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randazzo2018 (1)

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ARTÍCULO EN PRENSA
Norovirus: la carga de la
Desconocido
Walter Randazzo*,† , Doris H. D'Souza‡, Gloria Sanchez*,1
*IATA­CSIC, Valencia, Spain †
Universidad de Valencia, Valencia, España
‡
1
Universidad de Tennessee, Knoxville, TN, Estados Unidos
Autor para correspondencia: dirección de correo electrónico: [email protected]
Contenido
2
1. Introducción
1.1 Clasificación y Estructura
2
1.2 Características de la infección por norovirus
2
1.3 Vía de transmisión
3
1.4 Epidemiología 1.5
3
Norovirus en los alimentos
4
4
2. Avances en el Cultivo de Norovirus Humano
3. Detección de norovirus en alimentos
5
3.1 Extracción de virus de los alimentos
6
7
3.2 Métodos de detección molecular
4. Prevalencia del Norovirus Humano en los Alimentos
10
5. Enfoques para controlar los norovirus humanos en productos alimenticios 5.1
11
Inactivación de norovirus mediante procesamiento térmico 5.2 Inactivación de
12
norovirus mediante procesamiento no térmico 5.3 Depuración de mariscos 5.4
13
Eficacia de los procedimientos de lavado para eliminar o inactivar los HNoV en los
19
alimentos
productos
19
22
5.5 Polímeros antivirales para envasado de alimentos
27
6. Conclusiones y perspectivas futuras Referencias
28
Abstracto
Los norovirus humanos (HNoV) se transmiten principalmente por vía fecal­oral, ya sea por contacto de persona a
persona o por ingestión de alimentos o agua contaminados, así como por aerosolización. Además, los HNoV
contribuyen significativamente a que las enfermedades transmitidas por los alimentos sean el agente causante de
una quinta parte de las gastroenteritis agudas en todo el mundo. Como consecuencia de la globalización, los brotes
transnacionales de infecciones transmitidas por los alimentos se notifican con mayor frecuencia. Por lo tanto, en
esta revisión, la información más actualizada sobre
Avances en la Investigación de Alimentos y Nutrición
ISSN 1043­4526
https://doi.org/10.1016/bs.afnr.2018.02.005
# 2018 Elsevier Inc.
Reservados todos los derechos.
1
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2
Walter Randazzo et al.
Se han resumido los procedimientos moleculares para la detección del norovirus humano en los
alimentos, así como las tecnologías comunes de procesamiento de alimentos. Además, el propósito de
este capítulo es consolidar la información básica sobre varios aspectos de los HNoV y resumir las
tecnologías de procesamiento de alimentos que pueden aplicarse potencialmente en la industria alimentaria.
1. INTRODUCCIÓN
1.1 Clasificación y Estructura
Los norovirus humanos (HNoVs) de la familia Caliciviridae y clasificados dentro del
género Norovirus, son responsables de casos esporádicos y brotes de gastroenteritis
aguda (GEA) (Greening & Cannon, 2016). Los HNoV son virus pequeños de estructura
redonda, de 28 a 35 nm, con un genoma de ARN monocatenario lineal de sentido
positivo de aproximadamente 7,4 a 7,7 kb de longitud. El genoma de HNoV está
organizado en tres marcos de lectura abiertos (ORF). ORF1 codifica una poliproteína
que se escinde después de la traducción en siete proteínas maduras no estructurales
(NS1–NS7), que funciona en la replicación viral; ORF2 codifica la proteína de la cápside
mayor (VP1) que mantiene la estructura del virus junto con ORF3 que codifica la
proteína de la cápside menor (VP2) (Vinje, 2015). La cápside viral VP1 tiene 90 dímeros
que consisten en un dominio de cubierta (S) y un dominio sobresaliente (P). El dominio
P incluye las subregiones P1 y P2, donde se informa que el subdominio P2, que es
muy variable, contiene los sitios de neutralización putativos e interactúa con los
receptores celulares de norovirus humanos putativos llamados antígenos del grupo
histosanguíneo (HBGA) (Prasad et al., 1999 ) . Sin embargo, se ha encontrado que
algunas cepas de HNoV no se unen a ningún ligando HBGA, lo que sugiere posibles
cofactores adicionales (Almand, Moore y Jaykus, 2017).
Los HNoV se clasifican actualmente en siete genogrupos (G), tres de los cuales
(GI, GII y GIV) son responsables de brotes en humanos. Además, GI y GII son
responsables de la gran mayoría de los casos clínicos (Vinje, 2015).
1.2 Características de la infección por norovirus
Los síntomas comunes asociados con la infección por HNoV son diarrea, vómitos,
náuseas y calambres estomacales, junto con febrícula, dolor de cabeza, escalofríos,
dolores musculares y fatiga (Lopman et al., 2015) . Las personas con enfermedad por
norovirus generalmente desarrollan síntomas de gastroenteritis dentro de las 12 a 48
horas posteriores a la exposición, y la mayoría de las personas sanas se sienten mejor
después de 1 o 3 días, los síntomas se resuelven por sí solos y no se sabe que
experimenten problemas de salud a largo plazo. (Teunis et al., 2008).
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Norovirus: la carga de lo desconocido
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1.3 Vía de transmisión
Las principales rutas de transmisión de partículas infecciosas ocurren debido a
episodios de diarrea y/o vómitos que liberan partículas virales en altas dosis/niveles
infecciosos, que son las principales preocupaciones en entornos cerrados como
residencias de ancianos, centros de cuidados a largo plazo y centros de salud.
conciertos, eventos y cruceros (Marsh et al., 2017; Sa´nchez, Randazzo, & D'Souza, 2018).
Para este último, la mayoría (97 %) de los brotes de AGE que se informaron y
diagnosticaron en cruceros en los Estados Unidos durante 2008–14 fueron causados
por HNoV (Mouchtouri et al., 2017). Se ha identificado que los manipuladores de
alimentos, los trabajadores del servicio de alimentos y los trabajadores de tratamiento
de aguas residuales infectados contribuyen a los brotes de HNoV. Los alimentos listos
para comer que no se procesan más, las verduras de hoja verde frescas, las verduras y
frutas frescas y congeladas, los embutidos en rodajas, el hielo (Cheng et al., 2017) y los
artículos de panadería se han visto implicados en los brotes de HNoV (D 'Souza, Moe,
& Jaykus, 2007; Sánchez et al., 2018).
1.4 Epidemiología A
pesar de la tasa creciente de brotes informados causados por HNoV, su incidencia ha
sido difícil de estimar debido a las limitaciones técnicas asociadas con su diagnóstico y
también por la naturaleza leve y autolimitada de la enfermedad. De hecho, los casos de
HNoV muy a menudo no se notifican a las autoridades públicas, ya que rara vez
requieren atención médica u hospitalización, aunque a veces se necesitan y ocurren en
personas mayores o inmunocomprometidas ( Atmar et al., 2014; Teunis et al., 2008). ).
Dado este hecho de que no se notifican los brotes de HNoV, se sigue informando que
los HNoV siguen siendo los principales agentes causantes de infecciones transmitidas
por los alimentos y GEA en todo el mundo, con incidencias epidémicas y esporádicas
(OMS, 2015). A nivel mundial, se estima que hay 120 millones de enfermedades, con
más de 35 000 muertes atribuidas a enfermedades transmitidas por los alimentos con
HNoV cada año (OMS, 2015) y un costo anual estimado de $64 500 millones (Bartsch,
Lopman, Ozawa, Hall y Lee, 2016). Según los últimos datos epidemiológicos disponibles,
los HNoV son la causa del 9%­20% de los brotes de origen alimentario notificados en
Europa (EFSA, 2015a, 2016a), con 12.591 casos, 349 hospitalizaciones y 1 muerte en
2015. En Estados Unidos Unidos, la incidencia de brotes transmitidos por alimentos
causados por HNoV durante 1998–2015 fue de 5362 brotes, 140,101 enfermedades,
1431 hospitalizaciones y 13 muertes (evaluado en línea el 10/10/2017 en https://
wwwn.cdc.gov/foodborneoutbreaks ).
La incidencia de brotes de HNoV no parece variar mucho entre los entornos de
ingresos bajos, medios y altos, lo que los convierte en la causa principal
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Walter Randazzo et al.
de enfermedades diarreicas incluso en países de altos ingresos con alrededor de 18 casos
por cada 100 personas (Lopman et al., 2015). Además, se ha pronosticado que una persona
experimentará un promedio de tres a ocho episodios de gas troenteritis por HNoV en su
vida, de los cuales al menos uno ocurrirá antes de los 5 años (Patel, 2008) . Se ha observado
una variación estacional de los brotes notificados en los países de ingresos altos con tasas
más altas en invierno, aunque parece depender más de las infecciones sanitarias que de las
transmitidas por los alimentos (McLeod, Polo, Le Saux y Le Guyader, 2017).
1.5 Norovirus en los alimentos
La contaminación de un alimento con HNoV puede ocurrir en cualquier punto desde la
granja hasta la mesa. Anteriormente se informaron ejemplos de alimentos implicados en
brotes. En el pasado, la mayoría de los brotes se relacionaron con mariscos, aunque la
mayoría de los alimentos (hojas verdes, bayas frescas y congeladas, mezcladas en batidos
o jugos, verduras frescas y congeladas, hierbas como ingredientes en preparaciones de
alimentos), fiambres en rodajas Se sabe que las carnes y los artículos de panadería están
implicados según las condiciones de manipulación, procesamiento y almacenamiento. Como
se informó anteriormente, los entornos cerrados y los restaurantes, hoteles y servicios de
catering son los lugares más comunes de brotes de HNoV (Chen, Hall y Kirk, 2017; EFSA,
2016a; Hall, Wikswo, Pringle, Gould y Parashar, 2014) .
Aproximadamente el 14 % de todos los brotes de HNoV en todo el mundo se pueden
atribuir a alimentos contaminados (Verhoef et al., 2015), en el mismo orden de magnitud
que el 36 % notificado en los Estados Unidos y el 9,8 % en la Unión Europea según las
estimaciones de la vigilancia de brotes datos (CDC, 2017; EFSA, 2017; Hall et al., 2014). A
nivel mundial, los peligros transmitidos por los alimentos causan aproximadamente 600
millones de enfermedades al año, principalmente debido a agentes infecciosos que causan
enfermedades diarreicas, siendo los HNoV responsables de 120 millones de casos atribuidos
al agua y los alimentos (OMS, 2015).
2. AVANCES EN EL CULTIVO DE NOROVIRUS
HUMANO
Uno de los avances más importantes en la investigación de HNoV ha sido el cultivo
exitoso de múltiples cepas de HNoV (incluidas cuatro variantes GII.4 y GII.3, GII.17 y GI.1)
en monocapas de enteroide de yeyuno humano (Ettayebi et al. , 2016). Aunque existen
diferencias entre las cepas de HNoV dependiendo de los contenidos variables del intestino
(la bilis, por ejemplo) que promueven la replicación de HNoV. Si bien es necesario avanzar
más para aumentar los niveles de propagación e infección de este sistema (actualmente en
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Norovirus: la carga de lo desconocido
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1200 y 2,0104 equivalentes de genoma/pozo según la cepa), este avance debería
permitir la investigación que antes se había visto obstaculizada (Ettayebi et al., 2016).
Estos numerosos desafíos en la propagación exitosa de HNoV de manera reproducible y
el alto título que ha seguido prevaleciendo ha dificultado el estudio de la comprensión de
las interacciones HNoV­huésped, los mecanismos de transmisión y control (Knight, Li,
Uyttendaele y Jaykus, 2013).
En el pasado (desde la década de 1970), se realizaron numerosos estudios para
comprender mejor la infección y la patología de los HNoV infectando a voluntarios sanos
(Atmar & Estes, 2001; Dolin et al., 1972; Frenck et al., 2012; Hutson, Atmar , Graham, &
Estes, 2002; Lindesmith et al., 2003; Lindesmith et al., 2005; Richards, 2012). Por lo tanto,
las cuestiones éticas eran una preocupación natural, junto con la reproducibilidad del
estudio. Luego, estudios más recientes se centraron en el uso de estudios de laboratorio
con modelos animales, incluidos chimpancés (Bok et al., 2011), ratones (Taube et al.,
2013), terneros (Souza, Azevedo, Jung, Cheetham y Saif, 2008), y cerdos Los problemas
de los derechos de los animales, la ética, el manejo y el costo de estos modelos continúan
siendo una preocupación.
Como se informó anteriormente (Sa´nchez et al., 2018), entonces serían más
adecuadas las líneas celulares, los cultivos primarios, así como los cultivos tridimensionales
que simulan tejidos intestinales para la replicación in vitro de HNoV que no tuvieron mucho
éxito en obtener reproducibles. o títulos infecciosos a niveles elevados (Duizer et al., 2004;
Lay et al., 2010; Papafragkou, Hewitt, Park, Greening y Vinje, 2013). El cultivo de HNoV en
células B se informó recientemente, pero la limitación fue la replicación de una sola cepa
de HNoV a niveles limitados (Jones et al., 2015, 2014). Por lo tanto, las monocapas de
enteroides de yeyuno humano, aunque actualmente son costosas y requieren mucha
experiencia, sientan las bases para futuros estudios in vitro con HNoV.
3. DETECCIÓN DE NOROVIRUS EN ALIMENTOS
A pesar de representar aproximadamente una quinta parte de todos los casos de
AGE en todo el mundo, el HNoV ha recibido comparativamente menos atención que otros
patógenos transmitidos por los alimentos (Bartsch et al., 2016). Hasta el momento, no se
dispone de métodos de rutina para el cultivo de HNoV aislado de matrices alimentarias. Porque
Debido al creciente número de brotes de HNoV transmitidos por los alimentos, se ha vuelto
aún más importante contar con técnicas confiables y ampliamente aplicables para la
detección y cuantificación de HNoV en los alimentos. Además, dado que la dosis infecciosa
de HNoV es muy baja (18–2800 equivalentes genómicos)
(Teunis et al., 2008), por lo tanto, se necesitan métodos sensibles al cribar
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Walter Randazzo et al.
productos alimenticios para HNoV. La detección del HNoV se ha abordado básicamente
mediante la detección de genomas virales mediante técnicas de amplificación molecular
como la reacción en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa (RT­PCR) o la PCR
cuantitativa en tiempo real (RT­qPCR). Sin embargo, la secuenciación tradicional y la
secuenciación del genoma completo parecen ser la tendencia para detectar y clasificar las
cepas de HNoV en el seguimiento de brotes (Yang et al., 2017).
3.1 Extracción de virus de los alimentos
La extracción de HNoV de los alimentos se puede definir como la separación y concentración
de partículas de HNoV de la matriz alimentaria. Dichas metodologías generalmente consisten
en un paso de elución del virus, seguido de una concentración y purificación del virus
diseñadas para reducir el volumen de la muestra y eliminar al menos algunos de los
compuestos de la matriz mientras se recuperan simultáneamente la mayoría de los virus
contaminantes. El tipo de alimento, su composición y la ruta de contaminación determinan
cómo liberar los virus de los alimentos antes de la extracción del ácido nucleico (Bosch et al.,
2011), por lo que se han desarrollado muchos métodos diferentes (Stals, Baert, Van Coillie,
y Uyttendaele, 2012).
Por lo general, se usa un tampón de elución para liberar el HNoV de los alimentos.
Muchos procedimientos de concentración de virus utilizan la manipulación del pH y/o las
condiciones iónicas para facilitar la adsorción del virus o la elución de la matriz alimentaria.
El extracto de carne y la glicina se agregan comúnmente a los tampones de elución para
reducir la adsorción de virus inespecíficos a la matriz alimentaria (Stals et al., 2012).
Además, la alta concentración de proteína del extracto de carne de vacuno facilita la
floculación de virus durante la precipitación con polietilenglicol (PEG). Sin embargo, el
extracto de carne de res también podría interferir con los métodos de detección molecular, lo
que podría generar resultados falsos negativos. Luego, la precipitación con PEG es seguida
por una centrifugación a velocidad relativamente baja, después de lo cual el precipitado de
virus se recupera para una purificación adicional.
Las verificaciones de control de calidad, incluidos los controles internos de amplificación
y los controles de proceso, son esenciales para monitorear cualquier problema que pueda
generar resultados falsos negativos (D'Agostino, Cook, Rodriguez­Lazaro y Rutjes, 2011).
Con respecto a este tema, la ISO 15216­1:2017 incluye el uso de una suspensión titulada de
mengovirus como control del proceso, que se agrega durante el paso inicial de la extracción
y se analiza y cuantifica mediante RT­qPCR al final del proceso. procedimiento (Costafreda,
Bosch, & Pinto´, 2006). Esto proporciona una estimación precisa del rendimiento de todo el
procedimiento. Como no parece haber un protocolo de extracción universal para recuperar
de manera eficiente los virus entéricos humanos de todo tipo de alimentos, la ISO
15216­1:2017 propone
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diferentes métodos de elución y concentración de virus dependiendo de la muestra,
es decir, tratamiento de las glándulas digestivas con proteinasa K para mariscos,
precipitación con PEG para frutas blandas y verduras de hoja, y adsorción en
membranas cargadas positivamente seguida de ultrafiltración para agua embotellada
(como se describe en Sánchez et al., 2018). Aunque se sabe que los métodos de
concentración aplicados a un alimento contaminado tienen un gran impacto en el
rendimiento de los procedimientos, se ha prestado poca atención comparativamente a
esta área (Butot, Zuber y Baert, 2014).
Una vez que se extrae el virus, se pueden usar ensayos de infectividad cuando
estén disponibles y/o métodos moleculares para la detección. Para la detección
molecular, primero se debe liberar o extraer el ARN mediante la interrupción de la cápside viral.
El protocolo estándar de Boom que usa reactivos caotrópicos seguidos de adsorción
de ARN a partículas de sílice (Boom et al., 1990) o kits comerciales se pueden usar
para obtener ARN purificado y de alto rendimiento.
Alternativamente, los aptámeros de ácidos nucleicos, secuencias cortas de
ssDNA que tienen afinidad de unión por HNoV, se han utilizado como ligandos de
unión para capturar y concentrar HNoV de lechuga (Escudero­Abarca, Suh, Moore,
Dwivedi y Jaykus, 2014).
Actualmente, diferentes instituciones internacionales como los CDC de EE. UU .
(https://www.cdc.gov/norovirus/lab­testing/diagnostic.htmland ) y Health Canada (http://
www.hc­sc.gc.ca/fn­an/res­rech/analy­meth/microbio/volume5­eng.php#share ) han
publicado procedimientos para la detección de HNoV en muestras de alimentos.
Además, recientemente se emitió un procedimiento estandarizado basado en RT­
qPCR para HNoV GI y GII en varias matrices alimentarias, incluidos mariscos, bayas,
verduras y agua embotellada (ISO 15216­1:2017), incluido un estudio de validación
internacional que involucra 18 laboratorios de 11 países (Lowther et al., 2017).
3.2 Métodos de detección molecular
Los medios tradicionales para la detección microbiana no se pueden aplicar para la
detección de HNoV en los alimentos; sin embargo, las metodologías moleculares
pueden proporcionar información oportuna y precisa sobre la presencia de HNoV en
los alimentos. Hasta ahora, se han aplicado varios procedimientos moleculares más
nuevos para detectar y cuantificar los HNoV en los alimentos, como la amplificación
basada en secuencias de ácidos nucleicos, NASBA ( Houde et al., 2006; Kou, Wu,
Zhang y Fan, 2006; Moore et al. ., 2004) y técnicas de amplificación isotérmica
mediada por bucle de transcriptasa inversa, RT­LAMP (Fukuda, Takao, Kuwayama,
Shimazu y Miyazaki, 2006). Sin embargo, RT­qPCR sigue siendo el estándar de oro actual para HN
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detección, debido a su sensibilidad, especificidad, velocidad y capacidad para entregar
datos cuantitativos (como también se describe en Sanchez et al., 2018).
Durante el desarrollo de ensayos moleculares, el conjunto de cebadores y sondas
altamente conservados debe tener como objetivo aumentar la capacidad de detectar las
diferentes cepas de HNoV entre los genogrupos que afectan a los humanos. Según se
informa, la unión ORF1/ORF2 es la mejor región del genoma objetivo para la detección de
€
HNoV (Hohne & Schreier, 2004 ; Kageyama et 2005;
al., 2003;
Katayama
et al., .2002;
Loisy et al.,
Nishida
et al., 2003)
Sin embargo,
en
la actualidad, un solo ensayo para detectar simultáneamente todos los genotipos de HNoV
sigue siendo difícil de alcanzar.
Aunque el estándar de oro actual, las metodologías de RT­qPCR tienen inconvenientes
para detectar el ARN viral de HNoV tanto infeccioso como inactivado, lo que podría
sobrestimar la cantidad de virus infecciosos. De hecho, la persistencia del ARN viral en
alimentos y en el medio ambiente puede ser mucho mayor que la de los correspondientes
virus infecciosos (Baert, Uyttendaele, Van Coillie, & Debevere, 2008; Butot, Putallaz,
Amoroso, & Sa´nchez, 2009). ; Butot, Putallaz, & Sánchez, 2008; Hewitt & Greening, 2004).
Para permitir la diferenciación entre partículas virales infecciosas e inactivadas, se han
informado diferentes enfoques basados en la integridad de la cápside (DiCaprio, 2017;
Sanchez et al., 2018), que incluyen: (i) pretratamiento con nucleasas y/o enzimas proteolíticas
antes del ácido nucleico extracción para eliminar cualquier señal de genomas dañados o
expuestos (Lamhoujeb, Fliss, Ngazoa y Jean, 2008; Nowak et al., 2011); (ii) uso de unión de
HNoV (con sitio de unión intacto) a mucina gástrica porcina (PGM) (Tan & Jiang, 2005; Tang
et al., 2010) que permite la recuperación selectiva de HNoV potencialmente infecciosos en
alimentos (Dancho, Chen , & Kingsley, 2012; DiCaprio et al., 2016), y (iii) pretratamiento de
ácido nucleico con colorantes intercalantes convencionales y recientemente desarrollados
(es decir, monoazida de propidio, PMA y monoazida de etidio, EMA; PMAxx y PEMAX,
respectivamente) ( Elizaquı ´vel, Aznar, & Sa´nchez, 2014; Randazzo, Lo´pez­Ga´lvez,
Allende, Aznar, & Sa´nchez, 2016). Este enfoque se basa en la capacidad de intercalar
colorantes para penetrar solo en las cápsidas dañadas o alteradas y se intercala
covalentemente en el genoma viral después de la exposición a una luz visible intensa, lo que
evita e interfiere con la amplificación por PCR. Hasta ahora, los colorantes intercalados
combinados con RT­qPCR se han aplicado con éxito a las suspensiones de virus para
discriminar entre HNoV infecciosos e inactivados (Tabla 1), y además estos pretratamientos
ya se han aplicado para detectar HNoV potencialmente infecciosos en muestras de agua,
aguas residuales. , vegetales y mariscos y discriminan entre viriones infecciosos y no
infecciosos (Randazzo et al., 2018; Randazzo, Lo´pez­Ga´lvez, et al., 2016). Curiosamente,
este enfoque
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Tabla 1 Aplicación de Colorantes Intercalantes para la Detección de Norovirus Humanos Potencialmente Infecciosos
Inactivación
Proceso
Colorante/surfactante
Matriz
Discriminación exitosa
Referencias
Sí por RT­PCR pero no por
RT­qPCR
Parshionikar, Laseke y Fout (2010)
Sí (SYBR verde
Squire­Embrace, Rawsthorne, Goulter, Suh y
Calor (72°C,
5min)
AMP
Calor (90°C,
5min)
AMP
Calor
AMP
No (por RT­PCR)
Karim, Fout, Johnson, White y
Parshionikar (2015)
PMA/
Sí
Lee, Lee, Yoon, Kim y Ha (2018)
Sí
Jeong, Park y Ha (2017)
Sí
Randazzo, López­Gálvez, et al. (2016)
Sí
Randazzo et al. (2018)
EN
ARTÍCULO
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Suspensión de heces
RT­qPCR)
Jaykus (2014)
Cloro
Cloro
lauroilsarcosinato de sodio
Calor (65–85 °C,
2 min)
AMP
Calor (99°C,
5min)
PMAxx/Tritón
Heces y
espinacas
Heces,
lechuga y
espinacas
Mejillones,
ostras y
berberechos
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Walter Randazzo et al.
demostró reducir las señales falsas positivas de RT­qPCR para HNoV en muestras de
agua contaminadas naturalmente (Blanco et al., 2017; Randazzo et al., 2018; Randazzo,
Lo´pez­Ga´lvez, et al., 2016). Por otro lado, se han observado algunas desventajas con
este enfoque, particularmente para lograr la supresión completa de la señal de RT­
qPCR de los virus inactivados presentes en algunas matrices alimentarias particulares,
por ejemplo, mariscos (Randazzo et al., 2018) . Como se mencionó anteriormente, se
está buscando la secuenciación del genoma completo de virus de brotes y muestras de
alimentos para la detección y confirmación simultáneas de cepas de HNoV en el
seguimiento de brotes, aunque es necesario lograr un progreso significativo para
enrutar las pruebas de muestras de alimentos para vincularlas a entornos clínicos.
4. PREVALENCIA DEL NOROVIRUS HUMANO EN LOS ALIMENTOS
Además, como se mencionó anteriormente (Sanchez et al., 2018), los mariscos
y todos los alimentos listos para el consumo se han visto implicados en brotes de HNoV,
lo que indica la prevalencia de HNoV en ellos. La contaminación de mariscos por HNoV
ha sido y sigue siendo un importante problema económico y de salud (Bellou, Kokkinos
y Vantarakis, 2013). El año pasado, la Comisión Europea lanzó un programa de
seguimiento para estimar la prevalencia europea de contaminación por HNoV en ostras
recolectadas en puntos de seguimiento representativos en áreas de producción y
centros de expedición utilizando la norma ISO 15216­1:2017 (EFSA, 2016b; ISO
15216­1 : 2017 ). Además, los riesgos para la salud asociados con el consumo de
ostras crudas no se reducen lo suficiente con los actuales procedimientos comerciales
de depuración aplicados para reducir la contaminación microbiológica (McLeod et al.,
2017). Hasta la fecha, se han informado altos niveles de HNoV en las ostras, con niveles
que varían notablemente entre los sitios en Europa, con algunos sitios con una
puntuación constante de más de 1000 copias/g durante el invierno, mientras que otros
rara vez o nunca superan las 100 copias/g (Panel de la EFSA sobre peligros
biológicos) . , 2012; Polo et al., 2016; Schaeffer, Le Saux, Lora, Atmar y Le Guyader,
2013).
Bélgica, Canadá y Francia fueron los primeros países en proporcionar datos sobre
la prevalencia de HNoV en más de 1000 muestras de verduras de hoja verde.
Los genomas de HNoV se detectaron con frecuencia (28,2 %, 33,3 % y 50 % en
muestras canadienses, belgas y francesas, respectivamente); sin embargo, la
confirmación de la secuencia no tuvo éxito en la mayoría de las muestras analizadas
(Baert et al., 2011). En ensaladas de vegetales de países europeos, las muestras
fueron positivas en 2% y 2.95% para HNoV GI y HNoV GII, respectivamente (Kokkinos
et al., 2012). En muestras de México, HNoV estuvo presente en el 32,6% de las
muestras (Felix­Valenzuela, Resendiz­Sandoval, Burgara­Estrella,
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Norovirus: la carga de lo desconocido
11
Herna´ndez, & Mata­Haro, 2012), mientras que en Turquía, de 525 muestras analizadas,
se detectó HNoV GII en 1 muestra de cebolla verde y 1 muestra de tomate mediante
los ensayos SYBR Green y TaqMan RT­qPCR (Yilmaz et al . , 2011). Un estudio reciente
realizado en ensaladas verdes del delta del Nilo mostró la validez del procedimiento ISO
15216­1:2017 en productos naturalmente contaminados con HNoV que detectan HNoV
GI en 20.8%–34.0% de muestras naturalmente contaminadas, incluidas cebollas verdes,
berros, rábanos. , puerro y lechuga con un número de copias del genoma de alrededor
de 102 (El­Senousy, Costafreda, Pinto´, & Bosch, 2013). En 2016, tras una alerta
de
per gram
brote en Europa (Rapid Alert System for Food and Feed, RASFF, expediente 2017/0469),
Blanco et al. (2017) determinaron beber agua embotellada como la posible fuente de
transmisión de HNoV. El estudio estimó la concentración de HNoV GI y GII en dos de
las cuatro muestras en alrededor de 103 a 104 copias del genoma por litro de agua.
5. ENFOQUES PARA EL CONTROL DE NOROVIRUS HUMANOS EN
PRODUCTOS ALIMENTICIOS
Como virus sin envoltura, los HNoV tienden a ser más resistentes a la
inactivación que las bacterias transmitidas por los alimentos en los procesos
tradicionales de fabricación de alimentos. La mayoría de los estudios para determinar la
eficacia de diferentes tecnologías de procesamiento, así como la actividad antiviral de
diferentes compuestos, se han realizado agregando artificialmente una cantidad conocida
de virus a un material dado, determinando la reducción en el título infeccioso después
de someter el material enriquecido a las condiciones designadas. , y aplicando
procedimientos estadísticos para determinar la importancia de la descomposición del virus (Sa´nchez
Evidentemente, esto implica el uso de cepas de virus que pueden propagarse en cultivo
celular y enumerarse a través de la infectividad, lo que restringe mucho el rango de
cepas que pueden incluirse en estos estudios debido a las dificultades para desarrollar
sistemas de cultivo in vitro para replicar HNoV. . Por lo tanto, la infectividad de los HNoV
se ha inferido principalmente a través de sustitutos cultivables, como el calicivirus felino
(FCV), el norovirus murino (MNV) y el virus Tulane (TV) ( Hirneisen & Kniel, 2013a).
Aunque estos modelos de virus se han utilizado en gran medida para estudiar la tasa de
supervivencia de los HNoV expuestos a diferentes procesos de inactivación, no está
claro si los HNoV podrían inactivarse mediante las condiciones de inactivación
establecidas para sus sustitutos (Bae & Schwab, 2008; Knight et al . , 2016; NACMCF,
2016). Como se informó anteriormente, la persistencia ambiental de HNoV depende de
muchos factores físicos, biológicos y químicos, como la temperatura, la fuerza iónica,
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12
Walter Randazzo et al.
componentes químicos, el antagonismo microbiano, el estado del virus (como virus
unido a materia orgánica o agregación de virus) y el tipo de virus (Cook, Knight, &
Richards, 2016; Knight et al., 2016; Sa´nchez et al. al., 2018). Se ha informado que
diferentes genotipos de HNoV muestran diferentes comportamientos y tasas de
inactivación.
5.1 Inactivación de norovirus por procesamiento térmico El
procesamiento térmico sigue siendo uno de los métodos más importantes y
comunes de conservación de alimentos en la industria alimentaria (Micali, Fiorino y
Parisi, 2016). Se ha demostrado que el procesamiento térmico es una tecnología
muy eficaz para la inactivación de bacterias y levaduras. Sin embargo, hasta hace
poco tiempo, la inactivación por calor de los virus entéricos, en particular los HNoV
en los alimentos, se había explorado poco. Es bien sabido que la inactivación de
HNoVs o de cualquier microorganismo por calor está influenciada por factores como
la presencia de materia orgánica, como materia fecal, la matriz alimentaria (por
ejemplo, alto contenido de grasas o proteínas), el nivel inicial de contaminación, y
el tiempo­temperatura del proceso (Li, Predmore, Divers, & Lou, 2012). Comprender
la resistencia térmica y las propiedades de un patógeno objetivo sigue siendo crucial
para diseñar procesos de tratamiento térmico efectivos para su inactivación y
control, que se determina utilizando el valor D, definido como el tiempo a una
temperatura dada para causar una reducción de 1 log del target (Bozkurt, D'Souza,
& Davidson, 2015). Esta sección se centra en los estudios que utilizan HNoV,
mientras que no se incluye la información de los estudios que involucran solo sustitutos.
El IG de HNoV en albahaca después de calentar a 75 y 95 °C tuvo valores D de
5,2 y 4,9 min, en cebollino de <0,83 min y <0,83 min, en menta de 2,57 min y <0,83
min, y en perejil de 1,56 y 1,58 min, respectivamente, cuando se analizó por RT­
qPCR (Butot et al., 2009). Mientras que HNoV GII después del análisis por RT­
qPCR después de calentar a 75 y 95 °C mostró valores D de 1,71 y 1,55 min en
albahaca, 1,85 y 1,08 min en cebollino, 1,58 y <0,83 min en menta, 1,64 y 0,89 min
en perejil , respectivamente (Butot et al., 2009). El efecto de los procedimientos de
cocción comunes en HNoV GII.3 inoculado en varios productos alimenticios se
investigó mediante RT­qPCR, donde la salsa de tomate especiada se trató a 74 °C
durante 1 minuto, la carne picada se asó a 200 °C durante 30 minutos y la pizza
congelada se horneó a 200 °C durante 12 min mostró una reducción de 0,4, 1,6 y
>4 log copias del genoma HNoV (Mormann, Dabisch y Becker, 2010). Además, las
espinacas, la lechuga y el canónigo se han utilizado como matrices alimentarias
para evaluar la infectividad de los HNoV después de tratamientos térmicos mediante
la aplicación de pretratamiento de diferentes tintes intercalantes junto con RT­qPCR
(Jeong et al., 2017; Randazzo, Lo´pez ­ Ga ´lvez, et al., 2016).
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Norovirus: la carga de lo desconocido
13
La aparición de brotes de HNoV asociados con el consumo de mariscos fritos,
a la parrilla, guisados y al vapor indica que los procedimientos estándar de cocción
no garantizan la inactivación completa de HNoV (McDonnell et al., 1997). Los
estudios iniciales se realizaron con sustitutos de HNoV, mientras que los estudios
más recientes se centraron en HNoV usando RT­qPCR sola o combinada con PGM
o pretratamientos con colorantes intercalados, donde los HNoV en mejillones
calentados a 100 °C mostraron valores D de 1,3 min por RT­qPCR ( Hewitt &
Greening, 2006) y los HNoV en mejillones calentados a 60 °C mostraron valores D
de 25 min mediante RT­qPCR (Croci, Suffredini, Di Pasquale y Cozzi, 2012).
Del mismo modo, Randazzo et al. (2018) evaluaron el destino de los HNoV GI y GII
en ostras bioacumuladas y contaminadas naturalmente después de un tratamiento
térmico. Al aplicar un pretratamiento PMAxx antes de la RT­qPCR para predecir la
infectividad de HNoV, los autores informaron reducciones de 1,61 y 2,18, y 2,99 y
1,93 log RT­PCRU/100 μL para HNoV GI y GII en ostras bioacumuladas y
contaminadas naturalmente, respectivamente. Además, en las ostras bioacumuladas,
las diferencias en los valores de reducción entre el pretratamiento sin colorante y
los pretratamientos con colorante aumentaron gradualmente junto con el aumento
escalonado de la temperatura, incluso estos resultados pueden subestimar la tasa
real de inactivación de HNoV como se informó anteriormente.
En general, los procedimientos de cocción en los que la temperatura interna del
marisco alcanza al menos los 90 °C durante 1,5 min se han considerado tratamientos
adecuados para eliminar la infectividad viral (Codex Alimentarius, 2012; NACMCF,
2008), aunque publicaciones recientes de la EFSA indican tiempos más altos.
necesario (EFSA, 2015b).
5.2 Inactivación de norovirus por procesamiento no térmico En los
últimos años, el interés por productos alimenticios de alta calidad está aumentando
constantemente debido a la demanda de los consumidores. Por lo tanto, tanto la
industria como la academia han avanzado en el desarrollo de tecnologías no térmicas
en un intento de enfrentar el desafío de producir alimentos procesados seguros de
alta calidad, aunque algunas preocupaciones en cuanto a la aceptabilidad actual del
consumidor y la regulación han limitado sus aplicaciones.
5.2.1 Procesamiento a alta presión (HPP)
HPP es una técnica de procesamiento en frío, no térmica, en la que el alimento en
su empaque flexible final se somete a altos niveles de presión hidrostática,
inactivando microorganismos, extendiendo la vida útil y garantizando la seguridad
alimentaria del producto (Rodrigo, van Loey, & Hendrickx , 2007).
Los efectos de HNoV por HPP se han investigado principalmente utilizando
sustitutos de HNoV, mientras que hay poca información disponible sobre HNoV (Tabla 2;
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Tabla 2 Efecto de los tratamientos HPP sobre los norovirus humanos aplicados a muestras de alimentos
hnov
Presión
Condiciones de procesamiento
Genotipo
(MPa)
(Tiempo, Temperatura)
soldado americano
650
600
Inactivación
Tipo de comida
(Reducción logarítmica) Referencias
2min, 0°C
Frambuesas
2.5
Huang et al. (2016)
5min, 6°C
ostras
4.0
León et al. (2011)
EN
ARTÍCULO
PRENSA
Cebollas verdes
>3.0
2min, 0°C
cuartos de fresa
1.9
Huang et al. (2016)
2min, 0°C
puré de fresa
>3.0
Huang et al. (2016)
Puré de arándanos
2.9
puré de frambuesa
2.9
2min, 1°C
Sido, Huang, Liu y
Chen (2017)
550
500
2min, 1°C
Salsa (principalmente tomates) >3.0
2min, 0°C
Arándano
>3.2
Huang et al. (2016)
ostras
>4.3
Ye et al. (2015)
homogeneizado de almejas
4.0
Ye, Li, Kingsley, Jiang y
5min, 1°C
450
4.1
400
2.8
Sido et al. (2017)
Chen (2014)
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GII
650
2min, 0°C
cuartos de fresa
3.1
Huang et al. (2016)
550
2min, 0°C
Puré de arándanos
>4.4
Huang et al. (2016)
Frambuesa
>4.1
2min, 1°C
Cebollas verdes
>3.0
Sido et al. (2017)
5min, 1°C
homogeneizado de ostras
4.0
Ye et al. (2014)
500
EN
ARTÍCULO
PRENSA
450
4.3
400
2.9
350
300
2min, 0°C
puré de fresa
>4.2
Huang et al. (2016)
5min, 25°C
ostra
1,87–1,99
Imamura et al. (2017)
2min, 0°C
puré de frambuesa
>4.2
Huang et al. (2016)
ostras
>4.2
Ye et al. (2015)
2min, 1°C
Salsa (principalmente tomates) >3.0
Sido et al. (2017)
2min, 0°C
arándanos
Huang et al. (2016)
>4.1
Adaptado de Sa´nchez, G., Randazzo, W., & D'Souza, DH (2018). Capítulo 10: Norovirus humanos. En D. Liu (Ed.), Manual de enfermedades transmitidas por los alimentos. Taylor y
Francisco.
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dieciséis
Walter Randazzo et al.
de Sa´nchez et al., 2018), que muestra que los diferentes factores de procesamiento
(presión, temperatura de mantenimiento y tiempo) y las propiedades de los alimentos
(pH, grasa, sal, azúcar o contenido de proteína) son factores clave que deben tenerse
en cuenta. durante el diseño de tratamientos HPP efectivos (revisado por Kingsley,
2013; Lou, Neetoo, Chen, & Li, 2015; Sanchez et al., 2018). Por ejemplo, se informa
una mayor inactivación de HNoV y sus sustitutos a pH neutro que a pH ácido cuando
se aplica HPP (Chen, Hoover y Kingsley, 2005; Kingsley y Chen, 2008; Li, Chen y
Kingsley, 2013; Lou et al. , 2016; Lou, Neetoo, Chen y Li, 2011), que se confirmó para
HNoV GI y GII mediante un método de captura PGM (Li, Chen y Kingsley, 2013).
Las bajas temperaturas también mejoraron el efecto HPP en los sustitutos HNoV
(Kingsley, Holliman, Calci, Chen, & Flick, 2007; Lou et al., 2011; Sa´nchez, Aznar, Martı
´nez, & Rodrigo, 2011) y HNoVs GII ( Lou et al., 2016). Se observó un efecto
baroprotector con CaCl2, NaCl y sacarosa utilizando sustitutos de HNoV (Kingsley &
Chen, 2008; Sa´nchez et al., 2011), que también fueron informados por Lou et al. (2016)
para HNoV GII en PBS y DMEM en comparación con agua. El HPP de alimentos
contaminados artificialmente, incluidos vegetales, purés, almejas y ostras, se resumen
en la Tabla 2 (adaptado de Sa´nchez et al., 2018). Se informó que HNoV GI se inactivó
a 600 MPa durante 5 minutos a 6 °C en un estudio con voluntarios humanos, mientras
que 400 MPa a 6 °C durante 5 minutos no protegió a todos los voluntarios (Leon et al.,
2011) . Se informa que el genotipo GII.4 de HNoV es más sensible a los tratamientos
de presión que el GI.1 (Huang et al., 2016; Li, Chen y Kingsley, 2013; Lou et al., 2016;
Ye et al., 2014).
5.2.2 Homogeneización a alta presión (HPH)
HPH es un proceso puramente mecánico y continuo con una presión relativamente más
baja (<400MPa) y un tiempo de exposición más corto (s), ideal para alimentos líquidos.
No hay muchos estudios informados en la literatura hasta la fecha que utilicen este
enfoque. HPH a 300 MPa durante <2 s mostró una reducción de 3 log para FCV F9 en
tampón, leche y jugos, mientras que MNV­1 fue más resistente y mostró una reducción
de título mucho menor ( D'Souza, Su, Roach y Harte, 2009; Horm & D'Souza, 2011;
Horm, Davidson, Harte y D'Souza, 2012; Horm, Harte y D'Souza, 2012).
5.2.3 Plasma a presión atmosférica (APP)
APP es un enfoque innovador que utiliza un gas ionizado neutro que contiene especies
altamente reactivas de iones, moléculas y fotones (Wan, Coventry,
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Norovirus: la carga de lo desconocido
17
Swiergon, Sanguansri y Versteeg, 2009). Como resumen Sánchez et al. (2018), el
tratamiento con APP fría (CAPP) en HNoV GII.4 ha demostrado que el aumento de los
tiempos de tratamiento con plasma condujo a una disminución de las copias del genoma
de HNoV en las superficies inoculadas (Ahlfeld et al., 2015). De manera similar, la potencia
de generación de plasma CAP, la mezcla de gases de alimentación, el tiempo y la distancia
de exposición y el medio de suspensión del virus afectaron la inactivación de FCV­F9
(Aboubakr et al., 2015). Alshraiedeh, Alkawareek, Gorman, Graham y Gilmore (2013)
utilizaron un chorro de plasma no térmico que mostró una rápida reducción de 3 log
después de 3 min y más de 7 log después de 9 min para el bacteriófago MS2. Se informó
que los tratamientos con plasma no térmico de las superficies de acero inoxidable
mostraron reducciones para los sustitutos de HNoV, con una clasificación de reducción de
FCV­F9>MS2> MNV­1 (D'Souza, 2013). Con respecto al tratamiento de los alimentos, el
tratamiento con chorro de APP después de 5 minutos en carnes frescas provocó una
reducción de >2 log en la infectividad del MNV sin cambiar la calidad de la carne (Bae,
Park, Choe y Ha, 2015), mientras que la descarga de la barrera dieléctrica APP, según se
informa, redujo la TV. por solo 0,7 log en lechuga envasada (Min et al., 2016).
5.2.4 Ultrasonido de alta potencia (HPU)
HPU ha demostrado que inactiva eficazmente las bacterias en alimentos líquidos y
productos frescos a bajas frecuencias que van desde 20 a 100 kHz (Bilek & Turantaş,
2013). Se informó que HPU a 0,56 kW/L, 20 kHz durante 60 min no es eficaz para la
reducción de MNV­1 en el agua de lavado de lechuga (Sa´nchez, Elizaquı´vel, Aznar y
Selma, 2015), aunque la reducción de 1,5 log de MNV­1 después de 30 minutos en jugo
de naranja se informó anteriormente (Su, Zivanovic y D'Souza, 2010). Además, el
ultrasonido de vapor también mostró que esta tecnología actualmente establecida no
parece ser adecuada para la descontaminación viral transmitida por los alimentos hasta
que se pueda lograr una mayor optimización de los parámetros (Schultz, Uhrbrand,
NØrrung y Dalsgaard, 2012).
5.2.5 Radiación Las
radiaciones ionizantes con fines de inocuidad de los alimentos indican dosis de 10 kGy por
la OMS, 4 kGy para lechuga iceberg y espinacas frescas, y 5,5 kGy en productos marinos
frescos por la FDA (Administración de Alimentos y Medicamentos, 2012; Goodburn &
Wallace , 2013; y como se describe en Sanchez et al., 2018).
Se informa que los sustitutos de HNoV son más resistentes a la irradiación (ionizante) que
los patógenos bacterianos, y esta tecnología no parece ser suficientemente efectiva contra
las cepas de HNoV (Sa´nchez et al., 2018). Después de un tratamiento con rayos X de 5,0
kGy, el MNV­1 internalizado en ostras de concha entera mostró 2,0 log
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18
Walter Randazzo et al.
Reducción de UFP/g (Wu et al., 2017), reducción de 2,6 log UFP/g en ensalada de atún
y >3,5 log UFP/g en ostras de media concha y sushi de salmón (Wu et al., 2016).
Mientras que a 5,6 kGy, se informó una reducción de 1,7–2,4 log MNV­1 en productos
frescos (Feng, Divers, Ma y Li, 2011).
La irradiación con haz de electrones a 4 kGy redujo TV en 1,4 y 1,3 log en fresas y
lechuga, respectivamente (Predmore et al., 2015), y MNV­1 en 0,4 y 0,7 log en fresas y
repollo, respectivamente (Sanglay, Li, Uribe y Lee, 2011). La irradiación gamma mostró
un mejor rendimiento que el haz de electrones contra HNoV GII.4 (DiCaprio et al., 2016),
aunque el ensayo de unión de PGM MB mostró que se necesitaban dosis de 22,4 kGy
mayores que los niveles actualmente aprobados en fresas enteras para abolir la unión
del receptor actividad. En un estudio muy reciente, el haz de electrones a 1, 3, 5, 7 y 10
kGy disminuyó la infectividad de MNV en 0,31, 0,6, 0,9, 1,1 y 1,4 log en carne de mariscos,
respectivamente, mientras que los parámetros sensoriales evaluados no fueron
significativos. significativamente modificado (Kim, Park, Rui y Ha, 2017).
El rango de longitud de onda de la luz ultravioleta (UV) para el procesamiento de
alimentos varía de 100 a 400 nm y se clasifica como UV­A (320–400 nm), UV­B (280–320
nm) y UV­C (200–400 nm). 280nm).
UV­C ha recibido la aprobación de la FDA para controlar los microorganismos en las
superficies de los productos alimenticios (Administración de Alimentos y Medicamentos,
2007; Li et al., 2011; Park, Kim, Lee y Ha, 2015). Se demostró que el tratamiento con UV­
C después de 5 minutos reduce los títulos de MNV­1 en menos de 1 log en lechuga recién
cortada, aunque se observó una reducción de 3 log en discos de acero inoxidable, lo que
indica que la topografía de la superficie, la dosis, la distancia, el tiempo y la matriz son
factores que juegan un papel en la eficacia del tratamiento y que acoplados con peróxido
de hidrógeno vaporizado pueden incrementar sus efectos (Li et al., 2011). MNV­1 se
inactivó por completo (>4 log) cuando los arándanos se sumergieron en agua agitada
durante 12 J/cm2 de tratamiento UV asistido por agua, con una reducción menor de 2,5
log con el tratamiento UV seco (Liu, Li y Chen, 2015).
La luz ultravioleta pulsada es aplicable para la descontaminación de superficies en
contacto con alimentos y alimentos mediante el uso de una lámpara de xenón que emite
longitudes de onda entre 200 y 1000 nm, y duraciones de pulso que no superan los 2 ms,
y una intensidad acumulada que no supera los 12 J/cm2 (Administración de Alimentos y
Medicamentos, 2013) . ). Se informó que el MNV­1 se inactivó por completo con luz
ultravioleta pulsada operada a 59 mWs/cm2 que provocó alteraciones en la estructura del
virus, con mayor reducción en fómites que en líquido, con menor eficacia esperada en
presencia de materia orgánica (Jean, Morales­Rayas , Anoman y Lamhoujeb, 2011;
Vimont, Fliss y Jean, 2015).
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19
Norovirus: la carga de lo desconocido
5.3 Depuración de mariscos La
depuración de mariscos es una tecnología de procesamiento comercial utilizada en todo
el mundo, donde los mariscos se colocan en tanques que contienen agua de mar limpia y
se les permite purgar los contaminantes durante varios días. La depuración de mariscos
elimina rápidamente los patógenos bacterianos y los microorganismos indicadores; sin
embargo, la comunidad científica está de acuerdo en que los procesos comerciales de
depuración de mariscos son inadecuados para los HNoV, ya que ha habido muchos
brotes de HNoV en ostras depuradas que contienen alrededor de
103de
copias
tejido
ostradel
( Legenoma/
Mennec
et al., 2017; McLeod et al., 2017). Además, la mitad de las publicaciones no mostraron
disminución en los títulos de HNoV durante la depuración, y en los estudios restantes,
tomó entre 9 y 45,5 días para una reducción de 1 logaritmo, significativamente más que
los plazos de depuración comercial (revisado por McLeod et al. , 2017). Además, un
estudio con voluntarios humanos sobre la depuración de mariscos concluyó que la
depuración no tuvo éxito (Grohmann, Murphy, Christopher, Auty y Greenberg, 1981).
5.4 Eficacia de los procedimientos de lavado para eliminar o inactivar
HNoV en productos alimenticios
Los productos y, en particular, las verduras de hoja verde y las bayas que se consumen
crudas, han ganado mucho reconocimiento como vehículos importantes para la
transmisión de patógenos virales transmitidos por los alimentos. Los HNoV pueden
contaminar los productos a través del contacto con aguas residuales tratadas
incorrectamente o aguas residuales contaminadas en los campos, así como a través de
la contaminación del agua de riego y los sistemas de riego, y durante el procesamiento,
almacenamiento, distribución o preparación final. Esto puede ocurrir porque las personas
infectadas con HNoV, el agua contaminada o los fómites entran en contacto con los alimentos (Xiao, Ta
De hecho, estudios experimentales han demostrado que aproximadamente el 1 % del
€
HNoV se puede transferir al pepino a partir de guantes de látex contaminados (Ronnqvist
et al., 2014). Por lo tanto, se continúan investigando estrategias mejoradas de saneamiento
y descontaminación.
5.4.1 Cloro y dióxido de cloro El uso de
desinfectantes a base de cloro está muy extendido en toda la industria de productos
frescos, con la intención de mantener la seguridad microbiana de los productos, evitar la
contaminación cruzada y reciclar el agua. Se supone que el mecanismo de acción del
cloro y los compuestos liberadores de cloro contra los virus es a través de la destrucción
de la cápside por oxidación que da como resultado la exposición del ARN a la degradación
por el medio ambiente.
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ARTÍCULO EN PRENSA
Walter Randazzo et al.
(Fraisse et al., 2011; Lim, Kim y Ko, 2010; Tian, Yang, Quigley, Chou y Jiang,
2013). Muchos estudios han informado sobre la capacidad del cloro y los
desinfectantes a base de cloro para inactivar el HNoV y sus sustitutos (Doultree,
Druce, Birch, Bowden y Marshall, 1999; D'Souza y Su, 2010; Fraisse et al.,
2011; Hirneisen & Kniel, 2013a; Lim et al., 2010; Tian et al., 2013) , mientras
que hay menos información disponible sobre su aplicación en los productos agrícolas.
Por ejemplo, se demostró que la infectividad de FCV­F9 se redujo en 2,9 log
después de lavar las verduras de hoja con 200 ppm de cloro durante 2 minutos
(Allwood, Malik, Hedberg y Goyal, 2004). Butot et al. (2008) exploraron la eficacia
del lavado de diferentes tipos de bayas y verduras de hojas verdes con 200 ppm
de cloro libre y demostraron que la infectividad de FCV­F9 se redujo a niveles
indetectables. Además, la inactivación de HNoV varió según el tipo de alimento
y el genotipo de HNoV, con una reducción máxima de más de 3 log para el IG
de HNoV en arándanos, fresas y albahaca (Butot et al., 2008).
Se informó que el lavado con hipoclorito de sodio a 200 mg/L durante 15 s
redujo la infectividad de FCV­F9 en lechuga y chiles jalapeños en menos de 1,4
log UFP/mL y a niveles indetectables, respectivamente (Su & D'Souza, 2011) .
La combinación de surfactantes (dodecilsulfato de sodio) y polisorbatos (Tween
20 a 50 ppm) junto con los lavados tradicionales con cloro (200 ppm), redujo la
infectividad del MNV­1 en 3log PFU/mL después de 1 h en productos frescos
(Predmore & Li , 2011). Las copias del genoma de HNoV GI se redujeron en 2,0
log en hojas enteras y lechuga romana picada después de lavados con cloro a
1,5 y 0,9 mgmin/L, respectivamente, mientras que se necesitaron concentraciones
más altas para la inactivación de HNoV GII (Dunkin, Weng, Jacangelo y Schwab,
2017). Se demostró que el cloro libre a 33 y 189 ppm durante 1 min utilizando
un ensayo PGM MB reduce la unión de HNoV en 1,4 y 4,1 log, respectivamente
(Kingsley, Vincent, Meade, Watson y Fan, 2014).
El dióxido de cloro se ha convertido en una alternativa al cloro, ya que su
eficacia se ve poco afectada por la materia orgánica y el pH, y a 10 ppm durante
10 minutos podría inactivar FCV­F9 en menos de 1,5 log en frambuesas y perejil,
y reducir las copias del genoma HNoV GI y GII por menos de 1 log (Butot et al.,
2008).
5.4.2 Aerosoles electrostáticos/agua electrolizada
El mecanismo exacto de acción antiviral del agua electrolizada (EOW) aún no
está claro (Tian, Yang y Mandrell, 2011). Se demostró que el lavado ácido EOW
aumenta la unión de HNoV a las frambuesas y la lechuga, provocando una
eliminación de solo el 7,5 % y el 4 %, respectivamente (Kingsley & Chen, 2008).
Un estudio reciente mostró que EOW neutral a 250 ppm de cloro disponible libre causó
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Norovirus: la carga de lo desconocido
21
una reducción logarítmica de 4,8 y 0,4 en el número de copias del genoma de HNoV
después de 1 minuto en suspensión y en acero inoxidable, respectivamente (Moorman,
Montazeri y Jaykus, 2017).
5.4.3 Ozono El
ozono se ha utilizado como un fuerte desinfectante contra microorganismos en el medio
ambiente y en superficies que pueden destruir la proteína de la cápside y el genoma viral
(Kim, Yousef y Dave, 1999). Hasta el momento, tres estudios han informado el efecto del
ozono gaseoso en sustitutos de HNoV en matrices alimentarias (es decir, lechuga,
frambuesas, fresas y cebollas verdes) ( Hirneisen, Markland y Kniel, 2011; Predmore,
Sanglay, Li y Lee, 2015). Rociar las plantas de cebolla verde con ozono a 6,25 ppm durante
10 min redujo los títulos de MNV­1 en 2,0 log UFP/planta (Hirneisen et al., 2011). Además,
6,25 ppm de ozono durante 4 min redujeron la infectividad de FCV­F9 en más de 6 log
TCID50/mL en agua y en 2 log TCID50/mL en lechuga y cebollas verdes (Hirneisen & Kniel,
2013b). También se obtuvo una inactivación comparable para MNV y TV en lechuga y
fresas (Predmore, Sanglay, Li y Lee, 2015). Muy recientemente, se demostró que 3 ppm
de ozono gaseoso durante 1 minuto reduce la infectividad de MNV­1 en más de 3,3 log en
frambuesa fresca (Brie et al., 2018).
5.4.4 Ácidos/álcalis
Los desinfectantes ácidos (como el ácido gálico y el ácido peroxiacético, PAA), así como
los alcalinos, se han evaluado contra los HNoV o sus sustitutos cultivables (Cliver, 2009).
Sin embargo, PAA a 195 ppm redujo la unión de HNoV en menos de 1 log (Kingsley et al.,
2014) y a 250 mg/L redujo la infectividad de MNV­1 en 1 log en lechuga triturada, incluso
en presencia de materia orgánica (Baert et al. ., 2009). Mientras que el lavado de la lechuga
con un biocida basado en PAA (100 ppm) durante 2 min se informó que causaba una
reducción logarítmica de 3,2 y 2,3 de FCV­F9 y MNV­1, respectivamente (Fraisse et al.,
2011) . Se informó que el fosfato trisódico alcalino (TSP, pH 12) al 2 % después de 30 s
reduce el FCV­F9 a niveles no detectables (Su et al., 2010), y cuando se aplica al 2 % y al
5 % durante 30 s en lechuga y pimientos redujo los títulos de MNV­1 en 3 log UFP/mL y
hasta niveles indetectables, respectivamente (Su & D'Souza, 2011). Sin embargo, se deben
considerar las desventajas potenciales de TSP para el medio ambiente.
5.4.5 Compuestos naturales La
industria alimentaria se ve impulsada a buscar estrategias alternativas naturales para
controlar los patógenos debido a la creciente demanda de los consumidores de productos
etiquetados como "naturales" y "limpios". En esta medida, numerosos de origen vegetal y animal
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22
Walter Randazzo et al.
los compuestos naturales se han probado contra sustitutos de HNoV (revisado por
D'Souza, 2014; Li, Baert y Uyttendaele, 2013; Ryu et al., 2015; Seo y Choi, 2017),
con solo unos pocos informes que han utilizado cepas de HNoV, es decir, extracto
de semilla de uva (GSE), extracto de té verde (GTE) (Falco´ et al., 2018; Randazzo,
Falco´, Aznar, & Sa´nchez, 2017), y ()­galato de epigalocatequina (Falco´ et al. .,
2017; Li et al., 2012) como se informó anteriormente (Sánchez et al., 2018) y se
resume en la Tabla 3. Li, Baert y Uyttendaele (2013) y Li, Baert, et al. (2012)
combinaron una RT­qPCR de unión a células con un ELISA de unión a saliva y
demostraron el efecto antiviral de GSE en HNoV GII.4. Además, estudios recientes
indicaron que las algas marinas son nuevas fuentes de compuestos bioactivos que
mostraron actividad antiviral in vitro contra los sustitutos de HNoV (Choi et al., 2014;
Eom et al., 2015). Al igual que con cualquier método de inactivación, las matrices
alimentarias que incluyen proteínas y grasas disminuyeron la eficacia de los bioactivos
y antimicrobianos al proteger o recubrir las partículas virales (Li, Baert, et al., 2012).
El carvacrol y el jugo de frambuesa (Gilling, Kitajima, Torrey y Bright, 2014; Oh et al.,
2012) mostraron actividad antiviral contra los sustitutos de HNoV.
Los compuestos naturales que actúan como fotosensibilizadores incluyen la
curcumina, un compuesto polifenólico extraído de los rizomas de la cúrcuma
(Curcuma longa L.) que ha demostrado reducir la infectividad de FCV­F9 y MNV­1
en soluciones que usan inactivación fotodinámica (Randazzo, Aznar, & Sa´ nchez,
2016) y en ostras (Wu et al., 2015; y como se informó en Sanchez et al., 2018). Los
pocos informes sobre su uso en aplicaciones alimentarias, como se mencionó
anteriormente, se resumen en la Tabla 3. Por ejemplo, se informó que GSE es
efectivo para disminuir los títulos de FCV­F9, MNV­1 y HAV en lechuga, chiles
jalapeños, jugo de manzana y la leche (Joshi et al., 2015; Su & D'Souza, 2013) , así
como el carvacrol, podrían reducir los niveles de MNV­1 y FCV­9 en la lechuga y el agua de lavado de
(Sánchez, Aznar, & Sánchez, 2015). GTE también se ha aplicado con éxito para
reducir los títulos de MNV­1 en hojas de lechuga y espinaca inoculadas (Randazzo
et al., 2017) y en superficies en contacto con alimentos (Falco´ et al., 2018). Además,
la mayor actividad antiviral de GTE se relacionó con el cambio en la cantidad de
derivados de catequina, en función del pH y el tiempo de almacenamiento (Falco´ et al., 2018).
Las mejoras en las eficiencias de encapsulación y/o liberación de bioactivos en los
alimentos es una investigación necesaria (Go´mez­Mascaraque, Soler, & Lopez
Rubio, 2016).
5.5 Polímeros antivirales para el envasado de
alimentos Existe un interés creciente en la aplicación de recubrimientos y
películas antimicrobianos en la industria alimentaria, motivado por el creciente consumo
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Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias
Natural
Concentración y
Inactivación
Virus (Inicial
Compuesto
Concentración) Aplicación de Alimentos
Extracto de aloe vera MNV (5
Lavado de repollo
log PFU)
Carvacrol
FCV
Agua de lavado de lechuga
Condiciónes de la prueba
(Reducción logarítmica) Referencia
1mg/mL a 25°C por
60min
0.8
Ng et al. (2017)
0,5 % a 37 °C durante
3.1
Sanchez, Aznar, and Sanchez (2015)
EN
ARTÍCULO
PRENSA
2h
(6 registro TCID50)
4.5
MNV (6
log TCID50)
FCV
Lavar la lechuga
(4 registro TCID50)
1% a temperatura ambiente
no detectable
durante 30 min
niveles
1.8
MNV
(4 registro TCID50)
Cinnamaldehído MNV (5 log
Películas antimicrobianas
2,60 mg/cm2 a 37
TCID50)
% de HR
FCV
Fabra et al. (2016)
no detectable
niveles
(6 registro TCID50)
Curcumina MNV (4 log PFU)
2.7
°C, ENCENDIDO, 100
ostras
20μM
Fotoactivación
1.15
Wu et al. (2015)
0.4
Ng et al. (2017)
3,6 J/cm2,
0,06 W/cm2 durante
60 s
Extracto de
hoja de Eriobotrya
MNV
(5 log UFP)
Lavado de repollo
1mg/mL a 25°C por
60min
Continuado
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Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias (continuación)
Natural
Concentración y
Inactivación
Virus (Inicial
Compuesto
Concentración) Aplicación de Alimentos
Condiciónes de la prueba
(Reducción logarítmica) Referencia
Semilla de uva
extracto
HNoV GII.4
2mg/mL a 37°C por
60min
1.2
0,1% leche
(7 log copias
Le, Baert, et al. (2012)
genómicas)
1.0
MNV (5
EN
ARTÍCULO
PRENSA
log UFP)
HNoV GII.4 (7
1.2
extracto de lechuga
log copias
genómicas)
MNV
no detectable
(5 log UFP)
niveles
FCV
Lavar la lechuga
(7 log UFP)
0,25 y 1 mg/ml a TA
durante 1 min
2,71;
niveles no
detectables
MNV
(5 log UFP)
FCV
(7 log UFP)
lavado de pimientos
1 mg/ml a TA
durante 5 min
1.09
0,25 y 1 mg/ml a TA
durante 1 min
3,0;
no detectable
niveles
MNV
(5 log UFP)
1 mg/ml a TA
durante 5 min
1.2
Su y D'Souza (2013)
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FCV
jugo de manzana
(4 log UFP)
1mg/mL a
37°C
5min Niveles no detectables
Joshi, Su y D'Souza (2015)
15min Niveles no detectables
MNV (5
log UFP)
FCV
2% de leche
4mg/mL a 37°C por
24 h
1.1
Películas de quitosano
5; 10; 15% a 23
°C durante 24 h
1,9; 3.2; 4.0 Amankwaah (2013)
Películas comestibles de alginato
0,50 g extracto/g
1.0
EN
ARTÍCULO
PRENSA
(5 log UFP)
MNV (6
log UFP)
MNV
alginato a 37°C, ON
(6 registro TCID50)
0,75 g extracto/g
Fabra, Falco´, Randazzo,
Sánchez, y López (2018)
1.7
alginato a 37°C, ON
Extracto de té verde MNV
(6 log UFP)
lavar fresas
10 mg/mLa a TA
durante 10 min
1.08
Lavar la lechuga
1.34
Lavar cebollas verdes
0.58
MNV
Desinfección de inoxidable
(6 registro TCID50)
superficies de acero y vidrio
10 mg/ml a TA durante
30 min
1,79–3,46
VHA
Niveles no
(6 registro TCID50)
detectables
Martí, Ferrary­Américo, y
Barard (2017)
Randazzo et al. (2017)
Continuado
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Tabla 3 Efecto de los compuestos naturales contra sustitutos de norovirus y HNoV en aplicaciones alimentarias (continuación)
Natural
Concentración y
Inactivación
Virus (Inicial
Compuesto
Concentración) Aplicación de Alimentos
Condiciónes de la prueba
(Reducción logarítmica) Referencia
1,75–1,27
MNV
Desinfección de superficies
5 mg/ml (24 h de
(6 registro TCID50)
de acero inoxidable y vidrio
almacenamiento y
pH 7,2) a TA
durante 15 min
VHA
Falco´ et al. (2018)
1,92–1,54
(5 registro TCID50)
EN
ARTÍCULO
PRENSA
MNV
Películas de quitosano
(6 log UFP)
MNV
Películas comestibles de alginato
(6 registro TCID50)
5; 10; 15% a 23
°C durante 24 h
1,6; 4,5; 4.2
Amankwaah (2013)
0,50 g extracto/g
2.0
Fabra et al. (2018)
alginato para 37°C, ON
0,75 g extracto/g
1.9
alginato para 37°C, ON
aPolyphenon 60, compuestos de GTE, con un mínimo del 60% de catequinas.
TA: temperatura ambiente; ENCENDIDO: durante la noche; HR: humedad relativa; UFP: unidades formadoras de placa; TCID50: dosis infecciosa en cultivo tisular.
Modificado de Sa´nchez, G., Randazzo, W., & D'Souza, DH (2018). Capítulo 10: Norovirus humanos. En D. Liu (Ed.), Manual de enfermedades transmitidas por los alimentos. Taylor y
Francisco.
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Norovirus: la carga de lo desconocido
27
demanda de alimentos seguros y estables. Se ha llevado a cabo una amplia investigación para
incluir en la película o recubrimiento antimicrobianos como aceites esenciales y compuestos
fenólicos. Sin embargo, aunque sus propiedades bactericidas y fungicidas han sido ampliamente
investigadas, existe poca información disponible en la literatura sobre cómo los biopolímeros
podrían actuar como portadores de compuestos antivirales.
Como metales, se ha informado que las nanopartículas de plata (así como el cobre)
muestran propiedades antivirales en películas a base de polihidroxialcanoatos (Castro Mayorga,
Fabra Rovira, Cabedo Mas, Sa´nchez Moragas, & Lagaro´n Cabello, 2018; Castro­Mayorga et
al. ., 2017; Warnes, Summersgill, & Keevil, 2015) y coloides híbridos magnéticos (Park et al.,
2014). El único informe actual sobre aplicaciones alimentarias es que el uso de iones de plata
al 1,0 % incorporados en películas de polilactida redujo el FCV­F9 a niveles no detectables en
lechuga a 4 °C, sin ningún efecto antiviral significativo en paprika (Martı´nez­Abad, Ocio, Lagaro
´n, & Sánchez, 2013). Una de las estrategias más prometedoras es la inclusión de compuestos
antivirales naturales dentro de los materiales de empaque o películas de recubrimiento. Como
se resume en la Tabla 3, el cinamaldehído, el GTE y el GSE mostraron interesantes propiedades
antivirales cuando se incluyeron en películas desarrolladas para el envasado de alimentos.
6. CONCLUSIONES Y PERSPECTIVAS DE FUTURO
La contaminación de alimentos por HNoV es un problema económico y de salud grave
y creciente. Actualmente, sin tener un método de enrutamiento sólido de cultivo celular para
evaluar la infectividad de HNoV en los alimentos, los procedimientos de RT­qPCR siguen
siendo el estándar de oro para la detección y cuantificación de HNoV, incluso si estos
procedimientos no pueden discriminar entre virus inactivados e infecciosos. Para superar esta
limitación, se han evaluado diferentes estrategias para predecir la infectividad utilizando ensayos
PGM basados en RT­PCR y el uso de tintes intercalantes en RT­PCR, que parecen ser
herramientas prometedoras, especialmente para la discriminación de HNoV potencialmente
infecciosos y no infecciosos en alimentos (Sánchez et al., 2018). Además, la adopción de estos
procedimientos en el seguimiento rutinario permitirá una cuantificación más precisa del HNoV
potencialmente infeccioso en los alimentos, lo que constituirá una herramienta útil para futuros
estudios de evaluación de riesgos. Como se sugirió recientemente, la aplicación de
secuenciación de próxima generación también es una tecnología prometedora tanto para la
detección como para la identificación de secuencias de HNoV (Yang et al., 2017). Además,
después de la identificación de la contaminación o como medida preventiva, es necesario
aplicar medidas de descontaminación, saneamiento y control que sean eficaces contra los
HNoV.
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28
Walter Randazzo et al.
Los estudios futuros deben buscar nuevos bioactivos y, especialmente, la eficacia de los
compuestos naturales en los alimentos como aditivos antivirales y también en la aplicación
relacionada con los alimentos como agentes desinfectantes que simulan escenarios
prácticos en términos de diseño experimental. Con este mayor conocimiento de los HNoV,
se puede mejorar la salud pública y la seguridad alimentaria.
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