Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas DETERMINACION DE PROTEÍNA POR EL MÉTODO DE BRADFORD Objetivos Elaborar una curva estándar de calibración mediante un método espectofotométrico utilizando soluciones estándar considerando datos de absorción y concentración conocida. Comprender el fundamento del método desde un punto de vista cuantitativo y establecer las ventajas y desventajas de su uso en muestras de leche. Cuantificar con validez estadística la cantidad de proteína en tres muestras de leche distintas y comparar los resultados con los parámetros establecidos en la norma y en los estándares oficiales mexicanos. Reportar los resultados en las unidades correspondientes a las concentraciones tras el cálculo utilizando la curva estándar elaborada con soluciones estándares. Marco teórico Investigar previo a la sesión de laboratorio los siguientes puntos: 1. Proteínas: ¿qué son? ¿Cuáles son sus propiedades fisicoquímicas? Ejemplos de proteínas encontradas en leche y su importancia industrial. 2. Método de Bradford para determinación de proteínas. Fundamento y reacciones presentes, coeficientes de extinción y reactivos utilizados para establecer la reacción colorimétrica. ¿Por qué usamos la albúmina para llevar a cabo la curva de calibración? 3. Describe que es el Azul Brillante de Coomasie G250, su estructura química y la reacción que el mismo tiene con las proteínas 4. Leyes y tipos de espectrofotometría: Ley de Lambert-Beer. ¿Cuál es la importancia de llevar a cabo una curva de calibración? Comprender la ecuación de Lambert-Beer 5. Espectrofotómetro y sus partes básicas. ¿Qué mide el equipo y cuales deben ser sus condiciones de uso? 6. Definiciones de absorbancia, transmitancia, longitud de onda, longitud de paso óptico, celda, blanco, solución estándar y solución problema en el ámbito de la espectrofotometría. 7. Estudiar el material y los reactivos empleados en esta práctica para comprender las medidas de seguridad necesarias durante el experimento. 8. Estudiar y comprender el procedimiento para llevar a cabo este método. _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 1 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Materiales y Reactivos 1 gradilla para tubos de 18x250 18 tubos de ensayo 18x250 c/tapón 4 vasos de precipitado de 50mL 3 pipetas graduadas de 1mL Celdas para espectrofotómetro 3 pipetas graduadas de 5mL 3 pipetas volumétricas de 5mL Guantes Látex Piseta con agua destilada 3 matraces aforados de 50mL Equipo o material 1 propipeta de 1 mL 1 propipeta de 5 mL 1 Vernier 1 balanza analítica 1 marcador permanente REACTIVOS Albúmina. Solución estándar para curva de calibración (0.25 mg/mL) Agua destilada Reactivo de Bradford Procedimiento PREPARACIÓN DE LA CURVA DE CALIBRACIÓN 1. Preparar 5mL de la solución de albumina, haciendo una dilución de albúmina sérica a una concentración 0.25mg/mL 2. Prepare su curva de calibración de acuerdo con la siguiente tabla: Tubo No mL de solución de proteína (0.25 mg/mL) Agua destilada (mL) Blanco 1 2 3 4 5 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 3.0 2.9 2.8 2.7 2.6 2.5 Reactivo de Bradford (mL) 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 3. Agrega los reactivos en los tubos de ensaye en el orden señalado. Tapa los tubos y agita por inversión. _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 2 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas 4. Calibra el espectrofotómetro de acuerdo con las instrucciones de tu profesor. Introduce el blanco y lee la absorbancia a 595 nm. Anota tus resultados en la hoja de resultados correspondiente. 5. Lee todos los tubos en orden y complementa la tabla 1 agregando la absorbancia leída de cada tubo. Posteriormente elabora la gráfica de absorbancia Vs concentración. 6. Elabora le ecuación de la recta y obtén el coeficiente de regresión lineal. PREPARACIÓN DE LA MUESTRA 1. Agregue 5 mL de cada muestra de leche en un matraz aforado de 50 mL. Afora con agua destilada. 2. Agrega 0.3 mL de leche diluida (del paso anterior) en un tubo de ensayo. Agrega 2.7 mL de agua destilada y 3 mL de Reactivo de Bradford en el mismo tubo. Tapa y agita por inversión. Las muestras se harán por triplicado 3. Medir la longitud de la celda con el vernier. Agregar los resultados en la tabla 3. 4. Calibra el espectrofotómetro nuevamente introduciendo el blanco y leyendo la absorbancia a 595 nm. Anota tus resultados en la tabla 2. 5. Con los datos de tu gráfica y con la ecuación obtenida, calcula la concentración de proteína de las muestras de leche preparadas utilizando el promedio de las absorbancias obtenidas. _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 3 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Hoja de Resultados Tabla 1. Mediciones de absorbancia de la curva de calibración Tubo Concentración de albúmina A595 Blanco 1 2 3 4 5 Realiza la gráfica de A vs Concentración. Obtén el coeficiente de regresión lineal (r) y la ecuación de la recta: _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 4 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Tabla 2. Mediciones de absorbancia de las muestras de leche Marca y Tipo de leche Absorbancia 1 Absorbancia 2 Promedio 1 Alpura ® Santa Clara® Nutrileche® Realiza los cálculos necesarios para determinar la cantidad de proteína de las muestras de leche utilizando la ecuación obtenida mediante la realización de la gráfica y el promedio de observancias. Alpura: Santa Clara: Nutrileche: _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 5 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Realiza los cálculos del coeficiente de extinción utilizando la ecuación de Lambert-Beer de cada muestra, llenando la tabla 3. Tabla 3. Coeficientes de extinción Marca y Tipo de leche1 Absorbancia Concentración promedio obtenida Longitud de celda utilizada Coeficiente de extinción (ᶓ) Alpura ® Santa Clara® Nutrileche® A=ᶓCL A = Absorbancia ᶓ = coeficiente de extinción (mg.mm/mL) C =concentración (mg/mL) L = Longitud de celda (mm) _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 6 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Análisis de resultados De acuerdo con la normatividad aplicable, ¿Cuáles son las cantidades de proteína permitidas en los distintos tipos de leche? ¿La leche analizada cumple los parámetros de la norma? Justifique su respuesta. ¿Por qué se usa albúmina como solución estándar para elaborar la curva de calibración? ¿En qué se parece a la proteína de la leche? ¿Qué aditivos están permitidos en la norma oficial para modificar la cantidad de proteína en leche? _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 7 Práctica # 4 ITESM, campus Qro. Academia de Química Depto. de Ciencias Básicas Describa un método alternativo a la determinación de proteína por el método de Bradford, que pueda ser aplicable para la determinación de proteína. Ética en el laboratorio (Tomado de: Mutio, R. Ana M., López, S. Carolina, Venegas, B. Luz M., Segal, Ranjana. Aprendiendo Química Gota por Gota. 1° Edición. México, Editorial Cengage Learning, 2010.) I. Completen el siguiente cuadro (Como equipo). Residuo generado ¿Cómo se desechó el residuo? Referencias Secretaría de Economía. NOM-155-SCFI-20, Leche, fórmula láctea y producto lácteo combinado-Denominaciones, especificaciones fisicoquímicas, información comercial y métodos de prueba. 12 de septiembre de 2003. Web. 29 octubre 2021. _____________________________________________________________________________ Q1004. Laboratorio de Química 8