GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA CÓRDOBA – ARGENTINA 2022 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - i PLANIFICACIÓN DOCENTE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA PARA INGENIERÍA AGRONÓMICA AÑO 2022 1. Ubicación del espacio curricular en el Plan de Estudios: Ciclo: Conocimientos Básicos Profesionales. Año y cuatrimestre: 2º año, 2º cuatrimestre. 2. Características del espacio curricular: Carácter: Asignatura Condición: Obligatoria Carga Horaria Total: 65 hs. Carga Horaria Semanal: 5 hs. Créditos: 6.5 3. Asignaturas Correlativas: Para cursar: Regularizado: Química Biológica. Acreditado: Química Orgánica. Para acreditar: Acreditado: Química Orgánica y Química Biológica. Página Web: http://www.agro.unc.edu.ar/~wpweb/microbiologia/inicio/ 4. Equipo docente Coordinador: Ing. Agr. Dr. Enrique Iván Lucini Nombre y Apellido Categoría docente y dedicación Función Docente Ing. Agr. Dr. Enrique Iván Lucini Prof. Titular (DE) Dictado de Teóricos y Actividades Prácticas. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - ii Dra. Carolina Merlo Prof. Asociado (DS) Dictado de Teóricos y Actividades Prácticas. Dra. Carolina Vázquez Prof. Adjunto (DE) Dictado de Teóricos y Actividades Prácticas. Dra. Marina Bruno Prof. Adjunto (DSE) Dictado de Actividades Prácticas. Ing. Agr. Lucas Esteban Dubini Prof. Asistente (DS) Dictado de Actividades Prácticas. Dra. María Paula Martín Prof. Asistente (DE) Dictado de Actividades Prácticas. Dra. Romina Pizzolitto Prof. Ayudante “A” (DS) Dictado de Actividades Prácticas. Ing. Agr. (MSc) Ezequiel D. Bigatton Prof. Ayudante “A” (DS) Dictado de Actividades Prácticas. Biol. Mariela Archilla Prof. Ayudante “A” (DE) Dictado de Actividades Prácticas. Ing. Agr. Ibrahim Ayoub Prof. Ayudante “A” (DS) Dictado de Actividades Prácticas. María Ángeles Gentili Ayudante Alumno “B” Colaboración en Actividades Prácticas Bautista Lacioni Ayudante Alumno “B” Colaboración en Actividades Prácticas Erika Rivarolo Ayudante Alumno “B” Colaboración en Actividades Prácticas Funciones en las que participan todos los docentes de la Cátedra de Microbiología Agrícola: - Dictado de clases - Atención de horarios de consulta - Elaboración y corrección de la Guía de Actividades Prácticas - Elaboración y corrección del Complemento Teórico - Elaboración y corrección de las evaluaciones Recuperatorios y de Integración y Transferencia. - Formación de recursos humanos, estando a cargo de los Ayudantes Alumnos. de Suficiencia, Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - iii 5. Fundamentación del espacio curricular: Se asume que la Ingeniería Agronómica es la consciente aplicación de la ciencia a los problemas económicos de la producción agraria. Se entiende que el ingeniero profesional es competente en virtud de haber recibido adecuada educación fundamental y adiestramiento para manejar métodos científicos y de tener habilidad para el análisis y solución de los problemas de la ingeniería. Por ello debe recibir una educación que le permita progresar en forma sostenida en su especialidad, asimilando la información y aplicándola con criterio independiente. El ingeniero agrónomo debe responder no sólo a los requerimientos productivos, sino también velar por el mantenimiento de esa productividad, en lo que se conoce como "manejo sustentable" de los recursos. Debe tomar conciencia que la producción no es un proceso aislado de los ecosistemas naturales, por lo que responde a las leyes que regulan dichos sistemas. El desentendimiento de tal situación provoca graves desequilibrios, que solamente son visualizados cuando disminuye la productividad. En la actualidad el ingeniero agrónomo se enfrenta con problemas de agotamiento, pérdida y contaminación de los recursos ambientales, a causa del inadecuado uso de agroquímicos, los monocultivos, las talas, quemas, sobrepastoreos, inadecuados sistemas de labranza, etc. Al mismo tiempo tiene a su alcance nuevas tecnologías de manejo racional que incluyen, desmontes selectivos, labranzas conservacionistas, coberturas vegetales y de rastrojos, manejo integrado de plagas, fertilización biológica, etc. Por lo tanto, en su formación se deben aportar elementos conceptuales claros que brinden fundamentos para la práctica profesional. De esta manera surge como necesidad el conocimiento de procesos biológicos en los cuales están involucrados microorganismos. La Microbiología Agrícola brinda los criterios básicos para el entendimiento de los principales procesos biológicos que desarrollan los microorganismos del suelo y otros procesos microbianos de interés agropecuario (metabolismo ruminal, fermentaciones agroindustriales, calidad microbiana de alimentos, etc.), con un criterio biológico sólido y actualizado. En la actualidad, la Microbiología Agrícola cobra especial relevancia teniendo en cuenta que se persigue una productividad agrícola sustentable, la preservación del medio ambiente y la producción de alimentos sanos. 6. Objetivos del espacio curricular Generales • Comprender el rol de los microorganismos en los diferentes procesos relacionados con la producción agropecuaria y agroindustrial, con la finalidad de facilitar la identificación y resolución de problemas en forma crítica y responsable en el ámbito regional y nacional. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - iv Específicos • Comprender la importancia de los microorganismos en los diferentes sistemas productivos. • Analizar críticamente los efectos de los diferentes sistemas productivos sobre la actividad biológica del suelo. • Adquirir conocimientos sobre el manejo de microorganismos de interés agronómico y agroindustrial. • Formar criterios de fundamentación para el manejo de agroecosistemas. • Utilizar correctamente equipos y material de laboratorio. • Desarrollar capacidad para la realización e interpretaión de productos e insumos agropecuarios. • Incorporar vocabulario técnico especifico. • Desarrollar capacidad de síntesis integrando los nuevos conceptos al contenido cognitivo previo. • Fomentar el intercambio de opiniones entre los estudiantes. • Generar espíritu de colaboración a partir de trabajos grupales. 7. Programa Analítico UNIDAD I: Grupos microbianos: características generales, célula procariótica y eucariótica. Estructuras de las células procariotas. Técnicas de laboratorio para el estudio de microorganismos de suelo: esterilización, cultivo, aislamiento y observación microscópica. UNIDAD II: Metabolismo de los microorganismos del aire, agua, suelo, rumen y alimentos. Metabolismo quimio-órgano-heterótrofo: respiración aeróbica y anaeróbica, fermentación y oxidaciones incompletas. Metabolismos quimio-litoautótrofo y foto-lito-autótrofo. UNIDAD III: Taxonomía microbiana convencional y molecular. Crecimiento bacteriano. Determinación de abundancia y biomasa microbiana. Curva de crecimiento. Productos microbiológicos de carácter industrial. Factores que afectan el crecimiento microbiano. UNIDAD IV: Ecología microbiana. Ecosistemas microbianos. Biofilmes microbianos. Sistemas “quorum sensing”. Hábitats microbianos. Distribución de los microorganismos en el suelo. Interacciones biológicas entre microorganismos, microorganismos-planta, microorganismo-animal. UNIDAD V: Degradación de compuestos orgánicos en el suelo. Tipo de materia orgánica. Sucesiones microbianas de la descomposición. Balance humificación Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - v y deshumificación. Tasa de descomposición (k). Técnicas para el análisis de la actividad microbiana. UNIDAD VI: Disponibilidad de nutrientes para las plantas. Degradación de restos orgánicos nitrogenados: amonificación y nitrificación. Pérdidas de nitrógeno del suelo: lixiviación, volatilización y desnitrificación. Disponibilidad de fósforo: mineralización y solubilización (micorrizas). Disponibilidad de azufre: sulfidrilación y sulfooxidación. Desulfatación. UNIDAD VII: Microorganismos Fijadores de Nitrógeno. Ciclo del nitrógeno. Fijación Biológica del nitrógeno: proceso bioquímico, enzima nitrogenasa (NASA) y su mecanismo de acción. Grupos de microorganismos fijadores de nitrógeno y sus mecanismos adaptativos para el funcionamiento de la NASA. Simbiosis rizobio-leguminosa: mecanismo de formación del nódulo, formación del bacteroide. Producción y control de inoculantes. Normas de calidad. Técnicas de aislamiento e identificación de microorganismos diazótrofos. UNIDAD VIII: Microorganismos Promotores del Crecimiento (MPC). Clasificación. Mecanismos de acción de los MPC, efectos directos e indirectos. Los MPC como biofertilizantes: mecanismos de acción. Micorrizas: concepto, clasificación, metabolismo y mecanismo de acción. Bacterias rizosféricas: ejemplos y mecanismos de acción. Los MPC como biocontroladores: Trichoderma y bacterias rizosféricas, mecanismos de acción. UNIDAD IX: Microbiología del agua: Ciclo Hidrológico. Microorganismos en los ecosistemas acuáticos. Contaminación de los ecosistemas acuáticos. Carga microbiana de las aguas según su origen. Sanidad y calidad del agua. Bacterias indicadoras de contaminación. Definición de agua potable según CAA (Código Alimentario Argentino). Calidad de agua de riego. Tratamiento de efluentes de origen pecuario. Métodos de análisis microbiológico de calidad de agua. UNIDAD X: Microbiología de los alimentos. Las fermentaciones en la elaboración de alimentos: Fermentación láctica: bacterias ácido-lácticas, producción de yogurt (microorganismos que participan y mecanismo de acción), producción de quesos blandos, semiduros y duros, etapas del proceso de producción. Fermentación alcohólica: microorganismos responsables, proceso de vinificación. UNIDAD XI: Microbiología de la conservación de alimentos. Las fermentaciones en la conservación de alimentos: Conservación de forrajes: Henificación, Henolaje y Ensilaje. UNIDAD XII: Degradación residuos sólidos orgánicos: compostaje, vermicompostaje y producción de biogás. Tratamiento de efluentes líquidos. Biorremediación y Fitorremediación. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - vi Programa de Actividad Prácticas TTPP 1: Técnicas de muestreo de suelo y rastrojo (Campo experimental de la FCA-UNC). TTPP 2: Técnicas de esterilización y cultivo de microorganismos. TTPP 3: Técnicas para la observación, aislamiento y conservación de microorganismos. TTPP 4: Análisis de fertilidad microbiana del suelo. TTPP 5: Actividad heterótrofa total. TTPP 6: Fertilizantes biológicos: desarrollo y control de calidad de inoculantes. TTPP 7: Microorganismos promotores del crecimiento vegetal. Biofertilizantes y Biocontroladores. TTPP 8: Trabajo Práctico de campo (Campo Experimental de la FCA-UNC). TTPP 9: Control de calidad de alimentos y agua. 8. Metodología de Enseñanza y de Aprendizaje El curso cuenta con clases Teóricas y Trabajos de Laboratorio y de Campo, en las cuales se fomenta la comunicación fluida entre docentes y estudiantes, haciendo propicias las instancias de diálogo y la participación continua del estudiantado. Las clases Teóricas se desarrollan mediante exposición dialogada. En las clases de laboratorio y de campo el docente trabaja en dos etapas: en la primera se exponen los fundamentos de las actividades prácticas a realizar y en la segunda etapa los estudiantes trabajan en forma grupal con la asistencia de una Guía de Trabajos Prácticos impresa y otras publicaciones realizadas en la Cátedra. En ambos tipos de clases, se utilizan técnicas de trabajo en grupos reducidos para que los estudiantes puedan tener mejor acceso al material didáctico disponible y posibilitar el intercambio directo con el docente y los demás compañeros. Para poder realizar adecuadamente todas las actividades de la asignatura se requiere que las comisiones no superen los 20 estudiantes. La asignatura utiliza el recurso de un Aula Virtual (http://www.fca.proed.unc.edu.ar/), donde además de interaccionar con el estudiante, se realizan actividades con frecuencia semanal. Cada semana se sube al aula virtual, el power point del teórico, el power point de la actividad práctica correspondiente y un cuestionario de preguntas teóricas de desarrollo, como así también cualquier material adicional para uso del Estudiante. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - vii 9. Plan de actividades obligatorias Tabla 1. SEMANA MODALIDAD LUGAR CARGA HORARIA (horas) 1 Clase teórica Aula 2 UNIDAD I Clase teórica Aula 2 UNIDAD I y II Actividad Práctica Campo experimental 3 TTPP 1 Clase teórica Aula 2 UNIDAD II Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 2 Clase teórica Aula 2 UNIDAD III Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 3 Clase teórica Aula 2 UNIDAD IV Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 4 Clase teórica Aula 2 UNIDAD V Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 5 2 3 4 5 6 7 UNIDAD TEMÁTICA PRIMER PARCIAL (26 de septiembre) Clase teórica Aula 2 UNIDAD VI Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 6 Aula 2 UNIDAD VII y VIII Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 7 Clase teórica Aula 2 UNIDAD IX Actividad Práctica Campo experimental 3 TTPP 8 8 Actividad Práctica Clase teórica 9 10 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - viii Clase teórica Aula 2 UNIDAD X Y XI Actividad Práctica Laboratorio 318 y 323 3 TTPP 9 Clase teórica Aula 2 UNIDAD XII 11 12 13 SEGUNDO PARCIAL (7 DE NOVIEMBRE) 14 RECUPERATORIO (14 DE NOVIEMBRE) 15 EVALUACIÓN DE INTEGRACIÓN Y TRANSFERENCIA (24 DE NOVIEMBRE) 10. Evaluación Tipos e instrumentos de evaluación • Evaluación Diagnóstica. Se realiza en la primera semana de actividades áulicas mediante un cuestionario de opciones múltiples a través del aula virtual. Los temas abordados se relacionan con contenidos correspondientes a materias correlativas como Biología Celular y Química Biológica. Instrumentos: cuestionario de opciones múltiples. • Evaluación formativa: Esta evaluación se realiza de forma sistemática y continua durante el cursado de la materia. La misma se implementa a través de preguntas orales que realizan los docentes a sus estudiantes para evaluar el avance del proceso de enseñanza-aprendizaje. Normalmente se realiza durante la actividad y al término de cada unidad. Instrumentos: cuestionarios orales. • Evaluación sumativa: Comprenden cuestionarios escritos que evalúan contenidos teóricos y de actividades, se realiza mediante autoevaluaciones de preguntas de opciones múltiples utilizando para ellos el aula virtual, previo a la realización de la actividad áulica. Instrumentos: cuestionario de opciones múltiples. • Evaluaciones de suficiencia: Comprende 2 parciales escritos. Con posibilidad de recuperar 1 de los parciales. Se aprueban con nota igual o superior a 4 (cuatro). Instrumentos: Exámenes escritos semiestructurados. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - ix • Evaluación de Integración y Transferencia: Solamente para estudiantes que tengan acreditados todas las Asignaturas correlativas y aprobado las evaluaciones de suficiencia. Comprende un examen integrador oral que se aprueba con nota igual o superior a 4 (cuatro). Instrumentos: Examen oral. • Criterios de evaluación a) aspectos cognitivos: nivel de comprensión, capacidad de aplicación de los conocimientos adquiridos y coherencia teóricopráctica. b) aspectos procedimentales: habilidad para la aplicación de procedimientos, habilidad para resolver problemas y capacidad de transferencia hacia la práctica de campo. c) aspectos actitudinales: actitud crítica y responsabilidad como estudiante. 11. Condición de los estudiantes: ▪ Estudiante promocionado: El que habiendo asistido al 80% de las actividades obligatorias, aprueba las evaluaciones de suficiencia y la evaluación de integración y transferencia con una nota igual o superior a 4 (cuatro) o aprueba las evaluaciones de suficiencia con una nota igual o superior a 7 (siete) en aquellos espacios curriculares que así lo consideren. Para acceder a la acreditación por promoción el estudiante deberá haber cumplimentado los requisitos de correlatividad al momento de iniciar el cursado del respectivo espacio curricular. ▪ Estudiante regular: El que habiendo asistido al 80% de las actividades obligatorias, aprueba las evaluaciones de suficiencia con una nota igual o superior a 4 (cuatro). Esta condición se mantendrá por el término de dos años y medio desde la finalización del espacio curricular. ▪ Estudiante libre por nota: El que habiendo asistido al 80% de las actividades obligatorias no obtenga cuatro puntos en las evaluaciones de suficiencia. ▪ Estudiante libre por faltas: El que no asistió al 80% de las actividades obligatorias o a alguna de las evaluaciones de suficiencia. ▪ Estudiante ausente: El que nunca asistió al espacio curricular. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - x 12.. Bibliografía BARTON LL y NORTHUP DE. 2011. Microbial Ecology. Wiley-Blackwell, New Jersey. BROCK T. 2015. 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U.N.C - xii GUIA DE ACTIVIDADES PRÁCTICAS MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA - Año 2022 – INDICE TTPP Nº 1: TÉCNICAS DE MUESTREO DE SUELO Y RASTROJO…...…pág. 1 TTPP Nº 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS………………………………………………………….pág. 9 TTPP Nº 3: TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN, AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS…………………………..….pág. 22 TTPP Nº 4: ANÁLISIS DE FERTILIDAD MICROBIANA DEL SUELO…..….pág.32 TTPP Nº 5: ACTIVIDAD HETERÓTROFA TOTAL………………………….pág. 43 TTPP Nº 6: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES……………………………………………..….pág. 48 TTPP Nº 7: MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECIMIENTO VEGETAL. BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES……………..pág. 63 TTPP Nº 8: EVALUACIÓN DE INOCULACIÓN A CAMPO…………………pág. 82 TTPP Nº 9: CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS Y AGUA……….…pág. 87 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 1 TRABAJO PRÁCTICO N° 1: TÉCNICAS DE MUESTREO DE SUELO Y RASTROJO Objetivos: • Conocer los criterios básicos para realizar un diseño de muestreo de suelo y rastrojo. • Conocer la metodología utilizada para el muestreo de suelo y rastrojo realizado para análisis microbiológicos. • Adquirir las habilidades y/o destrezas para correcto manejo de los materiales e instrumentos de muestreo. • Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin de fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN Los microorganismos del suelo presentan interés agropecuario debido al rol que desempeñan en numerosos procesos edáficos (por ejemplo, la descomposición de rastrojos y la disponibilidad de nutrientes para los cultivos) que condicionan las características de un suelo y su productividad. El análisis de las características químicas y microbiológicas del suelo y/o rastrojos (hojas, tallos, raíces y detritos de cultivos), brinda información que permite diagnosticar, predecir y planificar manejos sustentables, los cuales son luego transferidos al agricultor/productor. Los estudios de suelo y/o rastrojos incluyen como etapa principal el muestreo y procesamiento de las muestras. Muestreo La toma de muestras es fundamental para el análisis de suelo/rastrojo, pues de ella depende que los resultados obtenidos sean representativos de la situación en estudio. Por ello, el muestreo se efectúa de acuerdo con un método normalizado teniendo en cuenta las características del lote que se va a analizar, como las características propias del suelo (estructura y textura del suelo), del paisaje (topografía), y también del manejo del suelo (tipo y fenología del cultivo, sistema de labranza, rotación, etc.). Para poder realizar un muestreo representativo, es necesario detectar ambientes de zonas homogéneas en el lote de estudio. Para esto, se pueden Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 2 usar fotografías aéreas, mapas o cartas de suelo, como así también la tecnología digital. La tecnología digital es una importante herramienta para la planificación del diseño de muestreo. Los mapas satelitales y la agricultura de precisión facilitan la diferenciación de los ambientes en estudio. En el caso de la agricultura de precisión se utilizan los mapas de rendimiento obtenidos mediante GPS instalados en las cosechadoras, cuyos datos son procesados mediante programas específicos generando un mapa donde se visualiza la heterogeneidad del lote a analizar. Mientras más datos intervengan en el proceso para determinar un ambiente mejores predicciones podrán hacerse en base a la muestra extraída. Otras herramientas en la actualidad son los sistemas GIS (Geographic Information Sistem) o SIG (Sistema de Información Geográfica) los cuales podría decir que son un tablero de control que integra información de diferentes fuentes, (maquinarias, equipos GPS, mapas de productividad, mapas de rindes, imágenes satelitales etc.) constituyéndose en una herramienta para resolver problemas de planificación y de gestión, siendo útil para la toma de decisiones. En el caso de estudios microbiológicos se recomienda una profundidad de muestreo de 0-20 cm, debido a que en esa zona se localiza la mayor abundancia y actividad microbiana. Debido a la gran heterogeneidad que presenta el suelo, es necesario extraer submuestras que juntas conformarán nuestra muestra a analizar. Para extraer las submuestras, se recomienda utilizar pala (no barreno) para no disturbar el perfil original del suelo y conservar el material superficial. Tipo y cantidad de muestras La variabilidad de las propiedades del suelo en el espacio y el tiempo presentan un desafío para la evaluación de un sitio y la detección de cambios dentro y entre sitios. La variación espacial incluye la variación horizontal y vertical en el espacio. En sistemas no agrícolas la variabilidad es debida a numerosos factores incluyendo micro relieve, actividad animal, la acción del viento, el ingreso de restos vegetales (hojas, tallos, etc.), cualquier actividad humana, y el efecto de la planta individual sobre el microclima suelo. Por otra parte, la variabilidad en Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 3 sistemas agropecuarios es causada por las enmiendas, las labranzas, las secuencias de cultivos, aportes de heces de animales y la compactación a partir de pastoreo y el equipamiento agrícola. La historia de manejo es un factor clave en muchos sistemas para poder realizar la evaluación de distintos procesos o parámetros. La incapacidad para apreciar y ajustar la variabilidad por sitio puede comprometer el diseño de una cuidadosa investigación y/o recolección de información. Para garantizar la representatividad de toda la heterogeneidad del suelo es fundamental hacer un diseño de muestreo estipulando la forma y el número de muestras a tomar teniendo en cuenta que debe recogerse una muestra por cada porción de terreno con características particulares (replicas). Las replicas a campo monitorean la precisión del procedimiento y la variabilidad total a campo. La muestra puede ser: - Muestra simple: es la que se obtiene mediante una sola extracción. Generalmente, este tipo de muestreos no se llevan a cabo a campo debido a la gran heterogeneidad del suelo. - Muestra compuesta: se refiere a la muestra de suelo y/o rastrojo obtenida por la extracción de varias muestras simples o submuestras, reunidas en un recipiente o bien mezcladas (homogeneizadas) de aproximadamente 0,5 a 1 Kg de suelo. Se recomienda la extracción de 15-20 submuestras por sitio de muestreo. El peso de cada submuestra debe ser de aproximadamente 200 gramos de suelo o por lo menos de igual volumen que las demás submuestras. En el caso de rastrojo se colecta una superficie de 0,16 m2 (cuadrado de 40 x 40 cm). La utilización de muestras compuestas para el análisis es un efectivo método para obtener una adecuada estimación de la media de un parámetro reduciendo los costos y tiempo de análisis. Las muestras compuestas: a) deben ser homogéneas; b) cada submuestra debe contribuir de igual manera (mismo volumen) a la muestra compuesta; c) cada submuestra debe ser tomada siguiendo el mismo procedimiento en cuento a instrumento utilizado, profundidad, etc.; y d) las submuestras deben ser independientes y no presentar interacción. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 4 Frecuencia y época de muestreo Además de la variabilidad espacial, los suelos presentan variabilidad temporal (días, meses y años) que pueden ser substanciales para muchas propiedades. Los cambios temporales pueden reflejar variaciones estacionales y/o anuales del clima y microclima como así también los regímenes de manejo (por ejemplo: arado, abonos, fertilización, tala, etc.) y alteraciones en la cantidad y calidad química de los aportes de compuestos orgánicos (rastrojos). Muchos procesos biológicos del suelo (por ejemplo: respiración microbiana y mineralización de nitrógeno) son fuertemente controlados por la temperatura y la humedad y a menudo presentan patrones estacionales específicos para un sitio o ecosistema en particular. El tiempo y frecuencia de muestreo serán establecidos según los objetivos del estudio y las condiciones del sitio a analizar. Diseño de muestreo El diseño debe estipular la forma y el número de muestras a tomar teniendo en cuenta que debe recogerse una muestra por cada porción de terreno con características particulares (ambiente homogéneo). Las muestras deben ser tomadas al azar, recorriendo la parcela o el lote en cuadrículas, zigzag o diagonales (Fig. 1) o sobre el trazado de una transecta lineal. La transecta es una línea recta imaginaria con puntos de muestreo localizados a intervalos regulares. Figura 1: Tipos de diseños de muestreo sistemáticos. Instrumentos de muestreo Un instrumento de muestreo requiere dos condiciones importantes: a) que tome una capa uniforme desde la superficie hasta la profundidad determinada y b) que Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 5 se pueda obtener el mismo volumen de suelo en cada extracción. Entre los instrumentos de muestreo de suelo se encuentran: el barreno (existen diferentes tipos) y la pala. Para extraer las submuestras para realizar un análisis microbiológico se recomienda el uso de pala para no disturbar el perfil original del suelo y conservar el material superficial. No se deben tomar muestras de suelo a la orilla de los caminos, bebederos, dormideros, antiguas construcciones y sectores de carga de fertilizantes o agroquímicos. Las muestras de suelo sin disturbar se deberán tomar en ecosistemas naturales (monte/bosque) o debajo de los alambrados en ecosistemas agrícolas. Estos sitios sin disturbar sirven como puntos de comparación con los suelos en estudio. Otros elementos auxiliares que hacen a un mejor muestreo es el uso de GPS y los sistemas informáticos (ej: SIG) Acondicionamiento de las muestras En el campo las muestras deben ser colocadas en bolsas de polietileno debidamente rotuladas y acondicionadas en una conservadora hasta su llegada al laboratorio. De esta manera, se evita que sufran exceso de calor e insolación y que se alteren sus condiciones originales. El rótulo de cada muestra estará identificado (letras o números) y correlacionado con la información de la parcela o lote obtenida (cultivos, insumos, labores culturales, ubicación geográfica, topografía, rotación, y catastral), y del responsable de la muestra (nombre, dirección, localidad, teléfono, lote y establecimiento). Preparación de las muestras en el laboratorio Las técnicas seleccionadas y el tiempo requerido para la preparación de las muestras en el laboratorio deben ser cuidadosamente consideradas para minimizar los cambios producidos en las propiedades de interés y para evitar comprometer futuros análisis. El protocolo de procedimiento debe ser el mismo para todas las muestras. Antes de proceder al análisis, las muestras de suelo y/o rastrojos deben ser secadas al aire (oreadas) para detener los procesos biológicos. El procedimiento del oreado consiste en esparcir el suelo/rastrojo (formar una fina capa) sobre una bandeja de papel o plástico en una habitación libre de contaminantes y dejar secar el suelo a temperatura y humedad ambiente durante Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 6 un mínimo de 24 horas. Los suelos oreados tienen relativamente peso constante y mínima actividad biológica. Convencionalmente, las muestras de suelo para análisis químicos, físicos y microbiológicos se tamizan por una malla de 2 mm para separar el rastrojo del suelo y romper los agregados, donde se realizan la casi totalidad de los procesos biológicos del suelo. En el caso del rastrojo, las muestras son molidas con molinillo eléctrico para homogeneizar los restos orgánicos provenientes de las diferentes estructuras (hojas, tallos, frutos, etc). Almacenamiento y/o conservación Dependiendo del tipo de análisis que se realicen sobre las muestras de suelo y/o rastrojo será el método de almacenamiento o conservación que se utilice: 1- Refrigeración (4-5ºC): utilizado para almacenar por mínimos períodos de tiempo (no más de un mes) muestras oreadas y tamizadas de suelo y/o molidas de rastrojo, para la evaluación de parámetros biológicos. El almacenamiento de muestras húmedas por largos períodos de tiempo no es recomendado porque posiblemente ocurran muchos cambios en la comunidad de microorganismos y el potencial desarrollo de condiciones anaeróbicas. 2- Congelación (-20 a - 80 ºC): puede ser adecuado para el almacenamiento por largos períodos de tiempo dado que la actividad microbiana es efectivamente minimizada. Generalmente, es utilizado para análisis biomoleculares o para determinar la diversidad genética de las comunidades microbianas. 3- Temperatura ambiente (25ºC): utilizado para el almacenamiento por largos períodos de tiempos (años) de las muestras oreadas y tamizadas de suelo y/o molidas de rastrojo, para la evaluación de parámetros químicos y/o físicos. Recomendaciones para almacenamiento de muestras: 1. Las muestras almacenadas a temperatura ambiente deben estar en un ambiente seguro, con baja probabilidad de daños por humedad, contaminación química, etc. Las fluctuaciones de temperaturas en el almacenamiento deben ser mínimas para evitar la potencial condensación en el interior de los recipientes. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 7 2. Los recipientes deben tener tapa segura y ser de materiales que perduren en el tiempo (plástico o vidrio) con bajo potencial de contaminación de la muestra y alteración de las propiedades químicas del material. 3. Las etiquetas siempre deben estar sobre el recipiente y no sobre la tapa y contener la identificación de la muestra indicando su número y el tamaño de tamiz o molienda utilizado, por ejemplo 2 mm. TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Realizar muestreo de suelo y rastrojo en lotes del campo escuela - Tomar con pala una muestra compuesta de suelo (10 submuestras) por lote. - Con un aro de ¼ de metro cuadrado tomar una muestra compuesta de rastrojo por lote (4 submuestras). - Las muestras deben ser colocadas en bolsas de polietileno debidamente rotuladas y llevadas al laboratorio. 2. Realizar conteo de plantas de garbanzos - Determinar una transecta con 10 estaciones, siendo cada una de ellas de “1 metro lineal” y tomar el conteo del número de plantas de garbanzo emergidas por tratamiento. Cada grupo trabajará con dos de los seis tratamientos. - Con los datos del conteo realizado calcular un promedio de plantas emergidas por tratamiento y a partir de ello calcular la densidad de plantas en el lote: Promedio del conteo = X Distancia entre línea de siembra 0,52 cm Metros lineales por Ha = 100 m/0,52m x 100 m N° de plantas por Ha = X x 19230 m Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 8 3. Preparación de las muestras de suelo en laboratorio - Tamizar el suelo previamente oreado en tamiz de malla de 2 mm. - Embolsar, rotular y colocar en heladera. 4. Muestras de rastrojo - En una balanza pesar la muestra de rastrojo y a partir del dato obtenido, calcular el valor de biomasa de rastrojo por hectárea (kg / ha). Si la superficie del aro es de 0,25 m2 y las muestra está compuesta por 4 submuestras, la superficie a la que corresponde el pesaje obtenido corresponde a 0,25 m2 x 4 = 1 m2. Con regla de tres simple, calcular la biomasa de rastrojo por hectárea. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 9 TRABAJO PRÁCTICO N° 2: TÉCNICAS DE ESTERILIZACIÓN Y CULTIVO DE MICROORGANISMOS Objetivos: ● Conocer las metodologías actuales de control y eliminación de microorganismos. ● Obtener dominio de los métodos básicos de esterilización y desinfección. ● Conocer los medios de cultivo más utilizados en el laboratorio y las diferentes metodologías para el cultivo de microorganismos. ● Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de microorganismos de interés agropecuario. ● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto a fin de fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN: ESTERILIZACIÓN La esterilización es el proceso por el cual se destruyen o remueven las células vivas, esporas de hongos, endosporas bacterianas, virus y viroides presentes en un objeto o superficie, mediante el uso de agentes físicos o químicos (Tabla 1). Un objeto estéril es aquel que está libre de microorganismos, esporas y otros agentes infecciosos. El término esterilización tiene un significado absoluto, es decir, un objeto está estéril o no lo está. Debido a que los microorganismos se encuentran ampliamente distribuidos en el agua, el aire y el suelo, es indispensable cumplir con una etapa de esterilización y/o desinfección previa de todo el material de trabajo (ansas de siembra, material de vidrio, medios de cultivo, frascos de toma de muestras, mesadas, etc.), que se utilizará para realizar el estudio de los microorganismos de interés. La desinfección, a diferencia de la esterilización, es un proceso que destruye o inhibe la mayor proporción de los microorganismos potencialmente patógenos presentes en objetos o superficies. Otro término muy utilizado es el término “antisepsia”. Éste hace referencia al conjunto de procedimientos destinados a la inhibición o destrucción de microorganismos potencialmente patógenos presentes en la superficie de la piel y mucosas. Por ejemplo, el alcohol al 70% actúa como desinfectante cuando lo colocamos sobre una superficie inerte y como antiséptico, cuando lo usamos en la piel. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 10 Previo a la esterilización, el material debe ser: lavado con detergente, enjuagado con agua destilada y secado. Además, el material debe ser envuelto (previo a su esterilización) para que una vez esterilizado esté protegido de la contaminación ambiental durante el transporte y almacenamiento hasta el momento de su utilización. Tabla 1. Métodos de esterilización más comunes: - Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica Calor húmedo -Vapor de agua a presión atmosférica (Tindalización) Métodos físicos Calor Seco Radiaciones -Horno -Flameado -Calor al rojo -No ionizantes -Ionizantes Filtraciones Métodos químicos Sustancias líquidas y gaseosas Métodos físicos Calor húmedo Mecanismo de acción: el calor húmedo destruye los microorganismos en forma gradual. No hay un único mecanismo de acción, sino que se van sumando distintos eventos a medida que aumenta la temperatura. El primer efecto letal es la ruptura de la cadena de ADN que provoca la muerte celular por activación de endonucleasas. A medida que aumenta la temperatura comienza a perderse la integridad de la membrana celular, generando inconvenientes en la síntesis proteica y los procesos respiratorios, y fallas en el intercambio con el medio externo. Finalmente, se produce desnaturalización y coagulación irreversible de enzimas y proteínas estructurales. Modo de acción: difusión del vapor de agua sobre los microorganismos. ✔ Vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica La esterilización por calor húmedo se realiza con vapor de agua a presiones superiores a la atmosférica mediante el uso de autoclaves. Los autoclaves que comúnmente encontramos en los laboratorios son aparatos herméticos que Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 11 trabajan en forma similar a una olla a presión. El autoclave es básicamente una caldera metálica (en general de cobre), en cuya parte inferior se encuentra la fuente de calor (quemador o mechero) en autoclaves a gas, o bien, una resistencia eléctrica, en el caso de autoclaves eléctricas. La caldera lleva en su interior un doble fondo desmontable y perforado sobre el cual se coloca el material a esterilizar. La parte superior cierra con una tapa hermética que ajusta mediante una junta de goma de siliconas y una serie de tornillos. La tapa presenta tres elementos básicos que comunican el exterior con el interior de la caldera: el manómetro (que indica presión), la válvula de seguridad, y la llave de salida de vapor o espita. Para comenzar un ciclo de esterilización, primero debe colocarse agua en el autoclave procurando que su nivel no sobrepase el fondo perforado sobre el cual se ubicará el material. Luego, se colocan los objetos a esterilizar y se cierra la tapa ajustando los tornillos, a fin de asegurar un cierre hermético. El aire es un mal conductor del calor, lo que impide llegar a la temperatura deseada para lograr la esterilización. Es por ello que una vez cargado y cerrado el autoclave, éste debe purgarse. Para ello se enciende la fuente de calor manteniéndose la espita abierta. De esta manera, el vapor generado a partir del agua contenida en el fondo del recipiente, desplazará, por arrastre, al aire presente en el equipo y éste será expulsado a través de la espita. Una vez que la caldera se satura de vapor de agua (sale un chorro continuo y abundante de vapor a través de la espita) se cierra la espita y comienza a aumentar la presión de la cámara. La presión se regula con la cantidad de calor suministrado y se controla mediante un manómetro. Cuando se alcanza la presión deseada, la misma se mantiene constante y se controla el tiempo de esterilización. Para la esterilización de volúmenes pequeños se utiliza una combinación tiempo-temperatura de 20 minutos a 121ºC. Esta temperatura se logra generando 1,1 kg/cm2 atmósferas de presión. Los autoclaves poseen normalmente indicadores de presión (manómetros) y no de temperatura. La presión se corresponde con la temperatura cuando el vapor de agua es puro y no está mezclado con aire. Para lograr la correspondencia entre presión y temperatura debe tenerse especial cuidado de “purgar” el autoclave hasta que salga todo el aire del recipiente hermético. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 12 Para permitir la libre circulación del vapor, los tapones utilizados en los frascos, tubos, etc. y los papeles para las envolturas deben ser de material permeable (ej. tapones de algodón-gasa). Los recipientes que se utilicen para esterilizar medios de cultivo u otros materiales líquidos deben llenarse hasta la mitad de su volumen para permitir una buena circulación del vapor y evitar posibles derrames del líquido. El vapor saturado se condensa sobre los objetos líquidos compensando la cantidad de agua que se evapora. De esta manera, los materiales esterilizados no se deshidratan. El autoclave sólo debe abrirse cuando la presión del manómetro baje a cero. De la misma manera, no debe provocarse una salida brusca del vapor abriendo la llave de salida de vapor o espita antes que descienda adecuadamente la presión, debido a que, si hay líquidos en el interior, van a alcanzar rápidamente el punto de ebullición y se van a derramar. ✔ Vapor de agua a presión atmosférica (Tindalización) Es un método de esterilización que se aplica cuando el material puede alterarse si es expuesto a temperaturas por encima de 100°C y se denomina “Tindalización”. El proceso consiste en calentar el material por media hora a temperaturas de 80-90ºC. Luego, el material a esterilizar se incuba a 37ºC durante 24 horas. Se repite el proceso 3 días consecutivos. Durante la incubación las esporas germinan, generando células vegetativas, las cuales se eliminan en la siguiente exposición al calor. Este método puede utilizarse por ejemplo para la esterilización de soluciones de azúcares con concentraciones superiores al 10 % o medios de cultivo que contengan antibióticos, los cuales se alteran por la temperatura superior a 100 ºC. Calor seco Mecanismo de acción: el calor seco provoca desnaturalización de proteínas, lesiones por oxidación y efectos tóxicos por niveles elevados de electrolitos. Modo de acción: la acción letal es resultado del calor transmitido por el material que está en contacto directo con los microorganismos y no por el aire caliente que los rodea. ✔ Hornos o estufas de esterilización Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 13 Se emplean para esterilizar materiales de vidrio (pipetas, vasos, cajas de Petri), material de porcelana, material metálico (pinzas, cucharas, etc.). Debido a que la conducción del calor es más lenta en el aire que en el vapor, para esterilizar con calor seco se requiere mayor intensidad de calor y mayor tiempo de esterilización. La combinación temperatura-tiempo más usada es 160 °C, durante 2 horas. Los elementos deben envolverse en papel para evitar su contaminación una vez que finaliza el proceso. No corroe vidrio ni metal. ✔ Flameado Consiste en sumergir en alcohol el material (puntas de bisturís, varillas de vidrio, cucharas, etc.) y luego pasarlo por la llama de mecheros, colocando la pieza en el cono amarillo de la llama y luego lentamente en el azul (mayor poder calorífico). ✔ Calor al rojo Consiste en colocar materiales metálicos sobre la llama de un mechero de la forma en la cual se describe anteriormente, hasta que alcancen color rojo vivo. Se utiliza para esterilizar instrumental metálico (puntas de ansas, agujas, pinzas, etc.). Radiaciones ✔ No ionizantes Luz ultravioleta (UV): La porción ultravioleta del espectro que se utiliza para esterilizar corresponde a radiaciones que oscilan entre 200 y 300 nm. Para ello se utilizan lámparas de vapor de mercurio, que producen radiaciones con escasa capacidad para poder penetrar los materiales, por lo que sólo los microorganismos que se encuentran en la superficie de los objetos son sensibles a este tratamiento. El mecanismo de esterilización se basa en un fenómeno físico por el cual las ondas cortas de la radiación ultravioleta inciden sobre el material genético (ADN) de los microorganismos y los virus, y los destruyen en corto tiempo, sin producir cambios físicos o químicos notables en el material a esterilizar. Al momento de utilizar luz UV es importante tener en cuenta que la intensidad de la radicación emitida por la lámpara se disipa a medida que la distancia a la lámpara aumenta. Las radiaciones UV se utilizan para desinfectar superficies, aire y agua. Las cámaras de flujo laminar utilizadas para trabajar Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 14 asépticamente vienen equipadas con lámparas de luz UV para descontaminar las superficies. ✔ Ionizantes Rayos gamma: son radiaciones emitidas por ciertos isótopos radiactivos, como el cobalto (60Co) o el Cesio (137Cs), ambos productos colaterales de la fisión nuclear. Los rayos gamma esterilizan mediante acción letal contra los microorganismos al alterar el ADN. La radiación ionizante suele utilizarse para la esterilización y descontaminación de materiales de uso médico y en la industria alimentaria. Esta técnica de esterilización está indicada para materiales termosensibles (gomas, polietilenos, materiales quirúrgicos y farmacéuticos). Requiere instalación compleja por lo que es solo aplicable a gran escala. Filtraciones Algunos materiales como los líquidos biológicos (suero de animales, soluciones de enzimas, algunos azúcares, algunas vitaminas y antibióticos) son termolábiles. Cuando no es posible utilizar las radiaciones, se utiliza el método de filtración. Para ello, se procede a hacer pasar la solución por un filtro de poros muy pequeños que retienen a los microorganismos (logrando la exclusión en base al pequeño tamaño de los poros del filtro y en parte a la adsorción a las paredes del poro debido a la carga eléctrica del mismo y de los microorganismos). El tipo de filtro más utilizado es el filtro de membrana que consiste en un disco duro generalmente compuesto de ésteres de celulosa con poros pequeños que evitan el paso de los microorganismos. La filtración se realiza utilizando una jeringa o una bomba de vacío para forzar el paso del líquido a través del filtro hasta un recipiente estéril. La desventaja de este método es que partículas muy pequeñas (como algunos virus) pueden atravesar los poros y quedar en la solución. Métodos químicos Los desinfectantes químicos pueden clasificarse en 3 niveles (alto, mediano y bajo), según su concentración o su acción. Estos productos químicos se suelen utilizar para descontaminar materiales que se alteran por el calor (plásticos, semillas, papel, etc.) y varían en cuanto a su toxicidad siendo selectivos según los microorganismos. Además, deben ser solubles en agua o en lípidos para Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 15 obtener una penetración más eficiente en los microorganismos, tener baja tensión superficial y ser fácilmente eliminables luego del proceso. Sólo los desinfectantes de alto nivel pueden provocar una verdadera esterilización química, si el tiempo de acción es el adecuado. Además, pueden ser utilizados en superficies inertes, pero no como antisépticos, es decir, no sobre piel o mucosas. Dentro de este grupo se encuentran: óxido de etileno, formaldehído al 8% en alcohol al 70%, glutaraldehído al 2% y peróxido de hidrógeno. Su modo de acción es modificar en forma irreversible grupos funcionales de proteínas y/o ácidos nucleicos. Esto provoca inhibición celular y lleva a la muerte. El más utilizado en el laboratorio es el peróxido de hidrógeno, que actúa como un agente oxidante. Los otros son agentes muy tóxicos, altamente mutagénicos y carcinogénicos, por lo tanto, deben ser manipulados con extrema precaución. Los desinfectantes de mediano nivel, si bien no destruyen esporos, sí destruyen hongos, virus no lipídicos y al agente causal de la tuberculosis (Mycobacterium tuberculosis). Algunos ejemplos son: hipoclorito de sodio, alcohol iodado y alcoholes. Su modo de acción es actuar a nivel de proteínas y ácidos nucleicos como agentes oxidantes (hipoclorito de sodio, alcohol iodado) o producir precipitación, desnaturalización de proteínas y lesiones en la membrana citoplasmática (alcoholes). Es importante destacar que algunos agentes químicos, como es el caso del alcohol etílico, son más efectivos cuando se aplican diluidos en agua (por ej.: alcohol al 70%) debido a que el agua les otorga mayor poder de penetración en los microorganismos. La mayoría de ellos pueden ser utilizados como desinfectantes y antisépticos. En el caso de los desinfectantes de bajo nivel (compuestos de amonio cuaternario y agentes mercuriales), en la actualidad su uso solo se reserva para la limpieza doméstica ya que no destruyen ni esporos, ni virus no lipídicos ni m. tuberculosis. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 16 INTRODUCCIÓN: CULTIVO DE MICROORGANISMOS Para cultivar microorganismos en el laboratorio se utilizan medios de cultivo que proveen todos los requerimientos nutritivos para el desarrollo de los microorganismos, y además se les brindan todas las condiciones ambientales óptimas para su crecimiento (temperatura, pH, etc.). Medios de cultivo Un medio de cultivo es una mezcla balanceada de los requerimientos nutritivos que tienen los microorganismos a concentraciones tales que permiten el buen crecimiento de estos. Los medios de cultivo deben proporcionar los ingredientes químicos (nutrientes) que las células requieren para sintetizar las moléculas que las componen, permitiendo así la supervivencia y multiplicación de los microorganismos. Están constituidos en general por: base mineral, fuente de carbono, fuente de energía, fuente de nitrógeno y factores de crecimiento si son necesarios. La combinación entre los diferentes componentes químicos varía de acuerdo con las características nutricionales de cada microorganismo a cultivar. No hay ningún medio o condiciones de cultivo que permita el crecimiento de todos los microorganismos que se encuentran en la naturaleza. No obstante, hay medios que permiten el desarrollo de un gran número de microorganismos y otros en los cuales se desarrollan sólo algunos de ellos. Los requerimientos nutricionales varían entre microorganismos, dependiendo del tipo de metabolismo que presenten y de su capacidad biosintética. Algunos nutrientes se necesitan en grandes cantidades (macronutrientes) y otros en menor abundancia, incluso en cantidades muy pequeñas (micronutrientes). Los macronutrientes incluyen los principales elementos que constituyen las macromoléculas, es decir carbono, hidrógeno, oxígeno, nitrógeno, fósforo y azufre, entre otros. Los micronutrientes son tan importantes para el funcionamiento celular como los macronutrientes, pero se requieren en cantidades tan pequeñas que generalmente no es necesario agregarlos a los medios de cultivo. Estos suelen ser metales (cromo, cobalto, cobre, manganeso, molibdeno, etc.), muchos de los cuales tienen función estructural en varias enzimas. Algunos microorganismos necesitan, además, compuestos orgánicos Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 17 que son incapaces de sintetizar (factores de crecimiento). Estos compuestos se requieren en bajas cantidades e incluyen vitaminas, aminoácidos, purinas y pirimidinas. Además de los nutrientes, al momento de preparar un medio de cultivo debe tenerse en cuenta el pH que va a tener. En general el pH al cual desarrollan la mayoría de las bacterias es cercano a la neutralidad, aunque puede variar entre 5 y 9 según las especies. Los hongos se desarrollan preferencialmente en pH ácidos (5 a 6,5) y los actinomycetes suelen crecer a pH más básicos. Es por ello que cuando se prepara un medio, el pH se ajusta de acuerdo al organismo que se desea cultivar. Clasificación de los medios de cultivos Los medios de cultivo pueden clasificarse según distintos aspectos: Por el estado físico: ● Líquido (caldo) ● Semisólido (0,2 % agar) ● Sólido (1- 2 % agar) Por su composición química: ● Sintético o químicamente definido: se conoce la composición química exacta de sus constituyentes y las cantidades en que deben agregarse para formular el medio de cultivo. ● Complejo o químicamente indefinido: contienen al menos un componente cuya composición química exacta no se conoce, por ejemplo, extracto de levadura, triptona o peptona. Por su uso en el laboratorio (función): ● Generales: son medios que permiten el desarrollo de microorganismos con bajos requerimientos nutricionales. Por ejemplo: agar nutritivo, caldo nutritivo, etc. (Tabla 2). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 18 ● Selectivos o inhibitorios: contienen además de los nutrientes, sustancias que inhiben selectivamente el desarrollo de algunos microorganismos permitiendo el crecimiento de otros. Por ejemplo: caldo Mc Conkey. ● Diferenciales: permiten distinguir microorganismos por su crecimiento diferencial en el medio (Tabla 3). Para formularlos se consideran las propiedades metabólicas particulares del/de los microorganismo/s que se desea/n detectar y se agrega al medio un indicador que las evidencie. Por ejemplo: medio Y.E.M. con rojo Congo. Preparación de un medio de cultivo La mayoría de los medios de cultivo están disponibles comercialmente en polvo por lo que sólo debe pesarse la cantidad a utilizar e hidratarse en agua destilada en la concentración indicada por el comerciante. En cambio, existen otros medios de cultivo que no se encuentran disponibles en el mercado y que deben prepararse a partir de sus componentes. Medios de cultivo líquidos: Para ello, se debe leer atentamente la composición química del mismo y pesar la cantidad necesaria de cada constituyente, según el volumen de medio de cultivo a preparar. Luego se deben disolver los ingredientes del medio en el volumen requerido de agua destilada, agitando el recipiente con una varilla de vidrio o barra magnética y llevar a volumen final en recipientes aforados. En el caso de los medios disponibles comercialmente no debe regularse el pH; en cambio, en los medios preparados en el laboratorio debe medirse el pH y de ser necesario, el mismo debe ajustarse con soluciones de NaOH o H3PO4 (1 N). No se debe utilizar HCl para disminuir el pH debido a la alta toxicidad del cloro sobre las bacterias. Finalmente, el medio se coloca en tubos de ensayo, matraces, frascos, botellas, o en cualquier recipiente acorde al uso que se le vaya a dar y al método de esterilización. La boca del recipiente debe taparse con algodóngasa y papel de aluminio. Medios de cultivo sólidos: Se procede de la misma manera descripta para los medios de cultivo líquidos pero se agrega un agente solidificante. Si bien, existen varios tipos de agentes solidificantes, el más utilizado es el agar-agar, que es un polisacárido extraído Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 19 de algas marinas. Este compuesto puede estar incluido en la mezcla comercial o agregarse durante la preparación. El agar-agar no es soluble en agua a temperatura ambiente por lo tanto, previo a la esterilización, el medio debe fundirse a 100 ºC para lograr una mezcla homogénea. El agar-agar es muy utilizado como solidificante, debido a que gelifica a 40-45°C y no es degradado por los microorganismos. Además, su poder de gelificación no es afectado por varios ciclos de calentamiento y solidificación. Los medios sólidos suelen fraccionarse en tubos de ensayo. Luego de la esterilización pueden ser utilizados para cultivos en caja de Petri o cultivos en pico de flauta. Para lograr el pico de flauta se deja enfriar el medio sólido en una disposición inclinada. En el caso en que se requiere preparar un medio de cultivo semisólido se disminuyen las concentraciones del agente solidificante para lograr la consistencia deseada. Tabla 2. Composición química de un medio de cultivo general COMPUESTO CANTIDAD Fuente de C y energía Almidón 12 g Fuente de N NaNO3 0.5 g Base mineral KH2PO4 1.0 g MgSO4 .7H2O Agente solidificante Agua 0.5 g Agar-agar 15 g Agua destilada 1000 mL pH = 7.0 Tabla 3. Composición química de un medio diferencial para Fijadores de nitrógeno COMPUESTO CANTIDAD Fuente de C y energía Sucrosa 20 g Base mineral K2HPO4 0.15 g CaCl2 0.01 g MgSO4.7H2O 0.2 g Na2MoO4 0.002 g FeCl3 0.01 g CaCO3 0.1 g Agua destilada 1000 mL Agua pH = 7.0 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 20 Pasos a seguir para preparar un medio de cultivo: 1. Pesar los componentes sólidos. 2. Disolver los componentes en agua destilada (hidratación). 3. Regular el pH. Si el medio es ácido subir el pH con NaOH (1N) y si es alcalino bajar con H3PO4 (1N). 4. Si el medio es sólido, pesar el agar-agar y fundir al calor hasta ebullición para que pueda gelificar cuando se enfría (40-45°C). 5. Fraccionar los medios líquidos en frío y los sólidos en caliente (colocar 15-20 mL de medio de cultivo en tubos de ensayo si se van a utilizar para cajas de Petri y colocar 5 mL si se harán tubos en agar inclinado o pico de flauta). 6. Acondicionar los envases para esterilizar con tapones de algodón-gasa envueltos en papel poroso o papel aluminio. 7. Esterilizar en autoclave: los medios deben siempre esterilizarse en el día. 8. Para obtener medios en “pico de flauta”, después de la esterilización y antes que solidifiquen, apoyar los tubos en un ángulo adecuado para obtener mayor superficie de crecimiento. 9. Conservar los medios estériles en heladera (4-5°C). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 21 TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Preparación de medios de cultivo generales - Preparar 50 mL de medio de cultivo sólido general (agar nutritivo) y 25 mL de medio de cultivo general líquido (caldo nutritivo). - Fraccionar el medio de cultivo sólido: 15 mL de medio en cada tubo de ensayo (para cajas de Petri) y 5 mL en cada tubo de ensayo (para tubos pico de flauta). - Rotular - Acondicionar para esterilizar - Esterilizar 2. Preparación de cajas de petri y picos de flauta - Pasar el medio de cultivo sólido preparado a cajas de Petri y colocar los tubos para pico de flauta inclinados sobre la mesada hasta su solidificación. 3. Siembra de microorganismos del suelo Trabajando en condiciones de asepsia: - Colocar un gramo de suelo en 25 mL de medio de cultivo líquido general (preparado en el práctico). - Rotular. - Incubar a 28-30°C. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 22 TRABAJO PRÁCTICO N° 3: TÉCNICAS PARA LA OBSERVACIÓN, AISLAMIENTO Y CONSERVACIÓN DE MICROORGANISMOS Objetivos: ● Conocer el manejo del microscopio óptico, sus partes y utilidad en el laboratorio de microbiología. ● Conocer las técnicas básicas para la realización de coloraciones simples y dobles. ● Ser capaz de explicar el fundamento de la coloración de Gram y mencionar sus utilidades diagnósticas. ● Conocer las técnicas de aislamiento de microorganismos para obtener cultivos puros. ● Adquirir conocimientos sobre las distintas técnicas de conservación de cultivos puros. ● Adquirir habilidad para la observación de microorganismos. ● Adquirir habilidad en el aislamiento de microorganismos en medio sólido. ● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN Las bacterias son organismos pequeños y translúcidos, por lo que su visualización es muy dificultosa. Para estudiar a los microorganismos es necesario observarlos vivos o muertos y con este fin se utilizan lentes que incrementan su tamaño. En este sentido, para los trabajos de rutina en microbiología se utiliza el microscopio óptico, mientras que para el examen de las estructuras intracelulares se utiliza el microscopio electrónico. Los microscopios ópticos usan lentes para aumentar el tamaño de los organismos que se examinan. La capacidad de aumento de un microscopio óptico se calcula multiplicando el aumento del objetivo por el aumento del ocular. Aumentos de 1500 veces están cercanos al límite de lo que se puede conseguir con un microscopio óptico. Dentro de los microscopios ópticos más comunes tenemos: los de campo claro, de campo oscuro, de contraste de fases y de fluorescencia. En cambio, con los microscopios electrónicos se obtiene mayor resolución, ya que la muestra es atravesada por un haz de electrones en lugar de la luz. Existen Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 23 varios tipos de microscopios electrónicos, sin embargo, los más utilizados son: el microscopio electrónico de transmisión (MET) y el microscopio electrónico de barrido (MEB). El poder de resolución es la capacidad de poder ver dos puntos muy cercanos como unidades distintas y separadas. Aunque el aumento puede incrementarse prácticamente sin límites en los microscopios ópticos, no ocurre lo mismo con la resolución porque está limitada por las propiedades físicas de la luz. El poder de resolución es el responsable de la calidad, claridad, nitidez y fineza detallada de la imagen. El máximo poder de resolución en un microscopio óptico es de 0,2 µm, en cambio, en un microscopio electrónico es mucho menor (0,01 µm) y es por ello que con él se pueden observar las estructuras subcelulares. Observación microscópica Para observar una muestra en el microscopio óptico, que es el que se utiliza de rutina en el laboratorio, podemos realizar: 1- Preparaciones húmedas: se realizan colocando una gota de la suspensión de microorganismos entre un portaobjeto y un cubreobjetos y se observan directamente sin colorear ni disturbar la muestra. 2- Preparaciones fijadas: se coloca con ayuda de un ansa una gota del cultivo a analizar sobre el portaobjetos (extendido) y se fija (mediante calor o agentes químicos). En el caso de la fijación por calor se pasa el portaobjetos por la llama del mechero con lo cual se logra adherir (fijar) el material al vidrio. La fijación se produce principalmente debido a la coagulación de las proteínas presentes en las células. Este paso es crucial ya que si no fijamos el preparado adecuadamente no podremos observar los microorganismos en el microscopio a la hora de realizar la coloración. Al realizar el proceso de fijación, las bacterias mueren y sus paredes se vuelven más permeables a los colorantes. Otra manera de realizar la fijación es mediante agentes químicos (alcoholes, ácido acético, etc). Luego de fijado el preparado puede ser sometido a diferentes tipos de coloraciones dependiendo la estructura u organismo que se quiera poner de manifiesto. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 24 Métodos de coloración Las coloraciones o tinciones son técnicas que permiten observar microorganismos en función de la afinidad de diversas estructuras celulares con determinadas sustancias colorantes. Los colorantes son compuestos orgánicos que tienen las siguientes funciones: a) permiten hacer visibles los objetos microscópicos y transparentes; b) revelan su forma y tamaño y c) producen reacciones químicas específicas. Existen dos tipos de colorantes: - Catiónicos: son sustancias que están cargadas positivamente y por ello se combinan con los constituyentes celulares cargados negativamente, como los ácidos nucleicos y los polisacáridos ácidos. Ejemplos: azul de metileno, cristal violeta y safranina. - Aniónicos: son sustancias cargadas negativamente y se combinan con componentes celulares cargados positivamente como es el caso de algunas proteínas. Ejemplos: fucsina ácida, rojo congo, etc. Distintos caracteres son utilizados para la identificación de los microorganismos, entre ellos sus características morfológicas: forma celular, agrupamiento, tipo de pared, presencia de cápsulas, endosporas y flagelos. La observación al microscopio utilizando distintas técnicas de tinción permite obtener esta información. Además, dependiendo de la cantidad de colorantes que se utilizan y de qué estructuras celulares se quieren resaltar, las coloraciones pueden ser: - Simples: utilizan un solo colorante y se basan en el hecho de que las células tienen una composición química diferente a la de su entorno, de modo que ambos se comportan de forma diferente frente al colorante (Figura 1). - Diferenciales: utilizan más de un colorante y se fundamentan en que distintos tipos de células tienen distinta composición o estructura química, y por lo tanto reaccionan de forma diferente frente a uno u otro colorante. En este grupo se encuentra incluida la tinción de Gram. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 25 Figura 1. Secuencia de una coloración simple Tinción de Gram Es definida como una tinción diferencial, ya que utiliza dos colorantes y clasifica a los microorganismos en dos grandes grupos: bacterias Gram negativas y Gram positivas. Fue desarrollada por el científico danés Hans Christian Gram en 1884, a quien debe su nombre. Los fundamentos de la tinción de Gram están basados en las características de la pared celular de las bacterias Gram positivas y Gram negativas, la cual le confiere propiedades determinantes a cada microorganismo y determina sus características tintoriales. (Ver complemento teórico, Pared celular Unidad 1) (Tabla 1). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 26 Tabla 1. Secuencia de una tinción de Gram Pasos Observación Gram + Gram - 1- Se tiñe el extendido Todas las bacterias se con el colorante cristal tiñen de violeta. violeta durante 1 minuto. 2- Se añade Lugol (solución de yodo-ioduro potásico) para fijar el colorante durante 1 minuto. 3- Se decolora el extendido con una mezcla de alcoholacetona. Se enjuaga el extendido con agua. 4- Se tiñe el extendido con fucsina durante 30 segundos, que funciona como un colorante secundario y sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violetayodo. Enjuagar el extendido con agua. Todas las bacterias se tiñen de violeta. Las bacterias Gram positivas se mantienen de color violeta y las Gram negativas se decoloran. Las bacterias Gram positivas se mantienen violetas y las Gram negativas se tiñen de rosa. Obtención de cultivos puros Los microorganismos por su pequeño tamaño se estudian como poblaciones denominadas “cultivos”. Se denomina cultivo puro a un conjunto de microorganismos genéticamente iguales, obtenidos a partir de una sola célula o de una colonia formada por una sola célula. Esta célula inicial se obtiene mediante aislamiento en medio sólido, que es el procedimiento que permite separar un microorganismo de una población mixta, que es la forma en la cual se encuentran generalmente en la naturaleza. Métodos de aislamiento Existen numerosos métodos para aislar microorganismos. Los de mayor utilidad en microbiología de suelo son: aislamiento en medio sólido y aislamiento biológico. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 27 1. Aislamiento en medio sólido Consiste en separar e inmovilizar individuos en un medio agarizado. De esta manera cada célula al multiplicarse formará una colonia visible macroscópicamente. La técnica más común de aislamiento es la de “estrías en superficie o método de aislamiento por agotamiento” (Figura 2) y consiste en diluir progresivamente una alícuota de un cultivo (inóculo) mediante el trazado de líneas sobre la superficie del agar (estrías). Se inocula la muestra sobre un extremo de la placa con un ansa y se extiende formando estrías sobre la superficie en varios sentidos, en las primeras estrías se obtiene crecimiento confluente debido a que el inóculo está muy concentrado y en las últimas estrías al quedar menos microorganismos en el ansa, se obtienen colonias aisladas originadas a partir de cada célula. Figura 2. Aislamiento por agotamiento o estriado. 2. Aislamiento biológico Consiste en inocular organismos vivos (animales o plantas) con las bacterias en estudio para posteriormente aislarlas en estado puro a partir de la sangre o células especiales de los organismos. Es muy utilizado cuando se trabaja con bacterias patógenas y simbióticas (por ej. aislamiento de cepas de rizobios a partir de nódulos de leguminosas). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 28 Conservación de cultivos puros La conservación de cultivos puros tiene el propósito de poder mantener y preservar los cultivos puros por períodos largos de tiempo con el objetivo de: a) preservar la pureza genética del cultivo sin pérdida de ninguna de sus propiedades bioquímicas; b) preservar los niveles de su productividad inicial y c) lograr que el cultivo pueda ser transportado y manejado con facilidad. Técnicas de conservación de cultivos puros: - Liofilización: consiste en congelar rápidamente una suspensión de microorganismos y eliminar el agua (desecación) como vapor directamente desde hielo sin pasar por el estado intermedio líquido. Luego los liófilos se conservan entre 0 y 5°C durante muchos años. Para su recuperación se resuspende el liófilo en soluciones y temperaturas adecuadas. - Congelación: se coloca un cultivo puro de microorganismos suspendidos en medio líquido y luego se congela a -90°C recubiertos con glicerol (agente crioprotector). Con esta técnica se disminuye o anula el metabolismo del microorganismo, realizando un cultivo en fase estacionaria (alta resistencia a daños). El cultivo puede descongelarse y usarse incluso varios años después. - Subcultivos seriados: esta técnica consiste en cultivar los microorganismos en medio sólido pico de flauta y conservarlos en la heladera (4-5ºC), repicando el cultivo de manera periódica en un medio nutritivo fresco para garantizar la viabilidad y pureza del mismo. Manejo del material en condiciones de asepsia Las condiciones de asepsia son clave para trabajar con microorganismos. Los principales requisitos para trabajar asépticamente son: - La atmósfera del laboratorio debe ser lo más limpia posible (evitar corrientes de aire, polvo, humo, etc.). Lo más adecuado es manejar los cultivos de microorganismos en cámaras de flujo laminar. Estas cámaras consisten en gabinetes cerrados con flujo de aire filtrado hacia el operador, con lo que se evita la introducción de elementos contaminantes en la mesa de trabajo. Es conveniente que toda la habitación sea sometida a radiación UV antes de trabajar. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 29 - La superficie de la mesa de trabajo debe desinfectarse con alcohol o hipoclorito antes de comenzar y al finalizar el trabajo. - Cuando se toma material desde un cultivo de microorganismos, el ansa debe ser previamente esterilizada a la llama, proceso que se repite después de ser utilizada. - Cuando se destapa un recipiente conteniendo material estéril o un cultivo, se debe flamear la boca del recipiente y mantenerlo cerca de la llama mientras se trabaja. Al calentar la boca del recipiente se produce una corriente de aire caliente desde adentro hacia afuera que no permite la entrada de elementos contaminantes. Los recipientes deben flamearse nuevamente antes de taparlos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 30 TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Trabajando en condiciones de asepsia, realizar coloraciones simples (con el colorante fucsina) a partir de los cultivos de suelo en medio general y diferencial para fijadores de nitrógeno sembrados en el práctico anterior. Procedimiento: - Extender con el ansa una alícuota de cultivo de manera uniforme sobre el portaobjeto. - Fijar los extendidos sobre la llama del mechero - Cubrir el portaobjeto con fucsina. - Dejar actuar durante un minuto. - Lavar con agua destilada. - Secar en la columna de aire caliente del mechero. - Observar al microscopio con objetivo de inmersión (100 x). 2. Coloración simple (fijación con ácido acético) Realizar una coloración simple con fucsina a los portaobjetos enterrados (Técnica de Rossy-Cholodny) preparados en el práctico anterior. - Sacar los portaobjetos con cuidado (remover el suelo en exceso). - Fijar el material con ácido acético al 40% durante 5 minutos. - Cubrir el portaobjeto con fucsina. - Dejar actuar durante un minuto. - Lavar con agua destilada. - Secar en la columna de aire caliente del mechero. - Observar al microscopio con objetivo de inmersión. 3. Coloración diferencial Trabajando en condiciones de asepsia, realizar una coloración diferencial de Gram, siguiendo los pasos descriptos anteriormente en la guía de trabajos prácticos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 31 4. Aislamiento por agotamiento (estriado) En condiciones de asepsia tomar con un ansa una alícuota del cultivo en medio general preparado en el Práctico anterior, colocar la alícuota en un extremo de la caja de Petri y extenderla formando estrías sobre la superficie del medio de un cultivo sólido (agar nutritivo) con el objetivo de obtener colonias aisladas. Luego incubar a 28-30°C. 5. Actividad extra. Sembrar cultivo puro en pico de flauta. En condiciones de asepsia tomar con un ansa una alícuota del cultivo puro, colocar la alícuota en un extremo basal del pico de flauta y extenderla en forma de estriado sobre la superficie del medio de un cultivo sólido. Luego incubar a 28-30°C. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 32 TRABAJO PRÁCTICO N° 4: ANÁLISIS DE FERTILIDAD MICROBIANA DEL SUELO Objetivos: • Conocer las técnicas de recuento de microorganismos. • Conocer la importancia del monitoreo de abundancia, actividad y diversidad de los microorganismos edáficos. • Obtener dominio en el análisis de grupos funcionales microbianos que intervienen en la fertilidad del suelo. • Adquirir habilidades y/o destrezas para la siembra y cultivo de microorganismos. • Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN La vida microbiana tiene un rol esencial en la formación y el mantenimiento de la fertilidad del suelo. El monitoreo de la abundancia, actividad y diversidad de los microorganismos edáficos es de suma importancia en ecosistemas agrícolas a fin de evaluar el impacto de las diferentes prácticas de manejo productivo. El análisis microbiológico del suelo estudia la presencia, abundancia y actividad de las poblaciones microbianas y las interacciones entre los microorganismos y entre ellos y las plantas. Por tal motivo, se debe recurrir al uso de técnicas de laboratorio que respeten lo más fielmente posible las condiciones presentes en el ambiente natural. Las técnicas de análisis más utilizadas para estimar la abundancia microbiana incluyen: 1- Recuento de células totales (células vivas y muertas). 2- Recuento de células viables (células que aún presentan capacidad para reproducirse). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 33 1- Recuento de células totales a) Método directo (Cámara de Petroff‐Hausser) Este método consiste en el contaje de células microbianas (vivas y muertas) por visualización al microscopio. Para ello, se utilizan portaobjetos especiales con una graduación en superficie que retiene un volumen de inóculo conocido. La cámara de recuento cuenta con las siguientes medidas conocidas: - Tiene 0,02 mm de profundidad; - Presenta un área de 1 mm2, dividida en un retículo de 25 cuadrados grandes - Cada cuadrado grande está subdividido a su vez en 16 cuadrados pequeños Es decir, la muestra se distribuye en 16 x 25 = 400 cuadros pequeños. El método de recuento directo (Figura 1) es una manera rápida de estimar el número de células microbianas pero tiene una serie de limitaciones, por ejemplo, las células muertas no se distinguen de las vivas y las células pequeñas son difíciles de visualizar. Además, si el número de células vistas en el campo del microscopio es muy pequeño y poco significativo este método no es una forma adecuada de evaluar el número de células. Forma de calcular el número de células por mL de muestra Portaobjeto 12 células x 25 cuadrados x 50 x 103 Número x mm2 Sitio donde se coloca la muestra. El espacio entre cubre y porta es de 0,02 mm (1/50 mm). La rejilla tiene 25 cuadrados grandes, un área de 1 mm2 y un volumen total de 0,02 mm3 Número x mm3 Observación microscópica: todas las células son contadas dentro de un cuadrado grande (16 cuadrados pequeños). Ej. 12 células Figura 1. Cámara de recuento Número x cm3 o /mL Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 34 b) Método indirecto (Método Turbidimétrico) El cálculo indirecto de masa celular, consiste en la medición de la cantidad de luz dispersada o transmitida a través de un cultivo bacteriano. El método turbidimétrico, se basa en la capacidad de las células para dispersar la luz que incide sobre ellas, siendo el grado de dispersión proporcional a la biomasa o cantidad de células presente. La turbidez es la disminución de la luz transmitida a través del tubo (Transmitancia), lo que equivale a mayor cantidad de luz absorbida (Absorbancia). Para poder medir la absorbancia se utiliza un espectrofotómetro donde las lecturas obtenidas en el aparato se expresan en unidades de densidad óptica (DO). Este método requiere realizar previamente una curva patrón relacionando la DO con recuentos (mediante otros métodos) realizados para cada tipo de microorganismo estudiado. Estos métodos son ampliamente usados para evaluar el crecimiento de una población sin disturbar la muestra (Figura 2). Luz incidente Filtro (filtra diferentes longitudes de onda) Muestra con células Luz no dispersada Fotocélula (mide la luz no dispersada) Figura 2. Espectrofotómetro Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 35 2- Recuento de células viables: a) Recuento en medio sólido: Consiste en contar las colonias que se desarrollan sobre o dentro del agar asumiendo que cada célula origina una sola colonia. Como no siempre una colonia se forma a partir de una sola célula, los resultados se expresan en unidades formadoras de colonias (UFC). A pesar de esta limitación es un método ampliamente utilizado debido a su practicidad. Antes de realizar la siembra de una muestra mediante este método, usualmente se realizan diluciones seriadas. El resultado se expresa en UFC/mL o UFC/g. UFC/mL o UFC/g = colonias contadas x (1/factor de dilución) x (1/volumen de inóculo). Factor de dilución: Dilución utilizada Volumen de inóculo: 1 mL (para siembra por embebido) o 0,1 mL (para siembra en superficie). Existen básicamente dos formas de realizar recuento en medio sólido: - Siembra por inmersión o embebido: se siembra el inóculo (generalmente 1 mL) en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte el medio de cultivo previamente fundido (a una temperatura de aproximadamente 45-50ºC para evitar la muerte de microorganismos) (Figura 3). Solidificación e incubación Colonias creciendo en superficie Colonias creciendo embebidas en el agar El inóculo es pipeteado dentro de una placa estéril Medio estéril es adicionado y mezclado con el inóculo Figura 3. Método de siembra por inmersión o embebido Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 36 - Siembra en superficie: se vierte sobre una placa o caja de Petri el medio de cultivo fundido y se deja solidificar. Luego, se coloca sobre la superficie el inóculo a sembrar (generalmente 0,1 mL). Con ayuda de una espátula de Drigalsky estéril se extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo (Figura 4). Colonias creciendo en superficie Incubación Se coloca una alícuota (0,1 mL) sobre la superficie del agar Se esparce el inóculo con espátula de Drigalsky Figura 4. Método de siembra en superficie b) Recuento en medio líquido: Sirve para estimar la población de microorganismos viables en muestras de suelo, agua o alimentos. La metodología de la técnica se basa en la siembra de volúmenes secuenciales de base 10 (diluciones) de la muestra pura o 1 mL de las diluciones decimales. El número de diluciones dependerá de la cantidad de microorganismos presentes en la muestra (a mayor cantidad de microorganismos mayor cantidad de diluciones) (Figura 5). El método de número más probable (NMP) es una estrategia eficiente de estimación de las densidades poblacionales especialmente cuando una evaluación cuantitativa de células individuales no es factible. La técnica se basa en la determinación de la presencia o ausencia (tubos positivos o negativos) en réplicas de diluciones consecutivas de atributos particulares de los microorganismos presentes en muestras de suelo u otros ambientes. Por lo tanto, un requisito importante de este método es la necesidad de poder reconocer un atributo particular de la(s) población(es) en el medio de crecimiento a utilizarse. Generalmente se evalúa el consumo de algún sustrato y/o la aparición de algún producto microbiano (ácido, gas, etc.). El estimado de densidad poblacional se obtiene del patrón de ocurrencia de ese atributo en las diluciones seriadas y del uso de una tabla probabilística (tabla de Mc. Grady) (Tabla 1). Para ingresar a la tabla de Mc. Grady es necesario formar un número Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 37 conformado por la cantidad de tubos con actividad metabólica positiva (número característico). Algunas de las ventajas del método del Número más Probable son: (a) la capacidad de estimar tamaños poblacionales basados en atributos relacionados a un proceso: selectividad (por ejemplo, se puede determinar la densidad poblacional de organismos con capacidad de degradar la celulosa en una muestra de suelo utilizando medios de cultivo que contengan celulosa como única fuente de carbono), (b) proveer una recuperación uniforme de las poblaciones microbianas de suelos diversificados, (c) determinar sólo organismos vivos y activos metabólicamente, y (d) ser más rápido e incluso más confiable que los métodos tradicionales de esparcimiento en platos de cultivo. Diluciones seriadas Suspensión o inóculo a sembrar Batería de tres tubos Figura 5. Método del Número Más Probable Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 38 Recuento de células viables aplicadas a grupos funcionales Grupo funcional: conjunto de microorganismos que realizan procesos metabólicos semejantes, independientemente de su taxonomía. Para el análisis de la fertilidad del suelo se suelen analizar cuatro grupos microbianos: amonificadores, celulolíticos, nitrificadores y fijadores de nitrógeno. Pasos para determinar la abundancia de los grupos funcionales que intervienen en la fertilidad del suelo. 1- Suspensión y dilución de suelo Para poder realizar los recuentos, el suelo debe ser suspendido/diluido (generalmente 10 g de suelo se colocan en 90 mL de solución salina estéril). Como en el suelo la cantidad de microorganismos es muy grande se deben realizar diluciones de la suspensión/dilución para obtener un número factible de microorganismos que pueda ser contado. Por ejemplo, cuando se realizan métodos de recuento en medio sólido, el número factible de microorganismos que puede ser contado en una caja de Petri debe estar en el rango de 30 a 300 colonias por caja. Asimismo, en el caso del método de recuento en medio líquido (Número Más Probable), para poder ingresar a la tabla de Mc. Grady se requiere al menos que exista un tubo negativo. Para poder cumplir con estos requisitos, comúnmente se realizan diluciones al décimo (1 mL de la muestra en 9 mL de solución salina estéril) (Figura 6). 2- Siembra en medios selectivos líquidos y sólidos Para realizar la siembra de los microorganismos se procede a colocar 1 mL de cada dilución de suelo utilizada en medios selectivos estériles para los distintos grupos funcionales. Para optimizar el procedimiento se recomienda comenzar la siembra con las diluciones más altas, de esa manera se puede utilizar solo una pipeta estéril por muestra. Grupos funcionales a evaluar: Amonificadores: Debido a que es el grupo más abundante en el suelo, se siembran las tres diluciones más altas. La siembra se realiza por triplicado: se coloca 1 mL de las diluciones -9, -8 y -7 en tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con asparagina). Se incuba a 28- 30ºC durante 7 días. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 39 Celulolíticos: Se siembra por triplicado 1 mL de las diluciones -6, -5 y -4 en tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con papel de filtro). Se incuba a 2830ºC durante 15 días. Fijadores de nitrógeno de vida libre: Se siembra 1 mL de la dilución -4 en una caja de Petri y se agrega el medio sólido selectivo (sin N). Se incuba a 28- 30ºC durante 5 días. Nitrificadores: Debido a que es el grupo menos abundante en el suelo se siembran en las tres diluciones más bajas. Se siembra por triplicado 1 mL de las diluciones -4, -3 y -2 en los tubos conteniendo el medio líquido selectivo (con sulfato de amonio). Se incuba a 28- 30ºC durante 21 días. 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 1 mL 10-4 10-6 10-8 X g suelo en X mL de solución salina estéril Suspensión/dilución 10-1 Agitar 2 o 3 minutos 10-2 10-3 10-5 Recuento en medio sólido (Embebido) Organismos fijadores de N 10-7 10-9 Recuento en medio líquido (NMP) Nitrificadores Celulolíticos Incubación ESTUFA LECTURA Figura 6. Esquema de siembra de los grupos funcionales Amonificadores Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 40 3- Lectura Una vez que cada uno de los grupos funcionales han sido incubados se procede a la lectura. En el caso de realizar recuento en medio líquido, para poder obtener el NMP se procede de la siguiente manera: 1) se ordenan los tubos desde la dilución más concentrada a la más diluida que se utilizó para sembrar cada grupo funcional; 2) se cuentan los tubos positivos de cada dilución (número característico) y 3) se ingresa a la tabla de Mc Grady con el número característico para obtener el NMP. Amonificadores: se agregan 2 o 3 gotas de reactivo de Nessler en cada tubo y se cuentan los tubos positivos (color ocre por presencia de amonio). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady para obtener el número más probable. Celulolíticos: se cuentan los tubos positivos (colonias sobre el papel o alteración del mismo). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady. Fijadores de nitrógeno de vida libre: se cuentan las colonias (UFC) que se formaron en la caja de Petri. Nitrificadores: se agrega 0,1 mL de ácido sulfúrico concentrado y unas gotas de di fenilamina sulfúrica en cada tubo y se cuentan los tubos positivos (color azul por presencia de nitrato). Se ordena la cifra para obtener el número característico y se ingresa a la tabla de Mc. Grady. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 41 Tabla 1. Tabla de Mc. Grady para tres tubos Nº Característico NMP Nº Característico NMP Nº Característico NMP 000 ‹0.3 111 1.1 222 3.5 001 0.3 112 1.5 223 4.2 002 0.6 113 1.9 230 2.9 003 0.9 120 1.1 231 3.6 010 0.3 121 1.5 232 4.4 011 0.61 122 2.0 233 5.3 012 0.92 123 2.4 300 2.3 013 1.2 130 1.6 301 3.9 020 0.62 131 2.0 302 6.4 021 0.93 132 2.4 303 9.5 022 1.2 133 2.9 310 4.3 023 1.6 200 0.91 311 7.5 030 0.94 201 1.4 312 12 031 1.3 202 2.0 313 16 032 1.6 203 2.6 320 9.3 033 1.9 210 1.5 321 15 100 0.36 211 2.0 322 21 101 0.72 212 2.7 323 29 102 1.1 213 3.4 330 24 103 1.5 220 2.1 331 46 110 0.73 221 2.8 332 110 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 42 TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar la siguiente actividad: 1. Siembra de grupos funcionales - Trabajando en condiciones de asepsia, realizar una suspensión (10 gramos de suelo en 90 mL de solución salina estéril). - A partir de la suspensión realizar diluciones al décimo. - Realizar la siembra de grupos funcionales (nitrificadores, celulolíticos, amonificadores y fijadores de N2) en medios de cultivo selectivos y diferenciales. - Incubar a 28-30ºC. 2. Recuento de microorganismos de diferentes grupos funcionales - Realizar el recuento de microorganismos: fijadores de nitrógeno, celulolíticos, amonificadores y nitrificadores. 3. Actividad extra para trabajar en el Práctico Nº 5 Utilizando suelo oreado y tamizado realizar la siguiente actividad: - Pesar y colocar 20 gramos de suelo en un frasco de 300-400 cc. - Regar al 60% de la capacidad de campo. - Colocar (con pipeta) 15 mL de NaOH 0,2 N en dos cubetas. - Colocar una de las cubetas dentro del frasco con suelo y la otra dentro de un frasco de 300-400 cc vacio. - Rotular y cerrar ambos frascos lo más herméticamente posible (usar polietileno y cinta para sellar los frascos). - Incubar a 28-30ºC. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 43 TRABAJO PRÁCTICO N° 5: ACTIVIDAD HETERÓTROFA TOTAL Objetivos: • Incorporar conocimientos generales sobre las técnicas de análisis para la determinación de la actividad heterótrofa total microbiana. • Conocer la importancia del monitoreo de la actividad de los microorganismos edáficos. • Adquirir habilidades y/o destrezas en el análisis de la actividad heterótrofa total. • Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN La actividad microbiana total evalúa el metabolismo de todos los microorganismos del suelo en su conjunto. Debido a que el metabolismo más importante de los microorganismos es la respiración aeróbica, los métodos para medir la actividad heterótrofa total se basan en determinar la respiración del suelo mediante el consumo de O2 o la producción de CO2. La técnica para medir la producción de CO2 es la más difundida debido a su practicidad y simplicidad metodológica. La respiración del suelo puede medirse en condiciones controladas de laboratorio (respiración potencial) o directamente a campo (in situ). Los métodos de medición a campo reflejan de manera más realista la situación analizada pero suelen ser más difíciles de implementar. Producción de CO2 del suelo en condiciones de laboratorio El método se basa en captar el dióxido de carbono (CO 2) producido por una muestra de suelo en una solución alcalina y transformarlo en carbonato. Para ello se coloca una muestra de suelo y una cubeta con hidróxido de sodio (NaOH) en un frasco cerrado herméticamente en condiciones óptimas de humedad (60% de capacidad de campo) y temperatura (28-30°C) por un período de tiempo determinado. Simultáneamente, debe prepararse un frasco con las mismas Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 44 condiciones pero sin muestra de suelo, este frasco es utilizado “Blanco” para descontar el CO2 proveniente del aire. Principio químico de la medición del CO2 El CO2 liberado durante la respiración aeróbica en el suelo puede ser absorbido en solución alcalina y medido como un índice de la tasa de respiración. La reacción en la cual el CO2 es absorbido durante la incubación es: CO2 + 2 NaOH Na2CO3 + H2O Luego de la incubación se debe proceder a la medición de la cantidad de CO2 producido. Para ello, se realiza una reacción de titulación. La titulación es un método que permite conocer la concentración de una solución básica a partir de la neutralización (ácido-base) con una solución ácida de concentración conocida (o viceversa). Para poder determinar el momento en el cual ocurre la neutralización se utiliza a menudo indicador de pH. Cuando la solución de concentración conocida y la solución de concentración desconocida se hacen reaccionar al punto en el que el número de equivalentes de ácido es igual al número de equivalentes de base (neutralización), se alcanza el punto de equivalencia y el indicador de pH cambia de coloración. base + ácido sal + agua En este caso para medir el CO2 primero se debe precipitar el carbonato (CO3-2) con una solución de cloruro de bario (BaCl2): Na2CO3 + BaCl2 2 NaCl + BaCO3 La titulación se realiza con HCl y como indicador se utiliza la fenolftaleína. La fenolftaleína en una solución básica es rosa virando a incolora cuando el pH es neutro y permaneciendo incolora en soluciones ácidas. La reacción química general que ocurre durante una titulación es: NaOH + HCl NaCl + H2O Calculando la diferencia entre la cantidad de mL de HCl utilizados para titular el blanco y la cantidad de mL de HCl utilizados para titular la muestra, se obtiene la cantidad de CO2 producido por respiración mediante la siguiente fórmula: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 45 (Blanco – Muestra) 4.4 = mgCO2 /d / g pS donde : Blanco: mL de HCl gastados para titular el blanco Muestra: mL de HCl gastados para titular la muestra d: días de incubación pS: peso suelo (g) 4.4: factor de conversión entre mL de HCl y mg de CO 2, que se origina del siguiente cálculo: HCl equivale a CO2/2 HCl 0,2 N = HCl/5 equivale a CO2/2 x 5 Peso molecular del CO2 = 44 Por lo tanto: HCl 0,2 N = 44/10 = 4,4 Síntesis del proceso para medir CO2 en laboratorio: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 46 Producción de CO2 del suelo en condiciones a campo Para ello, se utilizan recipientes herméticos de un volumen conocido que se entierran hasta cierta profundidad (10 cm) durante un periodo de tiempo. La cantidad de CO2 formado en ese período se evalúa mediante un detector de gases graduado acoplado a una jeringa extractora de gases. Casos prácticos del análisis microbiano del suelo Para evaluar los cambios en la fertilidad de un suelo, los parámetros biológicos son más sensibles que los químicos, particularmente los grupos microbianos poco diversos y poco abundantes (por ejemplo, los microorganismos nitrificadores). Sin embargo, para poder interpretar los análisis microbianos de fertilidad de manera adecuada hay que considerar una serie de factores: 1) No existen valores óptimos absolutos para la fertilidad microbiana de un suelo debido a que cada lugar tiene características propias en cuanto a cantidad y actividad de las diferentes poblaciones microbianas. Los resultados de un suelo problema siempre deben compararse con un suelo testigo sin disturbar de sitios cercanos. 2) No siempre un mayor número de microorganismos ni una mayor actividad se corresponden con suelos de mayor fertilidad, ya que los procesos microbianos en el suelo deben estar balanceados. 3) Los índices que relacionan parámetros químicos y biológicos como el índice de mineralización de C (IMC), resultan ser más representativos de la dinámica del suelo que los parámetros biológicos de manera aislada. IMC= producción de CO2/contenido de materia orgánica IMC= 1 balanceado > pierde C < gana C Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 47 TRABAJO DE LABORATORIO: Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Titular las muestras preparadas e incubadas a 28-30°C en el práctico anterior y calcular el CO2 producido. Procedimiento: - Transferir la solución de cada una de las cubetas a un erlenmeyer. - Agregar 1 mL de BaCl2 al 2% y 1 gota de fenolftaleína a cada una de las cubetas. - Titular con HCl 0,2 N. - Calcular la cantidad de CO2 producido por gramo de suelo y comparar los resultados con los demás grupos. 2. Resolver los siguientes problemas de actividad heterótrofa total a. ¿En cuál de los siguientes resultados de actividad microbiana de suelo se utilizó más HCl 0,2 N para titular? - 0,98 mg CO2/g en una muestra de 15 g de suelo con un blanco de 14,5 mL de HCl 0,2 N - 0,12 mg CO2/g en una muestra de 25 g de suelo con un blanco que gastó 13,3 mL de HCl 0,2 N - 0,21 mg CO2/g de suelo en una muestra de 10 g de suelo con un blanco de 13,9 mL de HCl 0,2 N b. Calcule la actividad microbiana del suelo expresada como mg CO 2 /g suelo/ 7días, con los siguientes datos: HCl 0,2 N gastado para titular el blanco 14,7 mL; HCl 0,2 N gastado para titular la muestra 9,3 mL; peso de la muestra de suelo 15 g. Siete días de incubación. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 48 TRABAJO PRÁCTICO N° 6: FERTILIZANTES BIOLÓGICOS: DESARROLLO Y CONTROL DE CALIDAD DE INOCULANTES Objetivos: ● Conocer los parámetros para la selección de cepas. ● Conocer las metodologías y procedimientos microbiológicos para la evaluación y control de los inoculantes más utilizados en la actualidad. ● Adquirir habilidades y/o destrezas para la evaluación de la inoculación a campo. ● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN El uso indiscriminado de fertilizantes nitrogenados en agricultura ocasiona graves problemas de contaminación, ya que no todo el fertilizante que se aplica lo aprovecha la planta, sino que una cantidad importante acaba en aguas superficiales y subterráneas. En este sentido, una alternativa para disminuir la utilización de fertilizantes químicos puede ser la utilización de microorganismos con fijación biológica de nitrógeno (FBN), ya que además de no poseer riesgo de contaminación ambiental, su efecto está fuertemente sincronizado con los requerimientos de la planta y generalmente son de menor costo. En general, se estima que alrededor del 50 % de un fertilizante nitrogenado cuando es aplicado a los cultivos es absorbido por las plantas y el otro 50 % o más es almacenado en el suelo para la nutrición de los cultivos subsiguientes; pero una gran parte de este es transformado en nitrógeno atmosférico mediante los procesos de denitrificación y otra gran parte es lixiviado a capas inferiores donde produce contaminación de las aguas subterráneas y el manto freático en forma de nitrato (NO3-). Los procesos naturales de FBN juegan un importante rol en la activación de los sistemas agrícolas sustentables por su beneficio ambiental. La contribución de la FBN al ciclo global del nitrógeno es importante, presentando un balance con el proceso de denitrificación. Algunos de los compuestos de nitrógeno gaseoso originados por denitrificación juntamente con el CO 2, Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 49 producen el efecto invernadero causante en gran medida del calentamiento global. Por lo tanto, el incremento de FBN en el suelo, puede mitigar la necesidad del uso de fertilizantes nitrogenados sintéticos con su consiguiente efecto benéfico al ciclo de nitrógeno, el calentamiento global y el saneamiento de las aguas subterráneas y superficiales. Este proceso depende básicamente de la acción de los microorganismos en conjunto con las plantas (interacción microorganismo-planta). Fertilizantes biológicos (inoculantes) La legislación argentina define como fertilizantes biológicos a los productos que contienen uno o varios microorganismos como principal componente sobre un determinado soporte sólido, líquido u oleoso. Estos productos están formulados con microorganismos viables benéficos, seleccionados para favorecer la nutrición y/o promover el crecimiento de las plantas. La calidad de un inoculante está definida en principio por la eficiencia de la cepa presente en el producto, que debe ser escogida en base a un riguroso proceso de selección de cepas en diferentes condiciones agroecológicas. En segundo lugar, dependerá de la formulación del inoculante, la que deberá garantizar el número mínimo de células viables desde su elaboración y hasta el periodo de vencimiento en condiciones de almacenamiento determinados y durante el periodo de vida útil o tiempo de vigencia establecido por los entes de fiscalización. En general, el periodo de validez de los inoculantes está condicionado principalmente por las características del soporte y el mismo va desde los 6 hasta los 18 meses. Si bien, en nuestro país y en el mundo se ha despertado gran interés en el uso de microorganismos como los Rizobios para fabricar inoculantes, otros microorganismos como Pseudomonas y Azospirillum, también son utilizados como inoculantes. Ese interés ha ido acompañado del desarrollo de productos microbianos de calidad obteniendo resultados favorables en las investigaciones y ensayos realizados que provocaron que se incremente en los últimos años su producción y utilización, en especial como tratamientos a la semilla previos a la siembra. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 50 Clasificación de los inoculantes En general, los inoculantes pueden clasificarse según: - El soporte: puede ser: a) líquido (acuosos con o sin turba en suspensión y oleosos) o b) sólido (generalmente turba). El soporte constituye la mayor proporción o volumen del inoculante y su función es la de nutrir y proteger a los microorganismos frente a factores adversos, durante el periodo que transcurre desde su elaboración hasta su uso en los sistemas de producción. Los soportes deben ser capaces de mantener elevadas las concentraciones de microorganismos viables, sin producir alteraciones en sus propiedades fisiológicas durante periodos de almacenamiento prolongados. Además, deben proveer los elementos imprescindibles para la vida de las bacterias (alimento, oxígeno y humedad), evitar la competencia con otros organismos y no poseer sustancias tóxicas que alteren a las bacterias. - La cantidad de cepas con las que estén formulados: Los inoculantes efectivos pueden integrarse con una sola cepa (inoculantes monocepa), o pueden contener varias cepas (inoculantes multicepa). Cualidades de un inoculante efectivo: - Deberá contener microorganismos seleccionadas por su capacidad para fijar grandes cantidades de nitrógeno. - Los microorganismos utilizados deberán ser específicos para el cultivo a tratar. - Los microorganismos deben estar adaptados a las condiciones ambientales del lugar del cultivo. - Que los microorganismos estén presentes en número adecuado (1 x 109 bacterias/g o mL de inoculante a la fecha de fabricación y 1 x 10 7 bacterias/g o mL de inoculante a la fecha de vencimiento). Ley Nº 20466/80. - Presentar un soporte que debe proteger al microorganismo, debe ser fácil de aplicar y adherirse bien a la semilla. - No deben poseer contaminantes, es decir, deben estar libre de otras bacterias que puedan ser perjudiciales a los microorganismos, al ambiente o a la planta. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 51 - Debe estar envasado para proteger a los microorganismos hasta que sea usado por el productor. Para ello, el envase debe permitir el intercambio de gases y la retención de la humedad. - Que el envase provea instrucciones claras y una lista de las especies con las cuales nodula efectivamente. - El nombre y dirección del fabricante deben estar impresos en el paquete. Recomendaciones al comprar un inoculante: - Observar que el envase cuenta con la siguiente información: a) nombre del cultivo para el cual es efectivo (nombre común y científico); b) nombre científico de las especies de microorganismos que contiene el inoculante; c) número de microorganismos viables por gramo o mL de soporte al momento del vencimiento y d) fecha de vencimiento, número de lote, instrucciones de uso y peso neto del inoculante. - Observar las características del envase (permeable al oxígeno, cámara de aire, no presentar daño, etc.) - Controlar la fecha de vencimiento ya que es un producto perecedero. - Controlar que no esté formulado (mezclado) con productos químicos (curasemillas o insecticidas). - Observar las condiciones de comercialización (cadena de frío). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 52 Desarrollo de un inoculante para leguminosas 1º etapa: selección de cepas Antes de comenzar con la preparación, deben elegirse cepas infectivas, específicas y efectivas para el cultivo a inocular. Estas pueden provenir de colecciones de cultivos especializadas o pueden aislarse a partir de plantas bien noduladas (Fig. 1). En el caso de realizar los aislamientos a partir de nódulos, se seleccionan los nódulos turgentes y se los desinfecta para eliminar los contaminantes del suelo. Luego, los nódulos son macerados en agua estéril (liberando los bacteroides a la solución) y posteriormente se procede a la siembra por estriado en cajas de Petri con medio Y.E.M. (yeast extract medium) diferencial para el crecimiento de rizobios, con el objetivo de obtener colonias aisladas (cepas). Figura 1. Esquema de aislamiento de rizobios a partir de nódulos de plantas leguminosas. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 53 Las cepas seleccionadas deben ser buenas competidoras con respecto a las cepas nativas o naturalizadas y deben estar seleccionadas para las condiciones agroecológicas de la zona o región donde se desarrollarán las plantas o los hospedantes para los cuales se recomienda. Estas cepas deberán poseer habilidad para sobrevivir y multiplicarse en el suelo, y sobrevivir en la semilla. La primera etapa de la selección de cepas se realiza en cámaras de cultivo en el laboratorio (Fig. 2), en las cuales las cepas que se desean comparar se prueban en macetas. Para ello, se realizan dos tipos de ensayos: - Ensayos de infectividad: en los cuales se realiza la preselección de las mejores estirpes, evaluando la nodulación. Esta queda determinada por la cantidad de nódulos que producen, ubicación, tamaño y calidad al corte (color rojo) y actividad fijadora de nitrógeno. Dichas observaciones se realizan en distintos momentos del ciclo del cultivo, generalmente a los 30 y 60 días, y se relacionan con su crecimiento y aspecto vegetativo. Con este paso se realiza la preselección de las cepas de mayor capacidad de nodulación, para luego realizar una evaluación más compleja del sistema simbiótico. - Ensayos de efectividad: las cepas elegidas se evalúan en un ambiente óptimo (cámara de cultivo), con el fin de que desarrollen toda su capacidad potencial de fijación. Las variables que se evalúan en este caso son nodulación, materia seca, % de nitrógeno, etc., y por diferencia con los testigos se puede obtener la cantidad aproximada de nitrógeno que fija una cepa. La etapa final de selección se realiza a campo. Consiste en realizar ensayos con las cepas más destacadas de las etapas anteriores a las cuales se somete a las condiciones que se quieren seleccionar. Este tipo de ensayos debe repetirse por lo menos tres años con el objeto de contemplar las variaciones climáticas. Para evaluar los resultados se consideran los parámetros nodulación, peso seco de nódulos, % de nitrógeno, rendimiento en grano, entre otros. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 54 Figura 2. Ensayo tipo para selección de cepas de leguminosas. En el país el IMYZA (INTA-CASTELAR) dispone de una selección de 150 cepas de Bradhyrizobium japonicum (para soja) evaluadas por su eficiencia para distintas condiciones de suelo, clima y variedad. Este instituto realiza ensayos en invernáculos, realizando pruebas a campo con las cepas de mayor eficiencia. De los ensayos allí realizados surgen las recomendaciones de cepas altamente eficientes para ser empleadas por los fabricantes de inoculantes nacionales e incluso de otros países. 2º etapa: preparación del cultivo a nivel industrial En este caso, el primer paso consiste en el desarrollo y crecimiento de la cepa elegida a pequeña escala (cultivo de iniciación o starter) para posteriormente inocular el biodigestor (cultivo a nivel industrial). a) Cultivo de iniciación o pie de cuba: se prepara medio de cultivo Y.E.M. líquido estéril (cultivo de iniciación). La cantidad de mL de medio de cultivo a preparar dependerá de la escala a la que se trabaje (por ej: 500 mL de medio de cultivo Y.E.M. líquido para un biodigestor de 25 mL o 50 mL para un biodigestor de 2,5 L). Luego, se inocula el medio de cultivo con la cepa elegida (conservada Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 55 en pico de flauta), se coloca el cultivo en un agitador (para asegurar la aireación del medio) y se incuba a 28-30ºC por 3 o 4 días. Posteriormente, se controla la viabilidad y pureza del cultivo. Para ello, se realiza el recuento de microorganismos en medio Y.E.M. sólido y coloraciones Gram para determinar pureza de la cepa. b) Siembra en el biodigestor: el cultivo de iniciación o starter previamente controlado se siembra en el biodigestor representando un 2% del volumen a inocular (por ej 500 mL se utilizan para inocular un fermentador de 25 litros de volumen total). El biodigestor es un recipiente destinado a la multiplicación y desarrollo de cultivos de microorganismos a gran escala. Los biodigestores pueden ser de vidrio (usados en producciones de escala más pequeña) o grandes cubas de acero inoxidable con gran capacidad. Dentro de estos biodigestores encontramos medio de cultivo Asbhy estéril (la diferencia con el medio Y.E.M., radica en que posee una fuente de carbono menos eficiente pero más económica para la multiplicación a gran escala de rizobios). El biodigestor se inocula con el cultivo de iniciación y se pone en funcionamiento (presenta un mecanismo de aireación que favorece la disolución de oxígeno). Luego de 3 o 4 días los microorganismos se desarrollan durante la incubación y se obtiene el producto cuando llegan a una concentración de: 10 9 células de rizobios por mL. Nuevamente, en esta etapa se controla la viabilidad y pureza del cultivo (recuento en medio Y.E.M. sólido y coloraciones Gram para determinar pureza de la cepa) (Fig. 3). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 56 Figura 3. Producción de inoculantes Control de calidad de inoculantes Como todo producto biológico, los inoculantes pueden perder rápidamente su calidad por variaciones o mutaciones de los cultivos, presentar pérdida de viabilidad por no poseer el número adecuado de rizobios o por una inadecuada preservación del producto una vez que este se encuentra en el mercado. Metodología para el control de calidad de inoculantes de Bradirhizobium japonicum para cultivo de soja Si el inoculante es sólido: - Sanitizar el envase con alcohol 70%. - Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos). - En forma aséptica abrir el envase, extraer y pesar 10 gramos de producto en forma aséptica y colocarlos (suspensión/dilución: 1/10). en 90 mL de solución salina estéril Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 57 - Mezclar con agitador por 15 a 20 minutos. - En forma aséptica extraer 1 mL de la suspensión/dilución con pipeta estéril bajo llama de mechero o cámara de flujo laminar. - Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril. - Sembrar por triplicado y mediante el método de inmersión (sólo se siembran las últimas tres diluciones: 10-6, 10-7 y 10-8). - Verter el medio de cultivo diferencial (Y.E.M. con rojo Congo) previamente fundido (a una temperatura de aproximadamente 45-50ºC para evitar la muerte de microorganismos). - Dejar solidificar e incubar las placas en estufa a 28-30ºC por 7 días. - Realizar la lectura a los 7 días y verificar a los 10 días. - Se cuentan las placas que presenten entre 30 y 300 colonias. Las colonias típicas de Bradirhizobium japonicum son normalmente blancas y circulares si crecen sobre el agar y de forma lenticular si se encuentran embebidas en el mismo (Fig. 4). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 58 Figura 4. Siembra de un inocúlate sólido. Si el inoculante es líquido: - Sanitizar el envase con alcohol 70%. - Homogeneizar el envase mediante agitación manual (durante 30 segundos). - En forma aséptica abrir el envase y extraer 1 mL de inoculante líquido con pipeta estéril bajo llama de mechero o cámara de flujo laminar. - Realizar diluciones al décimo con solución salina estéril. - Continuar como indica el protocolo para inoculante sólido (Fig. 5). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 59 Figura 5. Siembra de un inocúlate líquido. Técnicas de inoculación a campo Inocular consiste en contactar la semilla con el inoculante. Las técnicas más recomendadas son las que utilizan métodos húmedos ya que permiten mayor adherencia de las bacterias al tegumento de la semilla. El inoculante debe diluirse antes de su aplicación para que pueda ser distribuido de manera homogénea en todas las semillas. El volumen total de líquido (agua + inoculante + curasemilla) para la dilución depende del tamaño de las semillas; en función de ello se recomienda: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 60 ♦ semillas grandes: hasta 2,4 litros cada 100 kg de semilla (soja: 900 mL/100 kg, ya que el exceso de humedad provoca ruptura de tegumentos) ♦ semillas chicas: hasta 4 litros cada 100 kg de semillas (alfalfa 1000 mL/100 kg) En la dilución, puede utilizarse agua azucarada al 10%, para disminuir la mortandad de rizobios durante la desecación de las semillas. La mezcla puede realizarse en hormigonera, inoculadora o directamente en la tolva de la sembradora. Existen distintas técnicas de inoculación: - Sobre la semilla: se denomina inoculación directa cuando sólo se le aplica el inoculante y pelleteado cuando además del inoculante, se aplican otros compuestos con la finalidad de proteger las bacterias y/o las semillas (por ej. CaCO3). Se recomienda realizar esta operación inmediatamente antes de la siembra para asegurar la viabilidad de los microorganismos; además es frecuente la aplicación de curasemillas durante la misma operación, lo que puede afectar la efectividad del inoculante. - En el surco: el inoculante se “chorrea” en el fondo del surco previo a la siembra. Generalmente, la siembra e inoculación se realizan en una sola operación, a tal fin se equipan las máquinas sembradoras con sistemas que permitan distribuir el inoculante diluido, preferentemente en el fondo del surco, antes que caiga la semilla. Recomendaciones generales para inocular a campo - Realizar la inoculación a la sombra. - Inocular la cantidad necesaria para un día de siembra. - Si debe aplicar curasemillas, realice la mezcla de ambos productos respetando el volumen de agua y sembrar inmediatamente. - No conservar el inoculante mezclado con el curasemillas durante mucho tiempo. - No usar herramientas o recipientes que hayan estado en contacto con combustibles o pesticidas. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 61 - Si durante la operación se aplica también inoculante, deben respetarse las normas de manejo seguro de agroquímicos: • Leer atentamente el marbete del producto antes de su utilización y proceder según lo indicado en el mismo. • Utilizar ropa de protección: guantes y overol o ropa cubierta, para evitar el contacto dermal con el agroquímico. • Utilizar respirador o barbijo, para proteger boca y nariz. • Preparar la mezcla al aire libre y lejos de viviendas. • No ingerir alimentos ni tocar boca o rostro durante la operación. • No colocar agroquímicos en botellas de bebida, ni utilizar éstas para realizar la mezcla. • Realizar el triple lavado de los envases vacíos (no liberar el agua de lavado a cursos de agua), perforarlos y disponerlos en sitios autorizados. • Finalizada la operación, se recomienda lavar manos y brazos con abundante agua y jabón. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 62 TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Aislamiento de rizobios y visualización de bacteroides a partir de nódulos de leguminosas. Trabajando en condiciones de asepsia, realizar el aislamiento de rizobios a partir de 2 plantas leguminosas noduladas. Procedimiento: - Cortar las raíces de plantas noduladas. - Lavar las raíces con cuidado y sin romper los nódulos. - Extraer de 5 a 10 nódulos turgentes - Desinfectar los nódulos extraídos con agua oxigenada durante 5 minutos. - Enjuagar los nódulos con agua destilada estéril. - Macerar los nódulos extraídos en 2 mL de agua destilada estéril. - Realizar estrías en medio Y.E.M. e incubar durante 7 días a 28- 30°C. - A partir del macerado realizar una coloración de Gram. - Visualizar el carácter Gram y la forma de los bacteroides. 2. Análisis de calidad de inoculante - Observar el crecimiento en cajas de Petri. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 63 TRABAJO PRÁCTICO N°7: MICROORGANISMOS PROMOTORES DEL CRECMIENTO VEGETAL. BIOFERTILIZANTES Y BIOCONTROLADORES. Objetivos: ● Conocer los fundamentos de las PGPR para hacer uso de estas como fertilizantes biológicos y biocontroladores. ● Conocer los fundamentos de endomicorrizas y ectomicorrizas para hacer uso de las mismas como fertilizantes biológicos. ● Adquirir habilidades y/o destrezas en metodologías y procedimientos microbiológicos para la realización de ensayos de biocontrol en condiciones in vitro. ● Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN Cambios en los paradigmas productivos, tecnológicos y sociales, demandan a la cadena agroalimentaria incrementos en la producción de alimentos y una reducción en la utilización de insumos de síntesis industrial como fertilizantes químicos y pesticidas en la producción agropecuaria frente a un contexto de aumento de la población mundial y escenario de cambio climático. La utilización de productos de síntesis biológica es una opción viable para mantener la dinámica de funcionamiento natural de los agroecosistemas y asegurar la productividad de los sistemas agropecuarios para las futuras generaciones. Una alternativa productiva es la incorporación de microorganismos asociados a la rizósfera de los cultivos comúnmente denominadas Rizobacterias Promotoras del Crecimiento Vegetal o PGPR (siglas en inglés) y Hongos Promotores del Crecimiento Vegetal (PGPF) como es el caso de Trichoderma y las micorrizas. Las PGPR y los PGPF y los cultivos interactúan principalmente en la rizósfera, y en el rizoplano. La relación que se establezca no solo va a depender del tipo de microorganismo y el cultivo, sino que también de factores ambientales y las formas de aplicación o utilización de estos organismos. La rizósfera es definida como aquella región o nicho ecológico que comprende un determinado Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 64 volumen de suelo influenciado por el contacto de las raíces de las plantas con el propio suelo, donde las propiedades fisicoquímicas y biológicas del suelo son afectadas o modificadas por la liberación de exudados que estimulan el crecimiento y desarrollo de microorganismos con propiedades positivas (PGPRPGPF) o negativas (patógenos) al crecimiento vegetal. Dentro de la rizosfera, existe una región muy importante donde las PGPR crecen y se desarrollan que se denominada rizoplano. El rizplano es una región del suelo conformada por partículas que están en íntimo contacto con la rizodermis de las plantas y que se extiende unos pocos milímetros (2-5 mm) desde la superficie de las raíces al interior del suelo. El rizoplano a su vez, es la región con mayor diversidad y riqueza microbiana de los suelos y es el sitio donde ocurren los principales procesos relacionados con la absorción de agua, nutrientes, promoción del crecimiento y defensa contra patógenos. La mayoría de las PGPR crece y se desarrolla en la rizósfera y el rizoplano y pueden establecer relaciones simbióticas o no simbióticas del tipo mutualista con las plantas. Según sea el tipo de interacción y efecto que ejerzan sobre los cultivos las PGPR-PGPF pueden ser clasificadas como biofertilizantes, bioestimulantes, rizoremediadores, biocontroladores o biopesticidas. Dentro de los principales tipos de PGPR podemos encontrar bacterias de los géneros Bacillus, Pseudomonas, Azospirillum, Burkholderia, Serratia, etc. y dentro de los PGPF a especies del género Trichoderma y a las micorrizas. Las PGPR pueden inducir el crecimiento vegetal en forma directa o indirecta. En general, la influencia directa incluye la producción de fitohormonas (auxinas, giberelinas, citoquininas, etileno, etc.) solubilización de fosfatos y micronutrientes por acción de ácidos orgánicos y fosfatasas acidas, y la fijación biológica de nitrógeno. Los efectos indirectos resultan de la modificación del ambiente rizosférico, actuando las PGPR como agentes de biocontrol de fitopatógenos mediante la liberación de sustancias como sideróforos, compuestos orgánicos volátiles (COVs), enzimas hidrolíticas, antibióticos y cianidas. Las bacterias del género Pseudomonas intervienen con mecanismos especializados en la solubilización de fósforo mediante la producción y liberación al suelo de ácidos orgánicos y fosfatasas. Estas a su vez, son productoras de Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 65 fitohormonas y COVs con actividad promotora del crecimiento vegetal y actúan como agentes de control biológico mediante la producción de antibióticos, sideróforos, y la inducción de resistencia sistémica interna en los vegetales. Además, existen estudios que indican el potencial de Pseudomonas en la inducción de tolerancia a estrés de tipo abióticos como salinidad, frío, térmico, etc. Por otra parte, las bacterias del género Bacillus se encuentran extensamente distribuidas en diversos ambientes, debido a su versatilidad metabólica y a la presencia de una estructura de resistencia como la endospora. Estas características generan un potencial biotecnológico para la obtención de inoculantes que permitan llevar a cabo los tratamientos profesionales de semillas, como lo son el pelleteado o la pre-inoculación en plantas industriales, asegurando la cantidad mínima necesaria de bacterias al momento de la siembra sobre la semilla. Estas bacterias poseen diversos mecanismos de acción como PGPR, tanto directos (producción de auxinas, solubilización de fosfatos y fijación del nitrógeno), como indirectos actuando como agentes de control biológico mediante la producción de antibióticos, sideróforos y enzimas líticas. El género Azospirillum está constituido por bacterias mutualistas no específicas capaces de habitar en la rizósfera de muchas especies vegetales. Promueven el crecimiento de las plantas por una sinergia de mecanismos tales como la producción de fitohormonas, la fijación de N, y la producción de sideróforos y de óxido nítrico. En la producción de gramíneas como trigo, maíz, etc. la inoculación con Azospirillum spp. es una práctica económicamente conveniente y se aplica principalmente como tratamiento a las semillas. Al inocular con Azospirillum spp., se observan mayores rendimientos y contenidos de proteína en grano, atribuidos a un incremento en la absorción radical de N. El mayor crecimiento inicial de las raíces contribuye a mejorar la eficiencia de uso del agua y el aprovechamiento de las fuentes de nutrientes de las que disponen las plantas. Los cambios en el crecimiento de las raíces se asocian principalmente a la producción de auxinas como producto del metabolismo de esta rizobacteria. La acción como biocontrol, es casi nula, ya que los mecanismos metabólicos más desarrollados y especializados de este género son la acción como biofertilizante. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 66 Ensayos de actividad Biofertilizante Para evaluar la acción biofertilizante de las PGPR, podemos realizar ensayos de germinación y crecimiento en cámaras de condiciones controladas. El objetivo de este tipo de ensayos es evaluar las modificaciones que puedan ocurrir como consecuencia de la acción de las PGPR sobre la producción de biomasa aérea y radical de los cultivos, cambios en el sistema radical (estructura y arquitectura), modificación en el índice verde (contenido de clorofilas), cambios en la superficie foliar de las plantas tratadas, modificaciones en los contenidos de nutrientes de los tejidos y variaciones del tipo molecular. Estudios en condiciones controladas Se pueden realizar pruebas de germinación de los cultivos, en cámarasde condiciones ambientales de crecimiento controladas, según las normas establecidas en el manual de Reglas ISTA (International Seed Testing Association) sobre la germinación en cuanto a temperatura, fotoperiodo y humedad ambiental. En el caso particular del maní (Arachis hypogaea L.) el cultivo se debe mantener a una temperatura de 28°C, un fotoperiodo de 16 hs de luz y 8 hs de oscuridad. Para sembrar el cultivo se deben preparar macetas de 3 L de capacidad con un sustrato estéril (1:1 suelo-arena) y por métodos gravimétricos determinar la Capacidad de Campo (CC) del sustrato, para que previo a la siembra, las macetas se rieguen con una cantidad de agua equivalente al 60% de CC. Durante la duración del experimento las macetas deben permanecer en esta situación hídrica. Procedimiento: Para proceder a la inoculación con las PGPR, las cepas bacterianas deben sembrarse en un medio de cultivo general como Tripteina Soya Caldo, hasta alcanzar una concentración de 109 bacterias mL-1. Una vez preparado el inoculante debemos proceder a la inoculación de las semillas con las cepas, teniendo en cuenta los cálculos del trabajo práctico de inoculación a campo, tanto para el inoculante, como así también para el cura-semillas (Fungicida). A su vez a fondo de surco (orificio de siembra) debemos colocar 40 µL. para simular la aplicación chorreada a campo. Las semillas se siembran a 3 cm de profundidad. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 67 TRABAJO PRÁCTICO PGPR BIOFERTILIZANTES A partir de macetas con plantas de albahaca de 20 días de edad, se determinarán los siguientes parámetros al momento de finalizar los ensayos (Fig.1): ● Altura de planta tomada desde el cuello de la planta (zona de transición entre el tallo y la raíz). ● Longitud de la raíz principal. ● Número de hojas. ● Peso seco aéreo y peso seco radicular: debemos colocar el material en bolsas de papel y llevarlo a estufa a 55°C hasta quitarle toda el agua y alcanzar peso constante. ● Área foliar: para ello debemos tomar una de las plantas y quitarles completamente los folíolos (Fig. 2). Podemos tomar una fotografía y realizar los cálculos con el programa ImageJ. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 68 PGPR CONT ROL Biomasa aérea Cuello de la planta BiomasaRadical Figura 1. Plántulas de maní de 10 días de crecimiento en cámara de germinación. Dos tratamientos con PGPR comparadas con una planta control sin microorganismos. Figura 2. Foliolos de una planta de maní de 10 días de crecimiento. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 69 Figura 3. Plántulas de albahaca de 15 días. A la izquierda el tratamiento testigo a la derecha un tratamiento con Bacillus sp. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 70 Ensayos de actividad Biocontroladora Para la evaluación de la acción biocontroladora de las PGPR, se pueden realizar diferentes pruebas que permitan dilucidar mecanismos aislados como la acción enzimática, como ensayos de actividad proteasas, quitinasas, etc. Pero también es posible probar el efecto de las PGPR sobre los patógenos de forma directa. Estos ensayos pueden ser realizados en condiciones in vitro, es decir en laboratorio, donde las condiciones de siembra y crecimiento de los microorganismos están controladas de forma estricta o mediante ensayos in vivo donde la planta que cumple la función de hospedera tanto de las PGPR, como así también de los patógenos es inoculada con ambos y se evalúa la incidencia (número de plantas enfermas) y la severidad (porcentaje de afección) de la enfermedad. Ensayos in vitro - Ensayo de cultivos duales Para evaluar el efecto antagónico de los aislados bacterianos sobre los hongos fitopatógenos y probar mecanismos de inhibición relacionados a la producción de antibióticos o enzimas hidrolíticas, se pueden realizar este tipo de ensayos que consisten en la un disco de micelio (conjunto de hifas que constituyen la estructura vegetativa de los hongos) de 5 mm de diámetro en el centro de una placa de Petri conteniendo medio de cultivo tipo agar papa dextrosa (PDA), el cual es un medio de cultivo que presenta como fuente carbonada almidones y la dextrosa que son la base para el crecimiento de hongos y levaduras. Debemos tener en cuenta tanto para estas pruebas duales, como las pruebas de volátiles que el micelio que debemos utilizar debe ser obtenido de un hongo que se encuentre en activo crecimiento, es decir lo debemos obtener del frente de avance cuando lo sacamos de una placa de Petri y a su vez, el micelio que utilicemos para todos los ensayos debe tener la misma edad para evitar variaciones del tipo fisiológicas. Una variante a lo anterior, en el caso de hongos productores de esporas, es posible la realización de estos ensayos utilizando una suspensión de esporas de concentración conocida. Para ello deberán prepararse suspensiones de esporas en solución salina estéril en combinación con surfactantes como el Tween20, para evitar que por efecto de adsorción las esporas queden adheridas a las Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 71 paredes de las micropipetas utilizadas. Para el conteo de esporas, se utiliza la cámara de Neubauer o hemocitómetro, que es un instrumento utilizado en medicina y biología para realizar el recuento de esporas y células en un medio líquido; similar a la Cámara de Petroff‐Hausser que hemos estudiado en el práctico N° 4 dentro de las técnicas de recuento de células totales. Una vez colocados los discos de micelio o sembradas las esporas debemos sembrar por superficie los aislados bacterianos en líneas paralelas a 20 mm de distancia del disco fúngico sin permitir el contacto inicial entre ellos. Las bacterias deben ser cultivadas en medio de cultivos generales como el Caldo Nutritivo (CN), Tripteina Soya Caldo (TSC), etc. Las PGPR deben ser sembradas 48 hs antes de realizar los ensayos, para asegurar una concentración mínima de microorganismos y a su vez previo a la siembra debemos asegurar la pureza de nuestros cultivos mediante la realización de tinciones diferenciales tipo Gram. Las placas serán selladas e incubadas a la temperatura óptima necesaria para el crecimiento de los patógenos. La superficie de crecimiento del micelio se medirá diariamente, determinando el diámetro de crecimiento en dos direcciones para obtener un promedio. En este tipo de ensayos es necesario utilizar controles, por ello se debe sembrar el disco fúngico y reemplazar las líneas paralelas de bacterias con H2O estéril. Los resultados se expresarán como porcentaje de inhibición de crecimiento del micelio (PIC) de acuerdo a la siguiente fórmula: PIC= [(C-T)/C] x 100, donde C es la media del área del control (mm2), y T es la media del área de cada tratamiento (mm2). - Efecto inhibitorio de los Compuestos Orgánicos Volátiles (COVs) La acción de los COVs en la actividad antagónica frente a fitopatógenos es posible evaluarla mediante un ensayo de enfrentamiento en placas de Petri entre hongos y bacterias. Este ensayo tiene como objetivo evaluar la capacidad de las cepas de producir COVs e inhibir a los patógenos sin necesidad de entrar en contacto la PGPR con el patógeno. El cultivo bacteriano (tomando los mismos recaudos que en el ensayo dual) se siembra en placas de Petri conteniendo como medio de cultivo Agar Nutritivo. La siembra de las PGPR se realiza por superficie colocando 0.1 mL de cultivo bacteriano y esparciéndolo por toda la superficie del agar con una espátula de Drigalsky. Estas placas se deben incubar a 28-30°C durante 24 hs. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 72 Al día siguiente se toma una placa de Petri con PDA y se realiza una siembra de una pieza de micelio (5 mm de diámetro) o una siembra de suspensión de esporas (igual que en los ensayos duales). Una vez sembradas las placas de PDA, para cada tratamiento se deben enfrentar las placas sembradas con hongos vs. las placas sembradas con bacterias del día anterior. Para ello ambas placas se enfrentan y se sellan utilizando Parafilm® para evitar el escape de los COVs, pero permitir el ingreso de oxígeno necesario para los procesos metabólicos. Las placas se incubarán a 28-30 °C durante 5 a 7 días dependiendo del tiempo de crecimiento de los patógenos. Todos los días se medirá el diámetro de micelio para verificar la inhibición del crecimiento. Como control se enfrenta una placa inoculada con el hongo a una placa sembrada con H2O estéril. Los resultados se expresarán como PIC de acuerdo con la fórmula indicada anteriormente (Fig. 3). Ensayos in vivo El ensayo de biocontrol in vivo se puede realizar en macetas de 10L con diferentes sustratos, los utilizados en la catedra generalmente están compuestos por una mezcla de suelo:arena (1:1) previamente esterilizado y el ensayo se conduce bajo condiciones controladas en invernadero. Los tratamientos que normalmente se utilizan son: a) control de una planta sana, b) control con la planta enferma, c) macetas sembradas con semillas del cultivo seleccionado embebidas en la suspensión con PGPR. Para llevar adelante el experimento, las PGPR deben ser sembradas en pie de cuba para formular inoculantes de la misma forma que se realiza para Bradyrhizobium, pero con medios de cultivo diferente. Para la inocular las semillas se deben tener en cuenta las proporciones estudiadas en el práctico de inoculantes. También se aplica en el fondo de surco 1000 µL. de la suspensión bacteriana a concentración mínima de 10 9 UFC/mL. El objetivo de este tipo de ensayos es evaluar la capacidad de las PGPR para biocontrolar el hongo durante el periodo susceptible de infección del cultivo. Posteriormente a la emergencia de las plántulas, todas las macetas (excepto el control sano) deben ser infectadas con esporas y/o esclerocios (estructuras de resistencia de los hongos del tipo Deuteromicetes) de los respectivos hongos. Se debe evaluar la incidencia de la enfermedad cada 15 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 73 días como el porcentaje de plantas enfermas y su vez en el caso de los cultivos a granos, podemos ver como se afectó la generación del rendimiento. Figura 4. Pruebas duales. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 74 TRABAJO PRÁCTICO PGPR BIOCONTROL Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: Trabajando en condiciones de asepsia, para las pruebas de actividad antifúngica. 1. Determinar el Porcentaje de Inhibición del Crecimiento (PIC). 1. A partir de placas ya crecidas determinar el PIC de cada una de ellas. Fórmulas para el cálculo: Recordar sacar un diámetro promedio. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 75 MICORRIZAS: BIOINOCULANTES FÚNGICOS (PGPF) Por otro lado, hoy en día se están utilizando las micorrizas como fertilizantes biológicos. La palabra micorriza, es de origen griego y define a la interacción simbiótica entre un hongo (mycos) y las raíces (rhizos) de una planta. Ambos participantes de la relación obtienen beneficios. Por un lado, la planta recibe principalmente nutrientes minerales y agua del hongo y el hongo obtiene de la planta hidratos de carbono y vitaminas que él por sí mismo es incapaz de sintetizar. Se estima que entre el 90 y el 95% de las plantas terrestres presentan asociaciones micorrícicas de forma habitual. Además, las micorrizas son comercialmente importantes debido a que con ellas se pueden producir inoculantes fúngicos, los cuales pueden ser utilizados como estrategia para una agricultura sustentable. Según su morfología, las micorrizas se dividen en distintos grupos entre los que cabe destacar dos: las ectomicorrizas y las endomicorrizas. - Ectomicorrizas: se caracterizan porque las hifas del hongo se desarrollan sobre y dentro de la raíz de la planta hospedadora. En este sentido, las hifas del hongo penetran intercelularmente (entre las células radicales) pero no lo hacen intracelularmente (en el interior celular). Las ectomicorrizas producen profundos cambios morfológicos en las raíces los cuales pueden ser observados a simple vista (las raíces son más cortas, bifurcadas en su extremo y presentan un manto blanquecino externo). Este tipo de micorrización es el que predomina entre los árboles de zonas templadas, siendo especialmente característico en árboles como hayas, robles, eucaliptus y pinos. Los hongos de este grupo pertenecen a los géneros Basidiomycota y Ascomycota (Fig.4). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 76 Figura 5. Estructuras características de ectomicorrizas - Endomicorrizas: las hifas se introducen inter e intracelularmente en la raíz de la planta, formando al ingresar dentro de las células estructuras características denominadas vesículas alimenticias y arbúsculos. Por ello, a este tipo de micorrizas también se las suele conocer con el nombre de micorrizas vesículoarbusculares o MVA. Las endomicorrizas no producen cambios morfológicos visibles a simple vista en las raíces que infectan. Los hongos de este grupo pertenecen a la división Glomeromycota y suelen presentar interacción con todo tipo de plantas, aunque con predominio de hierbas y gramíneas (Fig. 5). Figura 6. Estructuras características de endomicorrizas. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 77 Control de calidad de inoculantes formulados con MVA Actualmente la productividad de los cultivos depende en gran medida del suministro de fertilizantes e insecticidas. El uso creciente de agroquímicos y la contaminación ambiental asociada han llevado en los últimos años a la exploración de estrategias más sustentables desde el punto de vista medioambiental para mejorar la sanidad de los cultivos. Bajo esta premisa, existen a nivel global grandes restricciones en el uso de pesticidas químicos y una tendencia a utilizar métodos naturales u orgánicos. En este sentido, existe una amplia gama de microorganismos que pueden tener un efecto beneficioso sobre las plantas. Por un lado se encuentran los denominados Agentes de Control Biológico o Biocontroladores, los cuales ayudan a prevenir enfermedades o el daño causado por otros organismos. Otro grupo de hongos, los hongos formadores de micorrizas arbusculares, pertenecientes al Phylum Glomeromycota se constituyen en los hongos simbióticos dominantes, forman asociaciones simbióticas con la mayoría de las especies vegetales y se sabe que incrementan el status nutricional de las plantas, mejoran las relaciones hídricas y protegen a las plantas hospedadoras contra el ataque de patógenos. Estas interacciones se basan principalmente en la transferencia bidireccional de nutrientes entre ambos simbiontes. Uno de los beneficios importantes que las plantas obtienen de esta asociación es el incremento de la superficie de absorción, el total del volumen de suelo explorado por las raíces y la proporción de nutrientes absorbidos, principalmente de P. El efecto de la micorrización sobre el crecimiento de plantas es primariamente nutricional. El desarrollo de técnicas biotecnológicas aportará una solución de esta problemática, capaces de colaborar con las plantas para superar el estrés nutricional. En tal sentido los hongos micorrícicos participan en dicho efecto de un modo integral, abarcando la planta, el suelo y la interacción con otros microorganismos. Los beneficios de la inoculación con MVA repercuten en una reducción del aporte de fertilizantes y fitosanitarios, un ahorro del suministro del agua, un mayor crecimiento y producción de las plantas, una mayor supervivencia a las condiciones de estrés y un mejor aprovechamiento de los suelos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 78 Existen diferentes inoculantes de hongos formadores de MVA en el mercado que generan la necesidad de establecer estándares ampliamente aceptados para el control de calidad. Ello es relevante porque son organismos biotrófos, endosimbiontes obligados. El desarrollo de los inoculantes para MVA es una industria incipiente y su demanda proviene del hecho que las MVA son beneficiosas para el desarrollo y la salud de las plantas, para la recuperación de suelos, la biorremediación y la utilización de tecnologías alternativas a los agroquímicos y la producción sustentable. Actualmente, los inoculantes formulados a base de MVA se producen en parcelas inoculadas, en contenedores con diferentes sustratos y plantas. El desarrollo de la formulación consiste en colocar propágulos fúngicos (fragmentos de raíces colonizados de MVA, fragmentos de micelio fúngico y/o esporas, en un soporte como perlita, vermiculita, turba, arcilla inorgánica o arena).Se requieren protocolos básicos normalizados para determinar la eficiencia del inoculante a base de MVA y por ello se detallan las metodologías necesarias y adaptadas para el aislamiento y análisis de eficiencia del inoculante. La determinación de la abundancia de esporas por la técnica del gradiente de sacarosa y la tinción vital de las esporas y raíces son utilizadas para registrar el estado fisiológico de los hongos. Tinción para endomicorrizas Tratamiento de las raíces: ▪ Lavar las raíces con agua corriente, colocar en los tubos KOH hasta cubrir las raíces. Colocar los tubos en una gradilla. Llevar a baño térmico a 80°C durante 20 minutos. ▪ Lavado: eliminar el KOH y lavar las raíces con abundante agua. ▪ Neutralización: sumergir las raíces en HCl 0,1 N y dejar en reposo durante 20 minutos a temperatura ambiente. ▪ Coloración: eliminar el HCl y añadir azul de anilina o tripán al 0,05 % en ácido láctico. Calentar a 90 °C durante 20 minutos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 79 Preparación de los preparados: Se procede a montar las raíces a los porta objetos (10 raíces por porta ubicadas verticalmente) y se les coloca una gota de PVLG para fijar el cubreobjetos. Se los cubre con cubre objeto y se los pone a secar en estufa a 40-60 °C 2-3 días. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 80 TRABAJO PRÁCTICO MICORRIZAS Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1. Observación microscópica de endomicorrizas (Fig. 6). - Realizar la observación en microscopio óptico de diferentes estructuras: hifas, vesículas y arbúsculos de endomicorrizas 2. Observación de estructuras de ectomicorrizas - Observar raíces de pino bajo lupa (Fig. 7). Figura 7. Estructuras correspondientes a endomicorrizas en raíces de Soja (Glicine max). Fotos gentileza de la Ing. Agr. Dra. Soraya Salloum. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 81 Figura 8. Ectomicorrizas en pino. En la figura de la izquierda se observa fácilmente el manto blanquecino formado por las hifas de las ectomicorrizas y en la imagen de la derecha se observa el engrosamiento y acortamiento de las raíces, sumado a la bifurcación de las mismas en los extremos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 82 TRABAJO PRÁCTICO N°8: EVALUACIÓN DE INOCULACIÓN A CAMPO Objetivos: • Realizar la observación y medición de los parámetros de crecimiento y desarrollo del cultivo de garbanzo. • Evaluar la eficiencia de la inoculación: Determinar infectividad y efectividad. • Adquirir habilidades y/o destrezas en la medición de parámetros de crecimiento y nodulación del cultivo. • Adquirir los conocimientos necesarios para la elaboración de tablas para el análisis de los datos recopilados. • Realizar el análisis estadístico de los datos y la interpretación de los resultados obtenidos. • Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. INTRODUCCIÓN Las leguminosas son cultivos cuyas necesidades de nitrógeno (N) son sumamente altas. Algunas leguminosas que cobran importancia en nuestro país son: soja, garbanzo, alfalfa, maní, etc. Por ejemplo, el cultivo de soja puede necesitar cuatro veces más de N que un cultivo de maíz por cada tonelada producida. Para lograr este objetivo, la leguminosa tiene la habilidad de asociarse en forma simbiótica con bacterias fijadoras de N, genéricamente denominadas rizobios y obtener, a través de la Fijación Biológica de Nitrógeno (FBN), gran parte del N que requiere para su crecimiento. La técnica de inoculación se utiliza para agregar sobre la semilla o el suelo cepas de rizobios (bacterias), seleccionadas, las cuales deben estar vivas y ser infectivas, efectivas y eficientes a la hora de fijar N. Para logar una respuesta esperada en la FBN, las cepas aplicadas con sus respectivas características no son el único factor determinante, sino que también, debemos pensar que el cultivo debe estar en adecuadas condiciones sanitarias y nutricionales. La fertilización biológica (inoculación), no se debe realizar con el único fin de obtener más rendimiento en los cultivos, sino como una manera de Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 83 contribuir a un menor agregado de fertilizantes nitrogenados al suelo, disminuyendo la contaminación ambiental. La práctica de inoculación data de miles de años ya que existe evidencia en Egipto y otros lugares de haberse encontrado semillas tratadas, ya sea como ofrenda o para uso agrícola. En Argentina la difusión de la práctica de inoculación comenzó en el año 1939 con cepas importadas (principalmente de EEUU) y en 1957 se inauguró la primera fábrica de inoculantes del país. La práctica de inoculación fue asociada rápidamente por los productores en el país y creció en forma exponencial con el avance del cultivo de soja Fertilizantes biológicos (inoculantes) Si bien existen en el suelo rizobacterias nativas capaces de infectar las semillas sembradas de leguminosas, la utilización de inoculantes de concentración inicial adecuada bacterias, pureza de la cepa y en algunos casos aditivos especiales son fundamentales para lograr el éxito de la técnica de inoculación. Los parámetros para evaluar la inoculación a campo son: • Número de nódulos sobre la raíz principal. • Número de nódulos sobre raíces laterales. • Porcentaje de nódulos funcionales. • Peso de nódulos. • Longitud de raíz • Altura de planta. • Diámetro de tallo. • Altura de inserción de la primera vaina. • Número de vainas por planta Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 84 TRABAJO DE LABORATORIO Se trabajará sobre un cultivo de garbanzo cultivar Felipe, sembrado en el campo escuela de la FCA-UNC. Se aplicaron 6 tratamientos, un testigo sin inocular y se inoculó con 4 cepas PGPR, Trichoderma spp., Bacillus spp., Pseudomonas spp. y Mezorhizobium ciceri: Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: Descalzar con una pala (cuidando de no romper en demasía las raíces) las 10 plantas a las que les hicieron el seguimiento. Guardar las mismas en una bolsa identificadas con su número y llevar al laboratorio. Lavar con sumo cuidado las raíces de cada planta sin perder nódulos ni la identificación de las mismas y luego proceder a determinar y medir los siguientes parámetros con el instrumental que le provea el docente: 1. Evaluación de parámetros de nodulación. - Número de nódulos sobre la raíz principal. - Número de nódulos sobre raíces laterales. - Porcentaje de nódulos funcionales: realizando cortes transversales sobre los mismos y observando una coloración rojiza. - Peso de nódulos. 2. Evaluación de parámetros de crecimiento: - Longitud de raíz: se mide desde el cuello de la raíz hasta el meristema radical. - Altura de planta: se mide desde la superficie del suelo hasta el ápice de la planta, sin estirar las ramas. - Diámetro de tallo: se mide con un calibre a un tercio de la base del tallo. - Altura de inserción de la primera vaina: medida desde la superficie del suelo hasta el punto de inserción de la primera vaina. - Número de vainas por planta: se debe contar el número total de vainas presentes en la planta. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 85 3. Análisis de los datos registrados Con los datos obtenidos en la comisión, cada grupo deberá realizar un análisis estadístico utilizando el programa InfoStat y elaborará un informe. Actividades a realizar: - Realizar una tabla en Excel con los datos recopilados y copiarla en Infostat. - Realizar un ANOVA utilizando un comparador de medias (LSD Fisher, DGC, etc.) y obtener medidas resumen (Medias y desvíos estándar). - Con los datos obtenidos realizar tablas y gráficos. Cultivar Tratamiento Repetición % Nodulos Peso de N° de N° de Nodulos RP Nodulos RL Funcionales Nodulos Longitud de Altura de Diametro Altura 1° de Tallo Vaina Planta Raíz Vainas/ Planta Peso de Vainas N°Granos Peso de Granos Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 86 Tabla1. Datos recopilados actividad de campo. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 87 TRABAJO PRÁCTICO N° 9: CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS Y AGUA Objetivos: • Incorporar conocimientos generales sobre los posibles contaminantes en alimentos y agua. • Conocer los parámetros microbiológicos que deben reunir los alimentos y el agua para ser consumidos y/o utilizados. • Conocer la metodología analítica disponible para realizar el control de calidad de alimentos y agua. • Adquirir habilidades y/o destrezas para evaluar la calidad sanitaria de muestras de alimentos y agua. • Valorar la responsabilidad, interacción, cooperación y respeto para fomentar una eficiente labor grupal. CONTROL DE CALIDAD DE ALIMENTOS Introducción El control de la inocuidad y la calidad de los alimentos forma parte de programas nacionales en todos los países. Los sistemas nacionales de control de los alimentos están destinados a proteger la salud y el bienestar de los consumidores, promover el comercio de los alimentos y de los productos alimenticios. Se da prioridad a la prevención de los riesgos químicos y biológicos derivados de la contaminación, la adulteración, manejo inadecuado y al control de calidad de los alimentos antes de ser consumidos. Para realizar el control, los países disponen de diversos laboratorios que pueden realizar análisis organolépticos, físico-químicos y microbiológicos de los alimentos. El análisis microbiológico de los alimentos tiene dos finalidades: por un lado, comprobar la calidad microbiológica del alimento o de las prácticas de Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 88 elaboración del mismo y por otro, comprobar la aceptabilidad de estos en el mercado nacional o internacional. En general, la finalidad principal del análisis no solo es detectar la presencia de microorganismos patógenos sino comprobar que la probabilidad de la presencia de patógenos en el alimento sea aceptablemente baja. Cada tipo de alimento se deteriora por acción de un tipo de microorganismo concreto ya que cada asociación es alimento-microorganismo específica. De esta manera, de todos los microorganismos presentes en un alimento, solo algunos son capaces de multiplicarse activamente sobre el mismo resultando seleccionados. Existe una serie de factores intrínsecos o extrínsecos al alimento que dirigen esta selección: actividad del agua (aw), pH, potencial redox, nutrientes, agentes antimicrobianos, composición química del alimento, tratamientos tecnológicos que modifican flora inicial, condiciones físicas del ambiente y las relaciones entre los microorganismos establecidas como consecuencia de estos factores. Estos parámetros condicionan la resistencia a la colonización que posee un alimento. Desde el punto de vista sanitario, el control de la inocuidad de los alimentos es importante, debido a que pueden ser vehículos de infecciones (por ingestión de microorganismos patógenos) o de intoxicaciones (por ingestión de toxinas producidas por microorganismos). En este sentido, muchas veces la causa de la contaminación del alimento se debe a medidas higiénicas inadecuadas realizadas durante la producción, preparación y conservación; lo que facilita la presencia y el desarrollo de microorganismos. En el caso de alimentos que son parte de cadenas productivas, la evaluación que se hace de su inocuidad y aptitud para el consumo es a través del cumplimiento de diversos criterios microbiológicos designados para el producto en cuestión. Estos criterios pueden referirse a la demostración de la aplicación de Buenas Prácticas de Manufactura (BPM) o a la ausencia de patógenos. Los métodos de laboratorio utilizados para la detección o recuento de microorganismos forman parte del criterio microbiológico. La elección del método a utilizar debe privilegiar a aquellas técnicas estandarizadas y de alta sensibilidad que hayan sido validadas por organismos internacionales o nacionales. En nuestro país la normativa de referencia para todos los alimentos Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 89 comercializados es el Código Alimentario Argentino (CAA). En el CAA se establecen los valores de referencia y los límites máximos de microorganismos permitidos para cada alimento. En los últimos años existieron avances significativos en el desarrollo de nuevas tecnologías para la detección y la separación de microorganismos de los alimentos. El desarrollo de técnicas moleculares (PCR) e inmunológicas (ELISA) brinda ventajas sobre los métodos tradicionales, específicamente en lo que refiere a velocidad, pero debido a los altos costos su uso todavía no se ha generalizado. Microorganismos más buscados en alimentos Como se mencionó anteriormente, dependiendo del alimento a controlar, se buscan distintos tipos o grupos microbianos. A continuación, sólo señalaremos algunos de los más relevantes: a) Microorganismos mesófilos totales b) Mohos y levaduras c) Staphylococcus aureus coagulasa positiva d) Salmonella spp. e) Coliformes f) Escherichia coli a) Recuento de microorganismos mesófilos totales En este grupo se incluyen todos los microorganismos, capaces de desarrollar en presencia de oxígeno a una temperatura comprendida entre 20°C y 45°C con una temperatura óptima entre 30ºC y 40ºC. El recuento de microorganismos aerobios mesófilos estima la microflora total sin especificar tipos de microorganismos. La determinación de este grupo nos da idea de la calidad del alimento, de la materia prima y del proceso de elaboración del producto. Recuentos altos pueden indicar un proceso de alteración del alimento, sin embargo, un recuento bajo de aerobios mesófilos no implica o no asegura la ausencia de patógenos o sus toxinas. Asimismo, recuento elevado no significa Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 90 la presencia de microorganismos patógenos. Ahora bien, salvo en alimentos obtenidos por fermentación, no son recomendables recuentos elevados, ya que tasas superiores a 105-107 de microorganismos por mL o gramo de alimento suelen ser considerados como indicadores de inicio de descomposición. Este grupo es un indicador importante en alimentos frescos, refrigerados y congelados, en lácteos y en alimentos listos para consumir. Se determina mediante recuento en medio sólido por el método de inmersión o embebido utilizando el medio PCA (Agar plate count) e incubando la muestra en aerobiosis a 28-30°C por 48 hs (Fig. 1). Otra opción es realizar recuento mediante conteo en medio sólido por el método de superficie utilizando el medio PCA (Agar plate count) e incubando la muestra en aerobiosis a 28-30°C por 24 horas. Se cuentan como máximo 300 colonias por placa. Figura 1. Bacterias mesófilas creciendo en Agar PCA. b) Recuento de mohos y levaduras Los hongos son microorganismos aerobios estrictos, eucariotas, característicamente miceliares, y con metabolismo quimio-organo-heterótrofo. Dependiendo de la especie suelen desarrollar en un rango de pH de 2 a 9, temperaturas entre 10 a 35ºC y pueden crecer en condiciones de actividad de agua (aw) relativamente bajas, aunque las levaduras generalmente requieren una mayor actividad de agua. Comúnmente se da el nombre de mohos a ciertos hongos multicelulares filamentosos, microscópicos, y cuyo crecimiento en los alimentos se observa fácilmente por su aspecto aterciopelado o algodonoso. Las levaduras son hongos que crecen generalmente en forma de agregados sueltos de células independientes, que pueden ser globosas, ovoides, piriformes, alargadas o casi cilíndricas. Cuando crecen sobre medios Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 91 sólidos, forman colonias de aspecto característico que recuerdan a algunas colonias bacterianas (pequeñas, blancas y cremosas). En casi todas las especies de interés industrial, el modo habitual de reproducción vegetativa es por gemación. Se investiga la presencia de hongos, mohos y levaduras por la capacidad de estos organismos producir diferentes grados de deterioro y descomposición en los alimentos. Además, los hongos son potencialmente productores de metabolitos tóxicos conocidos como micotoxinas, compuestos estables que no se destruyen durante el procesamiento de alimentos, por lo que son responsables de intoxicaciones con consecuencias graves en los órganos afectados. También, los hongos están asociados a reacciones alérgicas e infecciones sobre todo en la población inmunocomprometida, en ancianos y niños. Para su determinación, se utiliza habitualmente el medio diferencial YGC (Agar extracto de levadura-glucosa) que lleva incorporado el antibiótico cloranfenicol, el cual inhibe de forma eficaz el crecimiento bacteriano. Se realiza recuento en medio sólido por el método de superficie incubando la muestra en aerobiosis a 20-25°C por 48 horas (recuento de levaduras) y 5 días (recuento de mohos y hongos) (Fig. 2A y 2B). Se cuentan como máximo 150 colonias por placa. A B Figura 2. Agar YGC. A. Colonias de levaduras (blancas y cremosas). B. Colonias de mohos y hongos. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 92 c) Determinación de Staphylococcus aureus coagulasa positiva Las bacterias del género Staphylococcus se caracterizan por ser cocos Grampositivos, que se encuentran aislados, en pares, tétradas o formando racimos irregulares (término derivado del griego staphylé: racimo de uva). Son inmóviles, anaerobios facultativos y no formadores de esporas. Este género incluye al menos 40 especies, siendo la mayoría inofensivos, residiendo normalmente en las mucosas, fosas nasales, vías respiratorias superiores y en la piel de los seres humanos y otros organismos. De estas especies, Staphylococcus aureus es el principal responsable de la intoxicación alimentaria estafilocócica, ya que produce una amplia gama de toxinas. Se los busca como indicadores en alimentos cocidos, en productos que son sometidos a manipulación excesiva durante su preparación y en aquellos alimentos que son sometidos a manipulación después del proceso térmico. Generalmente, los estafilococos se eliminan durante la cocción, sin embargo, altos recuentos en alimentos sometidos a procesos térmicos pueden deberse a contaminación posterior por manipulación, contacto con equipos o aire contaminados y/o conservación inadecuada (como, por ejemplo, falta de refrigeración). Los animales también son una fuente importante de infección; se destaca la mastitis en los bovinos y ovinos que puede determinar en la contaminación de la leche. La presencia de este microorganismo en cuero, plumas y piel de animales es habitual, por lo tanto, la contaminación de las carcasas de los animales a veces es inevitable. El análisis de S. aureus coagulasa positiva puede realizarse con medio de cultivo Agar Baird Parker o Agar manitol salado. En medio Agar manitol salado, el hidrato de carbono fermentable es el manitol. El cloruro de sodio que se encuentra en alta concentración en el medio es el agente selectivo que inhibe el desarrollo de la flora acompañante y el rojo de fenol es el indicador de viraje del pH. Este es un medio altamente selectivo por la alta concentración salina y diferencial debido a la capacidad de las bacterias para fermentar el manitol. Las bacterias que crecen en este medio con alta concentración salina y que fermentan el manitol, producen ácidos, por lo que se acidifica el medio y se Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 93 produce el viraje de color: de rojo a amarillo. Los estafilococos crecen en altas concentraciones de sal y pueden fermentar o nó el manitol. Los estafilococos coagulasa positiva fermentan el manitol y se visualizan como colonias amarillas rodadas de una zona del mismo color (Fig. 3A). Aquellos estafilococos que no fermentan el manitol se visualizan como colonias rojas, rodeadas del mismo color o púrpuras (Fig. 3B). Habitualmente, la determinación se realiza mediante siembra por agotamiento en medio sólido y posterior incubación en aerobiosis a 35-37 °C durante 48 hs. Se deben realizan pruebas posteriores a las colonias sospechosas de S. aureus cogulasa positiva crecidas en Agar manitol salado para determinar efectivamente la presencia de la enzima (prueba de coagulasa). A B Figura 3. Agar manitol salado. A. Staphylococcus aureus coagulasa positiva (fermentan manitol y producen ácidos). B. Staphylococcus epidermidis (no fermentan manitol). d) Determinación de Salmonella spp. El género Salmonella pertenece a la familia Enterobacteriaceae. Son bacilos Gram-negativos, anaerobios facultativos, no formadores de esporas, y generalmente móviles. Son viables en diferentes condiciones ambientales, sobreviven a la refrigeración y congelación y mueren por calentamiento (mayor a los 70°C). Se trata de enterobacterias patógenas causante de importantes trastornos gastrointestinales en humanos, por lo que resulta de interés su investigación en los alimentos. La salmonelosis es considerada una zoonosis de distribución mundial y de origen alimentario. La vía de transmisión es fecal-oral a través de alimentos y agua contaminada con heces humanas o animales, Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 94 materiales y utensilios de cocina contaminados o por contacto directo de persona a persona. Los principales reservorios de Salmonella son las aves de corral, el ganado bovino y el porcino. Por lo tanto, la transmisión del patógeno se lleva a cabo por ingestión de alimentos (especialmente pollos, carne, huevos y productos lácteos), mediante los manipuladores de alimentos como portadores y también se han identificado como fuentes de infección los vegetales frescos consumidos crudos en ensaladas y los eventos de contaminación cruzada. La legislación actual no admite la presencia de esta bacteria en los alimentos, por lo que se lleva a cabo un análisis de su presencia en medios Agar Salmonella-Shigella (SS) contiene sales biliares y verde brillante que inhiben el crecimiento de la mayoría de los microorganismos Gram-positivos y de algunas coliformes. La lactosa es el hidrato de carbono fermentable, y el tiosulfato de sodio presente en el medio permite la formación de SH2 que se evidencia por la producción de sulfuro de hierro. El indicador de pH es el rojo neutro. Los microrganismos fermentadores de lactosa capaces de desarrollar acidifican el medio haciendo virar al rojo al indicador de pH, obteniéndose colonias rosadas o rojas sobre fondo rojizo. Salmonella crece adecuadamente en el medio y produce colonias transparentes. La producción de SH2 se evidencia como colonias con centro negro debido a la formación de sulfuro de hierro. En resumen, las bacterias del género Salmonella crecen como colonias transparentes, delicadas y con centro negro (Fig. 4B). El medio Agar Hektoen contiene lactosa, salicina y sacarosa como hidratos de carbono fermentables. Las sales biliares que contiene este medio inhiben el desarrollo de la mayoría de las bacterias Gram-positivas y de algunas coliformes. El azul de bromotinol y la fucsina ácida son los indicadores de la fermentación de los hidratos de carbono, mientras que el citrato de hierro actúa como indicador de la formación de SH2 (color negro). Las colonias sospechosas de Salmonella spp. que crecen sobre este medio son colonias transparentes y generalmente con centro negro (Fig. 4A). Ambos medios se siembran por agotamiento en medio sólido y se incuban durante 24 h a 35-37°C. Luego, las colonias consideradas como sospechosas en cada uno de los medios deben ser re-aisladas y confirmadas en primera instancia mediante pruebas bioquímicas y luego en una segunda instancia mediante pruebas serológicas o moleculares. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 95 A B Figura 4. Medios de cultivo selectivos y diferenciales para la detección de Salmonella spp. A. Salmonella spp. en medio Agar Hektoen (colonias transparentes con centro negro). B. Salmonella spp. en medio Agar SS (colonias transparentes con centro negro). e) Recuento de Coliformes Las coliformes son bacterias de forma bacilar, gram negativas, no esporuladas pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa en 48 horas en presencia de sales biliares. Este grupo incluye a bacterias tales como de los géneros Klebsiellla, Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, entre otros. No todas las bacterias pertenecientes a este grupo tienen necesariamente origen intestinal, por lo cual su presencia en los alimentos no significa necesariamente que hubo una contaminación fecal o que hay patógenos entéricos presentes. Generalmente, en la leche cruda, vegetales, carne, aves y otros alimentos crudos se encuentran recuentos bajos de bacterias coliformes naturalmente por lo que presentan poco o ningún valor para el monitoreo de los mismos. Son microorganismos que se eliminan fácilmente por tratamiento térmico. La presencia de este grupo en los alimentos indica: -Contaminación post-proceso térmico o tratamiento térmico deficiente. - Fallas (ausencia o deficiencia) en la refrigeración post-cocción. - Deficientes prácticas de sanitización de superficies inertes. - Proceso de desinfección deficiente o inadecuado de frutas, verduras y legumbres. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 96 Los coliformes se estresan subletalmente por congelación, por lo que el recuento de coliformes en alimentos freezados debe ser interpretado con cuidado. El uso del recuento de coliformes como indicador requiere un conocimiento amplio del proceso que el alimento ha sufrido (producción, procesamiento, distribución, etc.) y del efecto que él ha tenido en las bacterias coliformes. La metodología utilizada para el recuento de los microorganismos coliformes se basa en el uso del método del Número más Probable (NMP). El número de diluciones utilizadas dependerá del grado de contaminación del alimento y/o de los estándares microbiológicos establecidos. Dentro de este grupo se encuentran las coliformes totales y las coliformes fecales. ✓ Coliformes totales: este grupo está integrado principalmente por los siguientes géneros de bacterias: Enterobacter, Escherichia, Citrobacter, Klebsiella, además de algunas cepas de Serratia. Todas son anaeróbicas facultativas, pueden existir como saprofitas independientemente o como microorganismos intestinales, excepto el género Escherichia cuyo origen es sólo fecal. Si bien el hábitat natural de los coliformes es el tracto intestinal humano y animal, las coliformes totales también se pueden aislar de muestras medioambientales (tierra, polvo, aguas superficiales y vegetales). Así, su procedencia puede ser tanto fecal como no fecal, por lo tanto, la presencia de coliformes totales en muestras de alimentos sólo indica existencia de contaminación, sin asegurar su origen. Metabólicamente, estas bacterias se caracterizan por su capacidad de fermentar lactosa a 35-37°C con producción de ácido y gas. Si bien existen varios métodos para determinar coliformes, uno de los más utilizados es el método británico por recuento en medio sólido (NMP) en medio de cultivo Mac Conkey. En el caldo Mac Conkey la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora Gram-positiva, y el púrpura de bromocresol es el indicador de pH. El indicador vira hacia amarillo a pH ácido cuando la lactosa es fermentada (Fig. 5). Los tubos utilizados deben contener una campana de Durham para evaluar la producción de gas (Fig. 5). En resumen, las coliformes totales se incuban en aerobiosis a 35-37°C durante 48 hs. Una vez que los tubos son incubados se debe realizar la lectura: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 97 Interpretación de la lectura de los tubos: - Positivos: tubos en los que simultáneamente se observa viraje del indicador al amarillo y la producción de gas en la campana de Durham. - Negativos: tubos sin viraje del medio de cultivo o sin la presencia de gas. Figura 5. Medio de cultivo Mac Conkey para la detección de bacterias coliformes. A la izquierda se observa un tubo positivo (fermentación de la lactosa y producción de gas) y a la derecha un tubo negativo (lactosa no fermentada y no hay producción de gas). ✓ Coliformes fecales o termotolerantes: este grupo es de origen exclusivamente intestinal (su hábitat es el intestino de aves y mamíferos) y presentan además de la capacidad de fermentar lactosa tanto a 35-37°C como a 44-45°C. La especie predominante en este grupo es Escherichia coli. Al estar presentes en el intestino, la presencia de coliformes fecales en alimentos indica contaminación de origen exclusivamente fecal, indicando la posible presencia de otros microorganismos patógenos de origen intestinal. Para su detección y a partir de los tubos positivos para coliformes totales, los microrganismos se repican con un ansa y se siembran en condiciones de asepsia; según la técnica del NMP en medio líquido Mac Conkey (producción de ácido y gas). En este caso, los tubos se incuban en aerobiosis a 44-45°C por 48 hs y se realiza la lectura de los mismos: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 98 Interpretación de la lectura de los tubos: - Positivos: tubos en los que simultáneamente se observa viraje del indicador al amarillo y la producción de gas en la campana de Durham. - Negativos: tubos sin viraje del medio de cultivo o sin la presencia de gas. ✓ Presencia-ausencia de Escherichia coli: la contaminación de alimentos con E. coli implica el riesgo de que puedan encontrarse en el mismo patógenos entéricos que constituyan un riesgo para la salud. Sin embargo, la ausencia de E. coli no asegura la ausencia de patógenos entéricos. Esta bacteria, habitante normal del intestino humano, es utilizada como indicador de contaminación fecal en diversos tipos de alimentos. En muchos productos crudos de origen animal, bajos recuentos de E. coli pueden ser esperados dada la asociación cercana de estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de la contaminación de las carcasas, reses, etc., con materia fecal animal durante la faena. E. coli se puede eliminar fácilmente mediante procesos térmicos, por consiguiente, la presencia de la misma en un alimento sometido a temperaturas elevadas significa un proceso deficiente o lo que es más común, una contaminación posterior al proceso atribuible al equipo, manipuladores o contaminación cruzada. Las cepas patógenas de E. coli causan infecciones del tracto intestinal (generalmente agudas y no presentan mayores complicaciones, excepto en niños y adultos con deficiencias nutricionales o inmunosupresión). Sin embargo, es importante destacar que algunas cepas de E. coli tienen importante poder patogénico. Escherichia coli productor de toxina Shiga (serotipo O157:H7), es un patógeno emergente asociado a casos de diarrea, colitis hemorrágica, síndrome urémico hemolítico (SUH) y trastornos de coagulación en seres humanos. El SUH afecta particularmente a niños, ancianos y aquellos que, por padecer otras enfermedades, tengan su sistema inmunológico deprimido. Los rumiantes en general y el ganado vacuno en particular, han sido señalados como los principales reservorios de E. coli O157:H7. La contaminación durante la faena es la ruta primaria que generalmente lleva a la contaminación de la carne picada de vacuno. La principal vía de transmisión son los alimentos contaminados como carne molida, productos cárnicos crudos o insuficientemente cocidos, embutidos fermentados, leche y jugos no pasteurizados, vegetales que se consumen crudos, etc. Otras formas de transmisión incluyen la contaminación cruzada Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 99 durante la preparación de alimentos, el contacto directo del hombre con los animales y de persona a persona por la ruta fecal-oral. En Argentina el SUH es endémico; siendo Argentina el país con mayor incidencia a nivel mundial. La enfermedad está distribuida en todo el país, pero la frecuencia es mayor en las provincias del centro y sur. La presencia de colonias sospechosas de E. coli se determina en medio sólido Agar EMB-Levine (inhibe el crecimiento de bacterias Gram-positivas y permite la diferenciación de bacterias fermentadoras y no fermentadoras de lactosa, dando lugar a colonias incoloras (no fermentadoras), y colonias de color azulado-negro con cierto brillo metálico, las fermentadoras), siendo las colonias presuntivas de E. coli de color negro con brillo verde metalizado (Fig. 6). Las colonias sospechosas en medio EMB-Levine deben ser re-aisladas y deben ser posteriormente confirmadas mediante pruebas bioquímicas o moleculares. Figura 6. Medio de cultivo Agar EMB-Levine. Se observan las colonias sospechosas de E. coli creciendo sobre el medio (color verde metalizado con centro negro). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 100 Muestreo y criterios para el análisis de alimentos Para analizar la calidad microbiológica de los alimentos, como se describió anteriormente, para cada alimento se deben evaluar distintos microrganismos o grupos microbianos en particular. Dichas normativas están contempladas en los diversos capítulos (alimentos cárnicos, azucarados, farináceos, lácteos, grasos, fermentados, etc.) que contiene el CAA. Para tomar la muestra se deben tener en cuanta ciertos recaudos (rotulado y recipiente estéril) y los planes de muestreo indicados por el CAA para cada alimento en particular. Planes de muestreo para análisis microbiológicos en alimentos El plan de muestreo es uno de los componentes del criterio microbiológico cuando se quiere analizar un alimento que no sea agua. El plan de muestreo se aplica para decidir, en base a criterios establecidos, la aceptación o el rechazo de un producto/lote. El plan de muestreo comprende: a) el procedimiento de toma de muestra y b) el criterio de decisión a aplicar en el lote de alimentos. Existen dos tipos de planes de muestreo reconocidos internacionalmente: el plan de dos clases y el de tres clases dependiendo de si se puede permitir o no la presencia de una muestra positiva en cualquier unidad de muestra. - Plan de muestreo de dos clases: los análisis microbiológicos tienen como objetivo comprobar la presencia o ausencia de un microorganismo en particular (generalmente evalúa patógenos). - Plan de muestreo de tres clases: este tipo de plan se divide la calidad del lote de alimentos en tres categorías o clases: aceptable, marginal aceptable o rechazable. Se utiliza generalmente con microorganismos indicadores. Criterios microbiológicos en alimentos En la República Argentina, el CAA establece dos categorías principales en cuanto a los criterios a seguir en la elaboración de patrones microbiológicos: - Criterio obligatorio: se utiliza para referirse a los microorganismos considerados patógenos y/o sus marcadores, considerados de importancia en salud pública y de acuerdo con la clase de alimento. En este caso su hallazgo constituye razón Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 101 suficiente para imputar la infracción y proceder en consecuencia, en forma preventiva o represiva, imponiendo las sanciones que correspondan. - Criterio complementario (recomendatorio): a diferencia del anterior es el criterio relativo a la evaluación del proceso tecnológico utilizado para la obtención de un producto. Puede orientar al fabricante, aconsejarlo acerca de puntos sin control, y su seguimiento permitirá inferir o determinar la “falla”, que se demuestra en los protocolos analíticos. No tiene por finalidad la inspección final, con lo que se indica que de su incumplimiento no derivarán sanciones. Ejemplos de normativas y criterios microbiológicos establecidos por el CAA para algunos alimentos Tabla 1: Normas y criterios para alimentos cárnicos (carne picada fresca) según CAA. Criterio Obligatorio: Determinaciones Límites Escherichia coli O157:H7 Ausencia/ 65g Salmonella spp. Ausencia/ 10 g Criterio complementario: Determinación Límites Recuento de Aerobios Mesófilos /g 107 Recuento de Escherichia coli /g 500 Recuento de Staphylococcus aureus coagulasa positiva /g 1000 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 102 Tabla 2: Normas y criterios microbiológicos para hortalizas Determinación Valores límites permitidos Hortalizas y verduras frescas Vegetales E. coli Salmonella spp. E. coli O157:H7 100/g Ausente en 25 g Ausente en 25 g <0.3/g Ausente en 25 g Ausente en 25 g mínimamente procesados (envasados y listos para consumir) Leche Según el Código Alimentario Argentino en su artículo 554 - (Res 22, 30.01.95) establece que: "Con la denominación de Leche sin calificativo alguno, se entiende el producto obtenido por el ordeño total e ininterrumpido, en condiciones de higiene, de la vaca lechera en buen estado de salud y alimentación, proveniente de tambos inscriptos y habilitados por la Autoridad Sanitaria Bromatológica Jurisdiccional y sin aditivos de ninguna especie. La leche proveniente de otros animales deberá denominarse con el nombre de la especie producto”. La composición química global de la leche vacuna se resume en la Tabla 3. Tabla 3. Composición química global de la leche vacuna. Componente Raza Holando Argentino (g/100 mL) Agua 87,8 Grasa 3,1 Proteínas 3,5 Lactosa 4,7 Sales minerales 0,7 Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 103 Los microorganismos presentes en la leche pueden alterar las características físico-químicas, organolépticas y nutricionales de la misma. Además, ciertos microorganismos o sus toxinas pueden generar riesgos para la salud, siendo por lo tanto deseable que la leche cruda contenga una baja carga microbiana. La microbiota inicial de la leche puede provenir de diferentes sitios como: 1. El interior de la ubre: En animales sanos, el tejido secretor de la ubre está libre de microorganismos. Sin embargo, en la membrana de la mucosa del canal del pezón podrían estar presente estreptococos, estafilococos, micrococos, coliformes y bacterias ácido-lácticas. Estos microorganismos pasan a la leche en una concentración aproximada de 102 a 104 UFC/mL. Ante procesos inflamatorios en la ubre, como la mastitis, los microorganismos más frecuentemente implicados son: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis, Corynebacterium bovis, etc. Esta enfermedad se caracteriza por cambios patológicos en el tejido glandular de la ubre que afectan la cantidad de leche producida, así como su calidad, causando cambios físicos, químicos y bacteriológicos en la misma. Además, residuos de antibióticos utilizados para su control pueden pasar a la leche representando un peligro potencial para la salud del consumidor y afectando la obtención de productos lácteos fermentados y quesos. Los rumiantes pueden estar infectados con agentes zoonóticos, que luego son eliminados en la leche. Los de mayor incidencia son Mycobacterium bovis, causante de tuberculosis y Brucella abortus, agente causal de la brucelosis. En nuestro país es obligatorio realizar un plan de sanidad riguroso para obtener el certificado de “Rodeo libre de brucelosis y tuberculosis”. 2. La superficie de la ubre y los pezones: (deben estar limpios al momento del ordeñe). 3. El equipo de ordeñe. 4. El medio ambiente (el agua que se utiliza para limpieza de pezones etc. debe ser potable). Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 104 La leche luego de ser tratada (seleccionada, higienizada por medios mecánicos, estandarizada según su contenido de materia grasa, homogeneizada, tratada térmicamente, enfriada, envasada y conservada a baja temperatura) debe además estar exenta de patógenos. Métodos indirectos para evaluar la calidad de la leche Existen métodos indirectos y directos para evaluar la calidad microbiológica de la leche. Los métodos indirectos estiman la carga microbiana, ya que evalúan propiedades físico-químicas de la leche que pueden ser modificadas por los microorganismos que la contaminan. Estos métodos son simples y rápidos por lo que se suelen realizar en el tambo para evaluar la calidad de la leche “in situ”: - Prueba de Acidimetría: la acidez de la leche aumenta cuando hay producción de ácido láctico como consecuencia de la fermentación microbiana de la lactosa. Este parámetro es por lo tanto utilizado como una medida indirecta de la calidad higiénico-sanitaria tanto de la leche cruda como de aquella tratada térmicamente. El método consiste en añadir 1,8 mL de NaOH 0,1 N a 10 mL de leche más 3 gotas de un indicador de pH como la fenoftaleína, si la leche permanece de color rosa es apta y si se decolora se encuentra ácida. - Prueba del alcohol: cuando se añade a la leche una cierta cantidad de alcohol etílico se produce una deshidratación, parcial o total, de ciertos coloides hidrófilos, que puede conducir a su desnaturalización, y con ello a la pérdida de su equilibrio y floculación. Este resultado sólo se alcanza con un cierto grado alcohólico de la mezcla final, por debajo del cual las leches térmicamente estables no floculan, mientras que la leche térmicamente inestable, flocula. Basándose en este principio se ha ideado un método simple que consiste en mezclar volúmenes iguales de leche cruda y de una solución acuosa de alcohol etílico de concentración conocida. La mezcla se agita en frío y se observa, si no se produce floculación alguna, la leche resistirá perfectamente el calentamiento correspondiente al grado de la solución alcohólica. Si se observa floculación, la leche no se mantendrá estable durante el calentamiento. Los factores que afectan esta prueba pueden ser divididos en tres grupos: Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 105 I. Leches con elevada carga bacteriana por falta de condiciones higiénicas o malas condiciones de refrigeración. II. Leches de composición anormal (ej. con exceso de albúminas). III. Leches con desequilibrio salino (por ejemplo, incremento de calcio iónico soluble a principios y finales de la lactancia). - Prueba de la reductasimetría: esta prueba se realiza como una medida de la población microbiana viable. Se determina el tiempo que tarda la leche a 37ºC, en convertir el colorante azul de metileno de su forma oxidada (azul) a su forma reducida (incolora). Se mide en forma indirecta, la población bacteriana de la leche capaz de crecer y consumir oxígeno disuelto en la misma, lo que disminuye el potencial de óxido-reducción de la mezcla causando la reducción del colorante. En caso de no producirse la decoloración debe sospecharse la presencia de inhibidores o conservantes, tales como: hipoclorito de sodio, ácido bórico, ácido salicílico, formol o agua oxigenada, cuyo uso está prohibido. Métodos directos para evaluar la calidad de la leche Las pruebas requeridas para garantizar la calidad microbiológica de la leche consisten en: a) el recuento de bacterias mesófilas totales, b) el recuento de bacterias coliformes, y c) la ausencia de Escherichia coli. Los límites en estos parámetros varían ligeramente entre los distintos tipos de leche. Tabla 4: Métodos directos que determinan la carga microbiana en la leche. Parámetro Límite máximo (*) Recuento Total a 30ºC (UFC/cm3) 200.000 Contenido de células somáticas (por cm3) 400.000 * Valor correspondiente a la media geométrica de los resultados de las muestras analizadas durante un período de tres meses, con al menos una muestra al mes, de la leche cruda en el momento de la recepción en el establecimiento de tratamiento térmico y/o transformación. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 106 Tabla 5: Métodos directos que determinan la carga microbiana en la leche ultrapasteurizada. Parámetro Recuento de mesófilos totales (UFC/cm3) Límite máximo (*) 10000 Recuento de coliformes totales <10 Recuento de coliformes fecales <10 CONTROL DE CALIDAD DE AGUA Introducción El agua para consumo humano es considerada un alimento esencial, sin embargo, según los diferentes usos que pueda tener el agua (riego, recreación, bebida animal, etc.) las normas establecen diferentes límites para la presencia de patógenos, siendo más restrictivas cuando el agua se utiliza para consumo humano. El análisis de la calidad microbiológica del agua es fundamental, ya que a través de ella se pueden transmitir numerosas enfermedades epidémicas. Si la calidad del agua no es buena, es decir, el número de patógenos o contaminantes excede los límites establecidos; puede provocar riesgos a la salud, restricción de la utilización en lugares de recreación y disminución de la utilización del recurso para usos productivos. Esto genera el aumento de gastos y costos para su utilización, porque es necesario realizar técnicas de purificación, que reduzcan la carga microbiana. Grupos de microorganismos buscados en agua a) Microorganismos mesófilos totales b) Coliformes c) Escherichia coli d) Pseudomonas aeruginosa (se busca solo en agua potable) Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 107 En muestras de agua los microrganismos mesófilos totales, coliformes totales y fecales y E. coli se determinan con los mismos métodos y medios de cultivos descriptos anteriormente para alimentos. a) Recuento de microorganismos mesófilos totales En muestras de agua, este parámetro se utiliza para evaluar la carga microbiana total que presenta el agua. El agua no tiene suficientes nutrientes como para actuar como medio de cultivo, por lo que la reproducción y supervivencia de microorganismos en el agua no contaminada es escasa. Por tal motivo, la presencia de alta cantidad de microorganismos siempre está asociada a una fuente externa de contaminación que aporta las fuentes carbonadas y nutricionales para el desarrollo de todo tipo de microorganismos incluso los patógenos. b y c) Bacterias coliformes y Escherichia coli Como se dijo anteriormente, las bacterias coliformes totales en gran número indican existencia de contaminación sin asegurar su origen, ya que su procedencia puede ser tanto fecal como no fecal. En agua potable y debido a que la cantidad de coliformes totales debe ser menor a 3 bacterias/100 mL (el CAA es muy restrictivo), se utiliza el método del NMP, pero los tres primeros tubos utilizados deben ser tubos de doble concentración (presentan el doble de concentración de nutrientes) (Tabla 6). Por otro lado, la presencia de coliformes fecales o termotolerantes en muestras de agua, indica contaminación de origen exclusivamente fecal, indicando la posible presencia de otros microorganismos patógenos. Escherichia coli en agua se utiliza como un indicador de contaminación fecal y reciente, ya que no vive mucho tiempo fuera del intestino debido a sus altos requerimientos nutricionales. Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 108 Tabla 6. Determinación de coliformes totales en agua mediante NMP. Número de tubos Volumen de la Volumen de Concentración del muestra medio medio 3 10 mL (100) 10 mL Doble 3 1 mL(100) 10 mL Simple 3 1 mL (10-1) 10 mL Simple d) Presencia-Ausencia de Pseudomonas aeruginosa Las Pseudomonas son bacterias muy comunes en napas freáticas debido a su versatilidad respecto a las fuentes de carbono (no fermentan glucosa) que pueden utilizar, su capacidad para formar biofilms y por sus bajos requerimientos nutricionales (quimio-organo-heterótrofos). Se trata de bacilos Gram-negativos que producen pigmentos y no forman esporas. Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista (muy importante en pacientes quemados) y un indicador por excelencia en agua. Por su relativa resistencia al cloro es considerado un indicador de la eficiencia de los procesos de cloración. Su presencia en sistemas de almacenamiento, tanque y cisternas responde a un estado deficiente de limpieza de dichas instalaciones. Para verificar su presencia se realiza siembra por agotamiento en dos medios de cultivo diferenciales: Agar King A o Agar P y Agar King B o Agar F. Estos medios de cultivo contienen glicerina lo cual favorece la producción de pigmentos por parte de la bacteria. En el medio King A, sales de magnesio y potasio incluidas en su formulación favorecen la producción de los pigmentos piocianina y piorrubina e inhiben la producción del pigmento fluoresceína. En este medio la bacteria Pseudomonas aeruginosa produce piocianina, lo cual se evidencia como una zona color azul-verdoso que rodea la colonia o se extiende por todo el medio debido a la difusión del pigmento (Fig. 7A). El medio King B contiene fosfato dipotásico el cual estimula la producción de fluoresceína e inhibe la producción de piocianina y piorrubina. La producción de fluoresceína se observa como un color amarillo-verdoso fluorescente cuando se ubican las placas incubadas bajo luz ultravioleta (Fig. 7B). Ambos medios de cultivo se incuban en aerobiosis a 28-30°C durante 24-48 hs para observar la Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 109 producción de los pigmentos. Las colonias presuntivas de Pseudomonas aeruginosa deben expresar los dos tipos de pigmentos en cada uno de los medios de cultivo utilizados para su detección (Fig. 7). Luego, si la expresión de ambos pigmentos es positiva, se debe realizar confirmación de las colonias presuntivas mediante la realización de pruebas bioquímicas. A B Figura 7. Medios de cultivo para la detección de Pseudomonas aeruginosa. A. Medio King A o Pseudomonas P (se observan las colonias rodeadas de color azul-verdoso). B. Medio King B o Pseudomonas F (se observan las colonias color amarillo-verdoso bajo luz ultravioleta). Instructivo para la toma de muestras de agua Antes de analizar el agua en el laboratorio, debemos tomar la muestra. Las muestras siempre deben ser homogéneas y representativas. Durante el proceso de extracción, se deben tomar todas las medidas de asepsia posibles, para evitar que se modifiquen a las propiedades del agua a analizar por la introducción en el recipiente de contaminantes externos. Para recolectar muestras de agua y poder realizar análisis microbiológicos se deben utilizar 2 recipientes estériles (se pueden conseguir en farmacias) y realizar la operación con el mayor cuidado y asepsia posible. En cambio, muestras de agua para análisis químicos, se deben tomar dos litros de agua en recipientes perfectamente limpios (para ello se puede lavar el recipiente con jabón o detergente, enjuagar varias veces con agua potable y por último enjuagar Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 110 con el agua a analizar). En este caso, los recipientes no necesariamente deben ser estériles y deben ser preferentemente de vidrio y con tapa hermética para impedir la salida del líquido o entrada de contaminantes. En ambos casos la muestra tiene que ser rotulada y enviada inmediatamente al laboratorio, de lo contrario debe mantenerse refrigerada (4-5 °C). Cuanto menor sea el tiempo transcurrido desde la toma de la muestra hasta el envío al laboratorio, más exacto serán los resultados obtenidos. - Toma de muestras para análisis microbiológicos desde un grifo situado en una cañería de agua corriente: previamente, limpiar la boca del grifo con un cepillo con detergente, cuidando de eliminar la suciedad que habitualmente se acumula en la parte interna del orificio. Después, dejar salir agua abundante durante 2 o 3 minutos y cerrar el grifo para esterilizarlo. El grifo se esteriliza quemando el alcohol previamente colocado con un algodón, tanto por la superficie externa, como por la superficie interna. Luego, abrir con cuidado (no tocando la boca del grifo) y dejar salir el agua durante un minuto hasta que se enfríe. Una vez que se ha enfriado el grifo y sosteniendo el recipiente estéril por la parte inferior, destapar cuidadosamente evitando el contacto de los dedos con la boca del recipiente, llenarlo y taparlo. Toma de muestras para análisis microbiológicos desde un grifo situado en una cañería de un pozo semisurgente: en este caso puede tratarse del grifo de una bomba accionada a mano, molino o bomba mecanica. Es importante cuando se examinan aguas provenientes de pozos, extraer muestras cuyas características bacteriológicas correspondan exactamente a las del agua del pozo, por ello conviene tomar las muestras de grifos que estén conectados directamente a las cañerías ascendentes del pozo. En caso contrario, el agua evaluada puede provenir de depósitos de reserva o antepozos que se pueden llegar a encontrar en malas condiciones de higiene, influyendo en los resultados del examen que no indicaran fielmente la calidad del agua. Para tomar las muestras se debe limpiar la boca del grifo eliminando toda la suciedad acumulada en su interior (con un cepillo con detergente). Si el pozo es de uso continuo, basta dejar correr el agua durante 30 minutos. En cambio, si el pozo está fuera de servicio o se utiliza muy poco, se debe dejar correr el agua durante 5 horas como mínimo Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 111 antes de tomar la muestra. Luego, se limpia la boca del grifo y se toma la muestra tal como se explicó en el punto anterior. Agua para consumo humano y otros usos Dentro del Capítulo XII del CAA, se encuentran todas las consideraciones referidas a las bebidas hídricas, agua y aguas gasificadas. En agua para consumo humano, el criterio microbiológico y los límites establecidos según el CAA se refieren a: recuento de bacterias mesófilas totales, recuento de bacterias coliformes totales, presencia/ausencia de Escherichia coli y de Pseudomonas aegurinosa (Tabla 7). En el caso del agua de efluentes, para riego o recreacional son otros los organismos que dictan las normativas y los microorganismos a evaluar (Tabla 7 y 8). Tabla 7: Normas de calidad de agua para consumo humano, uso recreacional y efluentes. CAA: Código Alimentario Argentino. NE: no especifica. EPA: Agencia de Protección Ambiental de los EE. UU. SRH: Subsecretaría de Recursos hídricos de la Provincia de Córdoba. Valores límites permitidos Mesófilos Coliformes Coliformes Pseudomonas totales totales fecales aeruginosa (Bac/100 mL) (Bac/100 mL) (UFC/mL) E. coli (Ausencia/ (Ausencia/ 100 mL) 100 mL) Agua potable 500 <3 NE Ausente Ausente 500 <3 NE Ausente Ausente NE NE NE NE 126 NE < 5000 <1000 NE NE (CAA) Agua envasada (CAA) Recreacional (EPA) Efluentes (SRH) Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 112 Tabla 8: Normas de calidad de agua para riego según la Organización Mundial de la Salud (OMS). Valores límites permitidos /100 mL Coliformes fecales E. coli <100 Ausente <1000 Ausente <1000 <1 Categoría A: riesgo para consumidores y trabajadores (cultivos hortícolas, campos de deportes y parques públicos) Categoría B: riesgo para trabajadores (cereales, forrajeras, árboles Categoría C: sin riesgo para consumidores ni trabajadores (forestaciones) Microbiología Agrícola – F.C.A. U.N.C - 113 TRABAJO DE LABORATORIO Cada grupo de alumnos deberá realizar las siguientes actividades: 1) Métodos indirectos para establecer calidad de la leche - A partir de muestras de leche provistas por el profesor, cada grupo deberá realizar las siguientes determinaciones: a) Prueba de acidimetría: Procedimiento: - Colocar 10 mL de leche en un tubo de ensayo. - Agregar 1,8 mL de solución Dornic (solución de NaOH 0,1 N). - Añadir 3 gotas de fenolftaleína. - Agitar suavemente. - Si se mantiene la tonalidad rosada, la leche es apta. Si se decolora rápidamente la leche se encuentra ácida. b) Prueba del alcohol: Procedimiento: - Colocar 2 mL de leche en un tubo de ensayo. - Agregar 2 mL de alcohol etílico al 70 % v/v. - Agitar suavemente. - Observar la presencia o ausencia de floculación, en caso positivo la leche no es térmicamente estable. 2) Observación de determinaciones realizadas en distintas muestras de agua - Cada grupo deberá realizar el recuento de bacterias mesófilas totales y coliformes totales a partir de los elementos provistos por el profesor. Además, deberán observa la presencia de E. coli y de Pseudomonas aeruginosa. Con los resultados obtenidos, cada grupo deberá comparar con normas de referencia para consumo humano de agua (CAA).
