INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIAGNOSTICO VIROLOGICO Marcos Carbajal, Pool MsC Laboratorio de Investigación en Biología molecular(LIBM) 15/02/2023 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Flaviviridae • • • • • • Fiebre amarilla Dengue Zika West Nile EncefalitisJaponesa (≈70…) Togaviridae • • • • • Chikungunya Mayaro Ross River EncefalitisEquinas (≈30…) Reoviridae Bunyaviridae • • • • Enc LaCrosse Oropouche Valle de Rift (≈20…) • Orbivirus VIRUS DENGUE • • • • • Arbovirosis (vector: Aedes aegypti) Familia: Flaviviridae. Es un virus ARN monocatenario +. Tiene 4 serotipos (DEN-1, 2, 3, 4) y 19 genotipos Contiene proteínas: • Estructurales: prM (pre M), E (envoltura) y C (cápside). • No estructurales: NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B y NS5. DENV-1 •5 genotipos: I, II, III, IV y V DENV-2 •5 genotipos: América, América/Asia, Asia I, Asia II, Cosmopolita y Selvático (exclusivo de primates nohumanos) DENV-3 •4 genotipos: I, II, III, IV •Nota:Algunas clasificaciones incluyen el genotipoV. DENV- 4 •4 genotipos: I, II, III y Selvático (exclusivo de primates nohumanos) SEROTIPO DENV-1 GENOTIPO AÑO DE INGRESO PERÚ América/África (V) 1990 América (IV) 1995 América/Asia (III) 2001 DENV-3 India (III) 2001 DENV-4 Indonesia (II) 2001 DENV-2 • Familia: Togaviridae • género: Alphavirus • Virus: (60 –70 nm) RNA (+) •Genoma: 12000 bases (E1Alanina226Valina) • Genotipos: (3) Figure 1. Chikungunya virus particle and electron microscopic picture of chikungunyaviruses - Asiático, - Africano Occidental. - Africano centro/sur/este ECSA Journal of Clinical Virologyy. Volume 64, Pages 144-152 (March 2015) Voss JE, Vaney MC, Duquerroy S, Vonrhein C, Girard-Blanc C, Crublet E, et al.Glycoprotein organization of Chikungunya virus particles revealed by Xraycrystallography. Nature 2010;468:709–12. CHIKV INSTITUTO NACIONAL DE SALUD • Incubación: 2 –7 días • Tasa de letalidad: < 1 % • No existen vacunas. • Tratamiento sintomático, no específico. . Tasa de Ataque: 63 % 2005 La Reunión (35%). . Vector: aedes Figura 5. Árbol filogenético con 5 secuencias de CHIKV analizados durante el período de estudio. Análisis filogenético con secuencias de 449 nucleótidos del gen que codifica la glicoproteína de la envoltura “E1”. Las cepas de este estudio están indicadas por letras en color rojo (genotipo Asiático). Distribución del CHIKV: INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Countries and territories where chikungunya cases have been reported* (as of October 20, 2015). Fuente CDC. USA. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD VIRUS ZIKA • • • • Arbovirosis (vector: Aedes aegypti) Familia: Flaviviridae. Es un virus ARN monocatenario +. Tiene 2 linajes . INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Ciclo selvático CICLO URBANO Ae. aegypti Ae. albopictus Descrito enÁfrica, bosque deZika (Uganda), 1947. Epizootias que involucranprimates no humanos ymosquitos Tiempo de incubación: 3 a 12 días Periodo de trasmisión: Hasta7días Susceptibilidad: Universal Casos de zika latinoamerica https://www.weforum.org/es/agenda/2 016/02/zika- una-amenaza-alturismo-de-latinoamerica/ Vector: Mosquito Aedes INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Aedes aegypti Adapted from Arias JR. Dengue: How are we doing? Celebrating 100 Years of PAHO. Washington, D.C.: PAHO; 2002. Aedes albopictus Adapted from Benedict MQ, et al. Spread of the tiger: global risk of invasion by the mosquito Aedes albopictus. Vector Borne Zoonotic Dis. Spring 2007;7(1):76-85. INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DENV, CHIK y ZIKA CARACTERISTICAS VECTOR DENGUE Aedes aegypti (Región Americana) CICLO CHIKUNGUNYA ZIKA Aedes aegypti yalbopictus Aedes aegypti (Región Americana) Ciclo urbano (hombre-mosquito-hombre) FAMILIA Flavivirus Alfavirus Flavivirus SEROTIPOS Y GENOTIPOS 1 serotipo con 3genotipos 1 serotipo 2genotipos REACCION CRUZADA 4 serotiposc/varios genotipos en c/u LA IgM e IgG cruza con Zika IgMe IgG Cruza con Dengue DURACION DE IgM 1-2 meses IgM e IgG no cruza con Zika NI Dengue Hasta 18 MESES Hasta 3 meses??? Infección asintomática, coincidencias en el cuadroclínico No vacuna TIEMPO DE VIREMIA 1-5 Días De 1 hasta 12 días 1-5 días Adaptado: CDC Preparación y respuesta Virus Chikungunya en Las Américas OPS 2011 Características clínicas INSTITUTO NACIONAL DE SALUD • • • • • • • • Ficha Clínica Tiempo de enfermedad. Tipo de muestra. Obtención de muestra. Conservación de la muestra. Transporte de la muestra. Tipo de prueba. Conservación del ARN. NTS N°125-MINSA/2016/CDC-INS NTS N°125-MINSA/2016/CDC-INS DIAGNOSTICO SEROLOGICO Kit TARIKI Dengue IgM ELISA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD del INS INSTITUTO NACIONAL DE SALUD IMPLEMENTACION: 2008 -2010 TRANSFERENCIA: 2010 lotespilotos PRUEBA DIAGNÓSTICA TARIKI IgM DENGUE - INS SENSIBILIDAD ESPECIFICIDAD 99.3% 98% PRUEBA DE REFERENCIA TARIKI IgM DENGUE INS + - Total + 149 2 154 - 1 100 101 Total 150 102 255 INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PRUEBA DIAGNÓSTICA AgNS1 AgNS1 + IgM/IgG Estándar Diagnostic, INC® Sensibilidad 40.6% (31.7-49.5) 73.4% (65.4-81.5) Especificidad 95.1% (89.8-100) 91.5% (84.8-98.1) Sensibilidad 42.1% (31.7-49.5) 74.2% (66.1-82.3) Especificidad 95.1% (89.8-100) 79.2% (69.9-88.6) Pan Bio® - Transferencia del CDC INS -Verificación y Reproducibilidad de la prueba ELISA IgM CHIKV. - Insumos de DENV. HRP HRP Reacción cruzada: Semliki Forest virus - Mayaro. - EEV. - Ross River. - O´nyong nyong Diferenciales: -Dengue. - Influenza. - Malaria. - Leptospirosis. - Rickettsiosis - Transferencia del CDC INS - Verificación y Reproducibilidad de la prueba ELISA IgM ZIKA. HRP HRP Reacción cruzada: -Dengue -Fiebre Amarilla. -Encefalitis de San Luis. -Virus Rocio. -Ilheus Diferenciales: -Dengue. - Influenza. - Malaria. - Leptospirosis. - Rickettsiosis INSTITUTO NACIONL DE SALUD DIAGNOSTICO MOLECULAR • • • • • Diagnóstico Vigilancia molecular Vigilancia entomologica Epidemiología Molecular Estudios etiopatogenia INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RT-PCR Y RT- PCR TIEMPO REAL RT-PCR convencional • Two-Step (RT y PCRpor separado) • One-Step RT-PCR tiempo real • Con Sondas Taqman • Con SYBR Green INSTITUTO NACIONAL DE SALUD PCR EN TIEMPO REAL PARA DENGUE - Detectección cualitativa - Cuantifica carga viral INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RT-PCR EN TIEMPO REAL: Lanciotti CHIKV 3855F 5’ GAG CAT ACG GTT ACG CAG ATA G 3’ CHIKV 3957c1 5’ TAC TGG TGA TAC ATG GTG GTT TC 3’ CHIKV 3957c2 5’TGC TGG TGA CAC ATG GTG GTT TC 3’ CHIKV 3886P1-FAM 5’ACG AGTAAT CTG CGTACT GGG ACG TA 3’ CHIKV 3886P2-FAM 5’ACG AGT CAT CTG CGTATT GGG ACG CA 3’ INSTITUTO NACIONAL DE SALUD RT-PCR EN TIEMPO REAL SG: CHIKV 3855F 5’GAG CATACG GTTACG CAG ATAG 3’ CHIKV 3957c1 5’TRC TGG TGAYAC ATG GTG GTT TC 3’ (chikvPaq) INSTITUTO NACIONAL DE SALUD M CP Jessie Pari 101 bp INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIAGNOSTICO MOLECULAR DE VIRUS ZIKA: Forward Primer Reverse Primer Sonda (Probe) Especific Z-‐1086CCGCTGCCCAACACAAG Z-‐1162CCACTAACGTTCTTTTGCAGACAT Z-‐1107FAM AGCCTACCTTGACAAGCAGTCAGACACTCAA All Zikastrains* Z-‐4481CTGTGGCATGAACCCAATAG Z-‐4552ATCCCATAGAGCACCACTCC Z-‐4507FAMCCACGCTCCAGCTGCAAAGG Asian Genotype** * Emerging Infectious Diseases • Vol. 14, No. 8, August 2008 * * Unpublished; more sensitive by 1-‐2Ct PRUEBAS DISPONIBLES EN EL INS PARA EL DIAGNOSTICO DE VIRUS ZIKA Pruebas para muestras ≤ 5 días –Moleculares: RT-PCR tiempo real. (SUERO) –Virológicas: Aislamiento viral (Suero) –Secuenciación genética (genotipos). Pruebas para muestras ≥ 6 días (hasta dia 15) - Moleculares: RT-PCR tiempo real. (ORINA) - Virológicas: Aislamiento viral (Orina) - Serológicas: in house CDC REACCION CRUZADA CON DENGUE. - Utilidad en Infección Primaria, natimuertos, Sindrome G.Bare. PRUEBAS DISPONIBLES EN EL INS PARA EL DIAGNOSTICO DE VIRUS ZIKA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD DIAGNOSTICO POR AISLAMIENTO VIRAL INSTITUTO NACIONAL E SALUD - C6-36 (glándulas salivales Aedes albopictus). -Vero (riñón de mono verde Africano). LINEA C6-36 NORMAL LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO LINEA C6-36 SIN EFECTO CITOPATICO VIRUS ZIKA - C6-36 (glándulas salivales Aedes albopictus). LINEA C6-36 CON EFECTO CITOPATICO VIRUS ZIKA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD LINEA VERO SIN EFECTO CITOPATICO VIRUS ZIKA - Vero (riñón de mono verde Africano). LINEA VERO CON EFECTO CITOPATICO VIRUS ZIKA INSTITUTO NACIONAL DE SALUD IDENTIFICACION VIRAL INMUNOFLUORESCENCIA IFI POSITIVO A ZIKA ANTICUERPOS ESPECIFICOS FACTORES QUE AFECTAN A LAS IRA ❖EDAD Afectan mayoritariamente a los extremos de la edad. ❖ESTACIONALIDAD A los países de clima temperado preferentemente en invierno. En los países tropicales en toda época, con mayor intensidad en estación fría. ❖HACINAMIENTO Facilita la propagación epidémica ❖NUTRICIÓN En los grados más avanzados de desnutrición aumenta la mortalidad por IRA Proceso desarrollado en el centro centinela local IDENTIFICACIÓN DEL CASO Síndrome gripal: - Inicio súbito - T >= 38ºC - Tos o dolor de garganta OBTENCIÓN DE LA MUESTRA Hisopado faríngeo en las primeras 72 horas desde el inicio de los síntomas TRANSPORTE LABORATORIO DE REFERENCIA REGIONAL
