FACULTAD DE ESTUDIOS SUPERIORES “ZARAGOZA” MICROBIOLOGIA GENERAL I SEMINARIO DE AISLAMIENTO Y CUANTIFICACION DE MICROORGANISMOS AISLAMIENTO Y CUANTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS AISLAMIENTO Consiste en separar los microorganismos de interés de una comunidad microbiana ,el aislamiento es importante por que se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicación en biotecnología y en microbiología ambiental e industrial. ¿COMO SE LOGRA? El aislamiento se logra por medio de cultivo selectivo para el organismo que se desea aislar, e inhibir el crecimiento de otros microorganismos no deseados pero sin afectar a la especie o grupo que se desea aislar. MEDIO DE CULTIVO CLASIFICACION EMB SELECTIVO Y DIFERENCIAL Escherichia coli Klebsiella pneumoniae Enterococcus faecalis SAL Y MANITOL SELECTIVO Y DIFEENCIAL Staphylococcus auerus Escheriachea coli Klebsiella pneumoniae S-110 SELECTIVO Staphylococcus aureus MAC CONKEY SELECTIVO Y DIFERENCIAL CHAPMAN SELECTIVO EJEMPLO DE M.O AISLADOS Shigella flexneri Proteus mirabilis E. Coli S . aureus ¿CÓMO LOGRO UN AISLAMIENTO? Separando los microorganismos físicamente mediante diluciones o por agotamiento (estría). Utilizando medios de cultivo selectivos para inhibir los m.o no deseados. CUANTIFICACION Es un método muy utilizado en diferentes áreas como por ejemplo: Industria alimenticia (leches, jugos, néctares) Hospitalaria (procesos patológicos infecciosos) MÉTODOS DE CUANTIFICACION Existen métodos que permiten establecer el número de microorganismos o en una muestra dada. Hay métodos que cuantifican el numero de células, y existen otros que cuantifican la masa total de la población. RECUENTO EN PLACA POR FILTRO DE MEMBRANA Fundamento Paso de la muestra a través de una membrana porosa que retiene los microorganismos y que posteriormente se coloca sobre una placa. RECUENTO EN PLACA POR FILTRO DE MEMBRANA Ventajas Desventajas Mide el no. De células viables Requiere bastante tiempo (24 horas o más) Las bacterias crecen en unidad, en cadenas o como grumos RECUENTO EN PLACA Fundamento: Se basa en la suposición de que cada bacteria o agrupación de colonia crece y se divide para formar una sola colonia. Dispersión de la muestra Formación de colonias ¿COMO SE CUENTAN LAS COLONIAS POR VACADO EN PLACA? El método más usual para realizar el conteo de células viables se basa en contar el número de células de una muestra que es capaz de formar colonias al sembrarlo en un medio adecuado. Método de extensión en placa. Método de vertido en placa (o diluciones). RECUENTO EN PLACA Ventajas Desventajas Mide el no. De células viables Requiere bastante tiempo (24 horas o más) Microorganismos sensibles al calor pueden resultar dañados por el agar fundido Las bacterias crecen unidad, en cadenas o como grumos. SIEMBRA POR VERTIDO DE PLACA Ventajas Desventajas Mide el no. De células viables Requiere bastante tiempo (24 horas o más) Microorganismos sensibles al calor pueden resultar dañados por el agar fundido Las bacterias crecen unidad, en cadenas o como grumos. En medios diferenciales las colonias que se forman debajo de la superficie no son adecuadas (solo las de la superficie) FACTORES QUE AFECTAN EL VACIADO EN PLACA • Tipo de muestra y microorganismos presentes en ella. • Procesamiento de la muestra. • Temperatura del medio de cultivo. • Tipo de diluyentes. • Es importante que haya un número determinado de colonias en la placa (30-300). RECUENTO EN PLACA POR EXTENSION SUPERFICIAL FUNDAMENTO Se basa en la extensión de la muestra, agregada con un asa calibrada sobre una placa seca. RECUENTO EN PLACA POR EXTENSION SUPERFICIAL Ventajas Desventajas rápido Poco exacta No diluciones Carencia de uniformidad en la extensión Muy poca muestra tiempo Evita el contacto de las células con el agar fundido DILUCIONES SERIADAS FUNDAMENTO: VENTAJAS Es fácil. DESVENTAJAS Afecta el no hacer bien las diluciones. No homogenizar bien la muestra. No contar correctamente. Cuenta los viables mesofilos. No cuenta anaerobios. Cuantifica muestras solidas y trabajar mas. No cuantifica bacterias exigentes nutricionalmente. FUNDAMENTO: VENTAJAS Su rapidez. No ocupas material de laboratorio. Se utiliza poca muestra. No hay restricción de unidades formadoras de colonias. DESVENTAJAS El tiempo. MILES-MISRA FUNDAMENTO: Nùm. De bacterias (mL) = NxF V DESVENTAJAS No es fácil. Hay restricción. El tiempo. RECUENTO ELECTRONICO CONTADORES ELECTRONICOS Un volumen fijo de una suspensión bacteriana es forzada a pasar desde un compartimiento al otro a través del pequeño conducto, en un muy breve intervalo de tiempo. Cuando un microorganismo pasa al nuevo compartimiento, la resistencia de éste se incrementa debido a que la conductividad de la célula es menor que la del medio. Estos cambios en la resistencia son convertidos en pulsos o voltaje y contados RECUENTO ELECTRONICO Es posible contar y medir varios miles de partículas por segundo, independientemente de su forma, color y densidad. Ciertas bacterias muy pequeñas producen cambios en la resistencia que son comparables al "ruido" generado por la turbulencia que se desarrolla al pasar el fluido por el orificio. RECUENTO MICROSCOPICO RECUENTO EN CAMARA DE PETROFF-HAUSER Un volumen conocido de muestra es depositado en un portaobjetos especial para cuenta, esta consiste de un portaobjetos excavado y cuadriculados que facilitan el recuento por unidad de superficie y de volumen. RECUENTO MICROSCOPICO Este tipo de recuento se utiliza para determinar la cantidad total de microorganismos de una muestra. Es un método que resulta ser bastante exacto debido a que tiene una dimensión que facilita el conteo de los microorganismos por cuadrante. CUANTIFICACION Tipo de cuadro Area [cm2] Cuadrado total 1.00 x 10-2 Cuadrado grande 4.00 x 10-4 Cuadrado pequeño 2.50 x 10-5 Volume n [ml] Factor [1/Volume n 2.00 x 10-5 5.00 x 104 8.00 x 10-7 1.25 x 106 5.00 x 10-8 2.00 x 107 CAMARA PETROFF HAUSER Ventajas: Es un método que se realiza fácilmente. Su procedimiento es rápido. Si se realiza adecuadamente es muy exacto. Desventajas: No es posible diferenciar microorganismos vivos de microorganismos muertos CUANTIFICACION 1/Dilución: Inversa de la dilución utilizada para llenar la cámara de recuento. Número de cuadrados contados: Cantidad de cuadrados de la cámara que se utilizaron para contar un el número de bacterias. Volumen del cuadrado: Volumen de cada cuadrado de la cámara. Depende del tipo de cuadrado en donde se realizó el recuento. Por ejemplo, cada cuadrado pequeño tiene un volumen de 5 x 10-8 ml (50 µm x 50 µm x 20 µm = 5 x 104 µm3 = 5 x 10-8 ml) MÉTODO DE BREED FUNDAMENTO: Es un método directo para cuantificar células totales en el cual un volumen conocido de la muestra diluida se extiende uniformemente sobre la superficie de un portaobjetos normal. Observando al microscopio el campo de observación contando los microorganismos en diversos campos microscópicos. Se obtiene el valor medio de células por campo que se logra multiplicando el número de campos microscópicos comprendidos en la preparación. Ello da el número de microorganismos existentes en el volumen conocido que a su vez al multiplicarse por 100 indica el total de microorganismos /ml o g de muestra original. VENTAJAS Es un método rápido Es un método económico DESVENTAJAS Es imposible diferenciar a las células vivas de las muertas. Cuando se tienen muestras que contienen poblaciones pequeñas, el margen de error es grande. El método no suele ser adecuado para suspensiones con baja densidad celular. Las pequeñas células son difíciles de ver. APLICACIÓN Utilizada para contar bacterias de la leche. Es usado para diagnóstico de mastitis bovina (diagnóstico subclínico). MÉTODO DEL NÚMERO MÁS PROBABLE (NMP) FUNDAMENTO: Es un método estadístico que se fundamenta en la teoría de la probabilidad. En él se preparan múltiples series de diluciones decrecientes, con cada dilución se inoculan varios tubos que contienen el medio de cultivo adecuado. APLICACIONES Este método se utiliza para contar microorganismos difíciles de cultivar en medio sólido, o para determinar el número de células que pueden crecer en un medio líquido determinado, como el análisis para determinar la contaminación del agua potable. NEFELOMETRÍA (TURBIDEZ) FUNDAMENTO. En una suspensión microbiana, la cantidad de m.o está directamente relacionada con la turbiedad o densidad óptica de la misma, e inversamente relacionada con la cantidad de luz que pasa por la misma. A mayor turbidez mayor número de bacterias. ESCALA MCFARLAND Es una curva estándar construida con una suspensión testigo de concentración celular conocida. Se basa en la mezcla de concentraciones crecientes de BaCl2 con concentraciones decrecientes de ácido sulfúrico obteniéndose un precipitado de Sulfato de bario en cantidades diferentes. VENTAJAS Rápido Poca muestra Sensible DESVENTAJAS No debe tener materia orgánica en suspensión. No debe tener color. Es total. La curva no esta hecha a base de bacterias si no de sales. Bibliografía Vullo. Microbiología en la práctica. Editorial atlante. Buenos Aires Argentina. 2000. pág 61-73 Dauget. Técnicas en bacteriología. Editorial Jims. Barcelona España. 1977. pág. 82-86. Alejandro Camacho; Ruth Alvarez. Manual de microbiología
