ASPERGILOSIS Ivan

1-ASPERGILOSIS
Micosis causadas por hongos filamentosos del género Aspergillus. Pueden presentar
localización superficial (aspergilosis cutánea), frecuente en ciertos casos de
enfermedad sistémica grave y en quemados. Otras formas superficiales son las que
afectan a las uñas y el CAE (otomicosis aspergilar). La localización más importante,
por frecuencia y gravedad, corresponde a la aspergilosis sistémica, profunda o
invasiva, en la que el pulmón es el órgano afectado con mayor frecuencia. Existen
unos 200 taxones reconocidos para el género Aspergillus, de los que unas 20
especies son potencialmente patógenas humanas.
Las principales son A. fumigatus, A. flavus, A. niger, A. terreus, A. glaucus, A.
versicolor y A. nidulans.
1.2-DIAGNÓSTICO MICROBIOLÓGICO
El diagnóstico microbiológico de las aspergilosis presenta ciertas dificultades de
interpretación, pues aunque está basado, fundamentalmente, en la observación del
agente en las muestras clínicas y en el aislamiento en diferentes medios de cultivo,
cuenta con el inconveniente de que Aspergillus spp. puede ser un
contaminanteambiental o estar presente en las vías respiratorias sin producir
patología.
Recientemente la incorporación de técnicas que detectan ciertos marcadores
(antígenos de la pared) y especialmente la correlación del conjunto de resultados
microbiológicos obtenidos junto con las características de los pacientes implicados
(neutropénicos, inmunodeprimidos “oncológicos”, etc.) permiten realizar una excelente
aproximación diagnóstica, especialmente en los casos más graves, de aspergilosis
invasiva.
La aspergilosis invasivaes una de las complicaciones infecciosas más graves en
pacientes hematológicos. Sin embargo, el diagnóstico de certeza es difícil, ya que los
procedimientos invasores y la toma de biopsias pueden estar contraindicados por el
mal estado clínico o hematológico de los pacientes (insuficiencia respiratoria,
trombocitopenia grave,...). A su vez, el diagnóstico precoz es de capital importancia
para mejorar los resultados terapéuticos, por lo que la posibilidad de detectar con
rapidez el antígeno galactomanano de Aspergillus ha generado grandes
expectativas. Por todo ello, la detección de galactomanano en suero se está
generalizando como una herramienta útil en el diagnóstico precoz y en el seguimiento
de la aspergilosis invasora.
1.3-EXAMEN DIRECTO
La observación de filamentos fúngicos y ausencia de blastosporas en muestras
respiratorias de calidad, aunque no resulta específica de Aspergillus spp., puede
orientar hacia un diagnóstico de aspergilosis, especialmente en pacientes
neutropénicos. En cuanto a las muestras, resultan muy indicadas el lavado bronquial,
lavado bronco alveolar y cepillado bronquial y en menor medida, el esputo. La
demostración de filamentos puede realizarse por observación en fresco,
eventualmente añadiendo KOH o blanco de calcoflúor (microscopía de fluorescencia)
o bien sobre extensiones teñidas (Gram o Grocott). Por lo tanto, el examen directo con
KOH, blanco de calcoflúor o Gram permite un diagnóstico presuntivo rápido.
Conviene recordar que la presencia de hifas en estas muestras no es criterio suficiente
para establecer el diagnóstico de la enfermedad.
1.4-DETECCIÓN DE ANTÍGENO
La posibilidad de detectar algunos componentes de la pared del hongo en el suero del
enfermo mediante técnicas sensibles ha cambiado notablemente el panorama actual
en relación con el diagnóstico de la aspergilosis invasiva en determinados grupos de
pacientes, especialmente los hematológicos sometidos a trasplante de médula ósea
(altamente neutropénicos) y otros pacientes inmunodeprimidos. Los dos marcadores
más importantes disponibles son:
-EL GALACTOMANANO (antígeno galactomanano), un componente de la pared
celular de Aspergillus fumigatus que puede determinarse mediante una prueba
inmunoenzimática muy sensible que es capaz de detectar valores de hasta 0,5
microg/ml.
- EL (1-3)-BETA-D-GLUCANO, que a diferencia del anterior no resulta específico de
Aspergillus.
1.4.1-INTERPRETACION DE LOS RESULTADOS
En cualquier caso, para interpretar adecuadamente los resultados de estos
marcadores, y en especial del galactomanano, es importante tener presentes las
siguientes consideraciones:

El empleo más racional de estas determinaciones se enmarca en el
seguimiento sistemático del paciente durante el período más crítico de su




inmunodepresión. Se recomienda por ello la determinación bisemanal de
galactomanano, durante la fase más crítica de su enfermedad.
Un valor aislado positivo no debe ser interpretado como sinónimo de
aspergilosis invasiva. En este caso, conviene repetir la determinación.
La sospecha de aspergilosis invasiva guarda relación con la elevación
progresiva y mantenida de los valores de antígeno galactomanano, que
incluso tiene un cierto carácter anticipatorio a la clínica y a las pruebas de
imagen.
Aunque puede observarse una cierta tasa de resultados falsos-positivos, en
relación a diferentes situaciones, la prueba se caracteriza por presentar un
valor predictivo negativo (VPN) extraordinariamente elevado (95-98%) en
pacientes neutropénicos, lo cual le confiere una gran utilidad, pues un resultado
negativo permite descartar casi con absoluta seguridad una aspergilosis
invasiva.
La determinación sistemática de antígeno galactomanano en estos
pacientes permite evaluar la respuesta a los tratamientos antifúngicos y,
eventualmente, modificarlos.
1.5-CULTIVO
El cultivo de diferentes muestras clínicas sobre todo respiratorias, resulta
especialmente útil para el diagnóstico de las aspergilosis, pues permite identificar la
especie implicada, realizar un recuento o cuantificación, realizar estudios de
sensibilidad frente a los antifúngicos e incluso estudiar los requerimientos de
temperatura (termofilia), entre otras determinaciones. En cualquier caso, como se
indicó en el apartado de examen microscópico, el aislamiento de Aspergillus spp. no
es criterio de enfermedad.
En relación con el cultivo, cabe destacar la importancia de emplear varios medios y
diferentes condiciones de incubación, especialmente a distintas temperaturas (26, 37 y
45 ºC). Las especies que se desarrollan únicamente a 25 ºC no se consideran
patógenas. La incubación a 45 ºC resulta especialmente útil, pues permite, por una
parte, informar de un resultado precoz a las 24 horas de cultivo y además, seleccionar
las especies termófilas, más relacionadas con un comportamiento patógeno.
1.6-DIAGNÓSTICO SEROINMUNOLÓGICO
La demostración de anticuerpos específicos anti-Aspergillus no resulta especialmente
útil para el diagnóstico de la aspergilosis invasiva. En la actualidad es importante
cuando se emplea simultáneamente con la determinación de antígeno
galactomanano, pues permite valorar el resultado en ciertas situaciones de casos
antígeno negativo y presencia de anticuerpos (complejos inmunitarios). Más
recientemente se ha introducido una técnica de enzimoinmunoensayo que presenta
una elevada sensibilidad, y que podría resultar útil en el diagnóstico de la
aspergilosisinvasiva, pues aproximadamente un 30% de estos pacientes presenta
niveles considerables de anticuerpos.
DETERMINACION DEL ANTIGENO DE GALACTOMANANO EN
SUERO
Preparamos los controles R3, R4 Y R5 y las muestras de la siguiente manera:
1- Añadimos 300 microlitros de cada uno en un tubo eppendorf es decir, 300
microlitros de R3 en un tubo, 300 microlitros de R4 en otro tubo……

En cada uno de los tubos añadimos 100 microlitros de R7.

Agitamos en el vórtex cada uno de los tubos y los calentamos en el termoblox
durante 6 minutos a una temperatura de 120 º centígrados, una vez concluido
este tiempo centrifugamos los tubos a xxxx rpm durante 10 minutos.
2- Sacamos las tiras necesarias dependiendo del número de muestras teniendo en
cuenta que 4 pocillos van a utilizarse para los controles (R3, R4, R4, y R5) y
preparamos la microplaca de la siguiente forma:

En cada pocillo echamos 50 microlitros de R6 previamente homogeneizado por
inversión

Ahora añadimos 50 microlitros del sobrenadante de los reactivos y muestras
previamente centrifugadas y homogeneizamos la mezcla de cada uno de los
pocillos.
3- Una vez preparada, tapamos la placa con la tira adhesiva que viene en el KIT y la
incubamos en la estufa a 37º centígrados durante 1hora y 30 minutos.
*mientras incubamos la placa y antes de pasar el siguiente paso debemos preparar la
solución WASH el cual contendrá 4 ml de R2 por tira + 76 ml de agua destilada por
tira .
4- Procedemos al lavado de la microplaca en el LAVADOR DEGALACTOMANANO
de la siguiente manera:

Encender el aparato cerciorándonos de que el tubo que posee el aparato en la
parte de atrás este conectado en la garrafa marcada como RINSE.

Colocamos la microplaca en la bandeja de manera que el pocillo A quede
situado en la esquina superior derecha

El siguiente paso es seleccionar mediante las flechas que aparecen en la
pantalla de LED las siguientes opciones de forma consecutiva; YES, RUN,
YES, ahora seleccionamos la opción TO2 N5BO, 55 que es la opción del
GALACTOMANANO y por ultimo volvemos a seleccionar la opción YES.

Ahora el aparato nos preguntara cual es el número de tiras que deseamos
lavar, seleccionamos el número adecuado y pulsamos YES.

Volverá a cambiar la pantalla la cual ahora mostrara el siguiente mensaje,
WASH este es el momento de desconectar el tubo que estaba enchufado a la
garrafa de RINSE y conectarlo a la garrafa en la que se puede leer WASH,una
vez echo esto volvemos a seleccionar en la pantalla de LED la opción YES.

El aparato comenzara a trabajar realizando 5 lavados consecutivos
automáticamente

Una vez el aparato concluya de lavar la microplaca retiramos la misma y
pulsamos ESC.

Ahora procedemos al lavado del aparato seleccionado con el cursor de la
pantalla de LED la opción RINSE con lo que debemos de volver a desconectar
el tubo de la parte trasera del aparato y esta vez pasarlo de la garrafa de
WASH a la de RINSE, una vez echo esto pulsamos YES (realizar 5 lavados
del aparato consecutivamente los cuales entre uno y otro debemos pulsar la
opción YES ya que no los realiza consecutivamente de forma automática).

Por ultimo introducimos la bandeja pulsando IN y apagamos el aparato.
5- Una vez lavado procedemos a la mezcla del R9 del cual añadiremos 200 microlitros
en cada uno de los pocillos, una vez realizada la mezcla dejaremos la microplaca
durante 30 minutos a temperatura ambiente en condiciones de OSCURIDAD.
6- Una vez trascurridos los 30 minutos debemos añadir 100 microlitros de R10 el cual
lo debemos de mezclar bien ya que esta reactivo es el que detiene la reacción que se
esta produciendo en cada uno de los pocillos
7- El último paso es leer los resultados en el LECTOR DE GALACTOMANANO
siguiendo los siguientes pasos:

Conectamos el aparato pulsando el botón que se encuentra situado en la parte
trasera del mismo

En la pantalla de LED aparece “UNIDENTIFIED USB DEVICE”; lo eliminamos
con el aspa de cerrar.

Ahora podemos ver que el aparato nos pide el usuario y la contraseña para
acceder a las opciones, una vez introducidas correctamente pulsamos OK.

Aparecerá el menú principal y automáticamente se abrirá la bandeja donde se
depositara mas adelante la microplaca.

Ahora hay que crear una lista de trabajo eligiendo la opción “CREAR
OMODIFICAR UNA LISTA DE ID DE MUESTRA”

Pinchamos “>>”

Por defecto aparece marcado “CREAR NUEVA”, a continuación volvemos a
pinchar “>>”.

Entonces aparecerá la casilla “REGISTRO MANUAL DE LA LISTA DE ID DE
MUESTRA” sobre la que debemos pinchar.

Por defecto aparece marcado “UNA”, nosotros pinchamos”OK”.

En la pantalla aparecerá “EDITAR DATOS DEL POCILLO” y se observa una
placa microtiter.

Para introducir los datos de las muestras en cada pocillo se pincha en cada
cuadrado de la microplaca virtual la cual simula la verdadera. Cada cuadrado
corresponde a un pocillo sobre el que se pincha y se escribe el número de
muestra que corresponde, entonces pinchamos” OK “y saltará
automáticamente al siguiente cuadrado en el que deberemos actuar de la
misma manera hasta registrar todos los datos de cada uno de los pocillos.

Al finalizar volvemos a pulsar “OK” y se mostrara la opción “GUARDAR
LISTA” la cual se guardara nombrándola con la fecha del día de la realización
de la prueba.

Pinchamos en “FINALIZAR”

Aparecerá de nuevo la pantalla del menú principal, donde una de las opciones
que se mostrara será la de “INICIAR MEDICION” sobre la que pincharemos.

Elegimos el nombre del archivo el cual en este caso será la opción “60” la cual
corresponde a “ASPERGILLUS” y pulsamos”>>”.

Colocamos la microplaca.

Aparecerá otra ventana de iniciar medición con un mensaje, el cual no
debemos de tener en cuenta asique volvemos a presionar “>>”.

De nuevo aparecerá una ventana de iniciar medición, con el método que vamos
a utilizar “ ASPERGILLUS”, debajo podemos escoger la lista de trabajo creada
anteriormente , nos situaremos sobre la misma y pulsaremos “ INSERTAR”,
“OK”, ahora saldrá una placa de microtiter en la pantalla y volvemos a pulsar
”OK”

Aparece de nuevo la pantalla de iniciar medición y pinchamos “FINALIZAR”.

Comienza el agitado automáticamente.

El espectrofotómetro introduce y lee la microplaca.

Aparecerá una pantalla de error en la cual se pregunta si deseas realizar los
cálculos igualmente, nosotros debemos pinchar “SI”.

Se imprime un informe con los resultados.

Extraemos la microplaca.

Aparece un nuevo mensaje en la pantalla y pulsamos “FINALIZAR”.

El aparato retornará a la pantalla del menú principal donde veremos la opción
“SALIR DE MAGELLAN” sobre la que pincharemos.

Por ultimo saldrá una ventana con el mensaje “AHORA ES SEGURO
APAGAR EL LECTOR ¿REINICIAR AHORA?”, entonces debemos apagar el
equipo del botón situado en la parte posterior del aparato directamente ya que
si pulsamos el “OK” que aparece en la pantalla de LED se volverá a reiniciar
al programa.
8- El último paso es informar los resultados, introducimos en el programa de validación
de resultados como NO (en caso de ser negativos) o como PO (en caso de ser
positivos).
*EN CASO DE OBTENER UN RESULTADO POSITIVO DEBEMOS REPETIR LA
TOTALIDAD DE LA PRUEBA PARA CONFIRMAR EL RESULTADO.