Técnicas: Elisa y Western Blot Aspectos prácticos… Prof. Diana Ortiz Cátedra Inmunología EJMV-UCV [email protected] Fundamento: Técnica de Elisa Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay: Ensayo por Inmunoadsorción Ligado a Enzimas. Inmunoensayo: detección Antígeno – Anticuerpo unido a una enzima y cuantificado por espectofotometría Ventajas: Es una prueba de alta sensibilidad y especificidad. Es cuantitativa. Es relativamente económica. Se pueden procesar hasta 96 muestras por placa. Reactivos de gran estabilidad. Limitaciones: Positividad Vs. Infección activa: depende del tipo de anticuerpo evaluado. A menos que se evalúe presencia de antígenos en la muestra problema. Dificultad de detección de Acs en pacientes con alguna inmunodeficiencia, en período de ventana o infectados por cepas desconocidas. Técnica de Elisa: fases 1. Unión del antígeno o anticuerpo primario a los pocillos de la placa (soporte sólido (polímero): poliestireno, polivinilo) 2. Lavado 3. Bloqueo 4. Muestra (antígeno o anticuerpo) 5. Lavado 6. Anticuerpo secundario conjugado con una enzima (sensibilidad) 7. Lavado 8. Sustrato de la enzima 9. Cuantificación (lector de ELISA) Técnica de Elisa: tipos Elisa Indirecto Ejemplos: Diagnóstico de infección por VIH-1 Diagnóstico serológico de H. pylori , hongos Técnica de Elisa: tipos Elisa sándwich Ejemplos: Determinación de antígenos de superficie del Virus de Hepatitis B. Diagnóstico de antígenos de H. pylori en heces. Técnica de Elisa: tipos Elisa competitivo Ejemplos: Determinación de Gonadotropina Coriónica Humana (h-CG) Prof. E. Escobar Prof. E. Escobar Prof. E. Escobar Prof. E. Escobar Prof. E. Escobar Prof. E. Escobar Técnica de Elisa Aspectos a considerar: Adecuado uso de controles positivos y negativos (control de calidad). Adecuado diseño de la técnica (Ag-Ac, Enzima sustrato). Concentración/ dilución de antígenos y anticuerpos. Reactivos en buen estado. Cuidado de la cadena de frío. Técnica de Elisa Estuches comerciales: Detección de anticuerpos IgM, IgG, IgE, IgA. Kit Pyloriset EIA-G (Orion Diagnostic): Títulos ≥ 20 positivos Técnica de Elisa Elisa estandarizada en laboratorio 1.- IgA secretora anti H. pylori en saliva: (ELISA) Sensibilización: 2,5µg/pozo Ag Hp toda la noche a 4°C o 2h a 37°C Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween Bloqueo: PBS-BSA 1% x 2h a 37°C Muestras de saliva 1/10 x 1h a 37°C Lavado: 3 veces con 200 µl de PBS-Tween Anticuerpo secundario conjugado: con peroxidasa 1/1000 x 1h a 37°C Revelado: OPD (o-phenylenediamine) + Peróxido de hidrógeno Se detiene la reacción con H2SO4 Valores: UDO > 0,300 positivos (Ortiz y col., 2000) 2.- IgA secretora total en saliva: (ELISA) Monoclonal IgA (Sigma) (Ortiz y col., 2000) Enzimas más utilizadas: Peroxidasa Fosfatasa alcalina β-galactosidasa Tetra-metil-benzidina Técnica de Elisa Técnica de Elisa Interpretación de resultados: ¿Qué es un valor cut off? Títulos de anticuerpos Valores reportados en unidades de Densidad óptica Técnica de Elisa Algunas Aplicaciones de la ELISA Determinación de hormonas: progesterona, estrógenos, cortisol, insulina, HGC, etc. Proteínas Agentes infecciosos (virales, bacterianos, parásitos, hongos) Marcadores de drogas Control de calidad de vacunas Screening de recién nacido Investigación clínica Anticuerpos: Acs antinucleares Antígenos tumorales: alfa-feto-proteína, Ag postático, carcinoembrionario, etc. Autoanticuerpos Una variante de la ELISA Elispot Mide el número de células productoras de anticuerpos. El antígeno se une al fondo de un pocillo, se añaden las células productoras de anticuerpos en un medio semisólido y los anticuerpos que se han secretado y unido se detectan mediante un anticuerpo anti-Ig ligado a una enzima como en un ELISA. Inmunohistoquímica Western Blot Western blot, inmunoblot o electrotransferencia, técnica analítica altamente específica utilizada para identificar proteínas específicas en una mezcla compleja de proteínas, presente en extractos celulares o de tejidos. Etapas: 1. Preparación de la muestra 2. Separación de la muestra por tamaño (Electroforesis en gel de poliacrilamida) 3. Transferencia a un soporte sólido (membrana de nitrocelulosa ) 4. Visualización mediante marcaje de proteínas con el uso de anticuerpos primarios o secundarios apropiados. Western Blot Preparación del gel de poliacrilamida SDS-PAGE y corrida electroforética. Western Blot Tinción del gel con azul de Coomassie Western Blot Transferencia Se transfieren las bandas de proteínas o desde el gel hacia una membrana de nitrocelulosa (flechas azules). Western Blot Western Blot Western Blot Western Blot Revelado CORTES X, GARCIA Z, TORRES L, TAYLOR L. Patrones Indeterminados de Western Blot en sueros reactivos por anticuerpos contra los virus linfotrópicos de células T tipo I/II (HTLV I/II) en donantes de sangre en Costa Rica. Rev. costarric. cienc. méd [online]. 2007, vol.28, n.1-2 [cited 2017-02-15], pp. 11-20 . Western blot Western Blot Aplicaciones: Investigación: Es una de las técnicas más usadas en el estudio de la biología molecular Permite identificar antígenos inmuno-dominates para vacunas. Estudiar perfil de citocinas. Presencia o ausencia de una proteína y sus niveles en una muestra. Factores de crecimiento Niveles de fosforilación, modificaciones post traduccionales, etc Diagnóstico: Prueba confirmatoria de VIH Prueba de la encefalopatía espongiforme bovina, comúnmente llamada“enfermedaddelasvacaslocas” Enfermedad de Lyme. ELISA Vs. Western Blot…