Facultad de Ciencias de la Vida Escuela de Biociencias Biología Marina “La Contaminación Lumínica Artificial (CLA) altera la conducta y condición fisiológica de un isópodo de playa de arena: ¿Son sus efectos reversibles?” Josué Manuel Navarrete Meneses Integrador IV: Tesis II Profesor tutor: Dr. Cristián Hernan Duarte Valenzuela, Universidad Andrés Bello Profesor comité: Dr. José Pulgar Aguila, Universidad Andrés Bello Profesor coordinador: Dr. Pablo Oyarzún, Universidad Andrés Bello Santiago, Chile Diciembre, 2021 1. ÍNDICE GENERAL 3. Resumen…………………………………………………………………….3 4. Ámbito de acción…………………………………………………………....4 5. Introducción………………………………………………………………....4 6. Hipótesis…………………………………………………………………….9 7. Objetivo general…………………………………………………………….9 8. Objetivos específicos………………………………………………………..9 9. Metodología……………………………………………………………...….9 Recolección de individuos…………………………………………………………….....9 Aclimatación…………………………………………………………..…………….....10 Objetivo específico 1…………………..………………………………………………..10 Objetivo específico 2………..…………………………………………………………..11 Objetivo específico 3……………….………………………………………………….…13 10. Análisis estadísticos……………………………………………………......14 11. Resultados………………………………………………………………… 14 12. Discusión…………………………………………………………………...21 13. Conclusión………………………………………………………………….27 14. Referencias bibliográficas………………………………………………….29 1 2. ÍNDICE DE FIGURAS Figura 1. Promedio de actividad locomotora de Tylos spinulosus, en respuesta a las condiciones control y CLA durante el periodo de impacto………………………………….15 Figura 2. Promedio de actividad locomotora de Tylos spinulosus, en respuesta a las condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación…………………………….16 Figura 3. Promedio de consumo de alimento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto………………………………………………………...17 Figura 4. Promedio de consumo de alimento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación……………………………………………………17 Figura 5. Porcentaje de la eficiencia de absorción de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto……………………………………………………….18 Figura 6. Porcentaje de la eficiencia de absorción de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación………………………………………………….19 Figura 7. Promedio de la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto………………………………………………………...20 Figura 8. Promedio de la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación……………………………………………………20 2 3. RESUMEN El aumento de la población humana ha llevado al aumento de la infraestructura costera y con esto un aumento en la Contaminación Lumínica Artificial (CLA). Este estresor antropogénico se encuentra cada vez más extendido en todo el mundo, y los ambientes costeros, particularmente las playas de arena son uno de los más afectados. La CLA tiene la facultad de alterar los ciclos naturales de luz y oscuridad, que estan intimamente involucrados en el comportamiento y sincronización de varios procesos ecológicos y fisiológicos de distintas especies marinas. Los estudios que evaluan los efectos de la CLA en ecosistemas marinos son escasos en comparación con los ecosistemas terrestres. Por lo tanto, en este estudio evaluamos los efectos de la CLA en el comportamiento y la condición fisiológica del isópodo Tylos spinulosus, una especie caracteristica de las playas de arena del norte de Chile. Además, evaluamos las respuestas de esta especie una vez eliminada la presencia de CLA. Estos individuos se alimentan de algas varadas que quedan en el intermareal medio alto y poseen habitos nocturnos, por lo tanto es un buen modelo para evaluar los efectos de la CLA. Se evaluaron los efectos de la CLA en la actividad locomotora, mediante el uso de actografos durante cinco días y luego su recuperación potencial durante tres días adicionales; además se utilizaron recipientes para evaluar el consumo de alimento, eficiencia de absorción y tasa de crecimeinto y luego su potencial recuperación. Los resultados demuestran que la CLA fue perjudicial para la actividad locomotora, consumo de alimento y tasa de crecimemiento hasta que el estresor fue eliminado del sistema. Sin embargo, en la eficiencia de absorción no hubo una respuesta de compensación al bajo consumo de alimento. Estos resultados muestran que la CLA tendrá importantes efectos sobre especies marinas, pero con medidas adecuadas de mitigación, sus efectos podrían ser reversibles en el corto plazo. 3 4. ÁMBITO DE ACCIÓN Esta tesis corresponde al ámbito de acción 1 de la malla de biología Marina: investigación básica y aplicada. El resultado de aprendizaje asociado fue: realizar investigación básica que permita la comprensión y conservación de los ecosistemas marinos, además del ámbito de acción 2: gestión ambiental. El resultado de aprendizaje fue: evaluar los efectos sobre el medio ambiente marino y de las diferentes actividades productivas asociadas a este. 5. INTRODUCCIÓN El medio ambiente natural esta siendo transformado rapidamente por el cambio climático causado por las actividades humanas, alterando las propiedades fisicas, químicas y diversos procesos ecológicos a un ritmo acelerado en los ecosistemas marinos (Boyd et al., 2018). Debido a las actividades humanas, una de las principales consecuencias ha sido el incremento en el contenido de CO2 en la atmosfera y en los océanos, provocando dos procesos relevantes para los ecosistemas marinos, el primero es el calentamiento global, y el segundo es la acidificación de los océanos. Ambos fenomenos han mostrado tener efectos negativos en muchos procesos fisiológicos, teniendo un impacto en el crecimiento, desarrollo, y la supervivencia de los organismos (Widdicombe & Spicer, 2008). Sin embargo, la acidificación y el aumento de temperatura de los océanos no es la única presión antropogénica de escala global que tienen que enfrentar los organismos y ecosistemas marinos. Un problema emergente de gran importancia es la Contaminación Lumínica Artificial (CLA) (Holker et al., 2010). Los ciclos de luz y oscuridad naturales juegan un papel fundamental en los patrones de comportamiento, y en la sincronización de muchos procesos ecológicos (Gaston et al., 2012). La rotación de la Tierra divide el tiempo en un ciclo regular de luz y oscuridad, en el cual la 4 intensidad lumínica entre día y noche varía aproximadamente en diez ordenes de magnitud (Gaston et al., 2013). Estos ciclos de luz y oscuridad son de suma importancia, debido a que la mayoría de las especies han evolucionado bajo regimenes naturales y predecibles de luz (Davies et al., 2014). La mayor parte de la iluminación natural proviene de cuerpos celestes, tales como el reflejo del sol en la luna, las estrellas, y la vía lactea (Duarte et al., 2019). Tanto la luz como la oscuridad son recursos que utilizan los organismos para la sincronización de diversos procesos fisiológicos y de comportamiento. Por ejemplo, sincronizan eventos de reproducción (Gorbunov & Falkwoski., 2002), los organismos autótrofos utilizan la energía en forma de luz para transformarla en energía química (Gaston et al., 2013), los cuerpos celestes otorgan señales para la migración de aves (Akkeston et al., 2001), las fases lunares afectan los ritmos circadianos de isópodos y anfípodos en playas de arena. Por ejemplo, se ha demostrado que el isópodo Tylos spinulosus (Dana, 1853) y el coleoptero Phalerisida maculata (Kulzer) tuvieron una mayor actividad locomotora durante las horas nocturnas (especialmente el isópodo), pero incluso se ha demostrado que la luz de la luna puede inhibir la actividad locomotora de los organismos (Jaramillo et al., 2003). Además, las señales de la luna están intimamente involucradas en la migración vertical nocturna de especies pelágicas como el zooplancton (Ringelberg., 1999). La CLA es un estresor antropogenico que tiene el potencial de alterar los ciclos naturales de luz y oscuridad (Gaston et al., 2013). En el ambito marino, existen pocos estudios de los efectos de la CLA en comparación con los ecosistemas terrestres (Depledge et al., 2010; Davies et al., 2014). Sin embargo, durante los ultimos años ha comenzado a tener mayor relevancia. Por ejemplo, Luarte et al. (2016) demostraron que el anfipodo talitrido Orchestoidea tuberculata (Nicolet, 1849) mostró tener tasas de crecimeinto tres veces menor en presencia de CLA. Se ha demostrado que el reclutamiento de tortugas disminuye en más de un 7 % en presencia de CLA, donde las crias de tortuga se 5 ven desorientadas por los focos de las ciudades, evitando su llegada al mar (Depledge et al., 2010; Dimitriadis et al., 2018). El comportamiento de alimentación también ha sido documentado, por ejemplo, (Manriquéz et al., 2019) demostraron que la CLA afectó el comportamiento de alimentación de una especie clave como el loco (Concholepas concholepas) (Bruguiere, 1798), donde los juveniles de esta especie buscan y eligen sus presas de manera más eficiente en áreas oscuras, evitando las áreas iluminadas. También se ha documentado que la CLA tiene efectos negativos en la fisiología del pez intermareal Girella leavifrons (Tschudi, 1846), en donde los individuos expuestos a CLA presentan un mayor consumo de oxígeno que los individuos no expuestos (Pulgar et al., 2019). La luz artificial esta extendida por todo el mundo, si bien el uso generalizado de la luz se traduce en mayor seguridad para la población, esta ha transformado considerablemente los ambientes nocturnos. La luz artificial se expande espacialmente cerca de un 6 % cada año (Holker et al., 2010), y se ha documentado que el 22,2 % de las costas del mundo estan expuestas a CLA. Las tres regiones que presentan un mayor grado de contaminación lumínica son Europa, Asía, y África con un 54,3, 34,2 y 22,1 % de sus costas afectadas respectivamente, esto debido a que el 22,3 % de la población vive a menos de 100 Km de la costa (Davies et al., 2014), lo que ha provocado un aumento en la infraestructura costera, aumentando el grado de CLA en este tipo de ambientes (Holker et al., 2010). Los estudios que pretenden entender los efectos de la CLA en playas de arena son escasos, y más escasos aún son los estudios tendientes a entender la capacidad de recuperación que tienen los individuos una vez que el estresor es eliminado del sistema. Entender la capacidad de recuperación que tienen los individuos frente a la CLA es de suma importancia en terminos ecológicos, pero también es de suma importancia en terminos de mitigación, lo que permitiría manejar este estresor de un mejor forma y así lograr la conservación de los ecosistemas marinos. Uno de los escasos 6 estudios realizados para comprender la recuperación de los individuos frente a la CLA es el de (Fobert et al., 2019), donde los autores expusieron al pez payaso Amphiprion ocellaris (Cuvier, 1830) a CLA, los resultados demostraron que la tasa de eclosión de los huevos se vio altamente afectada, sin embargo, posterior a la eliminación del estresor, los porcentajes de eclosión alcanzaron niveles parecidos a los de los individuos del tratamiento control. Otro estudio realizado por Lynn &Quintanilla-Ahumada et al., (2021) demostraron que el anfipodo de playa de arena Americorchestia longincoris (Say, 1818) en el atlántico canadiense tiene la capacidad de recuperar su actividad locomotora posterior a la eliminación del estresor. Dentro de los ambientes costeros, las playas de arena son los ambientes más representativos de Chile y el mundo, estas representan cerca del 80 % de las costas a nivel mundial (Bascom, 1980). Las costas de Chile también están expuestas a CLA, en este tipo de ambientes habitan especies ecológicamente importantes como el isópodo Tylos spinulosus y el anfípodo talitrido Orchestoidea tuberculata, los cuales son habitantes típicos de playas arenosas. Tylos spinulosus es la única especie del género que se encuentra en las playas de arena en el norte de Chile (26-30°S), este isópodo permanece enterrado en la arena durante el día y emerge durante la noche para alimentarse de detritos orgánicos (algas varadas), contribuyendo a la transferencia de nutrientes desde la costa hacía el océano, y de esta manera facilitar la descomposición y posterior remineralización por parte de bacterias (Duarte et al., 2010; MacMillan & Quijón, 2012), posterior a alimentarse vuelven a cavar para permanecer enterrados (Jaramillo et al., 2006). Las algas varadas representan un suministro de alimento y/o refugio para algunas especies que habitan las playas de arena, y su disponibilidad natural es altamente variable (Duarte et al., 1999). La CLA puede interrumpir la búsqueda de estos recursos que no son permanentes, evitando que los organismos puedan alimentarse, repercutiendo directamente en las tasas de crecimiento, por lo que los efectos negativos de la 7 CLA pueden abarcar amplios niveles de organización biológica, que van desde un nivel molecular Quintanilla-Ahumada et al., (2021), hasta un nivel comunitario (Duarte et al., 2019). Debido a que Tylos spinulosus es una especie de hábitos nocturnos, se considera un buen modelo para realizar estudios de CLA en ambientes costeros (Duarte et al., 2019). En este estudio se evaluaron los efectos de la CLA, y la capacidad de recuperación de los isópodos, en la conducta (actividad locomotora y consumo de alimento) y condición fisiológica (eficiencia de absorción de alimento y tasa de crecimiento) de Tylos spinulosus. La hipótesis de este trabajo es la siguiente: los efectos de la CLA sobre la conducta y condición fisiológica de Tylos spinulosus son temporales y desaparecen una vez eliminado el estresor; esto se fundamenta principalmente en estudios anteriores, donde se ha demostrado que los efectos negativos de la exposición no prolongada a CLA pueden revertirse (Fobert et al., 2019; Lynn et al., 2021). Además, debemos considerar que las especies de playas de arena se caracterizan por presentar una plasticidad conductual alta, las cuales pueden reaccionar rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales y particularmente a perturbaciones impredecibles, estas adaptaciones incluyen ritmos de actividad, orientación, zonificación, respuestas de escape y estrategias de alimentación (Brown., 1996; Scapini., 2014; Lynn Tummon Flynn et al., 2021). En playas de arena solo se ha evaluado la recuperación de la actividad locomotora, en un anfípodo en el atlántico canadiense, por lo que este trabajo tiene como objetivo evaluar el efecto de la CLA, en la conducta y condición fisiológica de un isópodo de playa de arena en Chile y por primera vez evaluar el potencial de recuperación en la conducta y condición fisiológica de Tylos spinulosus. 8 6. HIPÓTESIS Los efectos negativos de la contaminación lumínica artificial sobre la conducta y condición fisiológica de Tylos spinulosus son temporales y desaparecen una vez eliminado el estresor. 7. OBJETIVO GENERAL Evaluar los efectos de la contaminación lumínica artificial sobre la conducta y condición fisiológica de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación luego de la eliminación del estresor. 8. OBJETIVOS ESPECÍFICOS 1. Evaluar el efecto de la contaminación lumínica sobre la actividad locomotora de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. 2. Evaluar el efecto de la contaminación lumínica sobre la tasa de consumo y eficiencia de absorción de alimento de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. 3. Evaluar el efecto de la contaminación lumínica sobre la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. 9. METODOLOGÍA Recolección de individuos Se recolectaron individuos de Tylos spinulosus durante la noche, desde el intermareal superior de la playa el “Apolillado” (-29°10´48.315´´S, -71°29´ 22.918´´W). Se seleccionó esta playa debido a que presenta una gran abundancia de Tylos spinulosus, además, está alejada de zonas con iluminación (Jaramillo et al., 2013; Duarte et al., 2019). La recolección de los individuos se realizó a mano con la ayuda de una luz roja. Se seleccionaron individuos de un tamaño similar (~1-1,5 cm) con el fin de evitar respuestas diferenciadas que pudieran 9 estar dadas por la edad, los individuos recolectados se fueron depositando en una caja de 15x25x10 cm de altura, esta contenía arena húmeda y agujeros de 1 mm para permitir el intercambio de gases, posteriormente fueron trasladados al laboratorio LECIMAT de la Universidad Andrés Bello (Duarte et al., 2019; Lynn &Quintanilla-Ahumada et al., 2021). Aclimatación de los isópodos Posterior a la recolección de los individuos, en el laboratorio los isópodos fueron aclimatados durante 48 horas, los cuales contenían arena húmeda, con temperatura y humedad controlada, y fueron expuestos a ciclos de luz natural por 48 horas, las cuales correspondieron a 12 horas de luz natural y 12 horas de oscuridad para la aclimatación. Objetivo específico 1: Evaluar el efecto de la CLA sobre la actividad locomotora de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. Posterior al periodo de aclimatación, los isópodos fueron expuestos a dos tratamientos de luz, el primero corresponde al tratamiento control, en el cual los individuos estuvieron con un ciclo de luz natural con 12 horas de luz natural y 12 horas de oscuridad, el segundo tratamiento corresponde al de CLA, en donde los isópodos tuvieron 24 horas con una luz LED de 50 lx. Esta intensidad lumínica está dada por las condiciones de luz existentes bajo los faroles más cercanos a la costa (Lynn et al., 2021). Cada acuario (Condiciones control y CLA) disponía de tres réplicas y cada réplica contenía 20 isópodos. Cada acuario, tanto para cada tratamiento y réplica estaba equipado con dos actografos, los cuales son un sistema de grabación infrarroja que registra digitalmente la actividad locomotora de los isópodos. La actividad locomotora se registró durante cinco días consecutivos, posterior a los cinco días, los experimentos se extendieron durante tres días más, con la diferencia que los individuos 10 que en un principio fueron expuestos a CLA (24 horas con luz LED 50 lx), ahora fueron expuestos a condiciones naturales de luz y oscuridad (12 horas luz y 12 horas oscuridad), con el fin de evaluar la posible recuperación de la actividad locomotora posterior a la eliminación del estresor (Duarte et al., 2019; Luarte et al., 2016; Lynn & Quintanilla-Ahumada et al., 2021). Objetivo específico 2: Evaluar el efecto de la CLA sobre la tasa de consumo y eficiencia de absorción de alimento de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. Consumo de alimento Para evaluar el consumo de alimento, los isópodos fueron expuestos a los mismos tratamientos control y CLA, que tenían las mismas características mencionadas anteriormente, en este experimento se disponía de diez réplicas y cada réplica contenía tres isópodos en recipientes de 7x7x7 cm, el consumo de alimento se midió cada 24 horas por dos días, para cada una de las réplicas se pesó un trozo de alga fresco y se les ofreció a los isópodos, luego de 24 horas, se volvió a pesar el trozo de alga con la misma balanza, para calcular el consumo de alimento por parte de los isópodos, La tasa de consumo de alimento se calcularon mediante la pérdida de peso de los fragmentos de algas (pesos finales – pesos iniciales), paralelamente se disponían de recipientes que no contenían isópodos, con el fin de calcular el cambio en el peso del alga, sin el consumo por parte de los isópodos, luego de 48 horas, los experimentos se extendieron durante 48 días más, con la diferencia que los individuos que en un principio fueron expuestos a CLA, ahora se expusieron a condiciones normales de luz y oscuridad (12 horas luz y 12 horas oscuridad), con el fin de evaluar la recuperación en el consumo de alimento de los isópodos. El número de réplicas, individuos 11 por réplicas, se basó en estudios con diseños experimentales similares para evaluar la tasa de consumo de alimento (Luarte et al., 2016; Lynn & Quintanilla-Ahumada et al., 2021). Eficiencia de absorción de alimento Para la eficiencia de absorción de alimento, los isópodos fueron expuestos a los mismos tratamientos control y CLA, con las mismas características mencionadas anteriormente, este experimento contaba con diez réplicas y tres individuos por réplicas. Sin embargo existe una diferencia con el resto de los experimentos, los recipientes en vez de contener arena, tenían una esponja en el fondo del recipiente que era humedecida diariamente, esto con el fin de facilitar la recolección de las heces, durante tres días se recolectaron diariamente las heces de cada réplica y se depositaban en un tubo eppendorf que inmediatamente se congelaba a 20°C, debido a que en este experimento los individuos no tenían la posibilidad de esconderse bajo la arena, durante las horas nocturnas, los recipientes fueron puestos en oscuridad absoluta, para evitar que recibieran la luz directamente durante las horas nocturnas, por lo tanto, cada día a las 20: 00 pm, los recipientes se colocaban en oscuridad y luego a las 08:00 am los recipientes se colocaban expuestos a la luz, luego de tres días, los experimentos se extendieron durante tres días adicionales, con la diferencia que los individuos que en un principio fueron expuestos a CLA, ahora fueron expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (12 horas de luz y 12 horas de oscuridad), una vez terminados los experimentos, tanto de impacto como de recuperación, las heces fueron secadas a 60°C por 48 horas, se pesaron en una balanza con una precisión de 0,0001 g y posteriormente fueron incineradas a 500°C para calcular la eficiencia de absorción, esta se calculó utilizando la relación de (Conover, 1966) de fracciones orgánicas e inorgánicas, tanto de los alimento ingeridos como de las heces, esta metodología asume que el proceso de absorción por parte del isópodo, solo 12 afecta la fracción orgánica del alga y puede ser calculada como porcentaje mediante la siguiente formula: EA = ((F´ - E´) / (1 – E) F´) * 100 donde: F´ corresponde a la fracción orgánica en el alimento y E´ corresponde a la fracción orgánica en las heces (Luarte et al., 2016; Lynn & Quintanilla-Ahumada et al., 2021). Objetivo específico 3: Evaluar el efecto de la CLA en la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus y su capacidad de recuperación. Para medir las tasas de crecimiento de los isópodos, estos fueron puestos en recipientes plásticos de 7x7x7 cm, los individuos fueron expuestos a dos tratamientos; Control y CLA, que tienen las mismas características que los experimentos mencionados anteriormente. Cada tratamiento tenía diez réplicas y cada réplica un isópodo. Los contenedores contenían arena que era humedecida diariamente y se les dio alga al libitum (disponían alimento de sobra para comer) y se les recambiaba diariamente durante los diez días que duro el experimento. Antes de comenzar el experimento cada individuo fue pesado con una balanza de precisión al 0,0001 g, luego la mitad de los individuos fue asignado al azar, al tratamiento control, y la otra mitad al tratamiento con CLA. Luego de diez días, los isópodos fueron pesados nuevamente con la misma balanza para ver la tasa de crecimiento, que fue calculada mediante la siguiente formula: (pesos finales – pesos iniciales), posterior a los diez días, los experimentos se extendieron durante diez días más, con la diferencia que los individuos que en un principio fueron expuestos a CLA, ahora fueron expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad, una vez que terminaron los diez días, los individuos fueron pesados nuevamente, para observar si hubo una recuperación en la tasa de crecimiento (Luarte et al., 2016; Lynn & Quintanilla-Ahumada., 2021) 13 10. ANÁLISIS ESTADÍSTICOS Para determinar los efectos de la CLA sobre la actividad locomotora, se promedió la actividad durante el periodo de impacto y recuperación. Los gráficos resultantes fueron comparados cualitativamente para determinar el efecto de la CLA sobre la actividad. Esta comparación se basó en estudios previos realizados con esta misma especie. En el caso de los experimentos de consumo de alimento, eficiencia de absorción y tasa de crecimiento se realizó un análisis de ANOVA de una vía. Similar análisis fue utilizado para determinar la capacidad de recuperación de los animales posterior a la eliminación del estresor. Para estos efectos se analizaron los datos de impacto y recuperación por separado, siguiendo la metodología estadística de trabajos similares (ver Lynn & Quintanilla-Ahumada., 2021), esto con el fin de comparar en primera instancia, el tratamiento control con el de CLA, y en segunda instancia, el tratamiento control con el periodo de recuperación, estos análisis fueron llevados a cabo en el software R studio. 11. RESULTADOS: Actividad locomotora Periodo de impacto La actividad locomotora de Tylos spinulosus mostró una clara tendencia durante las horas de oscuridad entre las 01:00 am y las 07:00 am, alcanzando el mayor promedio de actividad a las 04:00 am. Por el contrario, hubo poca o nula actividad durante los periodos con luz entre las 07:00 am y las 19:00 pm. En el caso de los tratamientos expuestos a CLA, se detectó una fuerte inhibición o alteración del ritmo circadiano, donde se observa que no existe actividad locomotora ni durante las horas nocturnas ni diurnas (Figura 1). Periodo de recuperación 14 Para el periodo de recuperación, la actividad locomotora de los individuos inicialmente expuesto a CLA, y luego expuestos a tres días en condiciones normales de luz y oscuridad, mostraron una actividad locomotora durante las horas nocturnas, en periodos muy similares a los del tratamiento control, donde el mayor promedio de actividad se observó entre las 01:00 am y las 08:00 am. El mayor promedio de actividad se registró a las 04:00 am, se puede observar que los isópodos aumentan su promedio de actividad en comparación con el tratamiento control, y se evidencia la recuperación de su ritmo de actividad regular una vez que el fotoperiodo regresó a la normalidad (Figura 2). Actividad locomotora periodo impacto Promedio de actividad 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Control Horas CLA impacto Figura 1: Promedio de actividad locomotora de Tylos spinulosus a lo largo de un ciclo de 24 horas, en respuesta a las condiciones control y CLA durante el periodo de impacto. 15 Actividad locomotora recuperación Promedio de actividad 0,4 0,3 0,2 0,1 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Horas Control CLA recuperación Figura 2: Promedio de actividad locomotora de Tylos spinulosus a lo largo de un ciclo de 24 horas, en respuesta a las condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación. Tasa de consumo Periodo de impacto En promedio, los isópodos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (controles), mostraron un mayor tasa de consumo de alimento que la medida en los isópodos expuestos a CLA (en promedio 0,3 y 0,2 mg d-1 respectivamente; p< 0,05; figura 3). Periodo de recuperación Durante el periodo de recuperación, los individuos que inicialmente fueron expuestos a CLA y luego fueron expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad, mostraron un mayor consumo de alimento en comparación a los individuos control (0,35 y 0,25 mg d-1 respectivamente; p<0,05; figura 4). 16 Consumo de alimento mg d-1 Consumo de alimento periodo impacto 0,4 0,3 0,2 0,1 0 CONTROL CLA Figura 3: Promedio de consumo de alimento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto (p=0,003) Consumo de alimento mg d-1 Consumo de alimento periodo recuperación 0,4 0,3 0,2 0,1 0 CONTROL CLA Figura 4: Promedio de consumo de alimento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación (p=0,002) Eficiencia de absorción Periodo de impacto La eficiencia de absorción fue mayor en los individuos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (controles), en comparación a los expuestos a CLA (~ 45 y 40 % respectivamente; p<0,05; figura 5). 17 Periodo de recuperación Para el periodo de recuperación, la eficiencia de absorción siguió la misma tendencia que para el periodo de impacto, donde los individuos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (controles), tuvieron una mayor eficiencia de absorción, que los individuos que en un principio estuvieron expuestos a CLA, y que luego de tres días fueron expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (~50 y 35 % respectivamente; p<0,05; figura 6). Eficiencia de absorción (%) Eficiencia de absorción periodo impacto 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 CONTROL CLA Figura 5: Porcentaje de la eficiencia de absorción de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto (p=0,04). 18 Eficiencia de absorción (%) Eficiencia de absorción periodo recuperación 55 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 CONTROL CLA Figura 6: Porcentaje de la eficiencia de absorción de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación (p=0,004). Tasa de crecimiento Periodo de impacto Las tasas de crecimiento de los isópodos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad (controles), promediaron ~ 0,005 mg y fueron más altas que los individuos expuestos a CLA, los cuales perdieron peso (~ -0,001 mg; p<0,05; figura 7). Periodo de recuperación Durante el periodo de recuperación, la tasa de crecimiento de los individuos que en un principio fueron expuestos a CLA fue mayor en comparación a los individuos control (0,012 y 0,07 mg respectivamente), sin embargo, estas diferencias no fueron significativas, esto es atribuible a valores extremos. (p>0,05; figura 8). 19 Tasa de Crecimiento mg Tasa de crecimiento periodo impacto 0,02 0,016 0,012 0,008 0,004 0 CONTROL CLA -0,004 Figura 7: Promedio de la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de impacto (p=0,007). 0,02 Tasa de crecimiento periodo recuperación 0,016 0,012 0,008 0,004 0 CONTROL CLA Figura 8: Promedio de la tasa de crecimiento de Tylos spinulosus en condiciones control y CLA durante el periodo de recuperación (p=0,719). 20 12. DISCUSIÓN Actividad locomotora Las playas de arena y ecosistemas costeros están siendo cada vez más afectadas por distintas presiones antropogénicas, y muchas playas requieren con urgencia medidas de mitigación y conservación (Schlacher et al., 2016). Entre estas presiones antropogénicas encontramos la CLA, la cual está ampliamente extendida y afecta al 22.2 % de las costas del mundo (Davies et al., 2014). En los últimos años se han documentado los impactos ecológicos que la CLA está provocando en las costas, para esto es de suma importancia seguir evaluando los efectos que la CLA puede causar en distintas especies marinas. Los efectos de la CLA pueden variar tanto espacial como temporalmente, dependiendo de las fuentes de iluminación y las características espectrales de la misma (Davies et al., 2014). Los resultados de este estudio demuestran los efectos adversos de este estresor sobre la condición fisiológica y conductual de Tylos spinulosus. Interesantemente, estos efectos negativos desaparecieron una vez eliminado el estresor. La actividad locomotora tanto en condiciones control como en condiciones de CLA observadas en este estudio, fueron consistentes con experimentos de campo y laboratorio realizados previamente, por ejemplo, (Duarte et al., 2019), donde los autores encontraron que en los experimentos de laboratorio, las mayores probabilidades de actividad locomotora ocurrieron en condiciones normales de luz y oscuridad, las cuales fueron registradas durante las horas nocturnas, con el máximo de actividad a las 2:00 am, que es cuando los isópodos se mueven sobre la superficie de la playa para alimentarse de algas varadas, y la actividad más baja las registraron durante las horas diurnas entre las 06:00 am y 08:00 pm. Sin embargo, para las condiciones de CLA, Tylos spinulosus exhibió una drástica inhibición en 21 la actividad locomotora, donde no hubo actividad ni durante las horas nocturnas ni diurnas, resultados similares a los encontrados en este estudio. Otro estudio también registró efectos negativos de la CLA en la actividad locomotora en el anfípodo Orchestoidea tuberculata, donde la actividad locomotora fue inhibida por la presencia de CLA Luarte et al., (2016). Estos resultados se suman a la evidencia que apunta a los efectos negativos de la CLA en la actividad locomotora de especies de hábitos nocturnos. La actividad locomotora nocturna de estas especies es atribuible a factores tanto físicos como biológicos, al tener una actividad nocturna, evitan la desecación debido a la mayor humedad que existe durante la noche, además que sus ojos están mejor adaptados a la oscuridad, y alimentarse durante la noche evita la mortalidad por parte de sus predadores como las aves (Dugan et al., 2004). Consecuentemente, la CLA podría alterar significativamente la conducta de esta y otras especies. Con respecto al periodo de recuperación, los isópodos retomaron inmediatamente su actividad locomotora una vez que las condiciones de luz volvieron a la normalidad, tal como había sido registrado en un estudio previo Lynn & Quintanilla-Ahumada et al., (2021). En este estudio los autores evalúan la actividad locomotora y su recuperación en el anfípodo Americorchestia longicornis, que al igual que los resultados obtenidos en este estudio, los anfípodos fueron capaces de recuperar su actividad locomotora de manera inmediata una vez que el estresor fue eliminado del sistema. La actividad locomotora registrada por los actografos en los experimentos con CLA, mostraron que los isópodos permanecieron enterrados durante la mayor parte del experimento, lejos de la actividad registrada por los actografos en los experimentos control y en los experimentos de campos mostrados en otros estudios con especies nocturnas (Luarte et al., 2016; Duarte et al., 2019; Lynn & Quintanilla22 Ahumada., 2021), lo que nos indica la pérdida o supresión temporal de su ritmo circadiano normal en presencia de CLA (Jaramillo et al., 2003). Es importante destacar que las respuestas frente a la CLA en la actividad locomotora pueden variar tanto intra como inter específicamente. En condiciones de laboratorio también se ha demostrado que la CLA puede extender la actividad locomotora, como es el caso de Orchestia gammarellus, donde el periodo circadiano se extendió con el aumento de la intensidad lumínica (Jelassi et al., 2014). A medida que la CLA sigue aumentando espacialmente, es probable que este tipo de respuestas anómalas ocurra en otras especies de hábitos tanto nocturnos como diurnos, sin embargo, como quedó demostrado en los experimentos de recuperación, es probable que estas interrupciones sean temporales, aunque se debe tener en cuenta el tiempo de exposición, distancia de la fuente y la intensidad lumínica a la que se puedan ver enfrentadas las especies. Para esto se hace necesario seguir realizando estudios en los que se tenga en cuenta un periodo de exposición más prolongado y con distintas intensidades lumínicas, por ejemplo, Luarte et al., (2016) encontraron evidencia que Orchestoidea tuberculata mostró actividad diurna siete días después de iniciado los experimentos, lo que nos dice que posiblemente, los individuos puedan mostrar distintas respuestas luego de un periodo de exposición más largo. La intensidad lumínica utilizada en este estudio (50 lx) es consistente con intensidades lumínicas comunes en playas de arena que están expuestas a CLA, las evidencias tanto en estudios de campo como de laboratorio demuestran que la CLA provoca una reducción o inhibición de la actividad locomotora de Tylos spinulosus y en otras especies de playas de arena. 23 Consumo de alimento Las especies que se alimentan durante los periodos nocturnos (Fordward et al., 2010) y que su actividad locomotora se ve afectada por la CLA como la documentada para Tylos spinulosus y otras especies, verán afectado su consumo de alimento, esto principalmente debido a que los individuos expuestos a CLA permanecen enterrados durante la mayor parte del periodo de impacto. Los resultados obtenidos en este estudio para el consumo de alimento durante el periodo de impacto demostraron que el consumo fue mayor en el tratamiento control en comparación con el de CLA, estos resultados son consistentes con lo reportado por Luarte et al., (2016), donde los autores demostraron que los individuos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad presentaron consumo de alimento dos veces mayores que los individuos expuestos a CLA. Similarmente Manríquez et al., (2019) demostraron efectos adversos de la CLA en el comportamiento de alimentación de una especie clave como el loco, donde los autores demostraron que los individuos buscan y eligen sus presas de mejor manera en zonas oscuras, evitando las iluminadas. Hasta donde sabemos, no existen estudios previos que evalúen la recuperación sobre el consumo de alimento, eficiencia de absorción y tasa de crecimiento en invertebrados de playas de arena luego de la exposición a CLA. Durante el periodo de recuperación, los isópodos lograron recuperar su consumo de alimento, e incluso se alimentaron más que los isópodos en condiciones control, esto ocurre principalmente porque se ha reportado que los animales que habitan playas de arena se caracterizan por presentar una alta plasticidad conductual, donde pueden reaccionar rápidamente a los cambios en las condiciones ambientales y a perturbaciones impredecibles, estas adaptaciones incluyen ritmos de actividad, orientación, respuestas de escape y estrategias de alimentación (Scapini., 2014), tales adaptaciones quedan demostradas en este 24 estudio con las respuestas de comportamiento de Tylos spinulosus, donde los individuos son capaces de recuperar de manera inmediata sus ritmos de actividad y de consumo de alimento una vez que el estresor es retirado del sistema. En las playas de arena, los organismos móviles se distribuyen desde el intermareal bajo hacía el alto, y tales zonas abarcan cambios ambientales radicales como, tamaño del grano, humedad, temperatura y contenido orgánico, por lo que estos animales deben responder a estos factores ambientales de manera rápida, tales respuestas pueden favorecer a colonizar nuevos ambientes favorables y afrontar sucesos estresantes (Defeo et al., 2005) y eso explicaría la rápida respuesta de los animales cuando el estresor fue eliminado del sistema. Eficiencia de absorción Como se mencionó anteriormente, los resultados de este estudio mostraron que la exposición a CLA (50 lx) afectaron significativamente el consumo de alimento de los isópodos, estas bajas significativas en el consumo de alimento no se vieron compensadas por un incremento en la eficiencia de absorción. Se ha demostrado que algunos animales muestran una aumento en la eficiencia de absorción de alimento como respuesta compensatoria a la falta de alimento disponible o en ausencia de alimento de mayor valor nutricional (Simpson & Simpson., 1990; Duarte et al., 2010). La eficiencia de absorción para el periodo de impacto fue mayor en los isópodos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad en comparación con los isópodos expuestos a CLA, resultados parecidos a los ya reportados en Orchestoidea tuberculata Luarte et al., (2016) y también en Americorchestia longicornis Lynn & Quintanilla-Ahumada., (2021). Estos resultados no eran esperables, debido a que era esperable que los individuos que consumen poco alimento tengan una respuesta compensatoria con la eficiencia de absorción, para de esta forma extraer la mayor cantidad 25 de nutrientes posible del alimento como ha sido reportado en otros estudios. Por ejemplo, Norman & Lamprech., (2006), reportaron que en el anfípodo Gammarus oceanicus vieron afectados su consumo de alimento en situaciones de estrés por alta salinidad, sin embargo, su eficiencia de absorción de alimento se incrementó en un 124% como compensación al bajo consumo de alimento. De todos modos, hay que tener en cuenta que el tiempo de exposición a CLA (tres días) que fue lo que duró el periodo de impacto en este experimento, quizás no es suficiente para poder tener respuestas de compensación, otra posible respuesta a esta no compensación, puede estar dada por el sitio de recolección de los individuos, debido a que los isópodos fueron recolectados en áreas sin iluminación artificial, por lo que una respuesta de compensación frente a la CLA aún no este arraigada genéticamente como lo propuesto por Lynn & Quintanilla-Ahumada., (2021). Para esto se hace necesario seguir ahondando en este tipo de estudios, y evaluar la eficiencia de absorción en distintas poblaciones de Tylos spinulosus de playas expuestas y no expuestas a CLA. En el caso del periodo de recuperación se obtuvieron resultados similares a los del periodo de impacto, los isópodos que fueron expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad mostraron la mayor eficiencia de absorción en comparación con los isópodos expuestos a CLA. Tasa de crecimiento Con los efectos adversos en la actividad locomotora, consumo de alimento y eficiencia de absorción, es esperable que causalmente las tasas de crecimiento de los isópodos se vieran reducidas. Luego de 10 días, los individuos en condiciones normales de luz y oscuridad mostraron una tasa de crecimiento modesta en comparación a los individuos expuestos a CLA, los cuales tuvieron tasas de crecimiento negativas. Para el periodo de recuperación los 26 individuos que en un principio fueron expuestos a CLA mostraron un significativo aumento en la tasa de crecimiento en comparación a los individuos expuestos a condiciones normales de luz y oscuridad, sin embargo, tales diferencias no fueron significativas (p>0,05). La variabilidad en las respuestas podría explicar estos resultados. Por lo tanto, estudios futuros deberían incrementar el número de réplicas. Efectos adversos en la tasa de crecimiento frente a la CLA ya han sido documentadas anteriormente, por ejemplo, en murciélagos se ha documentado que los individuos que viven en edificios iluminados presentan tasas de crecimiento menor que los que viven en edificios con menos iluminación (Boldogh et al., 2007) y también se ha documentado la disminución en el crecimiento en anfípodos, por ejemplo (Luarte et al., 2016; Lynn & Quintanilla-Ahumada., 2021). Las tasas de crecimiento se han utilizado como un indicador de la aptitud de invertebrados marinos, además otros rasgos asociados a la aptitud pueden potencialmente verse más afectadas que las respuestas observadas en este estudio, como, por ejemplo, la supervivencia, reproducción y actividad enzimática, a pesar de esto, la evaluación de estos rasgos está fuera del alcance de este estudio (Fobert et al., 2019). 13. CONCLUSIÓN En general, los resultados observados en estudio demuestran que la CLA afecta negativamente la conducta y condición fisiológica de Tylos spinulosus, y que estos efectos negativos son al menos temporales para la actividad locomotora, consumo de alimento y tasa de crecimiento si las fuentes de CLA son eliminadas del sistema. Los resultados expuestos en este estudio y en otros similares, demuestran los efectos adversos que la CLA tiene en los ecosistemas marinos, así también estos resultados son de suma importancia para tomar medidas de mitigación y conservación en los ecosistemas marinos que cada vez son más 27 afectados por este estresor. Los estudios a futuro deben centrarse en evaluar la respuesta y recuperación frente a la CLA en diferentes especies y a lo largo de la ontogenia de los animales, también se debe tener en cuenta que las respuestas pueden ser diferentes frente a las distintas características espectrales de la luz, tiempos de exposición y distancia de la fuente, es por eso que se debe seguir ahondando en este tipo de estudios, sobre todo en aquellos que evalúen la capacidad de recuperación de los animales frente a este estresor, que aún son sumamente escasos en Chile y el mundo. 28 14. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS Åkesson, S., Walinder, G., Karlsson, L., & Ehnbom, S. (2001). 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