Practica_5

PRÁCTICA 5.
INVESTIGACIÓN SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMÁTICA CATECOLASA.
INTRODUCCIÓN.
Durante esta práctica se estudiará la actividad de la enzima catecolasa contenida en
algunas frutas y vegetales. Las papas peladas y las frutas machucadas se tornan cafés cuando
son expuestas al aire debido a que la catecolasa facilita una reacción entre el catecol y el
oxígeno. En presencia de oxígeno, el catecol es oxidado por la remoción de dos átomos de
hidrógeno. El catecol es así convertido en benzoquinona, y el oxígeno es reducido por la
adición de dos átomos de hidrógeno para formar agua. Las moléculas de benzoquinona se
unen luego para formar cadenas largas y ramificadas. Estas cadenas son la base estructural de
los pigmentos melanoides rojo y café que causan el oscurecimiento.
OBJETIVOS.




Determinar los efectos de la temperatura sobre la actividad enzimática catecolasa.
Determinar los efectos del pH sobre la actividad enzimática catecolasa.
Describir los efectos del cambio en la concentración de enzima sobre la tasa de reacción
catalizada por la enzima.
Describir la relación entre la concentración de sustrato y la máxima velocidad de la
reacción enzimática.
Nota: tenga en mente que, aunque esté utilizando jugo de papa en estos experimentos, Usted
está en realidad trabajando con un extracto enzimático.
MATERIAL.
Por equipo.










26 tubos 16 x 150
75 mL de jugo de papa (guardar en frasco ámbar)
Baño de hielo
Baño maría
Termómetro
200 mL de buffer de fosfatos pH 7.0, 0.01 M
10 mL de cada uno de los siguientes buffer de fosfatos (0.01 M): pH 4.0, 6.0, 8.0, 10.0
50 mL de solución de catecol 0.05 M (guardar en frasco ámbar y evitar contacto con la luz y
aire)
2 goteros
Parafilm
PROCEDIMIENTO.
PARTE I. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Como la mayoría de las reacciones químicas, la tasa de reacción de una reacción
catalizada enzimáticamente se incrementa al incrementar la temperatura hasta un punto en el
cual la tasa es máxima. Después la tasa de reacción declina abruptamente al seguir
incrementando la temperatura. Por encima de 400C la mayoría de las enzimas en los tejidos
vivos se desnaturalizan, es decir, pierden su estructura secundaria o terciaria.
1. Llene tres tubos con 3 mL de buffer de fosfatos de pH 7. Etiquete los tubos como “10”, “25”
y “50”.
2. Coloque el primer tubo en un baño de hielo, deje el segundo tubo a temperatura ambiente y
coloque el tercer tubo en baño maría (aproximadamente 500C). Mientras tanto continúe
con el paso 3.
3. Tome tres tubos conteniendo jugo de papa y coloque uno en baño de hielo, otro a
temperatura ambiente y uno más en baño maría. Haga lo mismo con tres tubos
conteniendo catecol.
4. Después de 10 minutos, añada 10 gotas de catecol (a temperatura ambiente) a cada tubo
de buffer.
5. Añada diez gotas de jugo de papa (a temperatura ambiente) a cada tubo.
6. Espere 5 minutos (agite las mezclas varias veces durante este tiempo). Registre sus
resultados en la tabla 1 indicando la intensidad del color en cada tubo después de los 5
minutos (0 indica sin color; +, ++ y +++ indican incremento en la intensidad del color).
Tabla 1. Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática.
Tipo de tubo
Intensidad de color
10
25
Buffer
Jugo de papa
Catecol
50
Actividades:
a. ¿A qué temperatura fue mayor la cantidad de producto obtenido en la reacción enzimática?
b. ¿Cómo podría relacionarse la cantidad de producto formado por minuto con la tasa de
reacción enzimática?
c. ¿Cuál fue el objeto de agitar los tubos?
d. ¿A qué temperatura fue mayor la tasa de reacción? Grafique sus resultados (temperatura
en la abscisa y tasa de reacción en la ordenada).
e. Colocar papas peladas en hielo antes de cocinarlas previene su oscurecimiento. ¿Por qué?
PARTE II. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.
La presencia de diversos iones puede interferir con los patrones de cargas positivas y
negativas en una molécula de proteína, cambiando así la configuración de la misma. En una
enzima, la forma del sitio activo puede ser cambiada. Nosotros debemos esperar, por lo tanto,
que cambios en el pH afectarán la actividad de las enzimas.
El valor de pH más favorable, el punto en el cual la enzima es más activa, se conoce
como pH óptimo. Valores de pH extremadamente altos o bajos resultan usualmente en le
pérdida de la actividad enzimática debido a la desnaturalización de la enzima.
1. Etiquete cinco tubos con los siguientes valores de pH: 4, 6, 7, 8 y 10.
2. Llene cada tubo con 3 mL del correspondiente buffer de fosfatos y agregue 10 gotas de
jugo de papa.
3. Añada 10 gotas de catecol a cada tubo. Cubra el tubo con parafilm e invierta varias veces
para mezclar el contenido.
4. Esté preparado para observar cambio en color. Espere de 3 a 5 minutos. Invierta la mezcla
de cada tubo a intervalos de 1 minuto. La tasa de reacción enzimática (medida por la
cantidad de producto formado durante un periodo dado de tiempo) será cualitativamente
proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada mezcla de reacción. Registre sus
resultados indicando la intensidad de color en cada tubo (0=sin color; +, ++ y
+++=incremento en la intensidad de color. Registre sus resultados en la tabla 2.
Tabla 2. Efecto del pH sobre la actividad enzimática.
Intensidad de color
pH 4
pH 6
pH 7
pH 8
pH10
Actividades.
a. ¿A qué pH fue mayor la cantidad de producto formado en la reacción enzimática?
b. ¿Cómo puede relacionarse la cantidad de producto formado por minuto con la tasa de
reacción enzimática?
c.
¿A qué pH fue mayor la tasa? Grafique sus resultados (pH en la abscisa y tasa de reacción
en la ordenada).
d. Añadir limón o jugo de naranja sobre frutas peladas previene su oscurecimiento. ¿Por qué
ocurre esto?
PARTE III. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática.
Cuando un sustrato de fija en el sitio activo de una enzima, se forma un complejo
enzima-sustrato. La enzima lleva a cabo una reacción y un producto es entonces formado.
Usualmente la tasa de reacción es directamente proporcional a
la concentración de enzima. La tasa de reacción se incrementará en proporción al incremento
en la concentración de la enzima sólo si el sustrato está presente en exceso de tal forma que la
reacción no esté limitada por la disponibilidad del mismo.
1. Etiquete cuatro tubos como se indica en la tabla de abajo. Añada la cantidad indicada de
buffer de fosfatos y jugo de papa a cada tubo. NO AÑADA CATECOL AÚN. Cubra cada
tubo con parafilm e inviértalos varias veces para mezclar el contenido.
2. Añada 10 gotas de catecol a cada tubo. Cubra cada tubo con parafilm e inviértalos varias
veces para mezclar los contenidos. (No use la misma pieza de parafilm para todos los
tubos).
Tubo
A
B
C
D
Buffer de fosfatos pH 7
3 mL + 20 gotas
3 mL + 15 gotas
3 mL + 10 gotas
3 mL + 0 gotas
Jugo de papa
----5 gotas
10 gotas
20 gotas
Catecol (AÑADA AL
ÚLTIMO)
10 gotas
10 gotas
10 gotas
10 gotas
3. Espere de 3 a 4 minutos; mezcle los contenidos de cada tubo a intervalos de 1 minuto.
4. La tasa de reacción enzimática (medida como la cantidad de producto formado en un
periodo dado de tiempo) será proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada
mezcla reaccionante. Registre sus resultado en la tabla 3 indicando la intensidad de color
en cada tubo después de los 3 +o 4 minutos (0=sin color; +, ++ y +++=incremento en la
intensidad de color).
Tabla 3. Efecto de la concentración de enzima sobre la actividad enzimática.
Intensidad de color
A
B
C
D
Actividades.
a. ¿Qué cambios observó en el periodo de tiempo durante el cual estuvo ocurriendo la
reacción?
b. ¿A qué concentración de enzima fue la mayor formación de producto?
c. ¿A qué concentración de enzima fue mayor la tasa de reacción?
d. ¿Apoyan sus resultados en concepto de que la tasa de reacción es proporcional a la
concentración de enzima? Explique.
PARTE IV. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática.
Si la cantidad de enzima se mantiene constante pero la cantidad de sustrato es
aumentada gradualmente, entonces la tasa de velocidad a la cual la enzima trabaja (convierte
sustrato a producto) se incrementará hasta alcanzar un máximo. En este punto el incremento
en la concentración de sustrato no incrementará la velocidad de la reacción debido a que toda
la enzima disponible está participando en la formación de complejos enzima-sustrato. Así, cada
enzima tiene una velocidad máxima a la cual trabajará.
1. Diluya el extracto de papa 1:1
2. Etiquete 8 tubos con los número indicados en la tabla de abajo y llénelos como se indica.
Cubra cada tubo con parafilm y mezcle invirtiendo los tubos varias veces.
Tubo
1
2
4
8
16
24
32
48
Buffer de fosfatos pH 7
5 mL + 47 gotas
5 mL + 46 gotas
5 mL + 44 gotas
5 mL + 40 gotas
5 mL + 32 gotas
5 mL + 24 gotas
5 mL + 16 gotas
5 mL + 0 gotas
Catecol
1 gota
2 gotas
4 gotas
8 gotas
16 gotas
24 gotas
32 gotas
48 gotas
3. Añada 30 gotas de jugo de papa diluido a cada uno de lo ocho tubos. Cubra cada tubo con
parafilm y mezcle invirtiendo los tubos varias veces.
4. Incube la mezcla por 5 minutos; mezcle cada tubo a intervalos de 1 minuto.
5. La tasa de reacción será proporcional a la intensidad de color desarrollado en cada mezcla
reaccionante. Registre sus resultados en la tabla 4 indicando la intensidad de color en cada
tubo después de los 5 minutos (0=sin color; +, ++ y +++=incremento en la intensidad del
color).
Tabla 4. Efecto de la concentración de sustrato sobre la actividad enzimática
Intensidad de color
1
2
4
8
16
24
32
48
Actividades.
a. ¿Que consecuencias tiene a existencia de una máxima velocidad enzimática sobre el
metabolismo celular?
b. ¿Sus resultados apoyan a idea de que una enzima tiene una máxima velocidad a la cual
trabaja? Explique.
c. Grafique sus resultados (concentración de catecol en la abscisa y velocidad de reacción en
la ordenada).