiento in vivo de tumores hipofisarios en ratones Rb +/- (16).
Así también, se pudo demostrar la utilidad de este vector para el tratamiento in vitro de
líneas celulares de carcinoma medular tiroideo
(17)
y carcinoma de próstata
(18),
entre
otros.
9
Por lo tanto, los vectores adenovirales tienen muchas ventajas, dentro de las que se
incluyen: la posibilidad de infectar una gran variedad de células, infectar células en
división y células que no se dividen, alta eficiencia de transfección, ausencia de
integración al genoma celular del huésped y fácil manipulación. Las desventajas son: el
corto tiempo de duración de la expresión transgénica y la inmunogenicidad (Tabla I).
Virus Herpes Simplex:
Los virus herpes poseen varias propiedades biológicas interesantes, incluyendo
la capacidad de causar una variedad de infecciones clínicas, permanecer latentes en
tejidos específicos y de ser reactivados en el sitio de infección original. Hay más de 80
miembros de la familia herpesvirus que incluyen el virus herpes simplex tipo 1 (VHS1), tipo 2 (VHS-2) y varicela-zóster. La mayoría de los vectores para terapia génica han
sido desarrollado de cadenas de VHS-1. Este es un virus encapsulado de doble cadena
de ADN con un genoma de 152 Kb que codifica para más de 80 genes (19).
Una de las propiedades de estos virus que los hace útiles para la terapia génica es la
expresión de la enzima timidina kinasa (TK). Esta enzima monofosforila a la prodroga
ganciclovir (GCV), que luego continua siendo monofosforilada por las enzimas
celulares a GCV trifosfato, el metabolito activo que inhibe la síntesis de ADN
(20).
El
GCV es una prodroga no tóxica para las células de los mamíferos, a menos que estas
expresen al gen TK del VHS-1. La transfección de genes "suicidas" VHS1-TK dentro
de las células tumorales seguido por el tratamiento con esta prodroga, es otra de las
estrategias usadas para el tratamiento de tumores endocrinos, como veremos más
adelante.
El VHS-1 expresa a la enzima TK durante su ciclo replicativo y permite la actividad
antitumoral tras la adición de GCV (Fig. 3). Esta terapia "suicida" tiene otra
10
característica que la convierte en una opción interesante al momento de elegir un vector
y es el hecho del denominado “efecto espectador” (bystander effect) (21), por el cual aún
las células tumorales vecinas que no fueron transfectadas con el virus mueren tras la
administración del GCV.
La exposición a esta droga, luego de la trasducción celular con el gen VHS1-TK resulta
en la monofosforilación en células que expresan el gen viral. En contraste, la TK
endógena no fosforila al GCV. La exposición de las células huésped a esta droga
conduce a su muerte y el transporte de los metabolitos tóxicos de la prodroga a través de
las uniones estrechas, resulta en la muerte de células adyacentes mediada por el "efecto
espectador"( Fig. 3).
Por otro lado, la clave para lograr una terapia génica "suicida" exitosa es
restringir la expresión del gen a determinadas poblaciones celulares a través del uso de
promotores específicos, como veremos mas adelante. Esto es muy importante, ya sea,
en el tratamiento de una enfermedad sistémica, como por ejemplo el cáncer metastático,
y en el tratamiento local, evitando la expresión de la enzima TK al mínimo en las
células no tumorales. Varios tipos específicos celulares se han explorado usando este
enfoque, incluyendo el uso de antígeno carcinoembrionario para el cáncer de colon
el antígeno prostático específico para el cáncer de próstata
carcinoma de mama
(24),
(23),
(22),
el DF3/MUC1 en el
la scc/11Bhidroxilasa en carcinoma adrenal
(25),
y el promotor
de TG en cáncer tiroideo (26).
Todas estas propiedades biológicas del VHS1-TK, así como el potencial para poder
planear distintos enfoques según el tipo tumoral, hacen de este virus un vector ideal para
la terapia génica.
Vaccinia virus:
11
El virus vaccinia pertenece al grupo poxvirus. Se aisló originalmente de un
caballo. Al igual que el VHS, posee una gran cadena doble de ADN que contiene 186
Kb. Se replica en células en división y en las que no lo hacen y su acción deletérea se
produce luego de la replicación en el citoplasma de las células infectadas,
permaneciendo en ese lugar hasta que la célula es destruida. Por lo tanto hay escaso
riesgo de recombinación de su material genético con el de la célula blanco.
El virus vaccinia es un buen candidato para terapia génica debido a que: i) es de muy
simple construcción; ii) infecta a una gran variedad de células y; iii) posee una alta
habilidad para producir altos títulos virales. Este virus ha sido usado con éxito en
experimentos in vitro para tratamiento de melanomas (30) y cáncer de colon (31).
Virus adeno-asociados:
Estos son virus pequeños, lineales, de cadena simple de ADN, que contienen
escasos genes virales, resultando en la dependencia de otros virus "adyuvantes" como
adenovirus, virus vaccinia o herpesvirus, que le proveen las proteínas requeridas para
completar su ciclo celular (Fig. 4). En forma similar a lo que sucede con los retrovirus,
se integran en el genoma de la célula huésped, pero esta integración difiere en 2 puntos
específicos: i) los virus adeno-asociados son integrados en el cromosoma 19 en un
proceso no aleatorio, por lo tanto, esto reduce el riesgo de mutagénesis insercional
comparado con los retrovirus, ii) estos vectores pierden su habilidad de integrarse con el
tiempo, pero continúan expresando el transgénico desde una localización cromosómica
por hasta 10 meses.
La versatilidad que presentan estos vectores para la terapia génica del cáncer fue
demostrada recientemente por el desarrollo de virus específicos que expresan a la VHSTK en células que producen alfafetoproteína (29).
12
SISTEMAS NO VIRALES:
Liposomas:
Al mezclar una solución lipídica con un ADN plasmídico, esto resulta en la
internalización del ADN en una bi-capa lipídica y en la formación de un liposoma, que
es capaz de transportar el ADN a una variedad de tipos celulares. Los liposomas llevan
el ADN al citoplasma, a través de la fusión de su membrana con la de la célula blanco.
Finalmente el ADN plasmídico sigue una localización nuclear donde se expresa de
manera transitoria. La transferencia de genes por liposomas es menos eficiente que la
que ocurre con los retrovirus y además no es específica. Varios intentos de mejorar la
especificidad de los liposomas han incluido el uso de glucolípidos que tienen una
dirección específica hacia el hepatocito
(30)
y el uso de liposomas catiónicos que están
ligados a anticuerpos monoclonales específicos (31).
ADN desnudo:
Wolff y col.
(32)
fueron los primeros autores en demostrar que los genes pueden
ser expresados a nivel celular, luego de la inyección directa dentro del músculo
esquelético. Aunque el ADN plasmídico no se integra en el genoma del huésped, la
expresión del transgénico puede continuar por mucho tiempo (33).
Se han sugerido varias posibilidades para incrementar la eficiencia de la transferencia
génica vía utilización de ADN desnudo, entre las que se incluye la electroporación
(34).
Esto permite que el ADN penetre directamente la membrana celular y evite la
degradación enzimática lisosómica. Recientemente, se demostró que los polímeros que
actúan débilmente con el ADN, pueden mejorar la eficiencia de transferencia génica
luego de la inyección directa intramuscular (35).
13
Estos polímeros protegerían al ADN de la degradación enzimática y podrían servir
como un sistema de depósito a partir del cual se liberaran en un período prolongado.
TRANSCRIPCION SELECTIVA (“transcriptional targeting”)
El principio del “transcriptional targeting” es que ciertos promotores pueden
restringir la expresión génica a una población de células en particular, por lo tanto
usando este enfoque, el transporte de genes desde un vector viral puede ser diseminado
pero la expresión génica ocurrirá solo en un tipo celular predeterminado, debido a un
control ejercido a nivel transcripcional. Se han usado promotores específicos con
vectores adenovirales para guiar la expresión en determinadas células de la glándula
pituitaria, usando al promotor de la PRL (36,37), o al promotor de GH (38).
Otros promotores utilizados para terapia génica hipofisaria fueron el de la proopiomelanocortina (39), el de la tirotrofina 
(40)
o el del receptor de GnRH
(41).
También
este enfoque ha sido usado para la terapia de tumores pancreáticos con promotores de
somatostatina
(42),
amilasa
(43)
y de proglucagon
(44)
y para el tratamiento de tumores
adrenales malignos (promotor scc/11B Hidroxilasa)(25) o tiroideos (promotor de TG)
(26).
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CAPITULO 2: ESTRATEGIAS PARA LA TERAPIA GENICA:
Hemos hablado previamente de los diferentes vectores para la terapia génica.
Ahora haremos una revisión de los diferentes enfoques terapéuticos usados para el
tratamiento de tumores endocrinos, que pueden ser divididos en 4 categorías
(45,46)
(Tabla II): i) transferencia de genes con efecto directo antitumoral (incluyendo
oligonucleótidos antisense o ribozimas para inhibir oncogenes, introducción de genes
supresores de tumores, o de genes con efecto antiangiogénico); ii) transferencia de
genes que activan prodrogas tóxicas ( referida previamente); iii) transferencia de genes
que incrementan la respuesta inmune contra el cáncer ( ya sea por modificaciones
genéticas de las células tumorales o a través de células inmunes efectoras) y, finalmente,
iv) transferencia de genes que disminuyen la toxicidad de la quimioterapia, tal como el
gen de resistencia a multidrogas MDR1.
Terapia génica correctiva:
La mayoría de las anormalidades endocrinas consisten en la pérdida de genes
supresores de tumores o en la activación de protooncogenes. Los genes supresores de
tumores regulan la transcripción y proliferación celular, y es necesaria la inactivación de
ambas copias del gen para que aparezca una proliferación celular descontrolada.
Entonces, el agregado de una copia correcta del gen supresor de tumor en células con
una pérdida de función homocigota podría restaurar un crecimiento normal o podría
inducir a la apoptosis a las células tumorales. Por el contrario, sólo una mutación, es
decir heterocigota de un protooncogen, es suficiente para la transformación maligna de
una célula. Los oligonucleótidos antisense, las ribozimas y los anticuerpos
intracelulares de cadena simple se pueden usar para disminuir la expresión de
oncogenes. La terapia génica antisense con el uso de oligonucleótidos produce una
15
supresión de la expresión de genes dañinos. Estos oligonucleótidos antisense son
pequeñas cadenas de ADN (no mayor a 20 nucleótidos) o ADN modificado que
contiene una secuencia complementaria a un ARN blanco. Al unirse al ARN
(annealing), interfiere con su transporte, corte (splicing), y traslación. En algunos casos
esta unión forma un sustrato para las ARNasas celulares. Para la introducción de estos
oligonucleótidos se han usado vectores virales y no virales.
La inhibición de ciertos genes blanco también se puede llevar a cabo con las ribozimas.
Estas son moléculas catalíticas del ARN que reconocen su ARN blanco en una
secuencia específica y producen la lisis de la cadena de ARN. Algunos tumores, tales
como los de mama y próstata, han sido tratados usando oligonucleótidos antisense o
ribozimas. Por ejemplo, se sabe que los factores de crecimiento insulíno-símiles son
factores mitógenos importantes para una variedad de tumores endocrinos y no
endocrinos
(47).
Se ha usado con éxito una estrategia antisense del receptor de IGF1, en
líneas celulares de carcinoma de mama (48) y próstata (49), y también se los ha usado para
escindir el ARNm del receptor de andrógenos y estrógenos
(50),
los cuáles juegan un rol
preponderante en el cáncer de próstata y mama, respectivamente.
El ciclo celular posee varios genes blanco para la terapia génica correctiva. Ejemplos de
esto lo constituye el gen supresor de tumor p53 que se encuentra mutado en una gran
variedad de tumores, fundamentalmente aquellos con comportamiento agresivo como el
carcinoma anaplásico de tiroides
(51).
La re-introducción de una copia normal en líneas
celulares de carcinoma anaplásico de tiroides ha sido utilizado con éxito por varios
grupos y la combinación de la funcionalidad de esta proteína anteriormente ausente en
estas líneas, asociada a quimioterapia y radioterapia resultó en un efecto citotóxico
incrementado para estos tumores (52-54).
16
Otro gen supresor de tumor del ciclo celular que es considerado como un blanco para
esta terapia es el Rb, que codifica para la proteína p105Rb, que es uno de los
reguladores más críticos del ciclo celular. Cuando la proteína del Rb no está fosforilada,
es responsable de la detención del ciclo por inhibición de la actividad de la familia de
factores de transcripción E2F. La activación del ciclo requiere de la inactivación del Rb
a través de la fosforilación por kinasas ciclino dependientes. El Rb está inactivo en los
retinoblastomas, en el 90 % de los carcinomas de células pequeñas de pulmón, en los
carcinomas paratiroideos y en una variedad de tumores malignos. Por ejemplo, los
ratones con una única copia normal del Rb (rb ) desarrollan tumores melanotropos del
lóbulo intermedio hipofisario y en algunos casos, carcinoma medular tiroideo e
hiperplasia de la médula adrenal
(55).
La transferencia intratumoral de Rb en estos
ratones determinó una disminución en la proliferación celular tumoral hipofisaria con
restablecimiento de la inervación por las neuronas dopaminérgicas reguladoras del
crecimiento, asociado a una mayor sobrevida comparada con los controles no
transfectados (16).
Terapia génica antiangiogénica:
El crecimiento tumoral y de las metástasis es dependiente de la habilidad de las
células tumorales para establecer un aflujo sanguíneo a través del proceso de
neoangiogénesis. Este complejo proceso está estimulado por numerosos factores, como
por ejemplo: el factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), el factor de
crecimiento  derivado de las plaquetas, el factor de crecimiento fibroblástico básico
(bFGF), el factor de crecimiento epidérmico (EGF) y la interleukina 8 (IL-8); otros
factores actúan como inhibidores de la angiogénesis, ejemplo: trombospondina 1, factor
plaquetario 4 (FP4), angiostatina y endostatina.
17
La terapia antiangiogénica considera como blanco a diferentes pasos del proceso de
angiogénesis, ya sea a través de la inhibición de la expresión de moléculas
angiogénicas, por medio de la
sobreexpresión
de moléculas antiangiogénicas o
mediante destrucción de las células endoteliales tumorales. Esto último puede conducir
a la regresión tumoral debido a apoptosis (56).
Los ensayos actuales están dirigidos principalmente a: i) suprimir la expresión de
factores angiogénicos con oligonucleótidos antisense o ribozimas y ii) transferir genes
que alteren a los receptores para los factores angiogénicos o que codifiquen para
moléculas antiangiogénicas
(57).
Sin embargo, el uso de esta modalidad, a menudo
resulta en una supresión incompleta del crecimiento tumoral y de las metástasis. Esto
probablemente podría solucionarse si se utilizara una terapia génica combinada
(antiangiogénica asociada a terapia "suicida").
En los tumores endocrinos, la angiogénesis demostró jugar un rol principal en la
proliferación celular y en la secreción hormonal, así, las neoplasias tiroideas evidencian
un incremento en la expresión de factores angiogénicos, incluyendo el VEGF
(58),
y la
angiopoyetina 2, y de receptores tirosina kinasa. La sobreexpresión de angiopoyetina 2
y de VEGF se asocia con una progresión de los tumores tiroideos desde una fase
prevascular hacia una netamente vascular. Más aún, los carcinomas tiroideos con
diseminación linfática, evidencian una mayor expresión de VEGF y los que presentan
un comportamiento más agresivo, muestran una disminución en la producción de
trombospondina 1 (59).
La supresión antisense de la expresión de VEGF en un carcinoma anaplásico tiroideo
condujo al desarrollo de un tumor pequeño y pobremente vascularizado in vivo (60).
Otros tumores endocrinos pueden resultar en blancos ideales para la terapia
antiangiogénica. Por ejemplo, la angiogénesis juega un rol principal en el desarrollo de
18
la glándula adrenal y en la proliferación de tumores adrenocorticales
(61)
y los
feocromocitomas malignos, asi como los paragangliomas, muestran un incremento de la
microvasculatura intratumoral
(62).
Estos tumores podrían ser, entonces, candidatos para
este tipo de tratamiento, aunque no hay trabajos hasta el momento que demuestren esta
hipótesis.
Terapia génica suicida:
Este punto fue desarrollado previamente cuando describimos al vector VHS1TK.
Terapia génica inmunomoduladora:
Uno de los métodos utilizados es la modificación genética de las células
tumorales para que expresen diferentes citokinas (ejemplos: IL-2, IL-12, factor
estimulante de la colonia granulocítica-macrofágica o IFN  ) que son factores
quimiotácticos para las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas
y los macrófagos, y factores activadores de la respuesta inmune por los linfocitos T.
Otro enfoque involucra el uso de vectores que induzcan la expresión de antígenos
asociados a tumores (vacunas). Las vacunas recombinantes pueden ser ADN virales,
bacterianos o ADN "desnudo". Estos últimos, que pueden persistir y expresar genes
codificados durante largos períodos luego de la inyección intramuscular, han
demostrado mediar los dos tipos de respuesta inmune, humoral y celular, contra
determinados productos codificados en los genes (63).
La terapia génica inmunomoduladora demostró resultados interesantes en un modelo de
carcinoma medular tiroideo in vitro e in vivo. La infección in vitro de líneas celulares de
carcinoma medular murino con un vector adenoviral que transportaba al gen IL-2
generó una respuesta inmunológica en el ratón singénico BALB/C. In vivo, la inyección
19
intratumoral del vector adenoviral resultó en el rechazo y/o estabilización de los
tumores, sin toxicidad significante observable en otros órganos (17,64).
Terapia génica combinada:
Esta nueva estrategia, que combina dos modalidades terapéuticas diferentes,
como lo es la terapia "suicida" con la inmunomoduladora, ha sido usada con éxito en
experimentos in vitro en líneas de carcinoma tiroideos. En un póster presentado en el
81er encuentro anual de la Endocrine Society en 1999
(65),
se comunicó el uso del gen
del VHS1-TK asociado al gen de la IL-2 , separados por un sitio de entrada para los
ribozomas que permitiera la expresión simultánea de los 2 genes del mismo transcripto.
Todo esto fue clonado en un vector retroviral. Posteriormente agregaron al mismo, el
gen del promotor de la tiroglobulina (TG) para dirigir la terapia a las células tiroideas en
forma específica. Los resultados in vitro demostraron una muerte selectiva de las células
tiroideas luego del tratamiento de los cultivos con GCV y además hubo un aumento en
la secreción de IL-2 al medio. Este enfoque combinado, empleando citokinas y genes
"suicidas" a nivel intratumoral, parece ejercer un efecto antineoplásico incrementado in
vivo, como fue observado en un modelo de ratón con carcinoma medular tiroideo, al
cual se le inocularon ambos genes (VHS1-TK e IL-2) (66).
20
Capitulo 3: EMPLEO ACTUAL DE LA TERAPIA GENICA EN LOS TUMORES
ENDOCRINOS:
EMPLEO DE TERAPIA GÉNICA EN EL CÁNCER DE TIROIDES:
- Reemplazo del gen supresor de tumor p53:
El p53 es una proteína que, en condiciones normales, actúa como un supresor
tumoral. Se trata de un factor de transcripción que "vigila" la integridad del genoma. Si
el ADN genómico sufre mutaciones, por ejemplo, por efecto de radiaciones ionizantes,
agentes quimioterápicos o hipoxia, el p53 detiene el ciclo celular para permitir la
reparación del ADN dañado. Si el daño es demasiado severo y las alteraciones del ADN
no son posibles de resolver, el p53 induce a la apoptosis para erradicar a la o las células
con alteraciones genómicas para prevenir su proliferación. El p53 es la proteína más
frecuentemente afectada en las neoplasias humanas (en casi el 40 % de los tumores).
Habitualmente un alelo presenta una deleción y el otro se encuentra mutado, lo que
contribuye a la progresión tumoral con malignidad creciente y disminución en la
diferenciación. Esto es aplicable también para el cáncer tiroideo. Este factor de
transcripción se encuentra intacto en la glándula tiroides normal, en las enfermedades
tiroideas benignas o en los carcinomas diferenciados pero hay una alta prevalencia de
mutaciones del p53 en los tumores tiroideos indiferenciados (casi del 80 % para
carcinomas anaplásicos
insular
(67).
(51)
y en cerca del 40% para carcinomas foliculares variedad
Las mutaciones del p53 parecen ser un evento tardío en los carcinomas
tiroideos. Este rol preponderante en la patogénesis de los tumores tiroideos lo ha
transformado en un blanco ideal para la terapia génica. En 2 estudios, en los cuales se
usaron líneas de carcinoma tiroideo con mutaciones del p53, se demostró que la reintroducción del gen normal (wild type) del p53 causó un fenotipo más diferenciado. En
21
estos trabajos se puso en evidencia el incremento de la expresión de marcadores
específicos de diferenciación como la tiroperoxidasa, la TG y el receptor de TSH, todo
esto asociado a una inhibición en la proliferación celular (52,53).
De acuerdo a lo que se sabe con respecto a la función del p53, su re-expresión en un
tumor p53 deficiente podría incrementar la sensibilidad a la radiación o a la
quimioterapia. Narimatsu y col.
(68)
no detectaron un efecto sensibilizante a los
quimioterápicos cisplatino, 5-fluoruracilo y doxorrubicina luego de transfectar una línea
de carcinoma anaplásico. Sin embargo, Nagayama y col. (54) posteriormente evaluaron la
eficacia terapéutica de la transfección mediada por AV del gen p53 en líneas de
carcinoma anaplásico con mutaciones del p53 y observaron que la re-expresión del p53
condujo a la muerte celular por apoptosis. Los estudios in vivo (realizando
xenotransplante de células tumorales a ratones), demostraron un aumento de la muerte
celular tras la administración de doxorrubicina (4 mg/kg, 3 veces por semana). Estos
estudios indican que esta estrategia parece ser un arma eficaz dentro de las opciones
disponibles para terapia génica de estos tumores, particularmente cuando se combina
con quimioterapia.
-
Terapia génica "suicida":
Nishihara y col
(69)
transfectaron 2 líneas celulares de carcinoma tiroideo (WRO
y FRO) con el VHS1-TK bajo el control del promotor del citomegalovirus (CMV),
usando un vector retroviral y observaron una disminución, tiempo y dosis dependiente,
de la sobrevida celular luego del tratamiento con GCV, asociada a un incremento en la
apoptosis. Las dosis bajas de GCV no produjeron daño por sí mismas, pero resultaron
en una sensibilización frente a las radiaciones ionizantes.
Para minimizar los efectos en otros órganos, la actividad enzimática TK debería, como
analizamos previamente, estar circunscripta a los tejidos blanco. Esto se podría lograr
22
realizando la inyección a nivel intratumoral, pero esta estrategia excluiría a las
metástasis diseminadas del efecto citotóxico. Braiden y col.
(70)
usaron un retrovirus
recombinante que transportaba a la TK bajo el control del promotor de la TG. Con este
vector, ellos transfectaron a la línea diferenciada de tirocitos FRTL-5, a la línea celular
maligna derivada de éstas, FRTC, y a la línea de carcinoma anaplásico FRO. Detectaron
un incremento 130 y 160 veces mayor con respecto a la sensibilidad al GCV y, 4 y 27
veces mayor, tras el agregado o la ausencia de TSH en las líneas celulares FRTL-5 y
FRTC, respectivamente. Estas 2 líneas expresaban TG, pero en el caso de la línea FRO
que no lo hace habitualmente, no hubo diferencias significativas en el porcentaje de
sobrevida celular entre las que fueron transfectadas y las que no recibieron la
transfección.
Nagayama y col.
(71)
utilizaron el sistema denominado Cre-loxP, logrando incrementar
la actividad del promotor de la TG. Construyeron AV recombinantes con el gen de la
TK del VHS1 bajo el control del promotor de la TG. Por lo tanto Cre activaba la
transcripción del gen VHS1-TK solamente en las líneas celulares que expresaban TG
(FRTL-5 y FRTC). Esto resultó en un efecto citotóxico, luego del agregado de GCV, in
vitro, aumentado 5 a 10 veces, en comparación con otra construcción que contenía un
AV recombinante con el gen VHS1-TK fusionado al promotor de TG.
Obviamente, este enfoque está limitado a aquellos cánceres que todavía mantienen la
expresión de la TG, (la mayor parte de los cánceres tiroideos, ya que la TG es usada
como un marcador sensible, aún en casos avanzados). De todas maneras, hay que
considerar que la desdiferenciación coincide generalmente con una disminución en la
expresión de factores de transcripción específicos tiroideos y esto reduciría la eficiencia
de la expresión de la TG y de cualquier transgénico controlado por el promotor de la
TG.
23
Recientemente, Zhang y De Groot
(72)
usaron esta estrategia "suicida" en líneas
celulares de carcinoma medular con resultados poco satisfactorios. Ellos relacionan esta
falta de respuesta con esta modalidad terapéutica con la ausencia de efecto bystander
debido a la escasa presencia de uniones estrechas presentes en las células del carcinoma
medular.
-
Inmunoterapia: IL-2 en tumores tiroideos
Aunque los tumores expresan antígenos que pueden desencadenar una respuesta
inmune, a menudo evaden la vigilancia del sistema inmune por una disminución en la
expresión de antígenos de histocompatibilidad clase I y II. Además, esta respuesta
puede estar deprimida como consecuencia de ciertos productos liberados por el mismo
tumor. La IL-2 actúa sobre la proliferación y diferenciación de NK, CD4 y linfocitos T
citotóxicos y la administración sistémica de IL-2 produce inmunidad antitumoral en
modelos animales. Sin embargo, la dosis necesaria para lograr este efecto terapéutico,
frecuentemente, causa efectos indeseables en el ser humano. La administración
intratumoral de la citokina podría proveer concentraciones más altas y evitar este
problema. Alternativamente, el gen de la IL-2 puede ser introducido por medio de
terapia génica, dentro de las células tumorales.
En 2 publicaciones de Zhang y De Groot (17,64), se utilizó este enfoque como una opción
para el tratamiento del carcinoma medular de tiroides. Ellos usaron un AV que
transportaba al gen murino de la IL-2 (IL-2m) bajo el control del promotor del CMV
humano. Estas líneas celulares transfectadas in vitro secretaron cantidades elevadas de
IL-2m. Al inyectar estas líneas celulares por xenotransplante a ratones con carcinoma
medular de tiroides, se observó una importante disminución en el crecimiento tumoral.
La reinyección de las líneas parentales en animales libres de tumor, luego de 60 días, no
mostró producción tumoral, revelando una inmunidad a largo plazo contra las células
24
tumorales. Cuando el AV codificante de IL-2 se inyectó en tumores previamente
generados, se observó una regresión en el 69 % de los tumores "pequeños" (menores a
30 mm3) y una estabilización de los "grandes" tumores (mayores a 30 mm3). Para
evaluar la seguridad del procedimiento, el AV se administró vía endovenosa para
monitorizar los efectos en otros tejidos. La diseminación hacia el hígado determinó una
infiltración linfocítica a nivel sinusoidal, pero esto no afectó los niveles enzimáticos de
GOT y GPT. Dos de 12 animales mostraron signos de necrosis celular en el bazo pero
no hubo alteraciones a nivel pulmonar ni renal.
-
Terapia génica usando el simporter de ioduro/sodio:
Luego de clonar el simporter de Na+/ I - (NIS) (73), se introdujo una nueva clave
para dilucidar la patogénesis de las enfermedades tiroideas, incluyendo la del cáncer de
tiroides. Por ejemplo, la reducción en la expresión y funcionalidad de esta proteína
puede contribuir a la falla en la terapia con radioiodo, debido a una carencia en la
acumulación de I131 en los carcinomas tiroideos avanzados (74).
Shimura y col.
(75)
investigaron si la reexpresión de este transportador en células poco
diferenciadas conduciría a la recaptación de I131 en tumores tiroideos. Ellos
transfectaron una línea celular de carcinoma tiroideo de rata (FRT-Te) con el NIS
intacto y posteriormente realizaron un xenotransplante a nivel subcutáneo en ratas
Fisher. Los tumores resultantes, concentraron el radioiodo 27 veces más que las líneas
parentales. De todas maneras, no se observó un efecto inhibitorio luego del tratamiento
con radioiodo, ya que el volumen tumoral no sufrió variaciones 3 semanas luego de esta
terapia.
También se ha enfatizado en el uso de este simporter para el tratamiento de otros
tumores, es decir, expresión de NIS en líneas celulares que habitualmente no lo hacen,
para poder usar el radioiodo como otra opción terapéutica. Mandel y col.
(76)
25
transfectaron al NIS con el uso de un vector retroviral en líneas celulares humanas de
melanoma, hepatocarcinoma, carcinoma de colon y adenocarcinoma de ovario. Las
células acumularon ioduro, ya sea en cultivo o en tumores que fueron generados por
xenotransplante. Además, demostraron un aumento en la muerte celular luego del
tratamiento con radioiodo en los cultivos, pero no se evaluó la respuesta en los
xenotransplantes.
Debería agregarse que una publicación reciente sugiere que la pérdida de la
captación de radioiodo en los carcinomas tiroideos podría ser secundaria a una
disminución en la transcripción, causada por una metilación aberrante del gen NIS
(77).
Las muestras tumorales no mostraron patentes específicas de metilación en correlación
con una deficiencia en la expresión del ARNm del NIS, pero el tratamiento de 7 líneas
de carcinoma tiroideo con 5-azacitidina o butirato de sodio, considerados como agentes
diferenciantes, restauró la expresión del ARNm del NIS en 4 y aumentó la captación de
I131 en dos de ellas y esto fue debido a una desmetilación del gen NIS. Entonces, la
expresión del NIS y su actividad podrían ser restauradas manipulando la metilación del
ADN, al menos en el contexto del cáncer tiroideo, como otro enfoque terapéutico.
-
Inmunización genética: calcitonina.
Como vimos previamente, es posible generar una respuesta inmune por
medio de la inyección de ADN plasmídico desnudo
(78).
En el cáncer medular de
tiroides, el marcador tumoral calcitonina puede representar un blanco interesante para la
inmunoterapia. Haupt y col.
(79)
desarrollaron una vacuna plasmídica que codificaba la
preprocalcitonina bajo el control del promotor del CMV. Ellos observaron una respuesta
inmune en 4 de 5 animales con carcinoma medular luego de su administración, y la coinyección de factores estimulantes de la colonia granulocítica-macrofágica, incrementó
esta respuesta específica.
26
-
Terapia antisense:
El protooncogen c-myc codifica para una proteína nuclear que actúa como un
factor de transcripción que produce un estímulo mitogénico. Este gen se encuentra
activado de manera constitutiva en una variedad de neoplasias (80).
En el cáncer de tiroides, la sobreexpresión de c-myc parece estar relacionada con un
pronóstico desfavorable y se ha encontrado un incremento de la expresión del ARNm de
c-myc en 7 líneas celulares de neoplasias tiroideas humanas comparado con líneas de
células tiroideas normales
(81).
Estos autores bloquearon la expresión proteica de c-myc
con oligonucleótidos antisense contra la región de iniciación de traslación del ARNm y
observaron una disminución significativa en la tasa de crecimiento de estas líneas
celulares de cáncer tiroideo. Aunque estos experimentos se hicieron primariamente para
clarificar el rol biológico de c-myc, también pueden ser considerados dentro de los
enfoques actuales para la terapia génica del cáncer tiroideo.
27
ESTRATEGIAS DE TERAPIA GENICA PARA EL TRATAMIENTO DE
TUMORES HIPOFISARIOS:
Los tumores hipofisarios constituyen cerca del 10 al 15% de todos los tumores
intracraneanos. Aunque en la mayoría de los casos son considerados como adenomas
benignos, pueden producir anormalidades endocrinas, presentar extensión supraselar, y,
dependiendo de su tamaño, pueden originar oftalmoplejía y otros síntomas
neurológicos. Debido a los progresos recientes en la microcirugía transeptoesfenoidal, al
tratamiento médico y a la radioterapia, la mayoría de estos tumores se han transformado
en fácilmente tratables, con una larga sobrevida o inclusive, la curación definitiva, luego
de estos tratamientos. Sin embargo, en algunos de los tumores de difícil manejo, tales
como los tumores invasivos localmente, endocrinamente activos, solo se ha conseguido
un éxito parcial y, en estos casos, la curación sería imposible de alcanzar. Para estos
tumores, actualmente, se están proponiendo nuevas estrategias, entre las que se incluye
la terapia génica.
- Uso de genes activantes de prodrogas:
Windeatt y col. (82), exploraron la hipótesis de que la transferencia génica usando
vectores adenovirales que expresaran a la TK del VHS1 podría ofrecer una alternativa
terapéutica para el tratamiento de los prolactinomas que no responden al tratamiento
clásico. Para esto, transfectaron por un lado, a células pituitarias (línea secretora de
GH/PRL, GH3) y por el otro trataron in vivo a ratas con hiperplasia prolactínica
inducida por estrógeno-sulpirida, con este vector adenoviral, bajo el control del
promotor proximal del CMV. Así observaron una disminución en los niveles de PRL
28
del orden del 60% en el grupo de ratas tratadas en comparación con un grupo control no
tratado, sin evidenciar efectos deletéreos sobre las otras líneas hipofisarias.
Otros de los enfoques para restringir la expresión génica en un tejido particular,
hace uso de las características peculiares del tejido pituitario, por ejemplo, el gen de la
PRL es un gen singular que se expresa en las células lactotropas hipofisarias y en muy
bajo grado, en un número de tejidos extrahipofisarios. La expresión hipofisaria de
manera casi exclusiva es un ejemplo de regulación por un promotor específico. El
promotor de la PRL tiene un sitio de unión para varios factores de transcripción, entre
ellos, PIT-1
(83).
Esta regulación transcripcional del gen de PRL puede ser explotada
utilizando promotores específicos que dirijan la transfección viral a un subgrupo celular
específico. Así varios grupos han trabajado con estos promotores: Xy y col.
(38)
usaron
promotores específicos de GH humana y realizaron una transfección con un adenovirus
transportando el gen VHS-TK y observaron una expresión elevada del mismo, así como
la muerte celular incrementada luego del agregado de GCV en las células productoras
de GH/PRL (células GH3). Se observó además una persistencia en la expresión viral
por al menos durante 21 días y con relativa baja toxicidad para las células no
hipofisarias o las células pituitarias que no expresaban GH. Por xenotransplante en
ratones, demostraron que la inyección del transgen durante 10 días permitió observar
una marcada reducción del tamaño tumoral (Fig. 6).
Por otro lado, Southgate y col.
(84)
usaron el promotor de la PRL para dirigir la
expresión del mismo sistema viral en líneas celulares prolactotropas in vitro y en
animales con hiperplasia hipofisaria inducida por estrógenos y sulpirida, observando
una disminución del tamaño glandular in vivo y del número de las células lactotropas in
vitro.
- Uso de genes supresores de tumores y genes que regulan el ciclo celular:
29
Como hemos visto previamente, las mutaciones y deleciones del gen supresor de
tumor p53, se asocian con el 40 al 50 % de los cánceres humanos. Sin embargo, hasta el
momento, no se han detectado mutaciones en este gen en adenomas hipofisarios,
carcinomas o sus metástasis
(85).
Por lo tanto, es probable que el p53 no juegue un rol
importante en la tumorigénesis hipofisaria.
Un estudio reciente demostró que las deleciones que afectan a los cromosomas 11q13,
13q12-14 y 10q26 ocurren más frecuentemente en los tumores hipofisarios invasivos
que en los no invasivos
(86),
ocurriendo la primera de éstas en aproximadamente un
30 % de los adenomas pituitarios esporádicos. Esto sugiere que habría una interacción
con genes supresores de tumores que provocaría una progresión tumoral. Una vez
identificados, los mismos serían candidatos ideales para la terapia génica.
El producto del gen Rb regula el ciclo celular y, como previamente vimos, juega un rol
fundamental en la diferenciación celular. Recientemente se demostró que la disrupción
del gen Rb en ratones conduce a una incidencia del 100 % de tumores pituitarios
originados en el lóbulo intermedio de la hipófisis que expresan pro-opiomelanocortina
(55).
No hace mucho tiempo se desarrolló una estrategia de terapia génica, y se la ha
usado in vivo para el tratamiento de estos tumores
(16).
Se utilizaron adenovirus que
codificaban para una copia normal del gen Rb. Se realizó una inyección intratumoral en
ratones Rb+/-. Esto disminuyó la proliferación celular, restableció la inervación por las
neuronas dopaminérgicas que regulan el crecimiento celular, inhibió el crecimiento
tumoral y prolongó la sobrevida de los animales tratados.
-
Factores de crecimiento y sus receptores involucrados en la modulación de la
angiogénesis:
Se ha demostrado que la angiogénesis es un factor fundamental para el
crecimiento de los tumores hipofisarios
(87).
Las estrategias que involucran el uso de
30
genes anti-angiogénicos (como vimos previamente en el apartado de generalidades de
estrategias), pueden proveer una terapia in vivo efectiva, ejemplo: expresión de cDNA
antisense para EGF o VEGF, o la expresión de los mutantes dominantes negativos de
sus receptores respectivos, con buenos resultados para el tratamiento de tumores del
sistema nervioso central.
Por otro lado, el factor de crecimiento nervioso (NGF) es una proteína neurotrófica que
promueve el crecimiento, diferenciación y sobrevida de las neuronas del sistema
nervioso periférico simpático, las neuronas ascendentes colinérgicas y de las células
nerviosas sensoriales derivadas de la cresta neural
(88)..
En un estudio, el mismo grupo
demostró que los prolactinomas humanos que fueron totalmente resistentes a la terapia
farmacológica por carencia de receptores dopaminérgicos D2, expresaban receptores
NGF. Ellos además demostraron que, después de la exposición a este factor, las células
tumorales disminuyeron la velocidad de proliferación, perdieron su capacidad
tumorigénica y re-expresaron el receptor D2
(89).
Estos resultados indican que el
tratamiento a corto plazo con NGF podría inducir la reversión de los prolactinomas
humanos a un estado prolactotropo símil más diferenciado y dopamino- sensible. Este
estudio da la posibilidad de que una terapia génica basada en la liberación de NGF in
situ, pueda restaurar la susceptibilidad de tumores refractarios al tratamiento
convencional con agonistas D2.
31
TERAPIA GENICA EN TUMORES ADRENALES
Chuman y col.
(25)
fueron los primeros investigadores que realizaron
experimentos in vitro construyendo vectores para terapia génica suicida con el VHS1TK con el agregado de diferentes promotores específicos de células adrenales y
aumentaron su actividad y especificidad con agentes que modulan la vía de la 3'5'
adenosina cíclica monofosfato. Una de las características peculiares de las glándulas
adrenales es la expresión del gen CYP 111 ( 11hidroxilasa) que cataliza la conversión
de 11 desoxicorticosterona y 11 desoxicortisol a corticosterona y cortisol,
respectivamente. Aunque el metabolismo esteroideo no es exclusivo de la glándula
suprarrenal, los estudios bioquímicos indican que la actividad de la 11hidroxilasa está
confinada únicamente a la zona fasciculada y reticular de la corteza adrenal. Estos
autores lograron restringir la expresión génica a las células adrenales a través de la
utilización de promotores específicos, por un lado el promotor de la CYP 11 1, al cual
le anexaron otro promotor, el del gen de la cadena lateral de clivaje del colesterol (p450
scc). Trabajaron in vitro sobre 2 líneas celulares de carcinoma adrenal, y demostraron,
en primera instancia, una mayor expresión del VHS1-TK en las células adrenales
comparada con otras 5 líneas de carcinomas no adrenales y posteriormente evaluaron el
efecto de ciertos agentes diferenciantes sobre la expresión del ARNm endógeno y la
actividad del promotor en las células adrenales. Para esto, utilizaron 8 Br AMPc,
forskolin (agonista del AMPc) y estimularon a las células con ACTH (que tiene una
actividad diferenciante de las células adrenocorticales), comparándolos con dos agentes
diferenciantes sin efecto sobre el AMPc (el butirato de sodio y el ácido all-transretinoico) y verificaron los efectos de estos agentes luego de la transfección estable con
el VHS1-TK, analizando la sensibilidad al GCV. Así lograron poner en evidencia que
32
las células adrenales transfectadas con el fragmento scc/ 11/ VHS1-TK fueron capaces
de expresar a la enzima viral, luego del agregado de los agentes diferenciantes que
actúan sobre la vía del AMPc y que estas células eran mucho más sensibles que las
líneas parentales al GCV.
Esos investigadores crearon, entonces, un vector suicida con toxicidad preferencial para
las células adrenocorticales y aumentaron su especificidad y actividad agregando al
VHS1-TK, el promotor CYP 111 asociado al promotor proximal de la scc p450,
incrementando la sensibilidad al GCV agregando agentes diferenciantes ( 8Br AMPc,
forskolin o ACTH). Se sugiere que el uso de esta estrategia podría ser efectivo para el
tratamiento de otros tumores endocrinos con propiedades únicas como lo son los
originados en las células adrenales.
33
CONCLUSIONES:
Desde que la terapia génica fue usada por primera vez en 1990 para la
deficiencia de adenosina deaminasa, más de 160 estudios han sido registrados
por el National Institutes of Health de Washington, USA, pero el éxito actual de
estos procedimientos parece ser un poco desalentador. De todas maneras, la
investigación en este campo está avanzando rápidamente. Los proyectos actuales
están enfocados en desarrollar adyuvantes cada vez más eficientes, virales o no
virales, y en modificar a los antígenos virales para lograr una infección más
eficiente o incrementar la especificidad en la transducción de genes exógenos
utilizando promotores específicos, como hemos visto detalladamente en los
párrafos de esta monografía. Otras perspectivas están apareciendo, considerando
la posibilidad de utilizar dos modalidades combinadas para lograr mayor
efectividad.
Actualmente, están desarrollándose múltiples opciones con un potencial
creciente y es muy probable, así como lo considera MG Castro, una de las
investigadoras que más ha trabajado en terapia génica hipofisaria
(90),
que en no
más de 5 a 10 años los pacientes podrán tener los beneficios de esta nueva
modalidad terapéutica que conlleva un cambio radical en lo que hasta el
momento significa el tratamiento de los tumores endocrinos.
34
Tabla I: VECTORES VIRALES PARA LA TERAPIA GÉNICA TUMORAL.
Vector ( tamaño)
Retrovirus
( 10 kb)
Ventajas
Desventajas
genoma pequeño
integración estable
transferencia génica eficiente
no tóxica para las células
infecta células en división
requiere células en división
transfiere solo secuencias
pequeñas
bajos títulos
expresión transitoria
mutagenesis tras inserción
integración aleatoria
labilidad in vivo
títulos virales elevados
transferencia génica muy
eficiente
no tóxica para las células
infecta células en división y
células que no se dividen
expresión transitoria
transfiere solo secuencias
pequeñas
inmunogénica
Virus adenoAsociados
(5 kb)
genoma pequeño
se integra en el cromosoma 19
trasferencia génica eficiente
infecta células en división y
células que no se dividen
transfiere solo secuencias
pequeñas
bajos títulos
seguridad?
Poxvirus
(vaccinia)
(187 kb)
expresión génica transitoria
transferencia y expresión
génica altamente eficiente
muy inmunogénico
segura en pacientes
inmunosuprimidos
Virus herpes
Simplex
(152 kb)
infecta células en división y
células que no se dividen
neurotrófico
altos títulos virales
transgen de gran tamaño
potencial para expresión
prolongada
toxicidad relacionada a
infecciones líticas
seguridad?
Liposomas
sintéticos
tamaño no limitado
ineficiencia en la
transferencia
ADN "desnudo"
expresión transitoria
Poca experiencia
ineficiencia en la
transferencia
Adenovirus
(36 kb)
35
Tabla II: ESTRATEGIAS PARA LA TERAPIA GENICA
1.
2.
3.
4.
5.
Terapia génica correctiva
a. Inactivación de oncogenes por antisense y ribozimas
b. Introducción de genes supresores tumorales
Terapia génica antiangiogénica
Terapia génica "suicida"
Terapia génica inmunomoduladora
a. Inmunización activa (modificación de las células tumorales
para incrementar la inmunogenicidad)
b. Modificación genética de las células efectoras inmunes
Genes de resistencia a drogas para disminuir la toxicidad de la
quimioterapia
36
Retrovirus
Interacción virus-receptor
Internalización
U3
ARN VIRAL
LTR
LTR
ADN PROVIRAL
LTR
LTR
U5
Sin Cápside
Integración
NÚCLEO
PROVIRUS INTEGRADO
LTR
LTR
Procesamiento
del genoma viral
U5
Transcripción
Traslación
U3
Brote
Figura 1: Representación esquemática del ciclo de vida de los retrovirus, mostrando la
internalización, transcripción reversa, integración, formación de nuevo virus y liberación. U5:
extremo 5’ , U3: extremo 3’, LTR: repeticiones terminales (éstas poseen un rol importante en el
control transcripcional y en la integración) Adaptado de Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103118.
37
Adenovirus
Interacción virus-receptor/integrina
Liberación del endosoma
dependiente de pH
Internalización
CITOPLASMA
NÚCLEO
Replicación del ADN
Genoma ADN episomal
Transcripción
Transcriptos de ARNm viral
Traslación
Liberación lítica
desde las células
Productos de genes virales
Figura 2: Ciclo de vida del adenovirus, mostrando la internalización, replicación, armado viral y
liberación. Adaptado de Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103-118.
38
Núcleo
A
Célula de glioma
sin división
Célula de glioma
en división
Neurona
Vector para
terapia génica
VHS-TK
B




Timidinakinasa
Ganciclovir
C




Metabolitos
de ganciclovir
"BYSTANDER
EFFECT"
+


+
+
+

+
+

+
+

MUERTE
CELULAR




+
+



No efecto
Uniones
estrechas
Figura 3: Terapia génica "suicida". (A) Las células tumorales son trasducidas con un vector que transporta al
gen de la timidina kinasa del virus herpes simplex (VHS-TK). (B) La expresión trangénica en las células
afectadas resulta en la síntesis de la enzima timidina kinasa, una kinasa exógena con alta afinidad para la
droga ganciclovir. (C) La exposición de las células huéspedes al ganciclovir conduce a la fosforilación de la
droga, dando origen a varios metabolitos tóxicos en las células que expresan el gen VHS-TK, determinando
la muerte celular. El transporte de los metabolitos fosforilados tóxicos a través de las uniones estrechas
conduce a la muerte celular de las células adyacentes por el efecto espectador ("bystander effect"). Adaptado de
Cusack JC et al. Surg Oncol Clin of North Am 7: 452. 1998
39
A.
B.
Interacción
virus-receptor/integrina
Unidad de transcripción
ITR
ITR
Rep
Cap
Internalización
CITOPLASMA
Translocación
nuclear
Adenovirus
adyuvante
NÚCLEO
ADN dc
Integrado al
genoma
Célula 293
Adenovirus
DR
Adenovirus
FASE LATENTE
Adenovirus
adyuvante
Genoma adenoviral
Genoma Virus
Replicación
Replicación del
ADN
Adeno-asociado
Stock mezcla de AV adyuvante y
Virus adeno-asociado
Calor a 56 ºC
Transcripción
Armado
viral
Transcriptos de ARNm
AV y VAA
Traslación
Centrifugación
Liberación
lítica desde
las células
Productos de genes virales
FASE DE RESCATE
AAVr
Figura 4: (A) Ciclo de vida de los virus adeno-asociados (AAV). Luego de la infección de la célula blanco se produce
una latencia. Los viriones AAV son rescatados luego de la infección subsiguiente con un adenovirus adyuvante (AVA), el
cual provee las secuencias necesarias para la replicación. (B) Representación esquemática de la producción de AAV
recombinantes (AAVr). Las células permisivas son co-transfectadas con un plásmido que contiene a la unidad de
transcripción (en verde). La infección posterior con un AVA posibilita el rescate de los viriones de AAVr junto con el
AVA. Finalmente, estos pueden ser separados, calentando el cultivo a 56ºC y centrifugando posteriormente. Adaptado de
Stone D et al. Journal of Endocrinology 2000 164:103-118
40
A
B
Figura 8: A. Inyección de vectores adenovirales dentro de las células tumorales GH3 en ratones. Se inyectaron
adenovirus que transportaban el gen de la timidina kinasa y adenovirus sin este gen y se trató a los ratones con
ganciclovir (100 mg/kg, parenteral, una vez al día durante 10 días). Los tumores escindidos se observan en el panel
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