(2012) - PROPIEDADES ELECTRICAS DE LA MEMBRANA

PRACTICA 1
Propiedades eléctricas de la membrana
Objetivos
1. Definir los siguientes conceptos: irritabilidad, conductividad, potencia de membrana en
reposo, bomba sodio-potasio, estímulo umbral, despolarización, potencial de acción,
repolarización, hiperpolarización, impulso nervioso, potencial de acción compuesto y
velocidad de conducción.
2. Conocer dos agentes capaces de inhibir un potencial de acción y el mecanismo por el cual
lo hacen.
3. Describir la relación entre tamaño del nervio y velocidad de conducción.
4. Describir la relación entre mielinación del nervio y la velocidad de conducción.
Las neuronas tienen dos grandes propiedades fisiológicas: excitabilidad, o la habilidad de
responder a estímulos y convertirlos en impulsos nerviosos, y la conductividad, que es la
habilidad de transmitir un impulso, en este caso, es tomar un impulso nervioso y pasarlo a lo
largo de la membrana de la célula. En una neurona en reposo, o sea, sin impulsos nerviosos,
el exterior de la membrana de la célula está cargada positivamente mientras que el interior
de la neurona esta cargado negativamente. Esta diferencia de carga eléctrica en la
membrana plasmática se refiere el potencial de membrana en reposo y se dice que la
membrana está polarizada. La bomba sodio/potasio en la membrana mantiene la
diferencia en carga eléctrica por medio de la difusión de iones. Este transporte activo
mueve 3 iones de sodio fuera de la célula mientras que incorpora 2 iones de potasio dentro
de la célula. En consecuencia, el catión más abundante fuera de la célula es sodio,
mientras que dentro de la célula es potasio. La superficie interna de la membrana celular es
más
negativa
que
la
superficie
externa
principalmente por las proteínas intracelulares que
en un pH fisiológico tienden a estar cargadas
negativamente.
El potencial de membrana en reposo puede medirse
con un voltímetro colocando un electrodo de registro
dentro de la membrana de la célula y un electrodo
de referencia fuera de la célula. En el axón del
calamar gigante, o en el axón de rana que se
utilizará en este ejercicio, el potencial de membrana
en reposo es de -70 mv (En humanos, el potencial
de membrana en reposo generalmente mide entre 40 y -90 mv).
Figura 1. El potencial de membrana en reposo se
mide con un voltímetro
EL IMPULSO NERVIOSO
Cuando una neurona se activa en respuesta a un estímulo de adecuada intensidad
(estímulo umbral), se genera un aumento transitorio en la permeabilidad de la membrana a
los iones de sodio, debido a la activación de los canales de sodio en la membrana. Los
iones de sodio fluyen al interior de la célula a favor de su gradiente de concentración
incrementando así el número de iones positivos dentro de la célula y cambiando la
polaridad de la membrana. La superficie interna de la membrana se torna menos negativa y
la superficie externa se vuelve menos positiva. A este fenómeno se le conoce como
despolarización.
Cuando la despolarización alcanza un umbral, el potencial de acción se inicia y la polaridad
de la membrana se revierte. Cuando la membrana se despolariza, el potencial de reposo
de la membrana de -70 mv se vuelve menos negativo. Cuando el potencial de membrana
alcanza 0 mv, los canales de sodio se cierran y los canales del ion potasio se abren.
Cuando los canales de sodio finalmente se cierran, el potencial de membrana ha alcanzado
+35 mv. Al abrirse los canales de potasio, se permite el flujo de estos iones al exterior de la
célula debido al gradiente electroquímico, lo cual ocasiona que el potencial de membrana
se mueva en dirección negativa. Esto se refiere a repolarización. Esta repolarización ocurre
un milisegundo después del flujo de iones de sodio inicial y restablece el potencial de
membrana en reposo. En realidad, después de cerrarse los canales de potasio, la
membrana celular ha llevado a cabo una hiperpolarización, alcanzando quizás -75 mv. Con
los canales cerrados, el potencial de membrana en reposo vuelve rápidamente al potencial
de membrana en reposo inicial.
Cuando los canales de sodio están abiertos, la
membrana es completamente insensible a estímulos
adicionales, sin importar la fuerza del estímulo. En ese
momento, la célula se encuentra en lo que se llama
período refractario absoluto. Durante la repolarización,
la membrana puede ser estimulada si se utiliza un
estímulo bastante fuerte. Ese período se conoce como
período refractario relativo.
Para estudiar la fisiología del nervio, utilizaremos un
nervio de rana y varios instrumentos electrónicos. El
primer instrumento a utilizar es el estimulador
electrónico. Los nervios pueden ser estimulados por
sustancias químicas, de forma mecánica y con
Figura 2. Fases de un potencial de acción.
choques eléctricos. El estimulador electrónico
administra un choque eléctrico, el cual permite que se
pueda controlar la duración, la frecuencia y el voltaje del estímulo. El estimulador tiene dos
terminales de salida: el terminal positivo es rojo y el negativo negro. El voltaje sale del
estimulador por el terminal rojo, pasa por el objeto a ser estimulado y regresa al
estimulador por el terminal negro.
El segundo instrumento a utilizar es el
osciloscopio, un instrumento que mide los
cambios de voltaje en un período de
tiempo. La pantalla del osciloscopio es el
frente de un tubo con un filamento al otro
extremo. Este filamento es calentado y
genera un rayo de electrones. El rayo pasa
al frente del tubo hasta llegar y colisionar
con el material fosforescente dentro de la
pantalla del osciloscopio, en el lugar de la
colisión, se nota un brillo. Cuando
aplicamos estímulos al nervio, la pantalla
del osciloscopio presentará uno de los
siguientes resultados: sin respuesta, una
línea horizontal, o un gráfico con un pico.
Figura 3. Vista de la pantalla de PhysioEx™ que se utilizará en
el experimento #1.
El gráfico con el pico indica que se generó un potencial de acción.
Durante este experimento, recuerde que está trabajando con un nervio, el cual consiste
de muchos axones. El potencial de acción que usted verá en el osciloscopio refleja la suma
de varios potenciales de acción de todas las neuronas del nervio, el cual es llamado
potencial de acción compuesto. Aunque un potencial de acción sigue la regla de todo o
nada en una neurona, esto no necesariamente ocurre en el nervio entero. Cuando se
estimula un nervio eléctricamente con cierto voltaje, el estímulo puede resultar en una
despolarización de la mayoría de las neuronas, pero no necesariamente todas ellas. Para
alcanzar la despolarización de todas las neuronas, un estímulo de mayor voltaje es
necesario.
En los siguientes experimentos, se investigará cuáles tipos de estímulos generan
potenciales de acción. Para ello se harán registros extracelulares de la respuesta eléctrica del
nervio ciático de rana y dos electrodos de Ag/AgCl en contacto con la superficie del nervio. Con
éste método, se registra la diferencia de potencial entre los dos puntos de contacto que se
denomina potencial de acción compuesto.
Para iniciar los experimentos, inicie el programa de PhysioEx y seleccione del menú principal,
el módulo de Neurofisiología del Impulso Nervioso (Neurophysiology of Nerve Iimpulses). En la
opción de experimento (experiment) seleccione “Generando un Impulso Nervioso (Eliciting a
Nerve Impulse).
En la pantalla principal observamos la preparación del nervio ciático de rana colocado en
la cámara de registro, la cual está conectada (a través de pares de cables, a un estimulador y
un osciloscopio.
Actividad #1: Estimulación eléctrica
En esta actividad, se estudiará cómo un impulso eléctrico puede generar un potencial de
acción.
1. Ajuste el voltaje a 1.0 V hacienda clic sobre el símbolo (+) al lado de la pantalla de
voltaje.
2. Emplee un estímulo simple haciendo clic en Single Stimulus.
3. ¿Observa algún tipo de respuesta en la pantalla del osciloscopio?
Si no ve respuesta, o simplemente no se distingue bien una señal eléctrica, haga
clic sobre el botón Clear del osciloscopio.
4. Aumente el voltaje y vuelva a emplear un estímulo simple hasta que observe una
deflexión de la línea horizontal, lo cual indica un potencial de acción. ¿Cual fue el
voltaje umbral? _________V.
¿Cómo se define el concepto de estímulo umbral para un potencial de acción?
¿Este valor será igual que el obtenido en un registro intracelular?
¿Qué fases se pueden distinguir en la respuesta del nervio representado en la
pantalla?
¿Qué factores determinan la respuesta eléctrica pasiva de la membrana?
Menciona las diferencias en la respuesta del nervio a estímulos eléctricos
obtenidas en registros intracelulares y extracelulares.
En respuesta a un estímulo umbral, calcule el tiempo que transcurre entre la
aplicación del estímulo y el inicio del potencial de acción (latencia)? ¿Qué factores
contribuyen a éste período?
5. Ahora, a partir del voltaje umbral, incremente el voltaje en 0.5 V y aplique un
estímulo. Compare esta respuesta registrada en el osciloscopio con la que se
obtuvo en el estímulo umbral.
¿Observa alguna diferencia? Explique éstas diferencia, si existen
6. Continúe estos incrementos de 0.5 V aplicando un estímulo cada vez hasta que
encuentre el voltaje en el que por más que se incremente el voltaje, no aparecen
cambios perceptibles en el registro del osciloscopio. Anote ese voltaje máximo
__________V.
Actividad #2: Estimulación mecánica
1. Seleccione Clear en el osciloscopio para borrar los registros de la actividad pasada.
2. Seleccione la barra de vidrio y arrástrela sobre el nervio. Cuando la barra este sobre
el nervio, suéltela. Eso indicara que el vidrio esta en contacto con el nervio.
¿Qué observa en el osciloscopio? Explique sus resultados.
3. Guarde sus resultados con Record Data para comparar la figura con los resultados
de la siguiente actividad.
Actividad #3: Estimulación térmica
1. Arrastre la barra de vidrio sobre el calentador. Haga clic sobre Heat para calentar la
barra de vidrio. Posteriormente arrastre la barra y colóquela sobre el nervio.
¿Qué ocurre?
¿Cómo compara este resultado obtenido con el que se obtuvo con la
estimulación mecánica?
¿Que explicación puede dar a esta diferencia?
2. Guarde sus resultados.
Actividad #4: Estimulación química
1. Seleccione y arrastre el gotero del frasco de NaCl sobre el nervio para aplicar
solución salina sobre el mismo.
¿Se genera un potencial de acción? Explique el origen de ésta señal
2. Realice lo mismo con el ácido clorhídrico,
¿se genera un potencial de acción? Explique el origen de ésta señal
INHIBICION DEL IMPULSO NERVIOSO
Numerosos factores físicos y agentes químicos pueden impedir que las fibras nerviosas
funcionen correctamente. Por ejemplo, alta presión y frías temperaturas bloquean la
transmisión de impulsos nerviosos evitando que llegue sangre las fibras nerviosas.
Sustancias anestésicas locales, el alcohol y otras sustancias químicas también son muy
efectivas en bloquear la transmisión nerviosa. En esta actividad, se estudiarán los efectos
de algunos agentes en la transmisión de impulsos nerviosos.
Actividad #5: Efectos del éter
1. Seleccione el experimento “Inhibiendo el impulso nervioso” (Inhibiting a nerve impulse”)
en el menú principal en la sección de experimentos.
Note que la pantalla es muy similar a la utilizada en los experimentos anteriores con la
excepción de la presencia de 3 conocidos compuestos que tiene sus efectos en la
actividad eléctrica de las neuronas
2. Inicie el experimento estimulando el nervio con un pulso de amplitud umbral.
3. Usando el ratón, arrastre el gotero del contenedor de éter sobre el nervio. Soltar el
botón del ratón sobre el nervio para añadirle unas cuantas gotas de éter
4. Estimule el nervio con el voltaje umbral.
¿Qué cambios observa en el registro
5. Guarde sus resultado (record data)
6. Haga clic sobre el botón de tiempo del osciloscopio. La pantalla mostrará ahora la
actividad del nervio durante 10 minutos (no msec).
7. Haga clic sobre el botón (+) debajo de intervalo entre estímulos del estimulador y
seleccione 2 minutos. Esto significa a que se estimulará el nervio automáticamente
cada 2 minutos. Estimule ahora el nervio y observe en el osciloscopio.
¿Cuánto tiempo transcurre hasta recuperar la respuesta inicial?. Explique las
bases fisiológicas de ésta respuesta
8. Detenga la estimulación haciendo clic sobre Stop.
9. Ahora, en el osciloscopio haga clic sobre Time para regresar a la pantalla en
milisegundos
10.
Ahora borre los resultados del osciloscopio haciendo clic en Clear.
Actividad #6: Efectos del Curare
El curare es un extracto de plantas que antiguamente utilizaban los aborígenes en
Suramérica para paralizar a las presas. Es una -toxina que se une a los sitios de unión de
la acetilcolina en la membrana de las células postsinápticas.
1. Inicie el experimento estimulando el nervio con un pulso de amplitud umbral.
2. Arrastre el gotero con curare sobre el nervio y agregue unas cuantas gotas sobre el
mismo.
3. Seleccione en el estimulador y aplique nuevamente un estímulo simple
¿Qué efecto se observa en el potencial de acción? ¿Cómo explica ese efecto?
¿Cuál es el efecto global que tiene el curare sobre el organismo?
4. Guarde los resultados y lave la preparación presionando el botón Clean, en la cámara
del nervio.
Actividad #6: Efectos de la Lidocaína
1. Repita el experimento anterior pero añadiendo Lidocaína en la preparación
¿Qué tipo de registro se observa?¿Por qué la lidocaína tiene este efecto en la
transmisión de impulsos en las fibras nerviosas?
Actividad #7: Velocidad de conducción
Una de las propiedades de las neuronas en la conductividad, definid como la habilidad de
transmitir el impulso nervioso a otras neuronas, músculos o glándulas. En ciertos nervios
en el humano, la velocidad de un potencial de acción puede ser tan rápida como 120 m/s.
En otros nervios, la velocidad de conducción es más lenta, ocurriendo a una velocidad de
menos de 3 m/s.
En este ejercicio, el osciloscopio y el estimulador serán usados junto con un tercer
instrumento, el bioamplificador. El bioamplificador se usa para amplificar cualquier
despolarización de membrana de modo que el osciloscopio pueda registrar el evento
fácilmente.
La velocidad de conducción del axón puede ser calculada determinando la latencia entre el
pulso de estimulación y el pico al valor máximo del potencial de acción compuesto y la
distancia entre los electrodos.
Para iniciar el experimento, pulse en el menú experimento (experiment) y seleccione la
opción “Velocidad de Conducción en Nervios” (Nerve Conduction Velocity).
Con la finalidad de compara el la contribución del diámetro y la presencia de mielina en la
superficie del nervio durante este experimento utilizaremos 4 tipos de preparaciones:
lombriz de tierra (earthworm), nervio mielinizado de rana (frog nerve) y dos tipos de nervios
de rata (rat nerve), uno mielinizado (nerve #2) y otro con mielina (nerve #1). En particular, la
lombriz de tierra puede ser utilizada intacta ya que el cordón nervioso se localiza a todo lo
largo de la superficie ventral del animal. Por ello, el animal debe ser anestesiado con etanol
antes de empezar a registrar
1. Presionar “Pulse” en el estimulador y seleccionar “On” en el amplificador.
2. Usando el ratón, arrastrar el dispensador de la botella de etanol hasta la lombriz de
tierra. Soltar el botón del ratón para añadir etanol a la lombriz.
3. Posicionar la lombriz en la cámara de registro.
4.
Fijar la amplitud del estímulo a 1 V y estimular la preparación presionando “ stimulate”.
Si no se ha generado un potencial de acción, incrementar el voltaje hasta alcanzar el
valor umbral. ¿Cuál es el estímulo umbral?
5. Presionar “Measure”. Una línea vertical amarilla aparecerá en el extremo izquierdo de la
pantalla. Presionar “+” para situar la línea amarilla en el punto en que comienza la
respuesta (punto en el que el registro deja de ser una línea recta horizontal y
comienza a elevarse). El programa automáticamente calcula la velocidad de
conducción.
6. Presionar “Record data” en la tabla de recolección de datos para registrar los resultados.
7. Retirar la lombriz de la cámara de registro y repetir la experiencia con los tres nervios
restantes. Recordar que no es necesario añadir etanol a los nervios, por lo que debe
colocarlos directamente en la cámara.
8. En una tabla de datos, registre los valores de: voltaje umbral; tiempo de latencia y
velocidad de conducción para cada preparación utilizada
9. En base a sus datos:
¿Cuál es la relación entre el diámetro del nervio y velocidad de conducción?
¿Qué relación puede establecer entre la velocidad de conducción y la
presencia o no de mielina?
¿Cuál es la principal razón de las diferencias observadas entre los nervios
mielinado y no mielinado?
En un registro extracelular, ¿cuál es el significado fisiológico de medir la
latencia al inicio del potencial de acción compuesto y medirlo al pico máximo
del mismo.
¿Cuál sería las posibles fuentes de errores con éste método para medir
velocidad de conducción
Actividad #7: Velocidad de conducción.- Ejercicio
Después que se genera un potencial de acción en una neurona, éste debe de propagarse con
rapidez y eficientemente (sin pérdida de información) a lo largo del axón y finalmente
transmitirse hacia las células que inervan.
En principio, la conducción del PA a lo largo del axón se efectúa
del mismo modo que la conducción de un impulso eléctrico a lo
largo de cables eléctricos. Sin embargo, hay una gran diferencia,
en lo que respecta a la calidad del aislante, (la membrana
neuronal es un aislante eléctrico muy malo con respecto a los
aislantes industriales). De este modo, la propagación pasiva de
los impulsos eléctricos a lo largo de un axón se realiza con
decremento en el valor máximo del cambio en el potencial de
membrana (Vm) en una forma proporcional con la distancia
recorrida (una parte de la corriente pasa a través de la
membrana ocasionando pérdidas de voltaje. El decremento es
de carácter exponencial y se puede calcular con la fórmula:
Vx  V0  e
 x
 

donde  (lambda) es la constante de
espacio (o longitud)
Esta expresión indica que Vm disminuye
exponencialmente a lo largo del axón
comenzando en el punto de estimulación
(x=0). Si sustituimos en la fórmula x por λ,
podemos calcular que la constante de espacio
que se define como la distancia en la cual el
valor del potencial de membrana en el estadoestacionario cae en un 1/e el valor inicial
(63% Vm), asumiendo que la respuesta no
incluye la activación de conductancias
iónicas.
Lambda () es una propiedad intrínseca de
las neuronas que aumenta con la calidad
(resistencia eléctrica) del aislante (=
resistencia de la membrana), al mismo tiempo
que disminuye con las resistencias eléctricas
interna y externa del nervio.
Realice el siguiente ejercicio que tiene como
finalidad calcular la constante de espacio y
tiempo de una motoneurona de vertebrado.
La siguiente figura corresponde al
arreglo experimental utilizado (inserto).
Inicialmente,
dos
microelectrodos
son
insertados a través de la membrana a una distancia de 20 m entre ellos. Se estimula la
preparación con un pulso cuadrado de amplitud subumbral y se registra la respuesta de la
membrana (potencial de membrana) a ese estímulo (trazo superior, panel inferior).
Manteniendo la posición del electrodo de estimulación, se repite este procedimiento pero
aumentando la distancia de separación entre los electrodos (indicado al lado de cada registro
de potencial de membrana). La amplitud del estimulo es constante a lo largo del experimento
En base a estos datos:
(a) Determine la amplitud máxima del potencial de membrana obtenido en cada distancia
(b) Exprese éstos valores como una fracción del valor máximo inicial
(c) Haga una grafica de la amplitud relativa del potencial de membrana en función de la
distancia de separación entre los electrodos.
(d) En base a estos resultados, calcule el valor de  de la preparación (ayuda: obtenga la
curva que mejor ajuste a sus datos experimentales y en base a la ecuación anterior despeje
el valor de )
Este reporte debe ser entregado el día de la práctica antes de las 17h00.