Machine Translated by Google Revista Internacional de Ciencias Moleculares Artículo Pan­plastoma del ñame mayor (Dioscorea alata) en China: Variación genética intraespecífica, genómica comparada y Análisis filogenéticos Rui­Sen Lu 1,2 , Ke Hu 1,2, Feng­Jiao Zhang 1,2, Xiao­Qin Sun 1,2 , Min Chen 1,2 y Yan­Mei Zhang 1,2,* 1 Instituto de Botánica, Provincia de Jiangsu y Academia China de Ciencias, Nanjing 210014, China Laboratorio clave de Jiangsu para la investigación y utilización de recursos vegetales, Nanjing 210014, China * Correspondencia: [email protected] 2 Resumen: Dioscorea alata L. (Dioscoreaceae), comúnmente conocida como ñame mayor, ñame de agua o ñame alado, es un tubérculo vegetal/cultivo alimentario popular en todo el mundo, con importancia nutricional, sanitaria y económica. China es un importante centro de domesticación de D. alata y se han establecido cientos de cultivares (accesiones). Sin embargo, las variaciones genéticas entre las muestras chinas siguen siendo ambiguas y los recursos genómicos actualmente disponibles para el mejoramiento molecular de esta especie en China son muy escasos. En este estudio, generamos el primer panplastoma de D. alata, basado en 44 muestras chinas y 8 muestras africanas, e investigamos las variaciones genéticas, la evolución del plastoma y las relaciones filogenéticas dentro de D. alata y entre miembros de la sección Enantio phyllum . . El panplastoma de D. alata codificaba 113 genes únicos y su tamaño variaba entre 153.114 y 153.161 pb. Se identificaron un total de cuatro haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) en las muestras chinas, sin mostrar diferenciación geográfica, mientras que las ocho muestras africanas compartieron el mismo haplotipo de plastoma completo (Hap I). Los análisis genómicos comparativos revelaron que los cuatro haplotipos completos de plastoma albergaban contenido de GC, contenido de genes, orden de genes y estructuras límite IR/SC idénticos, que también eran altamente congruentes con otras especies de Enantiophyllum. Además, se identificaron cuatro regiones altamente divergentes, es decir, trnC – petN, trnL – rpl32, ndhD – ccsA y el exón Cita: Lu, R.­S.; Hu, K.; Zhang, F.­J.; Sol, 3 de clpP, como posibles códigos de barras de ADN. Los análisis filogenéticos separaron claramente todas X.­Q.; Chen, M.; Zhang, las accesiones de D. alata en cuatro clados distintos correspondientes a los cuatro haplotipos, y respaldaron Y.­M. Pan­plastoma de ñame mayor firmemente que D. alata estaba más estrechamente relacionada con D. brevipetiolata y D. glabra que con D. cirrhosa, D. (Dioscorea alata) en China: En general, estos resultados no sólo revelaron las variaciones genéticas entre las muestras chinas de D. alata, sino variación genética intraespecífica, que también proporcionaron la base necesaria para el mejoramiento asistido molecular y la utilización industrial de genómica comparada y análisis esta especie. filogenéticos. En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341. https:// Palabras clave: Dioscorea alata; panplastoma; variaciones de haplotipos; genómica comparada; códigos de barras doi.org/10.3390/ijms24043341 de ADN ; análisis filogenéticos Editor académico: Zhiqiang Wu Recibido: 23 de diciembre de 2022 Revisado: 1 de febrero de 2023 Aceptado: 6 de febrero de 2023 Publicado: 7 de febrero de 2023 Copyright: © 2023 por los autores. Licenciatario MDPI, Basilea, Suiza. Este artículo es un artículo de acceso abierto. distribuido bajo los términos y condiciones de los Creative Commons Licencia de atribución (CC BY) (https:// creativecommons.org/licenses/by/ 4.0/). 1. Introducción Dioscorea alata L. (también llamado 'ñame mayor', 'ñame de agua' o 'ñame alado') es una hierba trepadora perenne que pertenece a la sección Enantiophyllum del género Dioscorea L. (Dioscoreáceas) [1]. Es la especie de ñame (Dioscorea spp.) más cultivada y la segunda más producida en todo el mundo, incluidos Asia, África, el Pacífico, el Caribe y América [2,3]. Recientemente, esta especie ha ganado un interés creciente tanto por parte de los consumidores como de los productores, debido a varios atributos valiosos. En primer lugar, D. alata es un importante cultivo alimentario tradicional y se considera una rica fuente de carbohidratos (75–84%), proteínas (~7,4%) y vitamina C (13,0–24,7 mg/100 g) [4,5]. En segundo lugar, D. alata tiene suficiente capacidad para adaptarse a diversos ambientes agroecológicos y climáticos y puede propagarse vegetativamente fácilmente mediante trozos de tubérculo [6–8]. En tercer lugar, sus tubérculos suelen tener un sabor delicado, una apariencia atractiva y una excelente capacidad de almacenamiento a largo plazo (4 a 6 meses) [9 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341. https://doi.org/10.3390/ijms24043341 https://www.mdpi.com/journal/ijms Machine Translated by Google 2 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 D. alata es rica en compuestos de metabolitos secundarios, por ejemplo, ácidos fenólicos, flavonoides y antocianinas, y por lo tanto tiene un gran potencial como alimento saludable y funcional [11]. No hay duda de que esta especie tiene diversas aplicaciones potenciales para ser utilizada en diferentes industrias alimentarias y no alimentarias a nivel mundial. China es un importante centro de domesticación de D. alata, donde se han desarrollado cientos de variedades cultivadas /variedades locales a lo largo de su larga historia de cultivo [12]. Sin embargo, la generación de estos cultivares depende en gran medida de la selección humana de mutaciones somáticas [13,14], mientras que la mejora genética de D. alata está muy por detrás de la de la mayoría de los demás cultivos. El éxito de los programas de mejoramiento genético radica principalmente en el nivel de variación genética dentro de las especies, que guiará la selección de padres adecuados para la reproducción de híbridos y el posterior desarrollo de cultivares mejorados [6,15]. Sin embargo, hasta la fecha, las variaciones genéticas de las muestras chinas de D. alata siguen siendo ambiguas, aunque se han realizado varios estudios basados en repeticiones de secuencias simples (SSR). Por ejemplo, Wu et al. [12] dividieron las muestras chinas de D. alata en dos clados principales, basándose en el método de grupos de pares no ponderados con media aritmética (UPGMA) y análisis de coordenadas principales (PCA), mientras que Chen et al. [16] reveló la existencia de tres subpoblaciones en las adhesiones chinas basándose en un análisis de la estructura de la población basado en modelos. Por lo tanto, resolver las variaciones genéticas en las muestras chinas de D. alata es un paso esencial hacia el mejoramiento molecular de esta especie económicamente significativa en China. Los plastomas de las angiospermas suelen poseer una estructura circular cuatripartita altamente conservada, con tamaños que varían de 100 a 200 kb, y codifican muchas proteínas clave en relación con la fotosíntesis y otras funciones celulares importantes, incluida la síntesis de almidón, ácidos grasos, pigmentos y aminoácidos. [17­19]. Debido a la ausencia de recombinación, los bajos niveles de sustitución de nucleótidos, el modo de herencia uniparental y el pequeño tamaño efectivo de la población [20,21], las secuencias de plastomas se han utilizado ampliamente para la identificación precisa de especies y la inferencia filogenética en diferentes linajes de plantas [21­23 ]. Más recientemente, se han desarrollado panplastomas para capturar variaciones inter e intraespecíficas [24­26]. Por ejemplo, Magdy et al. [25] construyeron panplastomas de alta resolución a partir de 321 muestras de Capsicum para diferenciar cultivares y linajes. Wang y cols. [26] de novo ensamblaron los plastomas de 316 accesiones de Nelumbo para construir un mapa pan­plastoma confiable e investigar la filogeografía y la diversidad genética entre ellos. Además, estos estudios también indicaron que los panplastomas tienen varias ventajas sobre los pangenomas nucleares, como (i) un ensamblaje más fácil que no se ve afectado por los poliploides, (ii) secuencias de referencia mucho más completas para el ensamblaje, anotación y comparación, y (iii) la ausencia de grandes regiones sinténicas duplicadas, aliviando así los efectos de la paralogía genética en la sistemática molecular [26]. Aquí, reunimos de novo plastomas para 44 muestras chinas y 8 muestras africanas , y aprovechamos estos recursos a escala pan­plastoma para examinar las variaciones genéticas dentro de las muestras chinas. Al combinarlos con cinco plastomas de la sección Enantiophyllum publicados previamente (una accesión de cada uno para D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente), también desarrollamos marcadores moleculares confiables para estudios adicionales sobre la taxonomía, filogenia y genética de poblaciones de especies de Enantio phyllum, y reconstruyó las relaciones filogenéticas dentro de esta sección. 2. Resultados 2.1. Estructura y organización de los plastomas de D. alata Se ensamblaron y analizaron con éxito de novo un total de 52 plastomas (Tabla 1). El tamaño del plastoma en la mayoría de las muestras (34 de ellas, Haps I y II) fue de 153,161 pb, mientras que 16 y 2 muestras tenían tamaños de plastoma reducidos de 153,158 (Hap III) y 153,114 pb (Hap IV), respectivamente (Figura 1, Tabla 1). Todos estos plastomas conservaron la estructura cuatripartita típica de los plastomas de angiospermas, que consistía en un par de regiones de repetición invertida (IR) (25.464 pb), separadas por una región grande de copia única (LSC) de 83.351 a 83.415 pb y una pequeña copia única. (SSC) región de 18.815–18.836 pb (Figura 1). El contenido de GC en toda la secuencia del genoma (37,0%) y también en las regiones LSC (34,8%), SSC (31,0%) e IR (43,0%) fue completamente idéntico entre todas las muestras de D. alata. Machine Translated by Google 3 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Tabla 1. Nombres locales o de cultivares, regiones de cultivo y haplotipos de plastoma completo de Dioscorea alata utilizadas en este estudio. Número de adhesión. Cultivar o nombre local CDa001 CDa002 CDa003 CDa004 CDa005 CDa006 CDa007 CDa008 CDa009 CDa010 CDa011 CDa012 CDa013 CDa014 CDa015 CDa016 CDa017 CDa018 CDa019 CDa020 CDa021 CDa022 CDa023 CDa024 CDa025 CDa026 CDa027 CDa028 CDa029 CDa030 CDa031 CDa032 CDa033 CDa034 CDa035 CDa036 CDa037 CDa038 CDa039 CDa040 CDa041 CDa042 CDa043 CDa044 ADa001 ADa002 ADa003 ADa004 ADa005 ADa006 ADa007 ADa008 'Minghuai No. 1' 'Quanhuai 1515' 'Quanhuai 1815' 'Shanghang dashu' 'Taihuai No. 6' 'Wuyishan zishanyao' 'Zhenghe hongxinshu' 'Zhouning zishu' 'Ziyushanyao' 'Anxi saobashu' 'Dongyou kuaishu' 'Minghuai No 3 'Zhenghe jiaobanshu' 'Ziyushenshu' 'Hainan danshu' 'Hainan zazi' 'Hainan zabai' Da90 Da94 'Yangxi nuomishu' 'Suyu No. 2' 'Suyu No. 4' 'Suyu No. 6' 'Ganzhoushangyou baixinshu ' ' Ganzhoushangyou zixinshu' 'Hongshuzi' 'Jiaobanshu' 'Wantian zishu' 'Zixin yuantiao' 'Baishu' 'Jiaobanshu púrpura' 'Jiaobanshu' 'Longnante zipishanyao' 'Ximazhuang jiaobanshu' 'Weihai baishu' 'Miyi shanyao' 'Honglong shanyao' 'Yangmingshan shanyao ' 'Chengtuo baishanyao' 'Lijiang zishu' 'Quzhou kuaigenbaishu' 'Ruian shanyao' 'Taizhou yuanshanyao' 'Wencheng nuomishanyao' Tda00/00005 Tda01/00039 Tda02/00012 Tda05/00015 Tda95­310 Tda95/00328 Tda99/000 48Tda99/00240 Región de cultivo Sanming, Fujian Quanzhou, Fujian Quanzhou, Fujian Fuzhou, Fujian Quanzhou, Fujian Wuyishan, Fujian Nanping, Fujian Ningdé, Fujian Quanzhou, Fujian Quanzhou, Fujian Nanping, Fujian Sanming, Fujian Nanping, Fujian Cantón, Cantón Sanya, Hainan Qiongzhong, Hainan Wuzhishan, Hainan Lingao, Hainan Danzhou, Hainan Loudi, Hunan Xuzhou, Jiangsu Xuzhou, Jiangsu Nankín, Jiangsu Ganzhou, Jiangxi Ganzhou, Jiangxi Ganzhou, Jiangxi Ganzhou, Jiangxi Ruijin, Jiangxi Shangrao, Jiangxi Ganzhou, Jiangxi Fuzhou, Jiangxi Ji'an, Jiangxi Ganzhou, Jiangxi Ruichang, Jiangxi Weihai, Shandong Paizhihua, Sichuan Jiayi, Taiwán Taibei, Taiwán Wenshan, Yunnan Lijiang, Yunnan Quzhou, Zhejiang Wenzhou, Zhejiang Taizhou, Zhejiang Wenzhou, Zhejiang África África África África África África África África Haplotipo I I I I I I I I I III III III III I I I II III III IV I I III I I I I I I III III III III III III I I I I I III III III IV I I I I I I I I Los detalles de ocho accesiones africanas se informaron en Bredeson et al. [27]. Los plastomas de las 52 muestras de D. alata codificaron 113 genes únicos idénticos, incluidos 79 genes codificadores de proteínas (PCG), 30 genes de ARN de transferencia (ARNt) y 4 genes de ARN ribosómico. (ARNr), 19 de los cuales (7 PCG, 8 genes de ARNt y los 4 ARNr) se duplicaron en los IR, dando un total de 132 genes (Figura 1, Tabla S1). Entre los genes únicos, ocho de los PCG (es decir, atpF, petB, petD, ndhA, ndhB, rpoC1, rpl2 y rpl16) y seis de los tRNA (trnK­UUU, trnG­UCC, trnL­UAA, trnV­UAC, trnI­GAU y trnA­UGC) contenían un único intrón, mientras que tres PCG (ycf3, rps12 y clpP) poseían dos intrones (Figura 1, Tabla S1). El gen rps12 consta de tres exones que están empalmados entre sí: los exones 2 y 3 son proximal y ubicado en los IR, mientras que el exón 1 está a ~ 29,0 kb de la copia más cercana de Machine Translated by Google En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 , ADa001 ADa002 ADa003 ADa004 ADa005 ADa006 ADa007 Un gen intacto que codifica ADa008 Tda00/00005 África Tda01/00039 África Tda02/00012 África África Tda05/00015 Tda95­310 África Tda95/00328 África Tda99/00048 África exones 2 y 3 y ~70,5 kb de distancia de su copia repetida distal. Tda99/00240 El factor de iniciación africano IF1 (infA) estaba mientras queseelinformaron gen rps16 se perdió de[27]. forma independiente en el Los detalles de presente, ocho accesiones africanas en Bredeson et al. I I I Yo 4 de 16 I I I I Plastomas de D. alata (Figura 1, Tabla S1). Figura 1. El mapa panplastoma de Dioscorea alata. Los genes que se muestran en el exterior del círculo son se transcriben en el sentido de las agujas del reloj, mientras que los genes internos se transcriben en el sentido contrario a las agujas del reloj. Los genes que pertenecen Figura 1. El mapa panplastoma de Dioscorea alata. Los genes que se muestran en el exterior del círculo pertenecen a diferentes grupos funcionales y están codificados con diferentes colores. El contenido de GC/AT se muestra mediante se transcriben en el sentido de las agujas del reloj, mientras que los genes internos se transcriben en el sentido contrario a las agujas del reloj. Los genes pertenecen a barras grises más oscuras/claras dentro de las tétradas (LSC, IRA, SSC, IRB). Las duraciones de LSC, IRA, SSC y Los que pertenecen a diferentes grupos funcionales están codificados con diferentes colores. El contenido de GC/AT se muestra en las regiones IRB (pb) de los cuatro haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) identificados en D. alata. en el círculo interior. 2.2. Polimorfismos del plastoma en D. alata La alineación de los plastomas de las 52 accesiones de D. alata dio como resultado una matriz de datos de 153.206 caracteres, de los cuales 69 eran variables. En total, cuatro haplotipos de plastoma completo. fueron identificados (ver detalles en la Tabla S2), con los valores generales para el haplotipo (Hd) y las diversidades de nucleótidos (π) fueron 0,51 y 0,05 × 10−3 , respectivamente. entre los cuatro haplotipos (Haps), (i) Hap I fue el haplotipo más prevalente (encontrado en el 63,5% de todos Machine Translated by Google 5 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 las adhesiones), y presente en todas las adhesiones africanas; (ii) Hap II sólo se encontró en una adhesión de la provincia de Hainan y solo tenía un polimorfismo de un solo nucleótido diferencia (SNP) del Hap I; (iii) El Hap III ocurrió en seis de las ocho provincias de China continental, incluidos Fujian (cuatro adhesiones), Hainan (dos adhesiones), Jiangsu (una adhesión), Jiangxi (cinco incorporaciones), Shandong (una adhesión) y Zhejiang (tres adhesiones) Provincias; y (iv) Hap IV fue compartido por dos accesiones, es decir, CDa020 de Provincia de Hunan y CDa044 de la provincia de Zhejiang (Tabla 1). Prueba D de Tajima en el El nivel de plastoma completo de D. alata mostró un valor negativo (–1,80), lo que puede indicar una expansión poblacional reciente o alguna selección purificadora en esta especie. 2.3. Comparación de plastoma completo a niveles intra e interespecíficos Las comparaciones exhaustivas de los nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro haplotipos de plastoma de D. alata y un plastoma representativo de cada uno de D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente) revelaron que la La similitud de secuencia fue superior al 99,9% entre todos los haplotipos de D. alata, mientras que algunos espaciadores intergénicos mostraron un alto grado de divergencia (<70% de similitud) entre D. alata y otras cinco especies de Enantiophyllum (Figura 2). Además, tanto a nivel intra como En niveles interespecíficos, las regiones codificantes estaban más conservadas que las regiones no codificantes, En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 6 de 17 incluidos espaciadores e intrones intergénicos, y los IR mostraron menos divergencia que el LSC y regiones CSS (Figura 2). Figura2.2.Gráfico Gráficode deidentidad identidadbasado basadoen enmVISTA mVISTAque quemuestra muestralalaidentidad identidadde dela lasecuencia secuencia del del plastoma plastoma dentro dentro de de Dioscorea Dioscorea alata alata y Figura y entre los miembros de la sección Enantiophyllum, con Hap I de D. alata como referencia. La vertical entre los miembros de la sección Enantiophyllum, con el Hap I de D. alata como referencia. la escala vertical La escala representa el porcentaje de identidad entre 50% y 100%. Los genes anotados se muestran y representan el porcentaje de identidad entre el 50% y el 100%. Los genes anotados se muestran a lo largo de la la parte superior, con flechas grises que indican sus posiciones y direcciones transcripcionales. Exones, intrones, arriba, con flechas grises que indican sus posiciones y direcciones transcripcionales. Exones, intrones y y las secuencias no codificantes (CNS) conservadas están resaltadas en azul, cian y rojo, respectivamente. Las secuencias no codificantes (CNS) conservadas están resaltadas en azul, cian y rojo, respectivamente. Las uniones IR/SC eran idénticas o casi idénticas, no sólo entre los haplotipos. Las uniones IR/SC eran idénticas o casi idénticas, no sólo entre los haplotipos. de D. alata, pero también incluso entre D. alata y sus parientes cercanos (Figura 3). En general, las diferencias de D. alata, pero también incluso entre D. alata y sus parientes cercanos (Figura 3). En general, el El gen rps19 se extendió entre 62 y 63 pb en la región IRA en la unión de LSC/IRA (JLA), el gen rps19 se extendió entre 62 y 63 pb en la región IRA en la unión de LSC/IRA (JLA), creando un pseudogén duplicado en la región IRB (pseudogén no mostrado). el ycf1 creando un pseudogén duplicado en la región IRB (pseudogén no mostrado). El gen ycf1 El gen cruzó la unión SSC/IRA (JSA), con la misma longitud (324 pb) en la región IRA, cruzó la unión SSC/IRA (JSA), con la misma longitud (324 pb) en la región IRA, y un y una longitud de 5241 pb a 5271 pb en la región SSC. De manera similar, el gen ndhF se ubicó con una longitud de 5241 pb a 5271 pb en la región SSC. De manera similar, el gen ndhF se localizó en el en las uniones SSC/IRB (JSB), con 2231 pb en la región SSC y 7 pb en la región IRB en todos los plastomas (Figura 3). Además, todos los genes trnH­GUG estaban ubicados en las regiones IR, a una distancia de 191 pb de sus uniones IR/SC adyacentes (Figura 3). Machine Translated by Google 6 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Uniones SSC/IRB (JSB), con 2231 pb en la región SSC y 7 pb en la región IRB a lo7 de largo 17 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 todos los plastomas (Figura 3). Además, todos los genes trnH­GUG estaban ubicados en el IR. regiones, a una distancia de 191 pb de sus uniones IR/SC adyacentes (Figura 3). JLA JSA 217 pb 62 pb rpl22 D. alata (los cuatro haplotipos) rps19 324 pb trnH 217 pb 62 pb rpl22 D. brevipetiolata rps19 trnH IRA D. cirrosa rps19 trnH 217 pb 62 pb rpl22 D. glabra rps19 trnH 217 pb 62 pb rpl22 D. japonica rps19 trnH 216 pb 63 pb rpl22 D. polistaquia LSC rps19 trnH LSC 191 pb 81 pb trnH trnN psba IRB ndhF CSS LSC 192 pb 81 pb 2231 pb 7 pb ycf1 psba IRB ndhF 5244 pb IRA trnH trnN CSS 324 pb LSC 191 pb 81 pb 2231 pb 7 pb ycf1 psba IRB ndhF 5241 pb IRA LSC trnH trnN CSS 324 pb LSC 191 pb 81 pb 2231 pb 7 pb ycf1 psba IRB ndhF 5265 pb IRA LSC trnH trnN CSS 324 pb LSC 191 pb 81 pb 2231 pb 7 pb ycf1 IRA LSC ndhF 5271 pb psba IRB CSS 324 pb trnH trnN 2231 pb 7 pb 5244 pb ycf1 217 pb 62 pb rpl22 ndhF CSS 324 pb LSC 191 pb 81 pb 2231 pb 7 pb 5244 pb ycf1 IRA LSC JLB JSB trnH trnN IRB psba LSC Figura 3. Comparación de las uniones IR/SC entre los nueve plastomas de Enantiophyllum ( es decir , cuatro haplotipos completos de Dioscorea alata y un plastoma de cada uno para D .brevipetiolata, D. cirrhosa, D. plastoma haplotipos de Dioscorea alata, y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente). JLA, JSA, JSB y JLB se refieren a uniones de LSC/ IRA, D. japonica y D. polystachya, respectivamente). JLA, JSA, JSB y JLB se refieren a uniones de LSC/IRA, SSC/IRA, SSC/IRB y LSC/IRB, respectivamente. SSC/IRA, SSC/IRB y LSC/IRB, respectivamente. 2.4. Repeticiones dispersas y SSR 2.4. Repeticiones dispersas y SSR Se identificaron un total de 292 repeticiones dispersas en los nueve plastomas de Enantiophyllum . Se identificaron un total de 292 repeticiones dispersas en los nueve plastomas de Enantiophyllum. tomos, incluidos cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata, y un plastoma cada uno para incluir cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata, y un plastoma de cada uno para D. brevipetio D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D .japonica y D.polystachya, respectivamente. Entre lata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente. Entre todos los identificados En todas las repeticiones identificadas, las repeticiones directas y palindrómicas fueron repeticiones considerablemente más altas, las repeticiones directas y palindrómicas fueron considerablemente mayores en número que las en número que las repeticiones inversas y complementarias (Figura 4A), y las longitudes de repetición inversas y complementarias (Figura 4A), y las longitudes de repetición de 30 a 39 pb fueron las más de 30 a 39 pb fueron los más comunes (Figura 4B). Dentro de D. alata, Haps I, II y III tenían algo en común (Figura 4B). Dentro de D. alata, Haps I, II y III compartieron las mismas 13 repeticiones directas. las mismas 13 repeticiones directas y 14 repeticiones palindrómicas, mientras que Hap IV albergaba 10 for y 14 repeticiones palindrómicas, mientras que Hap IV albergaba 10 repeticiones directas y 13 repeticiones palindrómicas. repeticiones de (Figura sala y 13 repeticiones palindrómicasD.(Figura 4A). A nivel interespecífico, D. el japon se repite 4A). A nivel interespecífico, japonica y D. polystachya contenían ica y D. polystachya contenían mayor cantidad de repeticiones (16 directas, 14 inversas,en21complemento), palindrómicas,seguidas la mayoría de las repeticiones (16ladirectas, 14 inversas, 21 palindrómicas y 10 repeticiones ybrevipetiolata 10 repeticiones complementarias), seguidas de D. alata, D. brevipetiolata (11 directas y 14 pal por D. alata, D. (11 directas y 14 repeticiones palindrómicas) y D. glabra (10 directas, repeticiones D. glabra (10 directas, inversa y 11 repeticiones mientras que 1 inversa y 11 indrómicas), repeticiones ypalindrómicas), mientras1que D. cirrhosa (7 directas palindrómicas), y 12 repeticiones palindrómicas) D. cirrhosa repeticiones 12 palindrómicas) contenía la menor cantidad (Figura 4A). contenía la (7 menor cantidaddirectas (Figura y4A). Machine Translated by Google 7 de 16 8 de 17 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Int. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Figura 4. Análisis repeticiones en losde nueve Enantiophyllum cuatro tomo completo dede Dioscorea alatadispersas y un plastoma cadaplastomas uno de D. de brevipetiolata (Db),[es D. decir, cirrhosa (Dc),haplotipos haplotiposde de plastoma de Dioscorea alata y un plastoma de cada uno de D. brevipetiolata (Db), D. cirrhosa D. glabra (Dg), D. japonica (Dj) y D. polystachya (Dp), respectivamente]. (A) Números de cuatro diferentes (Dc), D. glabra (Dg), D. japonica (Dj) y D. polystachya (Dp), respectivamente]. (A) Números de cuatro tipos repetidos; (B) frecuencia de repeticiones dispersas por longitud. diferentes tipos de repetición; (B) frecuencia de repeticiones dispersas por longitud. El total de SSR en losen plastomas de Enantiophyllum osciló entre 62 (D. glabra) Elnúmero número total de SSR los plastomas de Enantiophyllum osciló entre 62 (D. glabra) y ay 69 japonica), y los tipos de también motivos variaron repetidosentre también variaron entre estos 5, plastomas (Fig. 69 (D. japonica), los(D. tipos de motivos repetidos estos plastomas (Figura figura 5, Tabla S3). De todos los SSR, el tipo de SSR más abundante fueron los mononucleótidos (todos en la Tabla S3). De todos los SSR, el tipo de SSR más abundante fueron los mononucleótidos (todos A/T repeticiones A/T), variando (53,97%) D. cirrhosa 40 (58,82%) en alata, Haps I y II de D. repeticiones), variando de 34 (53,97%) ende D.34 cirrhosa a 40en(58,82% ) enaHaps I y II de D. alata, seguido (11 de dinucleótidos a 13y en D. japonica) trinucleótidos (7 en seguido de dinucleótidos en D. glabra a(11 13 en en D. D. glabra japonica) trinucleótidos (7yen D. D. glabra glabra aa 10 10 en en D. D. japonica japonica yy D. D. polystachya), polystachya), mientras mientras que que los los tetranucleótidos tetranucleótidos (5 (5 en en D. D. brevipetiolata brevipeti y 4 en los otros ocho plastomas de Enantiophyllum ), pentanucleótidos (3 en D. alata y D. olata y 4 en los otros ocho Plastomas de Enantiophyllum), pentanucleótidos (3 en D. alata cirrhosa a 4 en D. D. brevipetiolata, D. glabra, japonica y D.y polystachya), y hexanucleótidos D. cirrhosa a 4 en D. brevipetiolata, glabra, D. japonica y D.D.polystachya), rara vez se observaron hex (1 eny cada plastoma) en los plastomas Enantiophyllum (Figura 5, Tabla Los anucleótidos (1 en cada plastoma) rara vez se observaron en losde plastomas de Enantiophyllum S3). Los5, tipos de repeticiones dede dinucleótidos dominantes fueron AT/TA, que representan el 12,90% glabra). (Figura Tabla S3). Los tipos repeticiones de dinucleótidos dominantes fueron AT/TA, lo que (D. representa 15,87% de todos(D. loscirrhosa) SSR en de cada plastoma, mientras el GA (uno en cada y el 12,90% (D. cirrhosa) glabra) –15,87% todos los SSR en cadaque plastoma, mientras queplastoma) el GA ( uno Los motivos TC (dos en cada plastoma) fueron los plastoma) menos abundantes Tabla S3). (Figura Los motivos abundantes en cada plastoma) y TC (dos en cada fueron los(Figura menos5,abundantes 5, Las repeticiones A/T y AT/TArepeticiones probablemente a la riquezacontribuyeron general de ATaldel Enantiophyllum Tabla S3). Las abundantes A/Tcontribuyeron y AT/TA probablemente aumento general de AT. plastomas. riqueza de los plastomas de Enantiophyllum. Machine Translated by Google En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 9 de 17 8 de 16 100 suerte yo 90 Db feliz II Corriente continua feliz IV feliz III dg DJ dp 80 70 10 11 12 13 14 15 16 17 10 11 12 13 14 15 10 10 10 12 14 18 10 12 12 15 18 15 18 12 12 12 12 12 12 12 12 12 15 15 15 15 1 5 20 15 15 A tata TATT TCTTA TCTTG HACER ENCAJE taa 0 ATA EN 10 ejército de reserva 20 TC AGÁ 30 TCT ATT TTC AAAG 40 AATG AGAT TATT TTTA AAATA 50 ATAAA ATAGA ATATA 60 Georgia 3341 t 5. Los tipos de motivos y las longitudes losplastoma SSR en cuatro haplotipos de I­IV) plastoma completo (Haps I­IV) de Figura 5. Tipos de motivos Figura y longitudes de SSR en cuatro haplotiposdede completo (Haps de Dioscorea alata y otros cinco plastomas de Enantiophyllum. Abreviaturas: Db, D. brevipetiolata; Corriente continua, Dioscorea alata y otros cinco plastomas de Enantiophyllum . Abreviaturas: Db, D. brevipetiolata; Dc, D. cirrosa; Dg, D. glabra; Dj, D. japonica; Dp, D. polistachya. D. cirrosa; Dg, D. glabra; Dj, D. japonica; Dp, D. polistachya. 2.5. Puntos críticos de plastoma divergente en el Enantiophyllum 2.5. Puntos críticos de plastoma divergente en el Enantiophyllum Basado en la alineación del plastoma completo de nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro Basado en la alineación de plastoma del plastoma completo completo de D. dealata nueve y un plastomas plastomade deEnantiophyllum cada uno para (es D. brevipetiolata, decir, cuatro haplotipos D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente), un total de 120 regiones (6011 CDS, 45 IGS, Se sometieron haplotipos de plastoma completo de D. alata y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D. cir intrones y cuatro ARNt) a análisis de diversidad de nucleótidos (π). El rhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente), un total de 120 regiones (60 CDS, los valores de π para estas regiones oscilaron entre 2,44 × 10−4 (IGS rps12–trnV) y 1,90 × 10− 2 (IGS 45 IGS, 11 intrones y cuatro sepromedio sometieron análisis de (Figura diversidad de nucleótidos trnC– petN),tRNA) con un de a2,90 × 10−3 6). Las regiones no(π). codificantes (incluidas Los valores de π para estasmostraron regiones variaron un valordesde de π promedio 2,44 × 10−4 más(IGS alto rps12–trnV) (3,83 × 10−3hasta ) que1,90 el ARNt × 10−2 (promedio (IGS IGS e intrones) πde = 3,42 10−3(Figura ) y CDS (promedio 2,00 × 10−3 ), haciéndose eco no delcodificantes) hallazgo de que trnC–petN), con un promedio 2,90 ××10−3 6). Las regionesπno= codificantes (incluidas las regiones fueron más variables que las regiones codificantes (Figura 2). Cuatro π IGS e intrones) mostraron un valor π promedio más alto (3,83 × 10−3) que el ARNt ( π promedio = picos de valor (π > 8,50 × 10−3 ), es decir, trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y exón 3 de clpP, 3,42 × 10−3) y CDS (promedio π = críticos 2,00 × 10−3) , haciéndose ecousarse del hallazgo de que los fueron como puntos divergentes y podrían como códigos de no barras de reconocidos ADN en diferentes las regiones codificantes fueron más variables que dentro las regiones codificantes (Figura 2). Cuatro valores de π alcanzan niveles máximos taxonómicos de Enantiophyllum. (π > 8,50 × 10−3), es decir, trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y el exón 3 de clpP, fueron reconocidos como puntos críticos divergentes y podrían usarse como códigos de barras de ADN en diferentes niveles taxonómicos dentro de Enantiophyllum . . Machine Translated by Google 10 de 17 9 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Int. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Figura 6. Valores de diversidad de nucleótidos (π) en (60 regiones codificadoras de proteínas, 45 intergénicas Figura 6. Valores de diversidad de nucleótidos (π)120 en regiones 120 regiones (60 regiones codificantes de proteínas, 45 intergénicas espaciadores, 11 intrones y cuatro ARNt) extraídos de los plastomas alineados de cuatro plastomas completos espaciadores, 11 intrones y cuatro ARNt) extraídos de los plastomas alineados de cuatro plastomas completos haplotipos (Haps I­IV) dey Dioscorea y otrosde cinco plastomas de Enantiophyllum . haplotipos (Haps I­IV) de Dioscorea alata otros cincoalata plastomas Enantiophyllum. Relaciones filogenéticas dentro alata y entremiembros miembrosde deEnantiophyllum Enantiophyllum 2.6. 2.6. Relaciones filogenéticas dentro dede D. D. alata y entre topologías deárboles los árboles de máxima verosimilitud y de bayesiana inferencia (BI) bayesiana LasLas topologías de los de máxima verosimilitud (ML) e (ML) inferencia basados(BI) en secuencias de plastoma completo y 79 regiones codificadoras de proteínas compartidas fueron totalmente basado en secuencias de plastoma completo y 79 regiones codificadoras de proteínas compartidas eran totalmente idénticas, con valores de arranque (BS) del 100% y probabilidades posteriores bayesianas (PP) de 1,0 en idéntico, con valores de arranque (BS) del 100% y probabilidades posteriores bayesianas (PP) de 1,0 en los siete nodos principales (Figura 7). Todas las topologías filogenéticas apoyaron idénticamente la los siete nodos principales (Figura 7). Todas las topologías filogenéticas apoyaban de manera idéntica la monofilia de D. alata, que era hermana de D. brevipetiolata – D. grupo glabra. Estas tres monofilia de un D. alata, quecomún era hermana D. brevipetiolata – D. grupoD.glabra . Estas tres especies compartían además ancestro con D. de cirrhosa y su grupo hermano japonica. Además, la especie Las compartió un ancestro con D. cirrhosa y su en grupo hermano D. japonica. D. polistaquia. 52 accesiones de común D. alata podrían dividirse cuatro clados D. polistaquia. 52 accesiones D.accesiones alata podrían dividirse en cuatro clados (clados I­V), correspondientes a los cuatroLas haplotipos. Clado de I (25 chinas y todas 8 accesiones africanas) y Clade II (CDa017 de la Clado provincia Hainan) eran,y juntos, (clados I – V), correspondientes a los cuatro haplotipos. I (25de accesos chinos todos alhermanos clado III (16 accesos chinos), mientras que IIel(CDa017 clado IV (CDa020 de la provincia deeran, Hunan y 8 accesiones africanas) y el Clado de la provincia de Hainan) juntos, CDa044 hermano de la provincia de Zhejiang) ocuparon una posición temprana divergente ('basal') dentro del y D. alata (Figura 7). al clado III (16 accesiones chinas), mientras que al clado IV (CDa020 de la provincia de Hunan CDa044 de la provincia de Zhejiang) ocupó una posición temprana divergente ('basal') dentro de D. alata (Figura 7). Machine Translated by Google En t.J.J.Mol. Mol.Ciencia. Ciencia., 24, 20232023 3341 Int. 3341 , 24, 11 de 17 10 de 16 Figura 7. Relaciones filogenéticas dentro de Dioscorea y entre miembros de Enantiophyllum inferidas a partir de Figura 7. Relaciones filogenéticas dentro de Dioscorea alataalata y entre miembros de Enantiophyllum análisis de máxima verosimilitud (ML) een inferencia bayesiana (BI)­plastoma basados en análisis de máxima verosimilitud (ML) e inferencia bayesiana (BI) basados imágenes completas. secuencias de tomos. de probabilidades posteriores de BI.Los Losnúmeros númerosen enlos losnodos nodosrepresentan representanvalores valoresde dearranque arranquede deML ML(BS) (BS)yysecuencias probabilidades posteriores de BI (PP). lazoscompartidas (PP). Las topologías filogenéticas resultantes de dos conjuntos de datos (secuencias de plastoma completo y 79 79 regiones codificadoras de proteínas compartidas) son idénticas. Todas las muestras de D. alata podrían dividirse en cuatro regiones codificantes de proteínas) son idénticas. Todas las accesiones de D. alata podrían dividirse en cuatro clados clados (clados I – V), correspondientes a los cuatro haplotipos (Haps I – IV). (clados I – V), correspondientes a los cuatro haplotipos (Haps I – IV). 3. Discusión 3. Discusión 3.1. Evolución del plastoma en D.en alata y susyespecies estrechamente relacionadas 3.1. Evolución del plastoma D. alata sus especies estrechamente relacionadas Estudios anteriores han informado que los dentro de una estánestán altamente conservados Estudios anteriores han informado queplastomas los plastomas dentro de especie una especie altamente conservados en en términos de estructura genómica, contenido de GC , contenido de genes y sintenia del orden de los genes [26,28], [26,28], y D. alata no es una excepción a este respecto. El panplastoma excepción a este respecto. El panplastoma de D. alata construido de D. alata con D. alata no es una estructurado aquí indicó que las 52 muestraspb) (153,114–153,161 pb) geográficas de diferentes áreas geográficas aquí indicó que las 52 muestras (153,114–153,161 de diferentes áreas Las estructura áreas gráficas cuatripartita poseían típica la estructura de los plastomas cuatripartita detípica plantas de terrestres, los plastomas con de un plantas par de IR. terrestres, con poseían la regiones (25.464 pb) que la LSC (83.351–83.415 pb)yyellaSSC SSC (18.815–18.836 pb) un par de regiones IR (25.464 pb) separan que separan el LSC (83.351–83.415 pb) (18.815– 18,836 mismos pb) regiones, 113 genes y codificaron únicos, incluidos los mismos 79 PCG, 11330 genes tRNA únicos, y incluidos 79 PCG, 30 tRNA, y codificaron los 4 ARNr (Figura 1, Tabla S1). Todos estos plastomas secuenciados también compartían mismo aspecto de general. y 4 ARNr (Figura 1, Tabla S1). Todos estos plastomas secuenciados también compartieron el el mismo contenido GC (37,0%), el de las regiones (34,8%) y SSC (31,0%), contenido generalmayor de GCque (37,0%), mayor que elLSC de las regiones LSC (34,8%)pero y SSC (31,0%), menor que el de las IR en (43,0%), probablemente debido al alto contenido de de GC (55,3%) de los cuatro peroregiones menor que las regiones IR (43,0%), probablemente debidodealGC alto(55,3%) contenido ARNr.ARNr. Además, tampoco se detectaron detectaron disposiciones disposiciones genéticas genéticas ni dentro dede D.D. alata. los cuatro Además, no se dentro alata ni en comparación con sus especiescon estrechamente (esrelacionadas decir, D. brevipetiolata, D.brevipetiolata, cirrhosa, D. glabra, en comparación sus especiesrelacionadas estrechamente (es decir, D. D. cirrhosa, D. glabra, D. D. japonica y D. polystachya) 2). Estostambién hallazgos también enconsistentes gran medida con japonica y D. polystachya) (Figura 2).(Figura Estos hallazgos fueron en granfueron medida conconsistentes las características de los plastomas de Dioscorea publicados previamente, que mostraron que el las características de los plastomas de Dioscorea publicados anteriormente, que mostraron que los plastomas de este génerodeestaban bien conservados Los plastomas este género estaban bien[29­31]. conservados [29­31]. Expansiones y contracciones específicas delos linaje deIR/SC, los límites que Las expansiones y contracciones específicas del linaje de límites que sonIR/SC, comunes en son las comunes angiospermas, a menudo provocan la ganancia o pérdida de un pequeño número de genes y longitud. comunes en las angiospermas, a menudo provocan la ganancia o pérdida de un pequeño número de genes y variaciones de los plastomas En este estudio, las de los límites IR/SC variaciones de longitud de los plastomas [32­34]. En[32­34]. este estudio, las ubicaciones deubicaciones los IR/SC Machine Translated by Google 11 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 eran totalmente idénticos, no sólo en los cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata, sino también entre D. alata y sus cuatro especies estrechamente relacionadas, es decir, D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra y D. japonica ( Figura 3). Dado que la diferencia en el límite IRA/SSC entre D. polystachya y los otros plastomas es muy trivial (Figura 3), estos resultados proporcionaron una prueba más de la naturaleza conservada de los plastomas de Enantiophyllum. Además, a diferencia de la mayoría de las monocotiledóneas, con sus IR expandiéndose y abarcando el grupo de genes rps19­ trnH (p. ej., Arecales, Dasypogonaceae, Poales, Zingiberales, Asparagales y Commelinales) [28,32], todos los límites LSC/IRA de Los plastomas de Enantiophyllum se ubicaron dentro del gen rps19 (Figura 3). 3.2. Marcadores derivados de plastomas para la delimitación de especies/cultivares en Enantiophyllum Aunque los códigos de barras de ADN se han introducido en la taxonomía de Dioscorea y han acelerado la identificación de especies y las relaciones en las diferentes secciones y/o clados principales de este género, los loci comúnmente utilizados, es decir, genes de plastidios (p. ej., atpB, matK, rbcL), suplementado con regiones IGS intermediamente variables (p. ej., trnL­trnF y psbA­trnH) y/o espaciadores transcritos internos (ITS) de genes de ADN ribosomal nuclear, siempre mostraron un bajo poder discriminatorio en niveles taxonómicos bajos, incluso dentro del Enantiophyllum [35­39 ]. En consecuencia, se deben desarrollar regiones hipervariables adicionales para el análisis taxonómico y filogenético de una sección específica/clado principal de Dioscorea. En este estudio, el análisis de diversidad de nucleótidos de 120 regiones (60 CDS, 45 IGS, 11 intrones y cuatro regiones de ARNt) extraídas de los nueve plastomas de Enantiophyllum (es decir, cuatro haplotipos de plastoma completo de D. alata y un plastoma de cada uno para D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya, respectivamente), revelaron que las regiones IGS trnC–petN, trnL–rpl32, ndhD–ccsA y el exón 3 de clpP, con alto contenido de nucleótidos Los valores de diversidad (π > 8,50 × 10−3 ) (Figura 6) podrían servir como códigos de barras de ADN candidatos para la identificación de especies/ cultivares en Enantiophyllum. La disponibilidad de estos puntos críticos altamente divergentes también proporciona información genética valiosa para futuros estudios filogenéticos, poblacionales, genéticos y filogeográ 3.3. Relaciones filogenéticas dentro de D. alata y entre especies de la sección Enantiophyllum China es un centro de domesticación importante y posiblemente aislado de D. alata [12]. En este estudio, se detectaron un total de cuatro haplotipos de plastoma completo en las 44 muestras de ocho provincias de China continental y la isla de Taiwán (Tabla 1). La distribución de estos cuatro haplotipos fue aleatoria, lo que respalda el hallazgo anterior de que no hubo una diferenciación geográfica significativa dentro de D. alata en China [12]. Tales variaciones genéticas entre estos cultivares serían útiles para guiar la elección de padres adecuados para el mejoramiento por hibridación y la posterior utilización de esta especie económicamente importante [6]. Entre los cuatro haplotipos, Hap I predominó en la mayoría de las regiones de China y representa el 56,8% de las muestras chinas. Las accesiones de Hap I pueden haberse establecido a partir de aquellas que tienen Hap II (por ejemplo, CDa017 de la provincia de Hainan) mediante una sustitución de una sola base en la región codificante de ndhD, que discriminó Hap I de Hap II (Tabla 1, Figura 7 ) . El análisis filogenético sugirió que dos accesiones que portaban Hap IV (CDa020 de la provincia de Hunan y CDa044 de la provincia de Zhejiang) formaron un clado basal con respecto al clado completo de las accesiones restantes (Figura 7). Esto puede reflejar que Hap IV tuvo un origen relativamente antiguo y una historia evolutiva a largo plazo, lo que permitió su adaptación a diferentes condiciones climáticas y, por lo tanto, jugó un papel importante en los programas de reproducción de D. alata. Sin embargo, dado que un árbol basado en plastoma representa efectivamente la historia de un solo locus [40,41], se necesita un examen más riguroso con múltiples genes nucleares de copia única o secuencias del genoma completo. Además, también cabe destacar que, aunque nuestro análisis filogenético basado en secuencias completas de plastomas proporcionó una resolución filogenética mucho mayor que aquellos con marcadores moleculares tradicionales, como los polimorfismos de longitud de fragmentos amplificados (AFLP), y varios plastidios (p. ej., atpB, matK, rbcL , y trnL – trnF) y loci nucleares (Xdh) [1,37–39,42], este estudio se realizó basándose en un muestreo insuficiente de taxones de la sección Enantiophyllum. Por lo tanto, se necesitan más estudios filogenómicos con muestreo exhaustivo de taxones para Machine Translated by Google 12 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 establezca una imagen completa de las relaciones filogenéticas dentro de esta sección e identifique a los parientes más cercanos de D. alata. 4. Materiales y Métodos 4.1. Muestras de plantas, extracción de ADN y adquisición de datos genómicos Según nuestra observación de campo y estudios previos basados en fenotipos y SSR [12,16], se obtuvieron un total de 44 muestras (Tabla 1) que representan los principales cultivares de D. alata en China. seleccionados para la secuenciación del genoma completo. Estas accesiones, con alta diversidad fenotípica, cubrieron la principal área de distribución de esta especie en China, desde el oeste (Lijiang, provincia de Yunnan, coordenadas geográficas (gc): 26◦43 N, 100◦15 E) hasta el este (Taizhou, provincia de Zhejiang). , gc: 28◦38 N, 121◦27 E), y desde el sur (Sanya, provincia de Hainan, gc: 18◦24 N, 109◦45 E) hacia el norte (Xuzhou, provincia de Jiangsu, gc: 34◦39 N, 116◦35 E). Además, también seleccionamos específicamente muestras que han contribuido en gran medida al mejoramiento y la investigación de esta especie y muestras altamente resistentes al estrés abiótico y biótico. El ADN genómico de cada accesión se extrajo de hojas frescas o secas con gel de sílice utilizando un kit de plantas DNAsecure (Tiangen Biotech, Beijing, China), de acuerdo con el protocolo del fabricante. La concentración y la integridad del ADN se midieron en un BioAnalyzer Agilent 2100 (Agilent Technologies, Palo Alto, CA, EE. UU.), junto con electroforesis en gel de agarosa. Se construyeron bibliotecas de extremos emparejados con un tamaño de inserción de 350 pb y luego se secuenciaron en la plataforma BGISEQ­500 para generar secuencias sin procesar con una longitud de lectura de 150 pb. La construcción y secuenciación de la biblioteca se llevaron a cabo en Wuhan Benagen Tech Solutions Company Limited, Wuhan, China. Además, se descargaron conjuntos de datos de secuenciación del genoma completo que abarcan ocho accesiones africanas de D. alata (Tabla 1) de la base de datos del Archivo de lectura de secuencias (SRA) del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) y se convirtieron al formato FASTQ utilizando el método fastq­ utilidad de volcado del SRA Toolkit v.2.9.6 [43]. 4.2. Montaje y anotación de Plastoma Las lecturas sin procesar en formato FASTQ se recortaron para eliminar los adaptadores y las secuencias de baja calidad utilizando Trimmomatic v.0.36 [44], con los parámetros predeterminados. Las lecturas limpias restantes se utilizaron para el ensamblaje de novo de secuencias completas de plastoma utilizando GetOrganelle v.1.7.6 [45], con los siguientes parámetros: ­R 15­k 21,45,65,85,105­F embplant_pt. Posteriormente, la conexión y circularidad de los gráficos de ensamblaje de GetOrganelle se verificaron visualmente en Bandage v.0.9.0 [46]. Las anotaciones de plastoma se realizaron utilizando Geneious Prime 2022.0.1 (https://www.geneious.com, consultado el 16 de noviembre de 2021) alineando cada plastoma recién ensamblado con plastomas publicados previamente de D. alata (MG267382) y D. japonica (MT920319), como referencias, y transfiriendo las anotaciones de referencia a estos nuevos plastomas. Las anotaciones resultantes se verificaron y ajustaron manualmente para determinar la precisión de los codones de inicio y parada y los límites exón/intrón. 4.3. Análisis del polimorfismo del plastoma Las 52 secuencias del plastoma se alinearon utilizando el complemento MAFFT v.7 [47] tal como se implementó en Geneious Prime 2022.0.1. Luego, la alineación de la secuencia del plastoma completo en el formato NEXUS se importó a DnaSP v.6.12.03 [48] para calcular el número de sitios polimórficos (E), el número de haplotipos (H), la diversidad de haplotipos (Hd), la diversidad de nucleótidos. (π) y D de Tajima. Se identificaron un total de cuatro haplotipos de plastoma completo (ver Resultados) y se depositaron en GenBank (números de acceso: OP787123 – OP787126). Los mapas de plasmo circulares de D. alata se dibujaron con el software basado en web OrganellarGenomeDRAW (OGDRAW) v.1.3.1 [49]. 4.4. Genómica comparativa de plastomas dentro de D. alata y entre especies estrechamente relacionadas Para evaluar la similitud genómica de los plastomas completos dentro de D. alata y entre los miembros de la sección Enantiophyllum, se identificaron los cuatro haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) de las 52 accesiones de D. alata, junto con otros cinco publicados previamente. Machine Translated by Google 13 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Plastomas de Enantiophyllum [es decir, D. brevipetiolata (OL638495), D. cirrhosa (ON584759), D. glabra (OL638497), D. japonica (MT920319) y D. polystachya (KY996494): un individuo por especie], descargados del Se compararon la base de datos NCBI. Estas nueve secuencias completas de plastomas se alinearon utilizando el programa de alineación global Shuffle­LAGAN [50] y se visualizaron utilizando el navegador mVISTA [51], con el Hap I de D. alata como referencia. Las cuatro uniones entre las dos regiones de repetición invertida (IR) y de copia única grande/pequeña (LSC/SSC), denominadas JLA, JSA , JSB y JLB, se inspeccionaron más a fondo y se compararon con el complemento Buscador de repeticiones en Geneious Prime 2022.0.1. (https:// www.geneious.com/plugins/repeat finder/, consultado el 4 de agosto de 2019). 4.5. Caracterización de repeticiones dispersas y SSR El programa en línea REPuter [52] se utilizó para determinar el número y el tamaño de las repeticiones dispersas en D. alata y sus especies estrechamente relacionadas, incluidas las repeticiones directas (directas), inversas, complementarias y palindrómicas. Las restricciones para todas las secuencias repetidas se establecieron de la siguiente manera: (i) una distancia de Hamming de 3 y (ii) un tamaño de repetición mínimo de 30 pb (es decir, 90% o más de identidad de secuencia). Además, se utilizó la aplicación web MISA [53] para detectar los SSR en D. alata y otras cinco especies de Enantiophyllum, con umbrales (números mínimos) de 10, 5, 4, 3, 3 y 3 unidades de repetición, respectivamente. , para los SSR de mono, di, tri, tetra, penta y hexanucleótidos. 4.6. Identificación de puntos críticos divergentes Para explorar las regiones altamente divergentes para los códigos de barras de ADN y los estudios basados en poblaciones de D. alata, así como de otras especies de Enantiophyllum, se utilizaron cuatro secuencias de haplotipos de plastoma completo (Haps I­IV) de D. alata y una secuencia de plastoma de cada una de otras cinco Las especies de Enantio phyllum (es decir, D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya) se alinearon con el complemento MAFFT v.7 [47] en Geneious Prime 2022.0.1 con la configuración predeterminada. Las secuencias codificantes de proteínas (CDS), las regiones espaciadoras intergénicas (IGS) y los intrones y ARNt con una longitud alineada de más de 200 pb y al menos una mutación se sometieron a un análisis de diversidad de nucleótidos (π) utilizando DnaSP v.6.12.03 [48 ]. 4.7. Análisis filogenéticos Las relaciones filogenéticas dentro y entre D. alata y sus especies estrechamente relacionadas se llevaron a cabo utilizando dos conjuntos de datos: secuencias de plastoma completo y 79 regiones codificadoras de proteínas compartidas de las 52 muestras de D. alata (Tabla 1), y una muestra de cada una. para otras cinco especies de Enan tiophyllum (es decir, D. brevipetiolata, D. cirrhosa, D. glabra, D. japonica y D. polystachya), con D. schimperiana (MG805614) y D. sansibarensis (MG805614) como grupos externos [39, 54]. Tanto las secuencias del plastoma completo como las secuencias codificantes de proteínas se alinearon utilizando el complemento MAFFT v.7 [47] en Geneious Prime 2022.0.1. El mejor modelo de sustitución, GTR + I + G, para cada conjunto de datos, determinado por el Criterio de información de Akaike (AIC) en jModelTest v.2.1.4 [55], se utilizó tanto para la máxima verosimilitud (ML) como para la inferencia bayesiana (BI). análisis. Los análisis de ML se realizaron utilizando RAxML v.8.2.12, [56] disponible en CIPRES Science Gateway v.3.3 (http://www.phylo.org/portal2/, consultado el 14 de noviembre de 2010), con 1000 replicaciones de arranque. Los análisis de BI se realizaron utilizando el programa MrBayes v.3.2.7 [57], que consta de dos ejecuciones independientes de 1 × 106 generaciones, con cuatro cadenas independientes de Markov Monte Carlo (MCMC) cada una (es decir, una fría y tres calentadas). ) y una frecuencia de muestreo de 1000 árboles. Los primeros 1000 árboles se descartaron como "quemados" y los árboles restantes se utilizaron para construir un árbol de consenso de regla mayoritaria y estimar las probabilidades posteriores (PP). Materiales complementarios: la siguiente información de respaldo se puede descargar en: https: //www.mdpi.com/article/10.3390/ijms24043341/ s1. Contribuciones de los autores: Conceptualización, Y.­MZ; metodología, R.­SL; software, R.­SL, KH y F.­ JZ; validación, X.­QS y MC; curación de datos, R.­SL; redacción: preparación del borrador original, R.­ SL; redacción: revisión y edición, Y.­MZ; adquisición de financiación, R.­SL e Y.­MZ Todos los autores han leído y aceptado la versión publicada del manuscrito. Machine Translated by Google 14 de 16 En t. J. Mol. Ciencia. 2023, 24, 3341 Financiamiento: Esta investigación fue financiada por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (32172089, 32200192), el Programa de Talento Empresarial e Innovador de Jiangsu (JSSCBS20211311), el Laboratorio Clave de Jiangsu para la Investigación y Utilización de Recursos Vegetales (JSPKLB202206, JSPKLB202207), el Proyecto de investigación independiente del Instituto de Investigación de Bienestar Público Provincial de Jiangsu (BM2018021­2) y el Fondo de Talento del Instituto de Botánica de Jiangsu (JIBTF202102). Declaración de la Junta de Revisión Institucional: No aplicable. Declaración de Consentimiento Informado: No aplicable. Declaración de disponibilidad de datos: Los datos del plastoma presentados en este estudio se pueden encontrar en GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/, consultado el 16 de noviembre de 2021) con el número de acceso OP787123–OP787126. Agradecimientos: Los autores agradecen a Yao Xiao de la Universidad Agrícola de Jiangxi, Zhi­Ying Huang del Instituto de Investigación Agrícola de Quanzhou, Shipeng Chen de la Academia de Ciencias Agrícolas de Sanming y Jie Tang del Instituto de Investigación de Cultivos de la Academia de Ciencias Agrícolas de Jiangxi por su gran ayuda en la recolección. los materiales vegetales. Conflictos de intereses: Los autores declaran no tener ningún conflicto de intereses. Referencias 1. Malapa, R.; Arnau, G.; Noyer, J.; Lebot, V. 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