IV. CENTRIFUGACION

IV. CENTRIFUGACION
Técnicas de separación de partículas. Base : distinta velocidad de desplazamiento de las partículas en un
medio líquido al ser sometidas a un campo centrífugo.
COEFICIENTE DE SEDIMENTACIÓN: velocidad a la que se desplaza una partícula en el campo centrífugo
unidad (1.g)
d2 (p − m)
s=.g
18.
d2: volumen de la partícula p: densidad de la partícula
m : densidad del medio g: fuerza centrifuga relativa : la viscosidad s: velocidad sedimentación
Dimensiones: de tiempo a pesar de ser una vel, porque varia en f(x)del medio, el caso de
macromoléculas :valores del orden de 10−13 segundos ! el Svedberg, símbolo S, 1S = 10−13 segundos.
• Coeficiente de sedimentación : variable según condiciones experimentales ! s de la partícula en un
medio estándar ! agua pura a 20ºC ! s 20,w
Información obtenida con s :
Caracterizar a la partícula y obtener información sobre su tamaño, densidad y forma. Conocer su
comportamiento en centrifugación ! facilita el diseño de métodos para su aislamiento.
INSTRUMENTACIÓN: centrifuga ,tipos en f(x) velocidad:
1.− De baja velocidad, de sobremesa o clínicas: pequeñas, sin refrigeración, máxima velocidad : 5.000 rpm.
Útil : partículas grandes (células, precipitados de sales insolubles, etc.)
Micrófugas : variante de las anteriores. Velocidades altas : > de 10.000 rpm y tubos muy cortos−>volúmenes
muy peq.(eppendorf −>+ velocidad) Motor crea la fuerza centrífuga, está acoplado al rotor q tiene celdillas
donde se coloca la muestra en tubos.
2.− De alta velocidad: velocidad máxima : 18.000 − 25.000 rpm, refrigeradas para evitar el calentamiento del
rotor por rozamiento con el aire , algunas con sistemas de vacío, para controlar mejor la tº, porque evita el
rozamiento. Útil : fracciones celulares.
Insuficientes : ribosomas, virus, macromoléculas, pequeño tamaño.
3.− Ultracentrífugas: velocidad máxima : 50.000 − 80.000 rpm , sistemas auxiliares : sistema de refrigeración,
sistema de alto vacío (obligatorio), los tubos tienen q estar perfectamente balanceados.
Tipos :
• Analíticas : obtención datos precisos propiedades de sedimentación (s, PM).
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• Preparativas :aislamiento de partículas de bajo S (microsomas, virus, macromoléculas), estimaciones
cuantitativas de S, datos obtenidos no tan precisos
Rotores: la pieza q sufre el giro y sobre la cual colocamos la muestra. Tienen que ser materiales ligeros y
resistentes a las altas velocidades. La mayoría son aleaciones de Al, problema q tiene una vida media corta, se
corroe. Alternativa Titanio, problema es caro, o fibra de carbón, son ligeros, duraderos y caros. tipos:
1.−oscilantes, flotantes o basculantes: las celdillas no están ancladas de
2.−de ángulo fijo: celdillas con una inclinación.
3.−verticales: rotores macizos con celdillas esculpidas paralelas al eje.
Tubos: condiciones : inertes, q no interaccionen con la muestra y resistentes para q no se deforme a altas
velocidades.
Elección depende : tipo de rotor, tipo de muestra, volumen y tipo de fraccionamiento.
Materiales :
Vidrio: ventaja es transparente.
• Inerte, el AND se pega a sus paredes
• Hasta 3000 g, a más se rompen
• Vidrio Corex : hasta 25.000 g
Soluciones
solventes
dietilpirocarbonato
fenol
alcalinas
Policarbonato
S
S
S
S
R
R
R
S
R
R
R
R
Plásticos, transparen
Polisulfano
No muy trasparente
Polipropileno y
polialomero
eppendorf
S: sensible R: resistente
TIPOS DE CENTRIFUGACION:
1.−C. DIFERENCIAL:
La muestra se distribuye homogénea− por todo el tubo. Separación de las partículas en función de su s.
Capacidad de separación pobre, ya q como se distribuyen por todo el tubo en el pellet habrá de todas las
partículas, abundaran las de mayor s −>no hay pureza.
Útil : aislamiento de células y orgánulos subcelulares
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Para evitar la baja resolución podemos colocar la muestra en una banda estrecha, así todas las partículas
parten de un mismo pto−> fraccionamiento. Se pueden producir corrientes de convección , reorganización del
líquido −> evita usando gradientes de densidad.
2.− C. EN GRADIENTE DE DENSIDAD:
Muestra : parte superior como una fina banda. Función del gradiente : estabilizar el medio, va de la parte
superior con la d min hasta el fondo con la d max −>variación gradual de la densidad en el medio. Separación
de los componentes de la muestra en bandas o zonas
3.− C. ZONAL EN GRADIENTE DE DENSIDAD:
El valor de densidad de las partículas, no está incluido en el gradiente de densidad empleado, la dmax es
menor q la dmedia de las partículas. Separación en función del coeficiente de sedimentación (s). Tiempo
parámetro a controlar, porque influye en la distancia q recorre. Útil : separación partículas con " s por "
tamaño y forma, pero con densidades similares
4.− C. ISOPICNICA:
Gradiente de densidad, max. y min. en el rango de las densidades de las partículas a separar. Método de
equilibrio−> la partícula se detiene cuando p = m . No dependencia del tiempo .Velocidad de
centrifugación mucho más alta que en la centrifugación zonal.
Aplicación de la muestra : no es relevante.
Utilidad : partícula de " densidades, aún con tamaños similares.
5.− C. COLCHON:
busca diferencias en las d de el componente a separar y el contaminante. Centrífuga sobre una disolución
homogénea más densa q la d de las cel a aislar, ahí se coloca la muestra.
Útil para la separación de cél sanguíneas.
GRADIENTES DE DENSIDAD:
• Características necesarias :
1.No provocar modificaciones biológicas en la muestra
2.No interacción con el método de detección (visible −UV)
3.Valores mínimos de viscosidad
4.Fácilmente separable de la muestra
5.No difusible
6.Bajo coste.
Sacarosa y glicerol
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Ventajas: coste, pureza, inerte, carácter no iónico
Desventajas: activos osmóticamente, alta viscosidad
Util : fraccionamiento orgánulos celulares y virus
Ficoll
Sacarosa polimerizada (PM 400.000), densidad max. > densidad con sacarosa. Más estable
Inconveniente : ! viscosidad, afecta al movimiento de la particula
Útil : partículas grandes (células y orgánulos celulares)
*Derivados iodados del ácido benzoico
Derivados ácido triodobenzoico (sustituciones para ! solubilidad)
Biológicamente inertes, iónicos : metrizoato, neutros : metrizamida y Nycodenz
Densidad máxima : 1,4 g/cm3, gran estabilidad, fácil formación.
Útil para estructuras sensibles a la fuerza iónica, mem ,cel, virus, ..
Inconvenietes : coste, interferencia con UV afecta a la absorvancia
Percoll
suspensiones de partículas (5.15 nm) de ácido silícico con Revestimiento de polivinilpirrolidona (PVP)
Útil : partículas grandes (tamaño de las partículas coloidales y sensibles osmóticamente)
*Sales de metales alcalinos pesados : cesio y rubidio
Altas concentraciones : 6 − 8 M, elevada fuerza iónica.
Útil para macromoléculas resistentes a la fuerza iónica ! ácidos nucleicos, las otras precipitan. Muy
corrosivas−>ojo rotores
Sulfato de cesio (más usadas)
densidad max. 2,01 g/cm3, Capaz de bandear RNA
Cloruro de cesio (más usadas)
densidad max : 1,91 g/cm3 , variación de densidad del ADN por % G+C.
Útil : separación de ADN ! distamicina, bromuro de etidio
*Otras sales :
Trifluoracetato de cesio ! separar topoisómeros de ADN
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Rubidio : similar al cesio, < densidad max.
Inconvenientes : coste, corrosión.
TIPO Y FORMACION DE GRADIENTES
En f(x) de la variación de la densidad:
• Discontinuos
• Comenzando por la disolución más densa (overlaying)
• Comenzando por la disolución menos densa (underlaying)
B) Continuos
• Por difusión
• Utilizando formadores de gradientes
• Por centrifugación : gradientes autogenerados
FRACCIONAMIENTO Y ANALISIS DE LOS GRADIENTES.
Condiciones :
• Evitar turbulencias y distorsiones del gradiente
• Recomendable mantener la temperatura del tubo = temp. de centrifugación
• Evitar la inversión del gradiente
Métodos :
• Extracción directa del contenido del tubo
• Perforación . Extracción directa de la banda
• Por desplazamiento de abajo a arriba
• Por desplazamiento de arriba a abajo
• Por corte del tubo
Detección de la muestra :
• Espectofotométrica (ácidos nucleicos, proteínas)
• Seguimiento actividad enzimática
• Por marcaje radioactivo.
• CI : necesario densidad! directamente con picnómetro o índice de refracción
Manera fija al eje de la centrífuga−> móvil
Inconveniente si la centrífuga no esta bien balanceadaa oscilación del tubo es incontrolada se puede perder la
muestra.
Obs. 2 casos:
*centrifugación diferencial (verde): muestra distribuida homogénea−,tras cent. Hay sobrenadante y pellet.
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*gradiente de densidad (rojo):muestra no homogénea, cambio de posición del, tubo provoca mov de las
particulas x gradiente d, el contenido del tubo no sufre reorganización tubo vuelve su posición.
El contenido es impulsado por la fuerza de la centrífuga y se dispone perpendicular a la dirección del eje de
giro. Cuando la fuerza acaba el contenido recupera su posición.
El pellet se coloca en el ext inferior del tubo + alejado del eje de giro, en el caso de centrifugación diferencial
(1ºdibujo)
En gradiente de densidad la muestra queda paralela al eje de giro (2º y 3º dibujo)
Malos para sedimentar , lo q sufre un cambio de posición es el contenido del tubo.
*C. diferencial: reorientación del líquido, el pellet se dispone en la superficie del tubo más alejada al eje de
giro (1º dibujo)
*C. gradiente de densidad: cuando comienza y acaba la fuerza centrífuga se reorganiza el líquido −>
mecanismo para iniciar y acabar la centrifugación.
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