CROMATOGRAFÍA La cromatografía es un método analítico empleado ampliamente en la separación, identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. La cromatografía fue inventada por el botánico ruso Mikhail Tswett poco después del inicio del siglo XX. Tswett hizo pasar pigmentos vegetales (macerado de algas) como clorofilas y xantofilas, a través de columnas de vidrio empacadas con CaCO3 dividido finamente. Las especies separadas aparecían como bandas coloridas sobre la columna, lo cual explica el nombre que se escogió para el método (del griego chroma que significa “color” y graphein que significa “describir”). La cromatografía es una técnica en la cual los componentes de una mezcla son separados con base en las velocidades a las cuales son pasados a través de una fase estacionaria por una fase móvil gaseosa o líquida. Los componentes de una mezcla son llevados a través de una fase estacionaria por el flujo de una fase móvil gaseosa o líquida. Las separaciones están basadas en las diferencias en la velocidad de migración entre los componentes de la muestra. Todos los métodos tienen en común el empleo de una fase estacionaria y una fase móvil. Fase estacionaria: Esta fija en el sistema. Fase móvil: Solvente que mueve los solutos a través de la fase estacionaria. Sistemas Cromatográficos: Sistemas móviles: Sistemas estacionarios: Tipos de fases: Móviles Gas He, H, N, CO, Ar Líquido (Acetonitrilo, tetrahidrofurano, acetato de nitrilo, etc.) Líquido Estacionarias Sólidas (polímero que absorbe) Líquido a la temperatura de trabajo Sólido Estado micelar Cromatografía contracorriente G.S.C. G.L.C. Cromatografía supercrítica H.P.L.C. H.P.T.P.L.C. L.C. Electroforesis capilar A la temperatura de trabajo se permite un intercambio. Cualquier químico debe saber usar H.P.L.C. y L.C. H.P.L.C. o High Performance Liquid Chromatography (cromatografía líquida de elevado comportamiento o cromatografía líquida de alta eficiencia) es la de mayor uso actualmente. H.P.T.P.L.C. (cromatografía líquida planar de alta eficiencia) la disposición de la fase está sobre un plano. La columna contiene dos extremos: Un extremo por donde se introduce la muestra (gaseosa, solución, sólida) con una jeringa, y en el caso de G.L.C. se llama septa. Otro extremo en donde se sitúa el detector, el que ve lo que pasa por el. Es específico para cada técnica. Salazar-Jiménez ® 1 Salazar-Jiménez ® 2 TºA debe permitir volatilizar la muestra a un estado gaseoso, temperatura superior al punto de ebullición de la muestra. TºB, en la columna debe existir una temperatura tal que la muestra se mantenga volátil. La esfera (n) viaja a través del sistema gracias a que existe una fase móvil que la lleva al detector. Esta tiene una solubilización puntual en cada elemento, puntual de la columna. Cuando una sustancia no tiene ninguna retención en la fase estacionaria, el tiempo que pasa o transcurre cuando ella es detectada se llama tiempo muerto (t0). Pasa y escurre, es el mínimo tiempo que demora la sustancia del punto A al C. Toda sustancia que interacciona con la fase estacionaria se demora un tiempo determinado, tiempo de retención (tR). Siempre tR > t0 tR depende de las condiciones de Tº, P, calidad química y propiedades de la molécula analito. Este constituye un parámetro identificador hasta cierto punto y se puede investigar. En G.L.C. lo mejor para evaluar t0 es el CH4, y el H.P.L.C. se usa NaNO3 Cromatograma típico para mezcla de compuestos. Constante de distribución: KL = CS CM AMÓVIL AESTACIONARIA donde: CS: concentración molar analítica del soluto en la fase estacionaria CM: concentración molar analítica del soluto en la fase móvil Tiempo corregido: Parámetro que describe mejor la interacción con la fase estacionaria. Significa el tiempo que la sustancia permanece en la fase estacionaria. Corresponde a: tR` = tR – tO Velocidad lineal: Velocidad lineal promedio de las moléculas de la fase móvil: Salazar-Jiménez ® V0 = L tO donde: L = largo de la columna 3 Velocidad lineal promedio de la migración del soluto: V=L tR donde: L = largo de la columna Relación entre la velocidad de migración y la constante de distribución. V = VO * 1 …… 1+ KL Vs/Vm donde: VS: volumen de la fase estacionaria VM; volumen de la fase móvil Los dos volúmenes se pueden estimar por un método para el cual se prepara la columna. Capacidad (factor de capacidad k`) La capacidad es un parámetro experimental importante que se emplea ampliamente para describir las velocidades de migración de solutos en columnas. Para un soluto la capacidad se define como: k`= tR – tO = tR` tO tO La capacidad se relaciona con la constante de distribución: KL = *k` Donde se define como: (para columna solo capilar) = (RC – df)2 2 RC df donde: RC = radio de la columna. df = grosor del film. Para G.L.C. la columna es de sílice con un polímero externo, la fase estacionaria se ubica como un film (película) alrededor del tubo. KL se puede calcular experimentalmente, a partir de los datos de la columna. Por lo tanto, se puede utilizar para evaluar parámetros termodinámicos del sistema. Cuando el factor de capacidad es mucho menor que la unidad tiene lugar la elusión tan rápidamente que la determinación de los tiempos de retención es difícil. Cuando el factor el factor de capacidad quizás sea mayor que 20 a 30, los tiempos de elusión se convierten en excepcionalmente largos. Idealmente las separaciones deben realizarse bajo condiciones en las cuales los factores de capacidad para los solutos de una mezcla estén entre 1 y 5. Cuando se tiene dos sustancias se debe cuantificar la relación entre las sustancias. Se produce una dispersión de forma gaussiana. Cuando se tienen dos sustancias cercanas, cuantificar la posición se hace mediante una variable denominada selectividad. Salazar-Jiménez ® 4 La selectividad para dos analitos en una columna proporciona una medida de que tan bien la columna separa a los dos. Selectividad: = (tR)B – tO (tR)A – tO donde: (tR)B > (tR)A Siempre es mayor o igual a la unidad por definición. No se debe confundir con el concepto de grado de resolución que tienen dos señales. La resolución RS de una columna proporciona una medición cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. Esta se define como: RS = 2[(tR)B – (tR)A] WA + WB Si RS 1.5 existe separación de señales Si RS < 1.5 Existe una superposición o solapamiento entre las señales. No se puede cuantificar entre ambas señales. MODELO: Lo más probable es que las partículas estén en una esfera gaseosa por la menor energía. Si la estructura química de A es parecida a la fase estacionaria, puede interaccionar con la fase estacionaria, solo si KLA 0. Mayor velocidad de la partícula en fase gas que en fase estacionaria. Como las partículas de gas en la fase estacionaria se mueven mas lento que en la fase móvil, se genera una dispersión molecular interna (pelota Rugby). Línea base: Cuando el detector no indica partículas. Salazar-Jiménez ® 5 La varianza del peak indica dispersión de la molécula. La teoría de la velocidad de la cromatografía describe las formas y anchuras de los picos de elusión en términos cuantitativos basados en un mecanismo aleatorio para la migración de moléculas a través de la columna. Eficiencia de las columnas cromatográficas La eficiencia de una columna cromatográfica se refiere a la magnitud del ensanchamiento de la banda que ocurre cuando un compuesto pasa a través de la columna. Descripción cuantitativa de la eficiencia de la columna En mediciones cuantitativas de la eficiencia de las columnas cromatográficas se emplea dos términos: Altura de un plato (H) Número de platos teóricos (N) La altura de un plato se conoce como la altura equivalente de un plato teórico. (HETP) Los dos términos se relacionan mediante la ecuación: N=L H donde: L: longitud del empaque de la columna N: numero de platos teóricos H: altura de un plato, altura equivalente de un plato teórico La eficiencia de las columnas cromatográficas se incrementa a medida que se hace mayor el número de platos y a medida que la altura del plato se hace menor. A menor varianza, menor dispersión y mayor eficiencia. Altura de plato: Debido a que las bandas cromatográficas son gaussianas y debido a que la eficiencia de una columna se refleja en la anchura de los picos cromatográficos, la varianza por unidad de longitud de columna se utiliza como una medida de la eficiencia de la columna. H = σ2 L donde: σ2: varianza [cm 2] L y H [cm] Salazar-Jiménez ® 6 Numero de platos: Se evalúa experimentalmente con los datos que aparecen en el cromatograma. Se mide el tiempo de retención de un pico y la altura del pico en su base (en unidades de tiempo). N es adimensional y se define como: N = 16 (tR)2 W2 Para obtener H, se mide la longitud de la columna (L) y se aplica: H = L/N Eficiencia a temperatura constante (Isoterma): H f (v de la fase móvil) f(x) Va Deemter Modificada v=f A donde: v = velocidad lineal A = sección área (dado por equipo) f = flujo (dado por equipo) A partir de un cromatograma: N = 16 (tR)2 W2 ancho abajo Salazar-Jiménez ® N = 5,54 (tR)2 W2 ancho medio 7 Se pueden obtener distintos valores de N, ajustando la velocidad lineal, con lo que se fabrica un grafico de vO v/s H (obtenible a partir de N y L) y se busca el mínimo d la función. Obtenemos H mínimo y su respectiva velocidad óptima. Si no se logra captar la máxima eficiencia se debe probar con otra fase estacionaria. Para pick delgados se ocupa N2, pero se debe estar en el punto crítico. Es decir, el análisis con N 2 es más lento (<vo), pero H es más pequeño. Con He se puede trabajar en un rango mayor de velocidades, y con H 2 es mas rápido ya que el mínimo se produce a mayor velocidad lineal. Con He y H 2 como gas en la fase móvil se puede trabajar en un rango más amplio. Modelo matemático para explicar: Ecuación de Van Deemter Ecuación Original: H = A + B + C vO vO Se usaba cuando la columna esta rellena con partículas (sílice en general) y en cada superficie estaba el film de la fase estacionaria (sobre las partículas). Salazar-Jiménez ® 8 Ecuación Modificada: H = A + B + (CL + CM) vO vO Parámetros: A = constante de Eddy A = 2 dp donde: dp = tamaño promedio de partículas Si se tiene columna rellena A 0 Si se tiene columna capilar no rellena A = 0 (dp = 0) Flujo laminar, en el borde la velocidad de la fase móvil es cero. Existe distribución gaussiana de los vectores de flujo en relleno regular. H debido a irregularidades de la columna. B = difusión longitudinal. En H.P.L.C. como fase móviles estado líquido B 0 En cromatografía de gases B es mayor: B = 2 DM donde: DM = coeficiente de difusión en fase móvil (depende de la naturaleza del gas y de Tº = resistencia del sistema a choques de partículas 1 CL = coeficiente de transferencia de masa de la fase estacionaria. CL = f (k`), función compleja propuesta que depende de df 2/DS, CL = f (k`) df2 DS donde DS es el coeficiente de difusión en la fase estacionaria. Para incrementar la eficiencia se debe elegir un df menor. Esto esta supeditado a la Tº y la naturaleza de la fase estacionaria. Para columnas capilares: CL = 2 k`df2 = KCL … 3 (1+k`) DS Este término es válido solo cuando df es muy pequeño (df 0) Cuando df es grande el factor 2/3 aumenta KCL KCL depende de la unión de las partículas unas con otras. Se modifica df. Cuando las partículas se unen hay un cambio en el grosor y pasa a ser una constante (CL = KCL) CM = coeficiente de transferencia de masa de la fase móvil. Se dice que es función de: CM = f (K*dp/DM), donde dp es función del diámetro de la columna (dc). Para columnas capilares en G.L.C. existe una función definida: Salazar-Jiménez ® 9 CM = (1+6k`+11k`2) 96(1+k`)2 (dc2/DM) Para calcular el mínimo, se deriva la expresión y se iguala a cero: H/v0 = 0, obteniéndose: VOPTIMA = [B/(CM+CL)]1/2 HMINIMO = A + 2[B(CM+CL)]1/2 Resolución de columnas El usuario debe optimizar el proceso cromatográfico de manera que la resolución sea mayor a 1,5. La resolución RS de una columna proporciona una medición cuantitativa de su capacidad para separar dos analitos. La resolución debe ser de tal forma que si se tienen dos sustancias se puedan separar La resolución en general es una función de (selectividad), k`(capacidad) y N (número de platos teóricos. RS = N1/2 (-1) (k`B) 4 (1+k`B) A B C Término A depende de la construcción de la columna. Término B depende de , y este a su vez de la naturaleza química de los compuestos a separar (cargas, momento dipolar). Término C depende de la naturaleza de la sustancia y de la naturaleza de la fase estacionaria y para H.P.L.C. también depende de la fase móvil. A partir de la ecuación anterior se obtienen otras expresiones: N = 16 RS2 ()2 (1+k`B)2 (-1)2 (k`B)2 Con esta ecuación se puede calcular el número de platos teóricos necesarios para llevar a cabo una resolución dada. Efecto de la resolución sobre el tiempo de retención. El tiempo de retención de B (tRB) necesario para fluir dos especies A y B con una resolución R S esta dado por: (tR)B = 16RS2H2(1 + k`B)3 vO ( - 1)2 (k`B)2 donde: vO: velocidad lineal de la fase móvil. Para el cálculo de la resolución se hace la proyección a partir de los picos en el cromatograma. En algunos casos de detectores conductímetros (que miden conducción térmica) aparece un peak primero que corresponde al aire. Salazar-Jiménez ® 10 Salazar-Jiménez ® 11 Parámetros de retención. Tiempo de retención (tR) Tiempo muerto (tO) Tiempo de retención corregido (tR`) Volumen de retención (VR) VR = tR fc donde: fc = flujo de la columna, medido con un flujómetro. [ml/min] Volumen muerto (VO) Volumen de retención corregido (VR`) VR` = tR` fc = VR – VO Volumen de retención ajustado: se define en cromatografía de gases (VR) VR = VR j donde: j = constante de Gidding La caída de la presión no es lineal. Volumen de retención neto (VN) VN = VR j = (VJ – VO) j Volumen específico de retención (VO) VO = 273,2 Kf / TC O donde: TC = temperatura de la columna Kf = CS/CM O = densidad de la fase estacionaria La Tº de trabajo debe ser mayor a la temperatura de ebullición de la muestra para que este en estado gaseoso. Velocidad de la sustancia con retención (v) Velocidad de la sustancia sin retención (vO) = siempre es mayor. Volumen específico de retención (Vo) Salazar-Jiménez ® 12 Vg = (273 R) / PM i Pi donde: PM = peso molecular i = coeficiente de actividad del soluto en fase estacionaria a dilución infinita (Rango 0.3 – 5.0) Pi = presión de vapor de saturación del soluto puro a la Tº de trabajo Obtención de Vg: Vg = Fo [273] [1] [Po – PW] [Po] [tR – tO] [Tº] [W] [760] [Pi + Po] donde: W = peso de fase estacionaria de la columna Vg es un elemento de criterio para análisis cualitativos Si se tiene un Vg experimental igual a teórico entonces hay probabilidad que se trate de la sustancia en cuestión. Sin embargo todo análisis cualitativo es mas complicado, ya que involucra dos alternativas si o no. La energía libre molar de Gibbs parcial de un soluto a dilución infinita en la fase estacionaria puede ser calculada: KL = Vg [TC - O] 273.2 ∆G = -RTC ln (KL) Efecto de la velocidad de flujo de la fase móvil en la eficiencia de la columna El grado de ensanchamiento de la banda depende del tiempo que la fase móvil esta en contacto con la fase estacionaria. La eficiencia de la columna depende de la velocidad de flujo de la fase móvil. Tanto para G.L.C. como H.P.L.C. las alturas mínimas (eficiencia máxima) ocurren a velocidades de flujo relativamente bajas. En H.P.L.C. los peak en el cromatograma aparecen en forma clara y distinta si se trabaja sobre 0.8, por lo tanto no se puede trabajar en el rango mínimo (>0.5). el rango de trabajo es de [0.8;0.9-2.0] ml/min Hay otras columnas que son mucho más rápidas pero están construidas de otro material [5.0-10] ml7min Generalmente en los papers se trabaja a 1.0mi/min En G.L.C. la velocidad máxima se puede trabajar en un factor 2 VMAX. Se puede trabajar en rango más amplio. Salazar-Jiménez ® 13 Otras variables que afectan la eficiencia de la columna son: Diámetro de las partículas que constituyen el relleno H es mayor (menor eficiencia) a medida que las columnas están rellenas, disminuyendo H (mayor eficiencia) a medida que se tienen partículas más pequeñas. Se puede incrementar la eficiencia de la columna si se disminuye el tamaño de partícula del empaque de la columna empleando capas más delgadas de la película inmovilizada (en donde la fase estacionaria es un líquido adsorbido sobre un sólido). Para compensar la perdida de eficiencia se puede tener: Partículas grandes columna grande Partículas pequeñas columna pequeña Diámetro de la columna Para aprovechar el efecto del diámetro de la columna se han utilizado columnas cada vez más estrechas. A menor diámetro aumenta la eficiencia. Salazar-Jiménez ® 14 Salazar-Jiménez ® 15